Пуповинная кровь и вич
Обновлено: 24.04.2024
ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ
Впервые вирус иммунодефицита человека 1 типа (ВИЧ-1) был выделен в 1983 г. Однако, несмотря на изучение проблемы СПИДа ведущими научно-исследовательскими лабораториями всего мира на протяжении более 30 лет, пандемия ВИЧ остается одной из серьезнейших проблем здравоохранения в области инфекционных заболеваний. Молекулярные механизмы проникновения ВИЧ в клетку-мишень включают в себя специфичное взаимодействие гликопротеина вирусной оболочки gp120 с молекулой CD4 и хемокиновым рецептором CCR5. Одновременная экспрессия молекул CD4 и CCR5 наблюдается в CD4+ лимфоцитах (Т-хелперы 1 типа, дендритные клетки, моноциты, макрофаги).
Полифорфизм CCR5-Δ32 является делецией 32 пары нуклеотидов гена CCR5, мутация потери функции, которая обеспечивает генетическую резистентность инфицированию ВИЧ-1. Мутация обнаруживается в европеоидной популяции с частотой 10–15% гетерозиготные и 1% гомозиготные носители.
Таким образом, на основании гипотезы о том, что трансплантация гемопоэтических стволовых клеток (ГСК), содержащих данную мутацию, может стать средством эффективного лечения пациентов с ВИЧ-инфекцией, несколько научно-исследовательских групп начали формирование пула источников таких ГСК. Одним из наиболее перспективных направлений является создание на базе банка пуповинной крови хранилища образцов пуповинной крови, содержащих мутацию CCR5-Δ32 с учетом наиболее часто встречающихся в данном регионе гаплотипов HLA.
Для инфицирования вирусом иммунодефицита человека типа 1 (ВИЧ-1) требуется наличие CD4 рецептора и хемокинового рецептора 5 (CCR5) [1] . У человека белок CCR5 кодируется геном ccr5, расположенным на коротком плече третьей хромосомы в позиции 21 (3p21). Некоторые группы населения унаследовали мутацию ccr5-Δ32, представляющую собой делецию 32 пар нуклеотидов в кодирующей области гена ccr5. Гомозиготные носители этой мутации (ccr5-Δ32/Δ32) устойчивы к ВИЧ-1-инфекции [2–4] .
Однако для каждого региона мира существуют собственные особенности распределения аллелей системы HLA, поэтому образцы, хранящиеся в западноевропейских странах и США с невысокой долей вероятности могли бы подойти российским пациентам. Целью данного исследования является анализ образцов пуповинной крови, находящихся на длительном хранении в Покровском банке стволовых клеток на наличие мутации гена ccr5-Δ32/Δ32 и предварительная оценка данных образцов по количеству ядросодержащих клеток и HLA генотипу. Материал и методы В исследовании использовалась геномная ДНК, выделенная с октября 2011 г. по февраль 2013 г. из 1340 образцов пуповинной крови общественного регистра хранения Покровского банка стволовых клеток.
Получение пуповинной крови
Все образцы ПК были собраны как во время срочных родов, так и во время операции кесарева сечения после подписания роженицами информированного согласия на сбор материала. Получение пуповинной крови осуществлялся сразу после рождения ребенка – пуповина клеммировалась в течение 30 с после рождения ребенка, затем рассекалась между зажимами, и, после обработки антисептиком пуповины в месте предполагаемого прокола, производилась пункция пупочной вены. Кровь поступала в мешок самотеком. Сбор крови проводился до полного опустошения пупочной вены. По окончании сбора крови на трубку рядом с иглой накладывался зажим, игла извлекалась из вены, кровь перемешивалась с антикоагулянтом. Контейнер упаковывался в индивидуальный пластиковый пакет.
При поступлении контейнера с кровью в лабораторию после его идентификации и обработки поверхности антисептиком пакет с кровью переносился в подготовленный ламинарный бокс, где из него перед началом выделения фракции ядросодержащих клеток отбиралось по 1 мл в две микропробирки типа Эппендорф для исследования на гемоанализаторе и HLA-типирования. Микропробирки маркировались.
После получения клеточного концентрата, в ламинарном боксе стерильным шприцем в криопакет вводился рассчитанный объем криопротектора (ДМСО 10%, Pall, Великобритания). Замораживание концентрата осуществлялось в программируемом замораживателе Cryo 560-16 (Planer, Великобритания). Криокоробка с образцом переносилась на длительное хранение при температуре, не превышающей -150°С, в дьюар с жидким азотом.
ДНК выделялась из 0,9 мл замороженной крови с использованием коммерческих наборов Protrans (Германия) и Axygen (США). Скрининг образцов на ccr5Δ32 аллель выполнен методом ПЦР. Использовались следующие праймеры, фланкирующие делеционный сайт:
ПЦР проводилась в амплификаторе BioradMyCycler Version 1.065. Реакция проводилась по следующей программе: 94°С – 5 мин; далее 94°С – 30 с, 56°С – 40 с, 72°С – 40 с в течение 35 циклов; затем 72°С – 10 мин и 15°С – 5 мин. Детекция полиморфизма осуществлялась в 9% полиакриламидном геле с применением вертикального электрофореза. ПЦР фрагменты состояли из 224 пар нуклеотидов при нормальном варианте гена и из 192 пар нуклеотидов при гомозиготном полиморфизме ccr5Δ32.
HLA-типирование образцов пуповинной крови производилось методом SSP (sequencespecificpriming). ДНК выделялась из 0,5–0,7 мл пуповинной крови с применением наборов для выделения ProtransDNABox 500 (Protrans, Германия). Концентрация ДНК оценивалась на спектрофотометре, среднее значение концентрации при выделении данным набором равно 70 мкг/мл.
Далее производилась амплификация с использованием циклерплатных систем Protrans HLA-A*,B*,-DRB1* (Protrans, Германия). После нанесения на планшет, образцы ДНК помещались в термоциклер (MyCycler, Biorad) для проведения реакции амплификации. По окончании термоциклирования производился электрофорез в агарозном геле. После нанесения продуктов амплификации в лунки геля, электрофоретическую ячейку подключали к источнику питания и проводили электрофорез в течение 25 мин при 170V.
Снимок геля выполнялся через трансиллюминатор и заносился в компьютерную базу данных. В каждой из 96 лунок должен был получиться контрольный продукт для оценки проведения корректной амплификации, а также в некоторых лунках должна быть полоска специфичного продукта, что и обуславливало генотип по локусам HLA-A, HLA-B и HLA-DRB1.
Результаты и обсуждение
В результате исследования было выявлено 13 образцов пуповинной крови, содержащих гомозиготную мутацию гена ccr5Δ32, что составило 0,9% от общего количества исследованных образцов. Общее количество ядросодержащих клеток в образцах составило 1059±124×106, количество CD34+ клеток составило 3,95±1,08×106. Результаты HLA типирования приведены в таблице 1. Кроме того, было выявлено 256 гетерозиготных носителей полиморфизма ccr5Δ32 (19,1%).
Как видно из этой таблицы, 46% образцов пуповинной крови, гомозиготных по ccr5Δ32, имеют совпадение по 4–6/6 аллелям комплекса гистосовместимости при сравнении с наиболее часто встречающимися в Северо-Западном регионе аллелями системы HLA (табл. 2).
Известно, что требования к соответствию HLA для трансплантации пуповинной крови значительно менее строгие, чем к костному мозгу и периферической крови. Соответственно, гипотеза исследовательской группы под руководством профессора Л. Петца состоит в том, что лечение ВИЧ-инфекции при помощи трансплантации ГСК с использованием пуповинной крови, полученной из относительно небольшого хранилища криоконсервированных ccr5-Δ32/Δ32 образцов, может быть более выполнима.
Сотрудничество между многочисленными банками пуповинной крови делает высоко вероятным создание специального хранилища ccr5-Δ32/Δ32 образцов пуповинной крови, которое, при необходимости, может быть увеличено. Например, G. Gonzalez с соавт. (2011) подсчитали, что в мире хранится около 400 000 криоконсервированных образцов пуповинной крови, среди которых около 2000–4000 ccr5-Δ32/Δ32 образцов [11] .
Многие врачи до сих пор считают ВИЧ препятствием для трансплантации, и трансплантационные центры часто исключают этих пациентов из своих протоколов [28] . Тем не менее, опыт последних 25 лет свидетельствует об успешных трансплантациях ГСК ВИЧ-инфицированным пациентам с гематологическими заболеваниями, не только при лейкемии и рецидивах лимфом, но и при не злокачественных заболеваниях, таких как апластическая анемия [26] . Действительно, результаты при аллогенных трансплантациях у ВИЧ-инфицированных пациентов, вероятно, лишь незначительно хуже по сравнению с ВИЧ-негативными [26] .
В дополнение к трансплантации ГСК ВИЧинфицированным пациентам с онкогематологическими заболеваниями или другими показаниями к трансплантации, пациенты с развившимся СПИДом, при отсутствии других заболеваний, также могут быть включены в клинические исследования трансплантации ccr5-Δ32/Δ32 пуповинной крови. Оптимизм антиретровирусного лечения нивелируется невозможностью эрадикации вируса, постоянным приемом дорогостоящих лекарственных препаратов по сложным схемам, потенциальными токсическими эффектамии, распространенностью резистентных штаммов [29] . Пациенты со СПИДом, которые плохо отвечают на антиретровирусную терапию и были информированы о значительных рисках и потенциальных выгодах трансплантации ГСК, должны быть включены в клинические исследования, если есть HLAсовместимый ccr5-Δ32/Δ32 образец с достаточной дозой.
Логичный, на первый взгляд, подход к лечению ВИЧ-инфицированных больных трансплантацией ГСК костного мозга и периферической крови, имеющих аллель ccr5 и полученных от взрослых доноров, является для взрослых неприемлемым решением. Тестирование на ccr5-Δ32/Δ32 при регистрации доноров в NMDP (Национальная программа доноров костного мозга) дорого и вряд ли будет эффективным из-за низкой статистической вероятности нахождения как HLA совпадения высокой степени, как это требуется при трансплантации ГСК взрослых доноров, так иccr5-Δ32/Δ32 генотипа у донора. Таким образом, более разумно предложить широкомасштабное тестирование как помещаемой на хранение, так и уже хранящейся пуповинной крови для выявления ccr5-Δ32/Δ32 образцов.
В этой связи, полученные в процессе исследования результаты по доле ccr5-Δ32/Δ32 образцов пуповинной крови в общественном хранилище и их распределению по аллелям HLA позволяют в перспективе создать специальное хранилище таких образцов пуповинной крови. Этот материал при получении результатов клинических исследований мог бы с большой долей вероятности использоваться в лечении ВИЧ-инфицированных пациентов в Российской Федерации. В ближайшей же перспективе, обнаруженные в общественном хранилище НИЛ Клеточных технологий СЗГМУ им. И.И. Мечникова ccr5-Δ32/Δ32 образцы пуповинной крови могли бы быть включены в протоколы клинических исследований, проводимых за рубежом.
Группа исследователей в США, работающих в Международной сети клинических исследований СПИДа среди матерей и детей и подростков (IMPAACT), сообщила о третьем подтвержденном случае полного излечения от ВИЧ. Пациенткой стала женщина среднего возраста, которая избавилась от вируса через четыре года после экспериментальной терапии рака крови.
К настоящему моменту было известно только о двух доказанных случаях полной ремиссии ВИЧ после трансплантации костного мозга. Предварительные результаты нового экспериментального лечения были представлены на Конференции по ретровирусам и оппортунистическим инфекциям 2022 года в Денвере (США), однако пока еще не опубликованы в рецензируемых научных журналах.
В 2017 году женщине был поставлен диагноз острый миелогенный лейкоз — злокачественное заболевание крови, поражающее костный мозг. Ее смешанное происхождение затруднило поиск подходящей для пересадки ткани в библиотеках, где доминируют доноры европеоидной расы, поэтому специалисты обратились к другому источнику стволовых клеток — пуповинной крови.
Некоторое количество этой крови сохраняется в плаценте и пуповинной вене после рождения ребенка. В ней содержатся гемопоэтические стволовые клетки, то есть клетки-предшественники кровяных клеток, в том числе тех, что образуют ткани кроветворных органов, а также иммунные клетки. В отличие от большинства других трансплантатов, пуповинная кровь не требует идеального иммунологического соответствия между донором и реципиентом, и ее уже применяют в терапии десятков тысяч пациентов с лейкемией по всему миру.
Зараженный ВИЧ Т-лимфоцит
Стволовым клеткам из пуповинной крови требуется несколько недель, чтобы прижиться и начать производить кровяные клетки, однако ВИЧ может атаковать их до того, как начнется выработка защитных лейкоцитов. Чтобы решить эту проблему, ученые разработали двойную стратегию: вместе с пересадкой стволовых клеток они перелили кровь от совместимого по группе родственника, чтобы дать трансплантату временную защиту против вируса. Кроме того, ДНК клеток пуповины содержали мутации delta-32 в обеих копиях гена CCR5. Этот ген кодирует белок C-C-рецептор хемокина 5, с помощью которого ВИЧ присоединяется к иммунным Т-клеткам и проникает внутрь них, а мутация delta-32 делает это невозможным. Известно, что люди с этой мутацией являются невосприимчивыми к ВИЧ. Большинство среди них европейского происхождения.
Пациентка была выписана всего через 17 дней после трансплантации. Через три месяца после операции все Т-лейкоциты и миелоидные клетки пациентки происходили не от старого костного мозга или крови ее родственника, а из стволовых клеток пуповинной крови. То есть все эти клетки имели мутацию delta-32 в корецепторе CCR5, которая навсегда блокировала ВИЧ. Результаты анализа показали отсутствие активных частиц ВИЧ в организме женщины, а сама пациентка прекратила прием всех антиретровирусных препаратов. К сожалению, этот способ лечения, подобно трансплантации костного мозга, пока не подходит для большинства людей с ВИЧ, а является лишь бонусом к терапии онкологических заболеваний крови.
Взятие костного мозга для трансплантации
Фото: Chad McNeeley / U.S. Navy
О третьем случае, возможно, полного излечения от ВИЧ сообщал журнал Science в июле 2020 года. Пациентом стал 36-летний мужчина из Бразилии, которого окрестили Пациентом из Сан-Паулу. Курс лечения комбинацией антиретровирусных препаратов и никотинамида (витамина В3) уменьшил количество вирусных частиц до нуля, а после прекращения терапии в марте 2019 года ВИЧ больше не наблюдался в его крови. Также до чрезвычайно низких уровней опустилось число антител, что указывает на отсутствие зараженных клеток в лимфатических узлах и кишечнике.
Напротив, у большинства людей, принимающих антиретровирусные препараты и прекративших курс лечения, вирусная нагрузка вновь начинает возрастать в течение нескольких недель. Однако весной 2021 года ученые сообщили о вновь возросшей вирусной нагрузке у данного пациента, которая стала неопределяемой после начала стандартной антиретровирусной терапии.
В Испании стартовало клиническое исследование, в котором врачи попытаются вылечить больных зараженных ВИЧ с помощью пересадки стволовых клеток пуповиной крови.
Тимоти Брауна, американца проживавшего в Берлине, нельзя было назвать удачливым человеком. В 30 лет у него диагностируют ВИЧ, и как будто одного смертельно опасного заболевания недостаточно, через некоторое время он заболевает раком крови – тяжелой формой лейкемии.
Лечащий врач Геро Хюттер (Gero Huetter) после курса химиотерапии назначает стандартную в таких случаях пересадку костного мозга. Однако к подбору донора доктор подошел не стандартно.
Среди 13 миллионов образцов совместимыми с Тимоти оказались 213. Среди них врач решил поискать определенную мутацию – мутацию гена CCR5. При этой мутации на поверхности лейкоцитов отсутствует определенный белок, рецептор по которому вирус иммунодефицита определяет, что эта клетка пригодна для заражения. Лейкоцит остается невидимым для вируса, а человек неуязвимым для большинства видов ВИЧ.
И такой образец нашелся! После пересадки Тимоти Браун вылечился и от лейкемии и от ВИЧ.
Этот случай обнадежил и пациентов и врачей. Однако существует серьезное препятствие для широкого применения данного метода – найти совместимый образец костного мозга, да еще и с нужной мутацией очень сложно.
Здесь докторам на помощь приходит пуповинная кровь. Как известно, найти совместимого по HLA донора пуповинной крови в разы проще, чем донора костного мозга. Уже сейчас исследователи подобрали 157 образцов с нужной генетической мутацией. Первые введения будут произведены уже в начале этого года. Врачи рассчитывают полностью излечить 5 первых пациентов от этого смертельного заболевания в течение ближайших 3х лет.
Вирус иммунодефицита человека первого типа (ВИЧ-1) был впервые выделен в 1983 г. Пандемия ВИЧ-инфекции остаётся одной из наиболее значимых эпидемий в истории человечества, несмотря на то, что ведущие лаборатории мира около тридцати лет проводят масштабные научные исследования ВИЧ-инфекции. Разработаны эффективные схемы лечения, позволяющие значительно увеличить продолжительность жизни больных, однако существующие терапевтические стратегии не приводят к полному выздоровлению пациента.
ВИЧ проникает в клетки посредством связывания гликопротеина вирусной оболочки gp 120 с мембранными рецепторами CD4 и CCR5. Одновременная экспрессия рецепторов CD4 и CCR5 встречается на Т-лимфоцитах, моноцитах, макрофагах и дендритных клетках. Белок CCR5 кодируется геном CCR5, расположенным на коротком плече хромосомы 3 в позиции 21 (3p21). Существует полиморфизм CCR5 delta 32, представляющий из себя делецию 32 пар нуклеотидов в кодирующей области гена CCR5. В результате экспрессии мутантного гена в гомозиготном состоянии транслируется укороченный, функционально неактивный белок CCR5. Вследствие этого гомозиготные носители этого полиморфизма обладают практически полной резистентностью к инфицированию ВИЧ [1,2].
Гомозиготными носителями делеционного аллеля являются около 1% белого населения, гетерозиготами являются в среднем 10-15%, в африканской и азиатской популяциях практически не встречается гомозиготное носительство полиморфизма CCR5 delta 32 [3]. Отмечается снижение распространённости носительства полиморфизма с севера на юг Европы. Так, наибольшая частота носительства делеционного аллеля обнаружена в финской и мордовской популяциях – 16%, наименьшая частота на Сардинии (4%) [4]. Также высокая распространённость полиморфизма отмечена во Франции (13.6%) и Дании (12.3%). В южных странах отмечено снижение встречаемости полиморфизма – у итальянцев 5.6%, у португальцев 5.2%, у корсиканцев 1.2% [5]. Высокая частота носительства наблюдается у российских поморов – встречаемость полиморфизма CCR5 delta 32 в гомозиготном состоянии достигает 3.1%, гетерозиготами являются 30.2%. Также высокая встречаемость отмечена у гагаузов – 2.1% гомозиготное носительство, 19.9% гетерозиготное носительство и среди западных украинцев – 2.1% гомозиготное носительство, 20.8% - гетерозиготное носительство [6].
Известен успешный случай трансплантации гемопоэтических стволовых клеток (ТГСК) периферической крови в 2007 году в Германии ВИЧ-инфицированному пациенту с острым миелоидным лейкозом от донора, гомозиготного носителя полиморфизма CCR5 delta 32. Сразу после трансплантации была прекращена высокоактивная антиретровирусная терапия. Полный химеризм развился на 61 день после трансплантации. На 68 день после трансплантации провирусная ДНК находилась на неопределяемом уровне при исследовании периферической крови. Кроме того, при анализе периферической крови, биоптатов различных тканей, включая кишечник, печень, мозг, лимфоузлы, наличие провирусной ДНК в течение всего периода времени, прошедшего после трансплантации, выявлено не было [7,8]. Однако, несмотря на успешность проведённого лечения, это был лишь единичный случай и в последующем ни одной ТГСК для лечения ВИЧ-инфекции не было проведено [9]. Это связано не только с редкой встречаемостью полиморфизма CCR5 delta 32, но и необходимостью строгой совместимости донора и реципиента по системе HLA – должны совпадать минимум 7 из 8 аллелей в четырёх локусах HLA-А, -В, -С, -DRB1 при типировании высокого разрешения [10, 11].
Эти условия создают значительные сложности для подбора соответствующего реципиента в регистре доноров гемопоэтических стволовых клеток костного мозга и периферической крови. В то же время многими исследователями показано, что при ТГСК пуповинной крови не возникает необходимости соблюдения таких строгих условий совместимости по HLA-антигенам. При ТГСК пуповинной крови достаточно совпадения 4 из 6 аллелей в локусах HLA-A, -B при типировании низкого разрешения и в локусе HLA-DRB1 при типировании высокого разрешения [12, 13]. В настоящее время пуповинная кровь считается одним из главных источников гемопоэтических стволовых клеток, наряду с костным мозгом и периферической кровью. Первая успешная ТГСК пуповинной крови была проведена в 1988 году во Франции пятилетнему пациенту с анемией Фанкони [14]. C каждым годом растёт количество проводимых ТГСК пуповинной крови. Так к 2011 году в трансплантационных центрах по всему миру было проведено уже более 20000 ТГСК пуповинной крови для лечения детей и взрослых с гематологическими заболеваниями [15]. Многочисленные сравнительные исследования ТГСК костного мозга, периферической крови и пуповинной крови демонстрируют эквивалентные исходы трансплантаций, что позволяет рассматривать пуповинную кровь как альтернативный источник гемопоэтических стволовых клеток [16, 17, 18, 19, 20, 21, 22]. Таким образом ТГСК пуповинной крови с большой вероятностью могла бы найти клиническое применение для лечения ВИЧ-инфицированных пациентов.
Материалы и методы
Получение пуповинной крови
Определение полиморфизма CCR5 delta 32 с помощью метода полимеразной цепной реакции (ПЦР)
ДНК выделялась из 0.9 мл замороженной пуповинной крови с использованием коммерческих наборов Protrans (Германия) и Axygen (США). Скрининговое исследование образцов на CCR5 delta 32 аллель проведено с помощью метода полимеразная цепная реакция (ПЦР). Использовались следующие праймеры, фланкирующие делеционный сайт:
- F: CTGTGTTTGCGTCTCTCCCA
- R: CCTCTTCTTCTCATTTCGACACCG
ПЦР проводилась в амплификаторе Biorad My Cycler Version 1.065. Условия реакции: 94˚С – 5 мин.; далее 94˚С – 30 сек., 56˚С – 40 с., 72˚С – 40 с. в течение 35 циклов; затем 72˚С – 10 мин. и 15˚С – 5 мин. Детекция полиморфизма осуществлялась в 9% полиакриламидном геле с применением вертикального электрофореза. Длина ПЦР фрагментов составляла 224 п.н. при нормальном варианте гена и 192 п.н. при гомозиготном полиморфизме CCR5 delta 32.
HLA-типирование
HLA-типирование образцов пуповинной крови производилось методом SSP (sequence-specific priming). ДНК выделялась из 0.5-0.7 мл пуповинной крови с применением наборов для выделения Protrans DNA Box 500 (Protrans, Германия). Концентрация ДНК оценивалась на спектрофотометре, среднее значение концентрации при выделении данным набором равно 70 мкг/мл. Далее производилась амплификация с использованием циклерплатных систем Protrans HLA-A*,-B*,-DRB1* (Protrans, Германия). После нанесения на планшет образцов ДНК, они помещались в термоциклер (MyCycler, Biorad) для проведения реакции амплификации. По окончании термоциклирования производился электрофорез в агарозном геле. После нанесения продуктов амплификации в лунки геля, электрофоретическую ячейку подключали к источнику питания и проводили электрофорез в течение 25 минут при 170V. Снимок геля производился через трансиллюминатор и заносился в компьютерную базу данных. В каждой из 96 лунок должен был получиться контрольный продукт для оценки проведения корректной амплификации, а также в некоторых лунках должна быть полоска специфичного продукта, что и определяло соответствующий генотип по локусам HLA-A, HLA-B и HLA-DRB1.
Результаты
При скрининговом исследовании образцов пуповинной крови для детекции полиморфизма CCR5 delta 32 с октября 2011 года по июль 2013 года было обследовано 1940 образцов. В результате исследования было обнаружено 24 образца, гомозиготных по мутации CCR5 delta 32, что в относительном количестве составляет 1.24%. В 417 образцах полиморфизм CCR5 delta 32 присутствовал в гетерозиготном состоянии или 21.49% в относительном количестве. Общее количество ядросодержащих клеток (ОЯК) в образцах, гомозиготных по мутации CCR 5 delta 32, составило 1059±124 х 106, количество CD34+ клеток составило 3.95±1.08 х 106. Результаты HLA-типирования представлены в таблице 1.
| № | HLA-A | HLA-B | HLA-DRB1 | |||
| 1 | 2 | 26 | 15 | 38 | 7 | 13 |
| 2 | 2 | 3 | 35 | 58 | 1 | 14 |
| 3 | 2 | 3 | 41 | 56 | 13 | 15 |
| 4 | 24 | 68 | 38 | 44 | 13 | 13 |
| 5 | 2 | 32 | 44 | 44 | 11 | 12 |
| 6 | 3 | 3 | 7 | 27 | 15 | 16 |
| 7 | 1 | 23 | 8 | 44 | 3 | 7 |
| 8 | 2 | 25 | 18 | 57 | 4 | 7 |
| 9 | 2 | 25 | 27 | 44 | 1 | 11 |
| 10 | 3 | 33 | 44 | 47 | 1 | 13 |
| 11 | 2 | 11 | 8 | 27 | 3 | 14 |
| 12 | 2 | 2 | 7 | 18 | 4 | 11 |
| 13 | 1 | 2 | 8 | 51 | 3 | 11 |
| 14 | 1 | 3 | 13 | 35 | 1 | 7 |
| 15 | 29 | 32 | 7 | 27 | 4 | 10 |
| 16 | 3 | 29 | 13 | 40 | 4 | 13 |
Серым цветом выделены наиболее часто встречающиеся в Северо-Западном регионе России HLA-аллели (по данным ООО «Покровский банк стволовых клеток).
Как видно из этой таблицы, во всех CCR5 delta 32/delta 32 образцах выявлены наиболее распространённые на Северо-Западе России HLA-аллели (Таблица 2.).
| Локус | Наиболее часто встречаемый аллель | Частота, % | Средняя частота данного аллеля для европеоидной расы [25] | Диапазон частот [25] |
| HLA-A | *02 | 28.3 | 25.01 | 7.2-39.6 |
| *03 | 15.8 | 6.87 | 1.6-25.6 | |
| *01 | 13.6 | 14.07 | 5.3-28.1 | |
| HLA-B | *07 | 13.6 | 8.67 | 1.0-16.0 |
| *35 | 12.3 | 10.33 | 5.0-18.3 | |
| *44 | 8.8 | 11.19 | 4.6-21.7 | |
| HLA-DRB1 | *07 | 15.1 | 13.7 | 5.3-28.9 |
| *15 | 14.8 | 10.73 | 5.7-25.6 | |
| *13 | 13.7 | 11.11 | 4.5-26.2 |
По данным американских исследователей, регистр доноров стволовых клеток пуповинной крови, гомозиготных носителей полиморфизма CCR5 delta 32, состоящий из 300 образцов, позволит осуществить подбор образца для трансплантации, совместимого по системе HLA и с необходимой для трансплантации клеточностью не менее 2.5 х 107 ОЯК/кг массы тела, с вероятностью 73.6% для детей и 27.9% для взрослых европеоидной расы [26]. Кроме того, появились исследования, в которых было продемонстрировано, что для проведения успешных комбинированных ТГСК пуповинной крови и гаплоидентичных трансплантаций необходимая клеточность может составлять 1 х 107 ОЯК/кг массы тела [29, 30, 31]. В этом случае вероятность подбора соответствующего образца пуповинной крови для ТГСК будет равняться 85.6% для детей и 82.1% для взрослых пациентов европеоидной расы [26].
Подходящими кандидатами для проведения ТГСК пуповинной крови от доноров с CCR5 delta 32/delta 32 генотипом могли бы стать ВИЧ-инфицированные лица, которым показана ТГСК по поводу гематологической или другой сопутствующей патологии. Также ТГСК пуповинной крови с делеционными аллелями может быть показана пациентам со СПИД, резистентным к проводящейся антиретровирусной терапии.
Таким образом, дополнительно следует добавить, что для увеличения вероятности подбора пары донор-реципиент поиск донорского образца прежде всего стоит проводить в региональном регистре доноров всвязи с вариабельностью географического распространения HLA-аллелей. Об этом также свидетельствуют данные по распространённости HLA-аллелей среди образцов пуповинной крови, полученные в настоящем исследовании. Во всех CCR5 delta 32/delta 32 образцах встречаются наиболее распространённые на Северо-Западе России HLA-аллели (Таблица 1). Поэтому не возникает сомнений в необходимости создания собственного регионального общественного регистра доноров пуповинной крови, гомозиготных носителей CCR5 delta 32/delta 32 полиморфизма, для более эффективного поиска совместимых образцов пуповинной крови для проведения ТГСК ВИЧ-инфицированным пациентам. Обнаруженные в результате скрининга CCR5 delta 32/delta 32 образцы позволят в перспективе создать региональный общественный регистр доноров пуповинной крови для проведения ТГСК. Эти образцы при получении результатов клинических испытаний могли бы найти применение при лечении ВИЧ-инфекции в Российской Федерации и за рубежом.
Список литературы
А. Б. Смолянинов, Д. А. Иволгин, А.В. Чечеткин, Е.В. Жаров, И.А. Пирожков, А.С. Хрупина
Сегодня о стволовых клетках пуповинной крови говорят как о новом расцвете медицины и новых спасительных технологиях. И этот же термин используют, говоря о шарлатанах, которые делают деньги на болезнях и страданиях. И главная тема — ответ на вопрос: пуповинная кровь действительно золотая или золотая в кавычках, как золотой телец, приносящий золотые монеты? Как же в действительности обстоит дело? Давайте разбираться.
Миф 1.
Трансплантация стволовых клеток применяется с целью восстановления кроветворения после высокодозной химиотерапии при онкологических заболеваниях крови, при этом трансплантация собственных стволовых клеток может быть нецелесообразна при лейкозах, так как трансплантат уже может содержать клетки с мутациями, спровоцировавшими данное заболевание.
Реалии.
Помимо нейробластомы при лечении других солидных опухолей, приобретенной апластической анемии также целесообразно использовать собственные стволовые клетки.
Миф 2.
Количества стволовых клеток, которое содержит образец пуповинной крови, достаточно для трансплантации ребенку с массой тела не более 10 кг.
Реалии.
Каждый новый человек, приходящий в наш мир, как и каждая сохраненная при рождении пуповинная кровь, уникальны. Действительно, пуповинная кровь всегда разная, и по клеточному составу, и по количеству клеток. Проблема получения достаточного для трансплантации клеточного материала сегодня вполне решаема с помощью методов экспансии (наращивания количества стволовых клеток). Именно экспансия поможет снять проблему ограничения применения пуповинной крови как источника кроветворных стволовых клеток у взрослых. Сегодня в мире проводят 21 клиническое исследование, посвященное экспансии стволовых клеток пуповинной крови. От их результатов зависит, станет ли пуповинная кровь настоящей чашей Грааля для врачей. Приведем лишь один пример. В клеточном продукте из пуповинной крови NiCord количество лейкоцитов и кроветворных стволовых клеток удалось увеличить в 455 и 75 раз, соответственно. Уже пролечен 41 пациент, среди них есть взрослые.
Особо хотелось бы подчеркнуть, что для этнических меньшинств найти подходящего донора в Международном Регистре Доноров Костного Мозга совсем непросто. Наша страна многонациональна и межнациональные браки совсем не редкость. Вот здесь и выступает на первый план пуповинная кровь, которая приживается даже при неполной тканевой совместимости. Да и реакция трансплантат-против-хозяина (самое грозное осложнение трансплантации) развивается в 2-4 раза реже при пересадке именно пуповинной крови. Тот факт, что одногодичная выживаемость пациентов после трансплантации пуповинной крови от полностью совместимого брата или сестры в три раза выше, чем от полностью совместимого донора из Регистра, также иллюстрирует эффективность этого биоматериала.
Миф 3.
В популяции онкология системы крови редка. Вероятность того, что пуповинная кровь пригодится в будущем составляет сотые доли процентов…
Реалии.
Да, это так, однако ежегодно около 5 тыс. маленьких россиян требуется трансплантация кроветворных стволовых клеток. Много это или мало? Конечно, много.
Да, в онкогематологии востребована трансплантация костного мозга. Но главная проблема его применения — большие трудности в подборе совместимого донора. При отсутствии донора среди членов семьи встает вопрос о необходимости поиска неродственного донора. Где искать? В мире действует Международный Регистр Доноров Костного Мозга, насчитывающий более 20 миллионов человек.
Трансплантация костного мозга является высокотехнологичным и дорогостоящим методом клеточной терапии. Примерная стоимость на одного ребенка составляет несколько миллионов рублей. Только поиск и активация неродственного донора стоит около 15 тысяч евро. Поиск совместимого костного мозга, в среднем, составляет 4 месяца. А теперь представим, что кто-то из ваших близких тяжело заболел. Пока Вы ищете, ведете переговоры, решаете вопросы совместимости, может случиться непоправимое.
Миф 4.
Стволовые клетки пуповинной крови вызывают рак.
Реалии.
Ученые разделили стволовые клетки на две группы: эмбриональные и взрослые. В России, как и в большинстве других стран, клиническое использование эмбриональных клеток запрещено. Эмбриональные стволовые клетки строят зародыш на самых ранних этапах развития. Эти клетки склонны к неограниченному делению и, будучи введены в организм, способны давать начало злокачественным опухолям или тератомам. Лечение такими клетками — это как игра в русскую рулетку, ставка в которой — жизнь. Именно поэтому во многих странах отрицательно относятся к подобным исследованиям. В настоящее время Европейский суд по правам человека запретил патентовать методы лечения, которые связаны с использованием линий эмбриональных стволовых клеток человека. Решение Европейского суда обязательно для исполнения на территории 27 стран-членов Европейского Союза.
Миф 5.
Раннее пережатие пуповины для сбора пуповинной крови вредит здоровью новорожденного, необходимо дать пуповине отпульсировать.
Реалии.
Миф 6.
Пуповинная кровь применима лишь при нескольких редких заболеваниях крови.
Реалии.
В 2018 году минуло 30 лет со дня первой трансплантации пуповинной крови. За это время их количество приблизилось к 40 000, а число показаний к применению — к 100. Сегодня в более чем 50 государственных банках хранятся более 500 тысяч, а в 134 частных — более 1 млн. единиц пуповинной крови. По данным европейской статистики после 1998 года каждая пятая трансплантация пациентам моложе 20 лет проводится с помощью клеток пуповинной крови. В Японии на пуповинную кровь приходится 50% всех трансплантаций в онкогематологии. В России 18 федеральных гематологических центров трансплантируют клетки пуповинной крови.
Так стоит ли сохранять пуповинную кровь новорожденного?
Эта возможность дается всего один раз — во время родов. Будущие родители должны максимально ответственно отнестись к решению, которое они принимают за своего малыша и для него. Сохранение пуповинной крови — биостраховка, подобная автомобильной страховке КАСКО, необязательной, но так прибавляющей спокойствия. Так и будущие мамы и папы платят за гарантию здорового будущего своих детей. Платят и от души надеются, что эти клетки им никогда не понадобятся.
Читайте также: