Секвенирование днк при диагностики туберкулеза

Обновлено: 28.03.2024

Туберкулёз (от лат. tuberculum — бугорок) – распространённое, социально зависимое заболевание человека. Болеют им и животные. Возбудитель туберкулёза открыт Р. Кохом в 1882 г. Это кислотоустойчивые аэробные бактерии (74 вида) рода Мycobacterium, широко распространённые в почве, воде и у животных. У человека чаще всего возбудителем является Mycobacterium tuberculosis. Второй по частоте является Mycobacterium bovis. Оба вида очень устойчивы ко многим факторам внешней среды, а в организме очень долго остаются жизнеспособными и могут вызвать заболевание через многие годы после заражения. Очень важно, что микобактерии туберкулёза могут образовывать так называемые L-формы. Сохраняясь в организме, они создают противотуберкулёзный иммунитет.

Длительное время туберкулёз может протекать скрыто и обнаруживаться случайно, хотя нередко уже проявляются такие симптомы, как слабость, быстрая утомляемость, субфебрильная температура, ночная потливость, а в крови – анемия и лейкопения. В настоящее время, несмотря на все достижения антимикробной терапии, туберкулёз угрожает будущему нации. Поэтому все методы диагностики, особенно его латентных форм являются крайне важными.

Существует много методов лабораторной диагностики туберкулёза: микроскопия мазка (чаще всего для этого используют мокроту), классический культуральный метод, ИФА. Всем им присущи достоинства, но и определённые недостатки, в частности, обнаружение микобактерий только в случае их достаточного количества.

В последние годы для диагностики используют полимеразную цепную реакцию (ПЦР). Её высокая чувствительность позволяет обнаружить в исследуемом материале единичные клетки и даже их фрагменты ДНК. Метод исключает перекрёстные реакции и специфичность достигает 100%. ПЦР позволяет дифференцировать ограниченные и диссеминированные формы туберкулёза, особенно у детей даже при отрицательных результатах микробиологических исследований.

  • определяемый фрагмент - специфичные участки ДНК микобактерий;
  • специфичность определения - 100%;
  • чувствительность определения- 100 копий ДНК микобактерий в образце.

Специальной подготовки к исследованию не требуется.С общими рекомендациями для подготовки к исследованиям можно ознакомиться здесь >>

  • Лихорадка, характеризующаяся ежедневным двойным повышением и понижением температуры тела. На фоне туберкулиновой гиперчувствительности или туберкулиновой анергии.
  • Острые воспалительные заболевания верхних и нижних дыхательных путей с длительным контактом с туберкулёзным больным в анамнезе.
  • Ненормальная реакция на туберкулиновую пробу (гиперчувствительность или анергия) на фоне обострения какого-либо системного заболевания.
  • Подозрение на системную волчанку.

Интерпретация результатов исследований содержит информацию для лечащего врача и не является диагнозом. Информацию из этого раздела нельзя использовать для самодиагностики и самолечения. Точный диагноз ставит врач, используя как результаты данного обследования, так и нужную информацию из других источников: анамнеза, результатов других обследований и т.д.


Обзор

Автор
Редакторы


Спонсором приза зрительских симпатий выступил медико-генетический центр Genotek.

Тем не менее диагностика — это еще не диагноз, и результат любого теста не является истиной в последней инстанции. Диагноз же по-прежнему ставят, исходя из нескольких составляющих:

  • клинической картины;
  • наличия контакта с туберкулезным больным;
  • рентгенографии легких, флюорографии или компьютерной томографии;
  • результатов диагностических тестов.

Однако большинство этих методов диагностируют туберкулез постфактум — только скрининговые тесты помогают выделить лиц с высоким риском развития заболевания или с только зарождающимся процессом. И уже более 100 лет основным методом массовой диагностики туберкулеза является туберкулиновая проба Манту 2 ТЕ (содержащая 2 туберкулиновые единицы). Тест спорный, со множеством ложноположительных результатов, но именно его используют во всем мире и отказываться пока не собираются.

Проба Манту

В мире используют 3 вида туберкулина (рис. 1): датский препарат PPD (purified protein derivative) RT 23, американский PPD-S и российский — PPD-L. Различаются они видами микобактерий, из которых были получены: при производстве датского и американского препаратов используют только M. tuberculosis, а при производстве российского — смесь из M. tuberculosis и M. bovis (микобактерии, вызывающей туберкулез у крупного рогатого скота; на основе этого штамма была разработана вакцина БЦЖ). Различие в составах туберкулина обусловливает разные границы положительного результата: 15 мм для детей, привитых БЦЖ, и не более 10 мм для непривитых детей до 5 лет у датского препарата, не более 10 мм у американского и 5 мм у российского [4].

Препараты туберкулина

Рисунок 1. Препараты туберкулина

Диагностику с помощью пробы Манту проводят следующим образом: небольшое количество туберкулина вводят под кожу чуть выше запястья и через 72 часа оценивают реакцию, которую считают положительной, если в месте введения появляется припухлость (папула) более 5 мм в диаметре. В зависимости от ее размера, различают степень реакции от отрицательной (0–1 мм) до резковыраженной, или гиперергической (17 мм и более у детей и подростков, 21 мм и более у взрослых) [5]. И тут начинаются трудности, потому что у привитых БЦЖ реакция Манту положительна [6]! Мало того, чем больше поствакцинальный рубец, тем выше чувствительность к туберкулину [7]. Поэтому у привитых БЦЖ оценивают не только диаметр папулы, но и размер поствакцинального рубчика (табл. 1).

Таблица 1. Соотношение размера папулы и рубчика после прививки БЦЖ. [8]
Срок, прошедший с момента вакцинации БЦЖРазмер рубчика после БЦЖПривитый иммунитет (мм)Неясная причинаПодозрение на инфицирование
1 год 6–10 мм 5–15 мм 16 мм Более 17 мм
2–5 мм 5–11 мм 12–15 мм Более 16 мм
0 мм 2–4 мм 5–11 мм Более 12 мм
2 года Вне зависимости от размера Уменьшение размера папулы или прежний ее размер Увеличение размера на 2–5 мм от предыдущего положительного результата Реакция изменяется на положительную или папула увеличивается более чем на 5 мм
3–5 лет Вне зависимости от размера 5–8 мм либо уменьшение размера папулы Увеличение размера на 2–5 мм за последний год или отсутствие тенденции к уменьшению Изменение на положительную (5 мм) реакцию или увеличение папулы на 6 мм;
12 мм при впервые поставленной пробе; изменение предыдущего размера на 2–4 мм или размер в 12 мм
6–7 лет Вне зависимости от размера 0–4 мм 5 мм 6 мм и более
7–9 лет Если в 7 лет ребенку была сделана ревакцинация БЦЖ, реакция Манту вновь становится положительной и нормы повторяются 0–4 мм 5 мм 6 мм и более
Взрослые Отрицательная реакция, покраснение любого диаметра; папула до 4 мм Более 5 мм

Безусловно, метод оценки результата довольно субъективный. Но главное, папулу надо еще правильно измерить, зафиксировав только размер выпуклой части и игнорируя покраснение вокруг нее (рис. 2).

Правильная и неправильная оценки диаметра папулы

Рисунок 2. Правильная и неправильная оценки диаметра папулы

Еще одна трудность с диагностическими возможностями пробы Манту связана с тем, что они зависят от нижней границы положительного результата: чем ниже граница, тем больше будет наблюдаться ложноположительных реакций. К примеру, в России пороговым значением является папула в 5 мм. Это приводит к гипердиагностике — большому количеству зафиксированных реакций, но в итоге к низкому проценту реально выявленных случаев инфицирования [4].

В общем, не удивительно, что в последнее время информативность туберкулиновой пробы постоянно ставится под сомнение. Мало того, она может вызывать не связанные с туберкулезом аллергические реакции, поэтому все больше здоровых, но склонных к аллергии детей вынуждены идти в тубдиспансер в надежде выяснить причину положительной реакции. И наконец, на результат пробы может влиять множество факторов: недавно перенесенные инфекции, хронические заболевания, прием медикаментов, изменение гормонального фона или иммунитет к нетуберкулезным микобактериям [7].

Если говорить о достоинствах пробы Манту, то кроме низкой себестоимости, ими будут возможность выявления туберкулеза на ранних стадиях развития (за исключением лиц с иммуносупрессией и маленьких детей до двух лет [7]) и более высокая диагностическая ценность у непривитых БЦЖ по сравнению с привитыми (от 50% и ниже против 65,4% [6], [9]).

Мифы о пробе Манту

Антигены ESAT-6 и CFP-10

Рисунок 3. Антигены ESAT-6 и CFP-10

Что нужно знать о кожных пробах?

Анализы крови на туберкулез: плюсы и минусы

  • в ранние сроки инфицирования;
  • при иммунодефицитных состояниях;
  • при неправильном заборе крови или ее транспортировке;
  • из-за ошибок во время расшифровки результатов.

Добавлю, что тесты IGRA требуют наличия качественного оборудования, специальных реактивов и квалифицированного персонала, поэтому себестоимость у них довольно высока.

Кроме того, по сравнению с кожными тестами существенным недостатком этих анализов является определение in vitro только образования гамма-интерферона или активности Т-клеток. Поэтому в странах с высокой заболеваемостью (а Россия, несомненно, в их числе с показателем более 50 больных на 100 000 населения [13]) у IGRA-анализов нет никаких дополнительных преимуществ [12]. Тем более что их способность диагностировать туберкулезный процесс колеблется в районе 42–90% для разных возрастных групп, к тому же они не маркируют латентное носительство [12]. Другими словами, для жителей нашей страны анализы крови на туберкулез в общем-то напрасная трата денег, хотя в странах с низкой заболеваемостью (США, Канада, Западная Европа) они более информативны и рекомендованы к замене туберкулиновых проб для привитых БЦЖ [14].

В мире живет более полумиллиарда латентных носителей M. tuberculosis. Причем, далеко не каждый из них в итоге заболевает, потому что размножение микобактерии сдерживает иммунная система. Например, из 100 инфицированных палочкой Коха детей, лишь у одного развивается активная форма туберкулеза, поэтому диагностические тесты направлены не только на выявление латентных носителей, но и на оценку риска развития заболевания [15].

Анализы крови vs кожные тесты: сравнение эффективности

При оценке эффективности тестов для диагностики туберкулеза чаще всего учитывают два параметра: чувствительность (sensitivity) и специфичность (specificity). Под чувствительностью понимают способность метода выявлять лиц с заболеванием или носителей с высоким риском развития туберкулеза. Под специфичностью — способность теста правильно идентифицировать людей, у которых нет туберкулеза (то есть этот параметр характеризует риск появления ошибочных ложноположительных результатов) [12].

Какой тест все-таки выбрать?

Как говорится, при всем богатстве выбора альтернатив немного. К сожалению, при выборе теста многие руководствуются не его диагностическими характеристиками, а безвредностью для здоровья, потому что фенол в составе кожных проб пугает многих. И существует даже движение против пробы Манту, группа поддержки которого периодически предлагает заменить ее анализами крови IGRA. Но, как было отмечено выше, у подобных страхов нет никаких оснований. В придачу, являясь продуктом жизнедеятельности организма, фенол не накапливается, а выводится вместе с мочой. Поэтому главными критериями все-таки являются чувствительность и специфичность тестов.

К прямым методам обнаружения микобактерий туберкулеза можно отнести и бурно развивающиеся в последние годы подходы, сущность которых состоит в выявлении в исследуемых образцах диагностического материала специфических фрагментов цепи ДНК возбудителя. Среди применяемых для этого молекулярно-биологических методик наиболее широкое распространение получил метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), в основе которого лежит многократное увеличение числа копий специфического участка ДНК (так называемая направленная амплификация ДНК): 20 циклов ПЦР приводят к увеличению исходной ДНК в 1 миллион раз, что позволяет визуализировать результаты методом электрофореза в агарозном геле. Очень высокий уровень чувствительности (95 % и более), являющийся главным достоинством метода, достигается за счет того, что в результате многократного копирования уровень специфической олигонуклеотидной последовательности в редакционной пробе возрастает в 106 раз. По своей чувствительности метод ПЦР при туберкулезе органов дыхания в два раза превосходит эффективность культуральной диагностики.

Метод особенно актуален для туберкулеза, поскольку эффективен в отношении возбудителей с высокой антигенной изменчивостью, определение которых требует длительного культивирования или сложных питательных сред.

ПЦР-диагностика туберкулеза, как правило, строится на использовании последовательностей ДНК специфичных для всех 4 видов группы туберкулеза. Часто для этих целей используют праймеры для выявления последовательностей IS-элементов, например, IS-986 или IS-6110, поскольку данные мигрирующие элементы характерны только для видов микобактерий группы туберкулеза и присутствуют в геноме микобактерий в числе нескольких копий. Выделение ДНК из чистых культур и клинических образцов (мокроты больных) возможно осуществлять любым приемлемым методом, например, методом Boom с использованием лизирующего буфера на основе гуанидина, тиоционата и двуокиси кремния в качестве носителя ДНК.

Проведение ПЦР-диагностики туберкулеза

В качестве примера праймеров [49] для идентификации микобактерий группы туберкулеза можно привести праймеры, фланкирующие фрагмент размером 245 пар нуклеотидов мигрирующего элемента IS-986, содержащегося в геноме M.tuberculosis в числе 2-8 копий.

Амплифицированный фрагмент выявляют электрофорезом в 1,6 % агарозном геле.

Данная пара праймеров была проверена на специфичность с использованием в качестве контроля 100 нг/проба ДНК близкородственных микроорганизмов; ДНК возбудителей легочных заболеваний; ДНК микроорганизмов, входящих в микрофлору человека (например, E.coli, S. aureus и др.); образцов ДНК человека.

Испытания данной пары праймеров с параллельным бактериоскопическим и культуральным обследоваванием были проведены на клинических образцах мокроты, полученных от больных с различными клиническими формами туберкулеза. Методом ПЦР возбудитель был выявлен у 90,6% больных туберкулезом, в то время как значительно более длительными по времени микробиологическими методами микобактерии были выявлены только у 39,6% больного.

Роль молекулярной диагностики в клинической практике повышается, поскольку увеличивается число больных со скудным бактериовыделением.

Однако применение метода ПЦР чревато получением большого количества ложноположительных результатов, обусловленных как техническими погрешностями, так и особенностями самого метода. Кроме того, метод не позволяет определять степень жизнеспособности выявляемых микобактерий.

Основным недостатком ПЦР является опасность лабораторной контаминации микобактериальной ДНК. Поэтому в настоящее время разработаны достаточно жесткие сертификационные требования для ПЦР-лабораторий, предусматриваюшие наличие трех изолированных помещений. ПЦР - это сложная современная технология, использование которой требует помимо соответствующей аппаратуры наличия высококвалифицированного персонала.

Таким образом, при постановке диагноза результаты ПЦР являются дополнительными и должны сопоставляться с данными клинического обследования, рентгенографии, микроскопии мазка, посева и даже ответа на специфическое лечение.

24 марта 1882 года немецкий микробиолог Роберт Кох объявил об открытии возбудителя туберкулеза. В 2022 году с открытия палочки Коха прошло 140 лет, а 24 марта отмечается Всемирный день борьбы с туберкулёзом.

- Туберкулез пока не побежден, несмотря на то, что возбудитель заболевания открыли 140 лет назад. В разные годы смертность росла и падала, но болезнь все еще остается мировой проблемой. Как сегодня вы оцениваете эпидемиологическую ситуацию с туберкулезом?

- Открытие возбудителя туберкулеза стало большим прорывом в науке и медицинской практике.

С того момента прошло много времени. Был и период, когда мы действительно думали, что победим туберкулез – были открыты стрептомицин и рифампицин, которые стали достаточно эффективными препаратами для лечения туберкулеза. Но и микробактерия туберкулеза со временем изменилась: сегодня растет доля лекарственно-устойчивого заболевания. В клинической практике увеличивается число случаев, когда мы выявляем пациентов с туберкулезом, возбудитель которого устойчив ко всем известным противотуберкулезным препаратам. Это большая проблема и одна из причин, почему мы до сих пор не победили туберкулез.

Во времена Советского Союза в нашей стране была организована противотуберкулезная служба. Надо отметить, что врач-фтизиатр – это специальность, которая есть только на постсоветском пространстве. В зарубежных странах такой специальности нет, и пациентов с туберкулезом лечат пульмонологи. Я считаю, что фтизиатр — это специалист, который должен быть компетентным во всех проблемах, связанных с заболеваниями органов дыхания, так как широкий кругозор и глубокие знания патологии органов дыхания позволяют врачу построить дифференциально-диагностический ряд и своевременно поставить правильный диагноз.

В лечении туберкулеза применяется комплексный подход – сочетание этиотропного лечения (препараты, которые действуют непосредственно на возбудителя заболевания), патогенетической терапии (воздействие на различные звенья патогенеза туберкулеза) и хирургических методов лечения. Каждый пациент получает индивидуализированное лечение, с учетом лекарственной чувствительности возбудителя и лекарственной переносимости препаратов. Сегодня фтизиатрам мало знать, что у человека туберкулез – необходимы данные лекарственной чувствительности возбудителя, потому что без этого невозможно назначить адекватную терапию.

В настоящее время мы редко встречаем формы туберкулеза, которые описывали в начале ХХ века. Туберкулез изменился, изменилась и его диагностика. Например, если еще в 1980-х годах, выявляя в диагностическом материале кислотоустойчивые микроорганизмы, фтизиатры считали, что это равнозначно туберкулезу, то сейчас, обнаружив кислотоустойчивые микроорганизмы, грамотный врач должен выяснить, выявлены ли ДНК микобактерий туберкулезного комплекса. Если ДНК микобактерий туберкулезного комплекса не обнаружены, то не исключено, что у пациента нетуберкулезный микобактериоз.

В нашем институте успешно работает микробиологическая референс-лаборатория, в которой проводится весь спектр современных микробиологических исследований для диагностики туберкулеза и нетуберкулезного микобактериоза. Что очень важно, мы можем определить данные лекарственной чувствительности ко всем современным противотуберкулезным препаратам и контролировать эффективность лечения.

Да, мы не победили туберкулез за 140 лет. Изменился возбудитель заболевания, изменились люди. Но мы достигли огромного прогресса в диагностике, лечении и профилактике заболевания.

В нашей стране всегда работала тактика активного выявления туберкулеза – поиск больных в ходе обследований, проводимых независимо от наличия или отсутствия признаков заболевания туберкулёзом. Для этого проводят проверочные профилактические осмотры, флюорографию органов грудной клетки с определенной периодичностью, туберкулинодиагностику.

AH8A7691

- Наверное, в области выявления туберкулеза его можно сравнить с онкологическими заболеваниями, где важно обнаружить рак на ранних стадиях.

- Безусловно. При раннем выявлении заболевания прогноз лечения наиболее благоприятный. При своевременной диагностике туберкулеза чаще диагностируются ограниченные формы заболевания, и если при этом установлена лекарственная чувствительность возбудителя, то это существенно сокращает сроки лечения и увеличивает его эффективность.

Туберкулез – это излечимая болезнь. Но надо вовремя его выявить и правильно лечить. Важна также приверженность пациентов к лечению. Надо понимать, что лечение туберкулеза нелегкое, это может быть и 4, и 6 основных препаратов, к которым добавляются препараты для предотвращения побочных эффектов. Некоторые пациенты негативно воспринимают именно количество препаратов – их действительно много.

- Обычно туберкулез лечат в амбулаторных условиях или пациенты находятся в стационаре?

- В России сочетаются оба вида лечения. Если пациент не бактериовыделитель, то при определенных формах туберкулеза диспансеры могут проводить лечение в амбулаторных условиях.

- Как выглядит современная диагностика туберкулеза?

- Диагностика туберкулеза – это сложный процесс. Так, при выявлении изменений в легких – неважно, это очаговые, инфильтративные изменения или полости распада – врач выстраивает дифференциально-диагностический ряд. Ведь рентгенологическая картина может соответствовать нескольким заболеваниям. Конечно, компьютерные томографы высокого разрешения, которые сегодня установлены в больницах, это серьезная помощь для врачей, но однозначно сказать, основываясь только на данных рентгенологического исследования, что человек болеет именно туберкулезом, мы не можем. Диагноз должен быть подтвержден этиологически – путем выявления возбудителя, или морфологически – по результатам исследования операционного материала или материала бронхобиопсий. Только после таких исследований мы можем сказать, что действительно у человека туберкулезное воспаление.

В институте применяется трехэтапная диагностическая программа, включающая комплексное клинико-рентгенологическое, микробиологическое исследование, бронхоскопию с комплексом биопсий, в том числе и инновационных, диагностические операции.

AH8A7677

- С какого момента врачи начали не только опираться на снимки при постановке диагноза, но и проводить комплексные исследования?

- Наши учителя, которые заложили основы фтизиатрии, всегда стремились к тому, чтобы ставить диагноз, опираясь на совокупность всех данных. Но у них не было технической возможности.

Новые исследования появились вместе с технологическим прорывом. Большой прогресс – компьютерные томографы. Другой этап – виртуальная бронхоскопия. Следующий уровень – радиоизотопные методы, которые мы применяем и для диагностики, и для оценки эффективности лечения. Современная микробиологическая диагностика туберкулеза, расшифровка ДНК микобактерий туберкулеза, секвенирование – все это гармоничное развитие технологий, помогающих в диагностике туберкулеза. Однако мало получить результаты высокотехнологичных методов исследования, надо грамотно их интерпретировать, что позволяет поставить правильный диагноз.

- Туберкулез становится устойчивым к лекарствам. Какие работы ведутся, чтобы победить эту резистентность?

- Во фтизиатрию приходят новые, современные препараты. В том числе это препараты, которые раньше использовали для лечения других заболеваний, например, лепры, но они показали свою эффективность и при лечении туберкулеза. Некоторые антибиотики широкого спектра действия мы вообще перестали применять, так как к ним у возбудителя развилась тотальная лекарственная устойчивость.

Для борьбы с лекарственной устойчивостью необходимо синтезировать новые препараты, но это длительный процесс – от поиска новой молекулы до создания препарата и внедрения его в клиническую практику проходят годы.

- Какие альтернативы и дополнения к лекарственной терапии сегодня используются во фтизиатрии?

- Этиотропное лечение, то есть противотуберкулезная терапия, – это база, которая должна быть в обязательном порядке. Но бывают и крайне сложные случаи, когда мы определяем тотальную устойчивость возбудителя к противотуберкулезным препаратам. В таких ситуациях мы тоже научились подбирать схему лечения и применяем методы, которые повышают эффективность лечения.

В частности, мы применяем методы коллапсотерапии – искусственный пневмоперитонеум, искусственный пневматоракс. При применении таких методов лечения возникает коллапс легочной ткани, что уменьшает ее растяжение и создает благоприятные условия для заживления.

В последние годы мы применяем клапанную бронхоблокацию – врач-эндоскопист устанавливает при бронхоскопии клапан в бронх, дренирующий полость в легком, после чего полость спадается, и заживление проходит быстрее.

Подобные методы лечения – это индивидуальный подход к пациентам. Одного пациента можно успешно вылечить только препаратами, в другом случае дополнительно применяем клапанную бронхоблокацию и коллапсотерапию, отдельным пациентам требуется хирургическое вмешательство. Более того, есть пациенты с двусторонним деструктивным туберкулезом. В этих случаях проводят операцию на одном легком, а затем на другом.

Прорыв в хирургическом лечении заболеваний органов дыхания и в частности туберкулеза произошел, когда появилась возможность выполнять видеоторакоскопические операции. Мы отошли от больших кожных разрезов, которые делали еще в 90-х годах. Я застала этот период, когда начинала работать в хирургическом отделе института, например, для заднего доступа к легкому выполняли разрез длиной до 35 сантиметров. Сейчас выполняют видеоторакоскопические операции с небольшим разрезом. Дело не только в косметическом эффекте: при таком подходе минимизируется травма, и заживление проходит быстрее.

В настоящее время при хирургическом лечении деструктивного туберкулеза используется пломбировка силиконовым имплантом. Эта операция сопряжена с минимальной травматизацией и дает отличный лечебный эффект.

Сегодня пациенты могут вылечиться от туберкулеза, даже если заболевание поздно выявили или неэффективно лечили на ранних стадиях.

Чтобы победить туберкулез, Всемирная организация здравоохранения в 2015 году приняла стратегию End TB - ликвидация туберкулеза. Эта стратегия предполагала, что в течение каждого года заболеваемость туберкулезом в мире будет снижаться на 6-10%, а смертность – не менее чем на 10%. То есть к 2025 году заболеваемость туберкулезом должна снизиться на 35%, а смертность – на 50%.

- Это реально?

- Стратегию приняли в 2015 году, а в 2020 началась пандемия COVID-19. Во время локдауна доступ к медицинской помощи уменьшился, в результате и выявление туберкулеза в мире снизилось на 18%, а среди детей и подростков – на 24%. В России этот показатель составил 14%.

По данным ВОЗ, перспективные планы в борьбе с туберкулезом обратила вспять именно пандемия COVID-19. Мировые результаты по снижению заболеваемости и смертности от туберкулеза в 2020 году вернулись к результатам 2017 года. А по сравнению с 2019 годом в 2020 году смертность от туберкулеза в мире увеличилась на 100 000 человек. ВОЗ прогнозирует, что этот отсроченный эффект будет расти.

По показателям снижения заболеваемости и смертности от туберкулеза Россия идет опережающими темпами. В 2000 году заболеваемость туберкулезом была на уровне 90,4 на 100 000 населения, а в 2020 году - 32,4 на 100 000 населения, т.е. снижение заболеваемости практически в три раза. Смертность населения от туберкулеза в 2000 году составляла 20,6 на 100 000 населения, а в 2020 мы видим значительный прогресс – этот показатель составил 4,5 на 100 000 населения.

Как мы достигли таких результатов? Безусловно, этому способствовало положительное влияние государственной поддержки всех противотуберкулезных мероприятий, обеспечение противотуберкулезными препаратами и медицинским оборудованием. Кроме того, сама структура противотуберкулезной службы, ее способность работать как единый организм позволила достигать значимых результатов в борьбе с туберкулезом.

И именно противотуберкулезная служба оказалась наиболее готовой к пандемии COVID-19: для фтизиатра дистанцирование до полутора метров, изоляция заболевшего человека, использование средств индивидуальной защиты – само собой разумеющиеся профилактические меры.

Хочу сказать, что в 2021 году наш институт отметил 100-летие. Мы гордимся институтом и его историей, множество фтизиатрических достижений были получены именно в этих стенах. Это касается и хирургического лечения туберкулеза. Так, один из крупнейших советских хирургов, основоположник торакальной хирургии и выдающийся ученый – Лев Константинович Богуш – работал в нашем институте.

- Нарушения в маршрутизации пациентов, ограничение доступа к медицинской помощи во время пандемии могут в будущем вызвать взрывной рост запущенных случаев туберкулеза?

- Во время пандемии фтизиатрическая служба, в том числе в Москве, встала на борьбу с COVID-19, многие диспансеры в стране были перепрофилированы под лечение новой коронавирусной инфекции. Но фтизиатры смогли организовать работу так, чтобы не упустить профилактических мер, чтобы пациенты своевременно получали лечение. В 2021 году уровень охвата населения плановыми осмотрами повысился, и сегодня тот пробел, который появился в 2020 году, ликвидирован.

tuberkulez

В 2004 году по инициативе д.м.н., профессора Михаила Александровича Владимирского, заведующего сектором молекулярной диагностики туберкулёза НИИ Фтизиопульмонологии Первого МГМУ им. И.М.Сеченова, мы начали разработки в области ПЦР-диагностики туберкулёза.

Выделение ДНК: использование оригинальных реагентов и магнитных частиц обеспечивает получение максимального количества чистой ДНК и позволяет автоматизировать процесс выделения ДНК.

ПЦР в реальном времени: одновременная детекция нескольких различных участков генома комплекса микобактерий туберкулёза (МБТ) увеличивает информативность и достоверность анализа.

I этап – Пробоподготовка, инактивация


Amplitub-Prep

shema

II этап – Выделение ДНК

Набор реагентов для выделения ДНК (на магнитных частицах)

Набор реагентов для выделения ДНК микобактерий из клинических образцов и культур клеток на автоматизированных станциях TECAN

t8.jpg

  • Снижение риска контаминации во время выделения ДНК практически до нуля.
  • Значительное уменьшение трудоёмкости процесса выделения ДНК.
  • Стандартизированное выделение ДНК из клинических образцов.
  • Экономическая выгода: низкий расход пластика и реактивов.

Набор реагентов для ускоренной пробоподготовки и выделения ДНК микобактерий из образцов мокроты

III этап – ПЦР в реальном времени

Обнаружение и количественное определение комплекса МБТ

  • высокая достоверность анализа благодаря одновременному обнаружению двух специфичных генов M.tuberculosis complex: IS6110 и regX3;
  • оценка пригодности образца ДНК для определения антибиотикоустойчивости;
  • высокая чувствительность (не более 100 КОЕ/мл мокроты или 1–10 копий фрагментов ДНК в реакции) и 100%‑ая специфичность, подтверждённые на панели QCMD (Quality Control for Molecular Diagnostics) Mtb EQA (UK).


Определение антибиотикоустойчивости МБТ к препаратам I и II ряда

Наборы реагентов АМПЛИТУБ-МЛУ-РВ, АМПЛИТУБ-FQ-РВ — это:

  • диагностика форм туберкулеза с лекарственной устойчивостью, в том числе множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ) и широкой лекарственной устойчивостью (ШЛУ);
  • быстрая детекция мутаций M.tuberculosis, ассоциирующихся с устойчивостью к антибиотикам первого и второго ряда (рифампицину, изониазиду, этамбутолу, фторхинолонам);
  • достоверность результатов, ежегодно подтверждаемая при проведении Федеральной службой внешней оценки качества (ФСВОК) Росздравнадзора испытаний шифрованных тест-культур и образцов.

Наборы АМПЛИТУБ-МЛУ-РВ и АМПЛИТУБ-FQ-РВ основаны на использовании оригинальной мультиконкурентной аллель-специфичной методики ПЦР в реальном времени, позволяющей выявлять мутации в генах микобактерий туберкулеза, ответственных за устойчивость к конкретным антибиотикам.


Принцип мультиконкурентной аллель-специфичной методики ПЦР в реальном времени

  • В формате одной пробирки используются 5’-флуоресцентно-меченые аллель-специфичные праймеры с общим комплементарным им 3’-меченым олигонуклеотидом-гасителем и контрольный флуоресцентный зонд, комплементарный участку ДНК без мутаций.
  • При отсутствии мутаций в ДНК нарастание флуоресценции в ходе ПЦР-РВ наблюдается только по флуорофору зонда.
  • При наличии мутаций в ДНК нарастание флуоресценции в ходе ПЦР-РВ наблюдается как по флуорофору зонда, так и по флуорофору 5’-флуоресцентно-меченого аллель-специфичного праймера. Данный метод позволяет определить не только точку мутации, но и процент устойчивого мутантного штамма МБТ на фоне дикого.

Гены, кодоны, замены, используемые в наборах реагентов
АМПЛИТУБ-МЛУ-РВ при определении антибиотикоустойчивости

Использование автоматизированных станций Freedom EVO (TECAN, Швейцария) для молекулярно-генетической диагностики туберкулёза

tub-shema2.jpg

t13.jpg


Трудозатраты — 1 час
Продолжительность выделения ДНК — не более 2 часов
Подготовка к амплификации и ПЦР-РВ — 1,5 часа

ИТОГО: результаты анализа будут готовы через 3,5 часа
Оператор затратит 1 час своего рабочего времени.

t14.jpg

Читайте также: