Прибор для диагностики туберкулеза

Обновлено: 25.04.2024

Бактериологический метод диагностики туберкулеза. Влияние химиотерапии на диагностику туберкулеза.

Наилучшие результаты получают при одновременном использовании двух различных плотных сред. При этом не следует ограничиваться однократным или даже повторным исследованием, а необходимо последовательно, через известные интервалы производить посевы мокроты или промывных вод бронхов. Целесообразность такой диагностической тактики подтверждается повседневным опытом и, в частности, наблюдениями, проведенными в Институте туберкулеза в Будапеште. При троекратном исследовании методом посева мокроты у значительной группы больных туберкулезом легких микобактерии были обнаружены у 70,3% из них, после 5 анализов — у 80,7%, а после 10 — у 97,9%.

При бактериологическом способе исследования удается не только выявить и подсчитать количество выросших колоний микобактерии туберкулеза, но и изучить их различные свойства, дифференцировать от кислотоупорных сапрофитов и атипичных штаммов, определить типовую принадлежность, ферментативную активность, лекарственную чувствительность и др.

Успехи различных способов культивирования микобактерии, естественно, ограничили сферу применения биологического метода исследования, т. е. заражения животных исследуемым материалом. Но они ни в какой мере пе исключают его. Путем заражения высокочувствительных к туберкулезу лабораторных животных, главным образом морских свинок, можно обнаружить микобактерий, даже если они содержатся в исследуемом материале в небольшом количестве. Это обстоятельство приобретает, конечно, весьма важное диагностическое значение. Тем же способом удается лучше дифференцировать вирулентные и атипичные штаммы от сапрофитов, определить тип микробов, к которым одни виды животных чувствительны, а другие устойчивы, а также установить патогенность и вирулентность микобактерий туберкулеза.

Следует подчеркнуть, что при специфической химиотерапии затрудняется обнаружение микобактерий в различных выделениях, жидкостях и тканях организма больного. Это явление связано с тем, что под влиянием антибактериальных препаратов, особенно при длительной терапии, понижается жизнеспособность микобактерий и изменяются их морфологические свойства и химический состав, что отражается на тинкториальной способности, так как может вести к снижению или утрате присущей микобактериям кислотоустойчивости. Мертвые микобактерий по Цилю—Нельсену окрашиваются так же, как и живые. Для их дифференциации применяют специальные методы окраски. Так, живые микобактерий, в которых содержится нативная дезоксирибонуклеиновая кислота, окрашиваются метиловым зеленым. Погибшие микробы лучше окрашиваются пиронином в розовый цвет, а сафранином — в красный. При докраске карболовым фуксином живые микобактерий окрашиваются в зеленый цвет, а погибшие — в красный.

Распознавание таких биологически и морфологически измененных форм возбудителя туберкулеза, особенно в условиях повседневной практики, естественно, встречает затруднения. Этим отчасти можно объяснить, что у некоторых больных даже деструктивным туберкулезом легких не находят микобактерий туберкулеза в мокроте уже вскоре после начатой химиотерапии. Нет сомнения, что только у части из них произошло стойкое и полное морфологическое и биологическое оздоровление стенок туберкулезных каверн. У остальных имеет место мнимая абациллярность, что подтверждается возможностью обострения процесса при динамическом наблюдении, а также обнаружением микобактерий в полости или стенках каверны при специальном исследовании. В этом можно убедиться, если произвести пункцию, казалось бы, излеченной каверны и исследовать ее содержимое после промывания физиологическим раствором. Пользуясь таким методом, Neef (1966) из 49 больных с остаточными, большей частью небольшими (до 0,5 см в диаметре), посттуберкулезными полостями в легких у 11 больных, т. е. почти в 1/4 случаев, обнаружил микобактерий, которые не удавалось найти в мокроте или в промывных водах бронхов всеми доступными способами.

Таким образом, в условиях современной химиотерапии возникает необходимость дальнейшего усовершенствования методов обнаружения микобактерий туберкулеза. В то же время обязательным условием является одновременное динамическое комплексное применение различных лабораторных способов исследования патологического материала: бактериоскопии, посева, по возможности заражения лабораторных животных. Необходимо, кроме того, использование ряда специальных методов для выявления не только классических, но и других вариантов возбудителя.

Так, применяя новые питательные среды, а также пенициллин и дигидрострептомицин, можно выделить из мокроты, спинномозговой жидкости, мочи и тканей больных туберкулезом L-формы микобактерий в виде мелких зерен и шаровидных тел.

При дифференциации типичных и атипичных микобактерий используют комплекс многих методов исследования: определяют кислотно- и спиртоустойчивость микобактерий; изучают особенности их роста при различной температуре, на отдельных питательных средах, при наличии и отсутствии солнечного света; исследуют морфологию культур и способность образовывать пигмент; устанавливают степень чувствительности к туберкулостатическим препаратам. Существенное диагностическое значение имеют некоторые биохимические тесты: амидазный и ниациновый, определение каталазной, дегидрогеназной, пероксидазной, уреазной и липазной активности и реакция восстановления нитратов. О вирулентности тех или иных штаммов микробов судят по результатам определения корд-фактора и цитохимическим тестам. Их патогенность устанавливают при заражении морских свинок, белых мышей, кроликов, кур. Эти исследования дополняются изучением антигенных структур, а также аллергическими пробами с туберкулином и сенситинами, серологическими реакциями у больных.

Определенную роль в клинике туберкулеза органов дыхания играет вторичная — смешанная — инфекция, что связано прежде всего с тем что при нем нередко отмечаются хронический бронхит и пневмония, пневмосклероз, бронхоэктазы. Эти изменения могут сопутствовать туберкулезу или становятся его осложнением, особенно при длительном течении. В том и другом случае, отмечают Н. В. Татарский и А. Я. Цигельник (1968), создаются условия для проявления активности вторичной флоры и развития ряда клинических симптомов: повышения температуры, увеличения количества мокроты, нарастания катаральных явлений в легких, амилоидоза и т. д. При бактериологическом исследовании при этом обнаруживают различного вида стрептококки и стафилококки, грамположительные и грамотрицательные кокки, кишечную палочку и т. д. Все они имеют различную степень чувствительности к отдельным антибиотикам. При этом обязательным является выделение чистых культур и определение их патогенности.

При дифференциальной диагностике туберкулеза и глубоких микозов— аспергиллеза, гистоплазмоза, актиномикоза, кокцидиомикоза, нокаридиоза, кандидомикоза и т. д. — важно не только тщательно исследовать нативные и окрашенные препараты мокроты на присутствие дрожжеподобных грибов рода Candida, Coccidoides immitis, Histoplasma capsulatum, Aspergillus fumigatus и т. д., но и производить посевы на специальные питательные среды, главным образом на среду Сабуро с агаром или без него. Положительные результаты приобретают большее диагностическое значение, если одновременно у больных выявляются кожные реакции на кокцидиоидин, гистоплазмин, аспергиллин, бластомицин и др., а также серологические реакции с соответствующими антигенами (реакция преципитации, связывания комплемента).

Туберкулез является одной из опасных и одновременно распространенных инфекций в нашей стране. Если вы поищите литературу по фтизиатрии на территории США, то удивитесь, ее практически нет. Причина - туберкулез практически искоренен на территории США и считается социально значимым заболеванием, которое прямо указывает на качество жизни населения страны.

В нашей стране риск заболеть туберкулезом подстерегает нас везде, так как среди нас множество сограждан, приезжих из стран Азии, которые являются либо больными, либо носителями туберкулеза. А туберкулез это одно из тех заболеваний, где актуальна латинская поговорка "Quo bene diagnostit - bene curat" - "Кто хорошо диагностирует, тот хорошо лечит", так как чем раньше врач выявляет заражение туберкулезом, тем он успешнее лечит своего пациента. Сегодня в статье я предлагаю разобрать современную отечественную диагностику туберкулеза. Какой анализ на туберкулез сдать, чтоб точно исключить заболевание?

Кому необходимы данные методы диагностики туберкулеза?

Методы обследования, отмеченные в заголовке данной статьи, необходимо выполнять всем у кого заподозрена туберкулезная инфекция. Она может быть заподозрена в ходе:

выяснения жалоб, анамнеза,
объективного осмотра пациента,
лучевых методов обследования органов грудной клетки (флюорографии, рентгенографии, КТ),
бронхоскопии с забором мокроты на исследование,
анализов выпота, полученного при плевральной пункции,
операциях на органах грудной клетки (при выявлении характерной диссеминации на висцеральной и париетальной плеврах).

Если в ходе данного обследования заподозрена туберкулезная инфекция, то ее необходимо исключать. Именно тут и начинают привлекаться иммунологические методы диагностики: проба Манту с 2 ТЕ, диаскинтест и T-SPOT.ТБ.

Какой иммунологический метод диагностики туберкулезной инфекции выбрать?

Если детям поголовно делают пробу Манту и у них начинают выявляться ложноположительные результаты, то у взрослых эти результаты оказываются ложноположительными уже чуть ли не в половине случаев. Следовательно, от пробы Манту у взрослых в нашей стране постепенно отказываются и заменяют диаскинтестом. В чем между ними отличия?

По сути, они одинаковые по механизму выявления инфекции, отличие лишь в том, что вводится пациенту для выявления реакции. При пробе Манту вводится туберкулин - продукт жизнедеятельности возбудителя туберкулеза, а при диаскинтесте - белки характерные для возбудителя туберкулеза, но полученные путем генетического изменения штаммов кишечной палочки. То есть, материал вводимый при диаскинтесте никак не связан напрямую с микобактериями туберкулеза.

Проба Манту и диаскинтест - это отечественные разработки, созданные в СССР и дорабатываемые в России.

На сегодняшний день изготовление тестов T-SPOT.TB локализовано в нашей стране во Владимирской области по лицензии выданной компанией из Великобритании Oxford Immunotec. В 2012 году тест можно было выполнить только в Санкт-Петербурге, сегодня сдать анализ на туберкулез методом T-SPOT.TB можно во всех городах присутствия "Лабораторий будущего ЛабКвест" (АО "ЛабКвест", Центральный офис: 121059, Москва, Бережковская набережная, д. 20, стр. 13, федеральный телефон 8 (800) 700-09-99).

Какой метод исследования оказывается более точным, чем T-SPOT.ТБ?

На сегодняшний день более точным методом исследования оказывается микробиологический, в ходе которого в материалах, полученных от пациента, пытаются выявить сами микобактерии туберкулеза. В качестве материала могут выступать:

трехкратно сданная мокрота,
мокрота полученная в ходе диагностической или лечебной бронхоскопии,
жидкости полученной в ходе плевральной пункции,
тканях полученных в ходе операции (к примеру, на грудной клетке).

Все эти материалы, как правило, окрашиваются методом Циля-Нильсена и выявленные микробы достоверно укажут, что у пациента туберкулезная инфекция.

Единственное, метод напрямую будет зависеть от качества забора материала и его направления на исследование. К примеру, мокрота, полученная при бронхоскопии, значительно более ценна, чем трехкратно сданные "плевки", а измененные ткани, полученные в ходе операции, более ценны, чем жидкость полученная при плевральной пункции.

Следовательно, микробиологический метод диагностики более точен, чем T-SPOT.TB, но качество направляемого материала может подвести и свести ценность метода к нулю.

Резюме

В нашей стране с 2012 года доступны все современные методы выявления туберкулезной инфекции, единственное, одни из них могут быть оплачены полисом обязательного медицинского страхования (ОМС), а другие нет. В рамках ОМС могут быть выполнены проба Манту и диаскинтест. Надо лишь получить направление врача. А вот T-SPOT.TB в рамках ОМС недоступен и может быть выполнен лишь за счет ДМС, либо личных средств граждан.

Видео современная диагностика и лечение туберкулеза у детей и подростков к.м.н., ст.н.с., детско-подросткового отдела ФГБУ НМИЦ ФПИ А.В. Казаков

- Вернуться в оглавление раздела "Пульмонология."

Автор: Искандер Милевски. Дата обновления: 11.9.2020

Информация на сайте подлежит консультации лечащим врачом и не заменяет очной консультации с ним.
См. подробнее в пользовательском соглашении.

Диагностика туберкулеза. Принципы микробиологической диагностики туберкулеза. Выделение возбудителя туберкулеза.

Для диагностики туберкулёза применяют бактериоскопические, бактериологические, биологические, серологические и аллергологические методы, входящие в обязательный диагностический минимум. Материалом для исследований служат мокрота, отделяемое свищей, моча, СМЖ, испражнения.

Микроскопия возбудителя туберкулеза в патологическом материале. В мазках, окрашенных по Цилю-Нильсену, обнаруживают кислотоустойчивые палочки возбудителя туберкулеза.

Нередко материал содержит мало бактерий туберкулеза и для повышения вероятности их обнаружения используют методы обогащения: центрифугирование и флотацию. В первом случае исследуемый материал обрабатывают смесью растворов NaCl и NaOH, центрифугируют и микроскопируют осадок. Второй метод включает обработку материала смесью NaOH, дистиллированной воды и ксилола (или бензола). Образец энергично встряхивают; образующаяся пена всплывает и захватывает микобактерии. Пену отсасывают и готовят мазки.

Наиболее результативна люминесцентная микросколия возбудителя туберкулеза. Материал обрабатывают аурамин-родамином и бактерии окрашиваются в бело-жёлтый цвет. Для выявления L-форм применяют AT, меченные флюорохромами.

Выделение возбудителя туберкулеза

Достоинство метода — возможность получения чистой культуры туберкулеза, позволяющая её идентифицировать, оценить вирулентные свойства и определить чувствительность к ЛС. Материал засевают, тщательно втирая, на твёрдые питательные среды.

Для повышения эффективности выделения возбудителя туберкулеза и уничтожения контаминирующей микрофлоры применяют методы обогащения или обрабатывают материал 6-12% серной кислотой. Основной недостаток бактериологического метода — длительность получения результата (от 2 до 12 нед). В связи с этим разработаны ускоренные микрометоды выделения возбудителя туберкулеза.

Один из распространённых методов выделения возбудителя туберкулеза, метод Прайса, заключается в следующем. Материал помещают на предметное стекло, обрабатывают серной кислотой, отмывают физиологическим раствором и вносят в питательную среду, дополненную цитратной лизированной кровью.

Стекло вынимают через 3-4 сут и окрашивают но Цилю-Нильсену. При микроскопии обнаруживают микроколонии микобактерии возбудителя туберкулеза. Вирулентные бактерии образуют змеевидные (рис. 22-2), а невирулентные — аморфные микроколонии. Культуры L-форм выделяют посевом в столбик полужидкой среды и инкубируют при 37 °С 1-2 мес.

Рост проявляется в виде облачка помутнения с мелкими вкраплениями. Вирулентность выделенной культуры возбудителя туберкулеза определяют заражением лабораторных животных и по наличию корд-фактора. Последний легко идентифицируют по способности микобактерии связывать нейтральный красный и нильский голубой и удерживать их после добавления щелочи. Вирулентные штаммы возбудителя туберкулеза удерживают красители, авирулентные — нет.

В 2004 году по инициативе д.м.н., профессора Михаила Александровича Владимирского, заведующего сектором молекулярной диагностики туберкулёза НИИ Фтизиопульмонологии Первого МГМУ им. И.М.Сеченова, мы начали разработки в области ПЦР-диагностики туберкулёза.

Выделение ДНК: использование оригинальных реагентов и магнитных частиц обеспечивает получение максимального количества чистой ДНК и позволяет автоматизировать процесс выделения ДНК.

ПЦР в реальном времени: одновременная детекция нескольких различных участков генома комплекса микобактерий туберкулёза (МБТ) увеличивает информативность и достоверность анализа.

I этап – Пробоподготовка, инактивация

II этап – Выделение ДНК

Набор реагентов для выделения ДНК (на магнитных частицах)

Набор реагентов для выделения ДНК микобактерий из клинических образцов и культур клеток на автоматизированных станциях TECAN

Снижение риска контаминации во время выделения ДНК практически до нуля.
Значительное уменьшение трудоёмкости процесса выделения ДНК.
Стандартизированное выделение ДНК из клинических образцов.
Экономическая выгода: низкий расход пластика и реактивов.

Набор реагентов для ускоренной пробоподготовки и выделения ДНК микобактерий из образцов мокроты

III этап – ПЦР в реальном времени

Обнаружение и количественное определение комплекса МБТ

высокая достоверность анализа благодаря одновременному обнаружению двух специфичных генов M.tuberculosis complex: IS6110 и regX3;
оценка пригодности образца ДНК для определения антибиотикоустойчивости;
высокая чувствительность (не более 100 КОЕ/мл мокроты или 1–10 копий фрагментов ДНК в реакции) и 100%‑ая специфичность, подтверждённые на панели QCMD (Quality Control for Molecular Diagnostics) Mtb EQA (UK).

Определение антибиотикоустойчивости МБТ к препаратам I и II ряда

Наборы реагентов АМПЛИТУБ-МЛУ-РВ, АМПЛИТУБ-FQ-РВ — это:

диагностика форм туберкулеза с лекарственной устойчивостью, в том числе множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ) и широкой лекарственной устойчивостью (ШЛУ);
быстрая детекция мутаций M.tuberculosis, ассоциирующихся с устойчивостью к антибиотикам первого и второго ряда (рифампицину, изониазиду, этамбутолу, фторхинолонам);
достоверность результатов, ежегодно подтверждаемая при проведении Федеральной службой внешней оценки качества (ФСВОК) Росздравнадзора испытаний шифрованных тест-культур и образцов.

Наборы АМПЛИТУБ-МЛУ-РВ и АМПЛИТУБ-FQ-РВ основаны на использовании оригинальной мультиконкурентной аллель-специфичной методики ПЦР в реальном времени, позволяющей выявлять мутации в генах микобактерий туберкулеза, ответственных за устойчивость к конкретным антибиотикам.

Принцип мультиконкурентной аллель-специфичной методики ПЦР в реальном времени

В формате одной пробирки используются 5’-флуоресцентно-меченые аллель-специфичные праймеры с общим комплементарным им 3’-меченым олигонуклеотидом-гасителем и контрольный флуоресцентный зонд, комплементарный участку ДНК без мутаций.
При отсутствии мутаций в ДНК нарастание флуоресценции в ходе ПЦР-РВ наблюдается только по флуорофору зонда.
При наличии мутаций в ДНК нарастание флуоресценции в ходе ПЦР-РВ наблюдается как по флуорофору зонда, так и по флуорофору 5’-флуоресцентно-меченого аллель-специфичного праймера. Данный метод позволяет определить не только точку мутации, но и процент устойчивого мутантного штамма МБТ на фоне дикого.

Гены, кодоны, замены, используемые в наборах реагентов
АМПЛИТУБ-МЛУ-РВ при определении антибиотикоустойчивости

Использование автоматизированных станций Freedom EVO (TECAN, Швейцария) для молекулярно-генетической диагностики туберкулёза

Трудозатраты — 1 час
Продолжительность выделения ДНК — не более 2 часов
Подготовка к амплификации и ПЦР-РВ — 1,5 часа

ИТОГО: результаты анализа будут готовы через 3,5 часа
Оператор затратит 1 час своего рабочего времени.

Реакция Манту, Диаскин-тест, квантифероновый тест, Т-спот, ПЦР, а может флюорография? Расскажем подробнее.

Туберкулёз в России распространён настолько, что к сорока годам 70-90% жителей нашей страны инфицированы им. Это не значит, что они больны: после инфицирования иммунитет большинства людей справляется с бактерией. Вероятность заболеть составляет в среднем 8% в первые два года после инфицирования, затем постепенно снижается, и формируется приобретенный клеточный иммунитет. Среди взрослых чаще болеют люди ослабленные, живущие в плохих условиях, при недостатке света и свежего воздуха. Тем не менее, заразиться может абсолютно каждый из нас. Поэтому так важно проходить регулярные проверки на туберкулёз и проверять своих детей.

ВАЖНО! Информация из статьи не может быть использована для самодиагностики и самолечения! Назначить необходимые обследования, установить диагноз и составить план лечения может только врач на консультации!

Зачем нужна прививка БЦЖ?

ВОЗ рекомендует массовую вакцинацию новорожденных против туберкулёза во всех странах, где эта болезнь распространена. Поэтому на 3-5 день после рождения, еще в роддоме, всем новорожденным бесплатно делают прививку БЦЖ. Но эта вакцина не защищает от инфицирования туберкулёзом. Её задача несколько иная. Если не привитый ребенок младше 2 лет будет инфицирован туберкулёзом, у него крайне высока вероятность развития туберкулезного менингита и генерализованных форм туберкулеза, которые очень быстро приводят к смерти. БЦЖ достаточно надёжно защищает ребенка именно от этих форм. Она также защищает детей от легочной формы туберкулеза, но уже менее эффективно.

Проба Манту

Проба Манту ежегодно проводится всем детям до 7 лет. Это не прививка (!), а иммунологический тест, показывающий, есть ли в организме возбудитель туберкулеза. При этом внутрикожно вводится туберкулин — специфический белок, содержащий антигены человеческого и бычьего туберкулеза. Через 72 часа измеряется размер папулы. На результат реакции Манту может повлиять посещение сауны, долгое принятие ванны, бассейн и расчёсывание места введения пробы. Временный контакт с водой никак не влияет на результаты пробы Манту, поэтому мнение о том, что Манту нельзя мочить — миф.

Диаскинтест тест

Он проводится детям с 8 лет. Также является кожной пробой. Но если в Манту используются антигены как человеческого, так и бычьего туберкулеза, то в диаскинтесте — только антигены туберкулеза человека. Диаскинтест гораздо более специфичен: реакция на него возникает, только если в организме есть активные бактерии туберкулеза. Проще говоря — если проба Манту положительная, это ещё ничего не значит: эта проба часто дает и ложноположительные реакции. А вот после диаскинтеста появилась реакция — это более серьёзный показатель.

Точность Манту составляет 50-70%, диаскинтеста — 90%.

Квантифероновый тест

Квантифероновый тест — один из новых методов диагностики туберкулёза по анализу крови. Он основан на определении в крови гамма-интерферона, который вырабатывают клетки в ответ на внедрение туберкулезной палочки. В отличие от Манту и диаскинтеста, квантифероновый тест не требует введения в организм никаких антигенов и бактерий. Кровь для исследования берут из вены. Результат готов через несколько дней, и его точность намного выше, чем у кожных проб. Тест будет положительным, только если человек действительно болен.

Сравнительная характеристика четырех тестов на туберкулёз

Чтобы отличить активную форму туберкулеза от латентной, используется специфический тест — ПЦР (исследования мокроты на ДНК). Таким образом, диаскинтест, ти-спот и другие тесты позволяют определить, болен ли человек туберкулезом вообще (легочным или внелегочным), а ПЦР — болен ли он им в активной форме.

Флюорография

Читайте также: