Селективная добавка для выделения трихомонад

Обновлено: 27.03.2024

ФГУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва

ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Пастера, Санкт-Петербург

Сравнение пределов обнаружения микроскопии, культурального посева и методов амплификации нуклеиновых кислот, используемых в лабораторной практике для выявления Trichomonas vaginalis

Журнал: Клиническая дерматология и венерология. 2012;10(3): 16‑21

Гущин А.Е., Рыжих П.Г., Махлай Н.С. Сравнение пределов обнаружения микроскопии, культурального посева и методов амплификации нуклеиновых кислот, используемых в лабораторной практике для выявления Trichomonas vaginalis. Клиническая дерматология и венерология. 2012;10(3):16‑21.
Gushchin AE, Ryzhikh PG, Makhlaĭ NS. Comparison of detection limits of microscopy, culture, and nucleic acid amplification techniques using in the laboratory practice for the identification of Trichomonas vaginalis. Klinicheskaya Dermatologiya i Venerologiya. 2012;10(3):16‑21. (In Russ.).

Trichomonas vaginalis, простейшее, вызывающее урогенитальный трихомониаз, - одна из наиболее распространенных инфекций, передающихся половым путем. Классическими тестами, используемыми для обнаружения T. vaginalis, являются микроскопия и культуральный посев. Однако в последние годы все большую роль в диагностике инфекций играют методы амплификации нуклеиновых кислот, которые позволяют обнаружить возбудитель при минимальном его количестве. Представлены результаты интересной работы по установлению значения пределов обнаружения методов выявления T. vaginalis - микроскопии, культурального посева, полимеразной цепной реакции (ПЦР) и реакции транскрипционной амплификации (НАСБА), - используемых в лабораторной практике при диагностике мочеполового трихомониаза. Установлено, что среди методов выявления T. vaginalis наибольшей аналитической чувствительностью (наименьшим пределом обнаружения) обладают методы амплификации нуклеиновых кислот ПЦР и НАСБА на основе наборов реагентов Амплисенс, а наименьшей - микроскопические методы. Чувствительность культурального метода была выше, чем у метода микроскопии, но уступала методам амплификации ДНК и РНК.

ФГУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва

ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Пастера, Санкт-Петербург

Цель настоящего исследования — установить значения пределов обнаружения методов выявления T. vaginalis – микроскопии, культурального посева, ПЦР и НАСБА, используемых в лабораторной практике при диагностике мочеполового трихомониаза.

Материал и методы

В общем виде схема исследования аналогична использованной в нашей предыдущей работе (П.Г. Рыжих, 2011).

Исследования образцов с помощью микроскопии. Для микроскопического исследования отбирали аликвоты по 10 мкл и готовили: 1) три нативных препарата, которые исследовали в течение 2—3 мин с момента приготовления, подсчитывали среднее количество подвижных клеток в 10—100 полях зрения при увеличении 400 (×400); 2) три препарата, окрашенных по методу Романовского—Гимзы, которые исследовали в течение суток с момента приготовления, и подсчитывали среднее количество клеток трихомонад в 10—100 полях зрения (×1000).

При проведении культурального исследования по 100 мкл аликвот из разведений суспензии трихомонад переносили в пробирки с 900 мкл соответствующей питательной среды. Для каждого варианта питательных сред готовили и исследовали по три образца из каждого разведения. Пробирки с питательными средами после внесения посевного материала сразу помещали в термостат для инкубации при 37±1 oC. Учет результатов проводили через 2, 4 и 7 сут. Наличие или отсутствие роста трихомонад определяли при микроскопии нативного материала из придонного слоя питательной среды. Учет результатов проводился на основании наличия подвижных клеток T. vaginalis при просмотре 10—20 полей зрения.

Результаты

В нашем исследовании мы впервые провели количественную оценку пределов обнаружения лабораторных тестов, используемых для выявления T. vaginalis на основе серийно выпускаемых и используемых в Российской Федерации наборов реагентов.

Для этого были приготовлены суспензия клеток трихомонад c известной исходной концентрацией (1,45±0,24)×10 6 клеток/мл, и 10-кратные разведения, из которых отбирались аликвоты, объемом, соответствующим протоколу используемого метода. Пределом обнаружения считали минимальную концентрацию простейших, при которой они обнаруживаются при использовании определенного метода.


Результаты выявления T. vaginalis разными методами представлены в таблице.

Оценивая результаты двух методов микроскопии, следует отметить, что при высокой (более 10 6 клеток/мл) концентрации клеток T. vaginalis в исходном образце в обоих случаях было выявлено достаточное содержание клеток в каждом поле зрения микроскопа и для интерпретации результатов достаточно было проанализировать не более 10 полей зрения.

При микроскопическом исследовании аликвот из разведения с концентрацией 10 5 клеток/мл приходилось просматривать больше полей зрения, и не в каждом из них обнаруживались клетки трихомонад. В среднем при микроскопии нативного препарата обнаруживались 1—2 клетки в поле зрения, при микроскопии окрашенного препарата — 2—3 клетки в поле зрения. Разведение клеточной суспензии до 104 клеток/мл привело к тому, что при анализе 100 полей зрения было обнаружено всего несколько клеток простейшего при микроскопии нативного препарата. Согласно существующим рекомендациям, положительным результатом теста считается наличие хотя бы одного подвижного простейшего при микроскопии нативного препарата или хотя бы одного простейшего с типичной морфологией T. vaginalis при микроскопии окрашенного препарата в одном из 5 полей зрения [2]. В реальной лабораторной практике клетки трихомонад располагаются среди большого количества других клеток организма человека (зрелые эпителиальные клетки и их предшественники, лейкоциты, макрофаги, клетки сперматогенеза, дрожжеподобные грибы и др.) и бактериальной микрофлоры, присутствующих в биологическом материале. Это приводит к трудностям в выявлении единичных клеток простейших. Таким образом, установленным нами пределом обнаружения микроскопического метода в условиях чистой культуры T. vaginalis следует считать значение более 10 5 клеток/мл, а при исследовании биологического материала от пациентов эта величина может быть больше.

При проведении культурального исследования нами были получены следующие результаты: при высокой концентрации клеток простейших в разведении (более 10 5 клеток/мл) после 2 сут инкубации на исследованных питательных средах во всех полях зрения микроскопа было зафиксировано более 200 клеток трихомонад. Причем содержание неподвижных клеток составляло не более 3—4%, что соответствует экспоненциальной фазе роста микроорганизма. При уменьшении концентрации клеток простейших в разведении до 104 клеток/мл через 4 сут культивирования на коммерческих питательных средах были выявлены единичные подвижные клетки T. vaginalis не в каждом поле зрения микроскопа. При содержании простейших в исследуемом разведении 10 3 клеток/мл, зафиксировано не более 1 клетки не в каждом поле зрения микроскопа только для среды СВТ через 4 сут культивирования. Дальнейшая инкубация образцов не приводила к увеличению содержания клеток, и через 7 сут культивирования в этих пробирках со средой СВТ были выявлены только неподвижные клетки трихомонад. На средах НПО Диагност-Мед и Himedia при данной посевной дозе через 96 ч культивирования выявлялись только единичные неподвижные клетки трихомонад.

При культивировании на питательной среде СВТ+L-41, даже если концентрация клеток простейших в разведении составляла 102 клеток/мл, в каждом поле зрения микроскопа насчитывалось более 200 особей. Разница была лишь в том, что указанный количественный уровень достигался за разное время культивирования — от 2 до 7 сут. Минимальная концентрация простейших в разведении, при которой наблюдался рост на среде СВТ+L-41, составила всего 10 клеток/мл.

Таким образом, установленный нами предел обнаружения культурального метода с использованием серийно производимых сред составил более 10 3 клеток/мл, а при культивировании T. vaginalis в питательной среде СВТ в присутствии клеточной линии L-41 предел обнаружения составил более 10 клеток.

При исследовании с использованием наборов реагентов для проведения ПЦР и НАСБА в реальном времени получены самые низкие значения пределов обнаружения. Для ПЦР предел обнаружения соответствовал разведению 1,45 кл/мл. Однако при данном разведении ДНК T. vaginalis детектировалась в 1 из 3, а РНК T. vaginalis - в 2 из 3 тестирований. Воспроизводимое при 3-кратных тестированиях обнаружение ДНК и РНК T. vaginalis было получено для разведения с концентрацией трихомонад более 10 клеток/мл.

Первое исследование, в котором была установлена прямая зависимость между количеством T. vaginalis в образце и диагностической чувствительностью микроскопического метода, — работа A. Philip и соавт. [8]. Авторы разработали методику культивирования T. vaginalis на агаризированной культуральной среде с подсчетом колониеобразующих единиц в 1 мл (КОЕ/мл). Используя эту методику, авторы определили содержание простейших у обследованных пациентов и сравнили полученные результаты с клиническим статусом и долей положительных результатов, полученных с помощью микроскопии. Содержание возбудителя в биологическом материале варьировало от 40 до 10 6 КОЕ/мл. Возбудитель обнаруживался микроскопически, если его содержание в биологическом материале превышало 10 5 КОЕ/мл. У пациентов, имеющих значения, превышающие этот порог, инфекция протекала преимущественно с клиническими проявлениями, и, наоборот, среди бессимптомных лиц преобладали те, у кого концентрация возбудителя была ниже порога обнаружения микроскопическим методом. Таким образом, было показано, что бессимптомная трихомонадная инфекция чаще всего сопровождается низким уровнем возбудителя в организме и, следовательно, хуже диагностируется с помощью микроскопии. Учитывая то, что для формирования колонии необходима как минимум одна живая клетка простейшего, то полученное авторами значение предела обнаружения метода микроскопии соответствует значению, полученному в нашем исследовании.

Протоколы культивирования T. vaginalis, применяемые в рутинной лабораторной практике, основаны на использовании бесклеточных питательных сред, производимых как серийно, так и в бактериологических лабораториях. ДЧ культурального метода может значительно варьировать в зависимости от состава питательной среды и качества ее компонентов. Тем не менее полученные нами результаты не выявили разницы между средами разных производителей. Предел обнаружения при культивировании T. vaginalis в питательных средах был ниже, чем при микроскопии, что, как уже было отмечено, и обеспечивало более высокую ДЧ культурального метода. В нашем исследовании для видимого роста возбудителя в среде необходимо, чтобы его концентрация была не меньше 10 3 клеток/мл. Данная величина предела обнаружения соответствует экспериментально установленному значению, полученному ранее [9]. Установлено, что для инициирования детектируемого роста культуры T. vaginalis, необходимо, чтобы в ней присутствовало не менее 3×10 3 клеток/мл простейших. В той же работе, как и в ряде других [10, 11], было показано, что для культивирования T. vaginalis cо значительно меньшей начальной концентрацией простейших необходимо наличие эукариотической клеточной линии (McCoy), которая создает условия, более близкие к естественной среде обитания трихомонад. В этом случае для начала роста культуры достаточно всего 2—3 клеток T. vaginalis. В нашем исследовании мы также оценивали эффективность культурального выявления трихомонад в присутствии клеточной линии (L-41). В результате предел обнаружения снизился до

14,5 клеток/мл, что полностью согласуется с данными G. Garber и других авторов. К сожалению, несмотря на столь высокую чувствительность метода культивирования T. vaginalis на эукариотических клеточных линиях, его применение в клинической лабораторной практике весьма проблематично.

Среди методов диагностики трихомонадной инфекции самая высокая диагностическая чувствительность принадлежит МАНК, которая обеспечивается самым низким пределом обнаружения возбудителя, что в свою очередь определяется рядом условий при разработке амплификационных методик. В частности, для выявления ДНК T. vaginalis разными вариантами ПЦР большое значение имеет выбор генетической мишени. Ранее было показано, что доля выявленных с помощью ПЦР случаев трихомонадной инфекции в значительной степени зависела от выбора генетической мишени для амплификации и структуры праймеров [12]. Наибольшей чувствительностью обладали методики, в которых использовали праймеры к генетическим повторяющимся элементам T. vaginalis, насчитывающие несколько сотен копий на геном простейшего [13].

Вывод

В результате исследования установлено, что среди методов выявления T. vaginalis, используемых в лабораторной диагностике трихомониаза, наибольшей аналитической чувствительностью (наименьшим пределом обнаружения) обладают методы амплификации нуклеиновых кислот ПЦР и НАСБА на основе наборов реагентов Амплисенс, а наименьшей аналитической чувствительностью — микроскопические методы. Чувствительность культурального метода была выше, чем метода микроскопии, но уступала методам амплификации ДНК и РНК.

Trichomonas vaginalis вследствие метаболитных особенностей является труднокультивируемым простейшим [1], тем не менее, культуральный метод по-прежнему остается "золотым стандартом" диагностики трихомониаза и напрямую зависит от качества используемых питательных сред. В связи с этим встает вопрос о контроле ростовых свойств среды, что является основной ее характеристикой качества. В НИИЭМ имени Пастера для серийного производства была разработана диагностическая питательная среда СВТ (№ ФСР 2009/05982) [2]. Целью настоящей работы явилась отработка условий длительного хранения трихомонад для контроля качества выпускаемых сред.

В работе использовали 10 клинических штаммов Trichomonas vaginalis, полученных из лаборатории иммунологии ФГУН НИИЭМ им. Пастера (г. Санкт-Петербург, РФ). Все культуры имели типичную для Trichomonas vaginalis морфологию, были активно подвижны. Все штаммы были положительны в ПЦР-РТ, проведенной с помощью тест-системы производства ИнтерЛабСервис (№ ФС 01262006/5190-06). Для длительного хранения штаммов Trichomonas vaginalis культуру, сконцентрированную на питательной среде до концентрации 10 8 кл/мл, вносили (0,1 мл суспензии) в 0,9 мл свежей питательной среды СВТ с добавлением различных концентраций глицерина. После чего пробы сразу замораживали при температуре минус 70 °С. Восстановление культур осуществляли путем 10 минутного помещения пробирок в термостат при температуре 37 °С.

Известно, что Trichomonas vaginalis на питательной среде существует в грушевидной, овальной и амастиготоной формах. Все испытуемые штаммы на 1-2 сутки культивирования визуализировались преимущественно в виде грушевидной или округлой формах, все имели жгутики и совершали характерные толчкообразные движения. На третьи сутки наблюдалось максимальное накопление биомассы с наибольшим количеством грушевидных форм, а на 4-5 сутки культивирования трихомонады приобретали преимущественно малоподвижные и амастиготные формы с плохо различимым ядром и зернистой цитоплазмой. Однако при пересеве пятисуточной культуры на свежую питательную среду уже через 24 часа штамм восстанавливался и наблюдались только клетки с классической морфологией подвижностью. При ПЦР исследовании была выявлена ДНК Trichomonas vaginalis на всех сроках культивирования независимо от морфологических изменений на различных фазах жизненного цикла.

После хранения в условиях низкой температуры в течение месяца все культуры восстанавливались, сохраняли свою морфологию, подвижность и способность размножаться in vitro.

Таким образом, в результате работы была получена постоянная лабораторная коллекция из 10 культур Trichomonas vaginalis. Штаммы поддерживаются в питательной среде в концентрации 2 x 10 6 кл/мл.

Резюме. Лабораторная диагностика трихомониаза - обязательная составляющая при постановке диагноза урогенитальный трихомоноз. Обзор освещает диагностические методы, направленные на выявление простейшего, антигенов T.vaginalis, специфических антител и ДНК возбудителя. Отражены существующие проблемы в интерпретации результатов и сведения об эффективности применения того или иного метода в алгоритме обследования пациентов.

Ключевые слова: лабораторная диагностика, урогенитальный трихомониаз.

The laboratory diagnostic of genitourinary trichomoniasis (literature review)

Abstract. The laboratory diagnostics of trichomoniasis is strongly recommended for the diagnosis confirmation. Current review summarizes diagnostic methods directed to identification by morphology of protozoa, by antigenic properties of T.vaginalis, by specific antibodies and by the pathogen DNA detection. Overview reflects the existing problems in the interpretation of results and information about the efficacy of each method in the patient's examination algorithm.

Key words: laboratory diagnostics, urogenital trichomoniasis.

Трихомониаз в структуре ИППП

Одно из центральных мест в структуре заболеваемости инфекциями, передающимися половым путем, занимает трихомоноз. Он широко распространен в странах Африки, Южной и Юго-Восточной Азии, а также в странах с большим притоком эмигрантов. В последние годы продолжается положительная тенденция к снижению уровня заболеваемости трихомонозом, однако отмечается рост скрытых и малосимптомных форм инфекции, затрудняющих своевременную диагностику трихомониаза и лечение [7,11].

Особенно распространен трихомоноз среди женщин [33], однако вопрос о значении T.vaginalis в патологии беременности остается открытым из-за противоречивости информации по этому вопросу [23,26]. Клиническая картина урогенитального трихомоноза характеризуется отсутствием специфических признаков и примерно у 50 % инфицированных трихомонозом имеет место бессимптомный характер течения заболевания, т.е. возможно трихомонадоносительство [49]. Недовыявление трихомонад - причина неконтролируемого их распространения среди сексуально активного населения. В результате это приводит к развитию хронических орхоэпидидимитов и простатитов у мужчин, а также хронических аднекситов у женщин, что в итоге может служить причиной бесплодия, невынашивания беременности, патологии новорожденных [25,29].

Трихомоноз имеет важное медицинское, социальное и экономическое значение не только из-за высокой распространенности инфекции, но и из-за доказанной роли T.vaginalis как кофактора ВИЧ-инфекции и рака шейки матки [33].

Сравнительный анализ лабораторных методов диагностики трихомониаза

Диагностика урогенитального трихомониаза основывается на обнаружении в исследуемом материале T.vaginalis. Диагноз не может быть поставлен исключительно на основании клинической картины, поскольку патогномоничные симптомы встречаются только у 2 % пациенток. Ещё в 1980 году были представлены результаты, свидетельствующие о том, что если диагноз трихомоноза устанавливать только на основании клинической картины, то 88 % инфицированных T.vaginalis женщин будет дан ложноотрицательный результат, а у 29 % неинфицированных диагноз был бы поставлен ошибочно [27]. В связи с тем, что клинические симптомы зачастую не отражают реальной картины заболевания, в обязательном порядке необходимо применение лабораторных методов диагностики трихомониаза, причем актуальна задача своевременного проведения исследования.

До настоящего времени в соответствии с протоколом ведения больных урогенитальным трихомониазом [14] основными методами обнаружения трихомонад являются микроскопический и культуральный, т.е. прямая идентификация возбудителя в мазке либо при культивировании на питательной среде. Но сложилась парадоксальная ситуация: при высоком уровне заболеваемости трихомонозом в России отсутствует производственный выпуск стандартных, разрешенных к применению препаратов и питательных сред для диагностики трихомониаза. В практике используют зарубежные среды, что влияет на стоимость исследования, или приготовленные по прописям в лабораториях, что влияет на воспроизводимость и достоверность получаемых результатов.

Диагностика трихомониаза существенно осложнилась в последние годы в связи с распространенностью нетипичных округлых форм T.vaginalis, обнаруживаемых при световой микроскопии витальных препаратов [3].

Роль микроскопического метода при постановке диагноза

Исторически микроскопия - это первый метод в лабораторной диагностике трихомоноза. Его использование экономически целесообразно в силу простоты и возможности одновременного просмотра мазка и на другие возбудители. Микроскопия может производиться в нативном препарате или в препарате, окрашенном по различным методикам. Нативный препарат необходимо исследовать в течение 10 минут после забора материала, поскольку утрачивается подвижность возбудителя, клетка округляется и получение однозначного результата затрудняется [30]. В положительных случаях микроскопии нативного препарата трихомонады обнаруживаются в виде грушевидной, овальной или округлой формы по величине несколько превосходящей лейкоциты [5]. Для подвижных форм характерны толчкообразные движения за счет жгутиков и ундулирующей мембраны, которые особенно хорошо видны при исследовании в микроскопе с темнопольным конденсором. Необходимо отличать подвижность T.vaginalis от подвижных жгутиковых представителей семейства Bodonidae. Подвижные бактерии, прикрепленные к лейкоцитам и создающие ложное впечатление движения, также вероятно ошибочно идентифицировать как крупную трихомонаду.

Микроскопия окрашенных препаратов несколько повышает процент выявления трихомонад по сравнению с нативными препаратами в силу того, что учитываются не только типичные жгутиковые, но и амастиготные формы. Кроме того окрашенные препараты можно использовать для косвенной оценки воспалительного процесса - скопление лейкоцитов на клетках плоского эпителия или вокруг них. Еще один косвенный признак урогенитального трихомоноза - наличие большого количества слизи в исследуемом материале [6]. Правда, с увеличением количества лейкоцитов в отделяемом из уретры у мужчин больных урогенитальным трихомонозом, вероятность получения ложноположительных результатов культуральным и микроскопическим методами увеличивается [12].

В препаратах, окрашенных метиленовым синим, трихомонады наблюдаются в виде округлой или овальной формы, расположенные в слизи между клеточными элементами. Четко просматривается оболочка паразитов, эксцентрично расположенное ядро, интенсивно окрашенное в синий цвет, протоплазма - светло-синяя, вакуоли - бесцветные. При таком способе окраски трихомонады имеют характерный вид и хорошо распознаются [8]. Для более детального просмотра клетки и выявления хорошо идентифицируемых жгутиков следует использовать дифференциальные методы окраски по Романовскому-Гимзе, Лейшману.

В целом микроскопия нативного препарата считается высокоспецифичным тестом (99,8 %), но имеет низкую чувствительность - от 38 % до 82 %. [1,10 ,17,48]. Во многом это связано с высокой долей субъективизма при визуальной оценке результатов.

Питательные среды для культурального исследования

В связи с низкой чувствительностью микроскопического метода и в соответствии с протоколом ведения больных урогенитльным трихомониазом [14] идентификацию T.vaginalis следует проводить культуральным методом, считающимся, по мнению большинства исследователей, "золотым стандартом".

Первое in vitro культивирование T.vaginalis было проведено в 1915 г [36]. С тех пор разработаны разные варианты жидких и полужидких питательных сред для диагностики трихомониаза: среда Джонсона-Трасселя (СPLM), Даймонд среда, модифицированная Даймонд среда с добавлением тиогликолята натрия, среда Купферберг STS, среда Купферберг Difco, среда InPouch TV, среда TYM.

Известна попытка создания бессывороточной питательной среды для культивирования трихомонад [35]. Была предложена синтетическая питательная среда, в которой лошадиная сыворотка была заменена на бычий сывороточный альбумин и холестерин, совместно либо с глицериновыми жирными кислотами, либо со смесью жирных кислот. Однако на такой модифицированной среде скорость роста и урожай T.vaginalis были низкими.

В 70-80-х годах прошлого века в отделе микробиологии ЦНИИКВИ была разработана модифицированная среда Джонсона-Трасселя - среда СКДС [5]. В состав этой среды входят: смесь гидролизата казеина и гидролизина или аминопептида, отходы фармацевтической промышленности при изготовлении лизоцима, ферментативный гидролизат биомассы микроорганизмов, а также экстракт кормовых дрожжей. Коммерчески среда СКДС не выпускается.

В настоящее время отечественные производители выпускают следующие готовые питательные среды: питательная среда для выявления влагалищных трихомонад (ООО "Диагност-Мед", г. Омск), основа питательной среды для культивирования трихомонад (НПО "Микроген", г. Махачкала) и питательная среда СВТ для визуальной диагностики трихомониаза (НИИЭМ имени Пастера, г. Санкт-Петербург).

Исследования, посвященные сравнению питательных сред, немногочисленны. Так, в США в 1989 г. были проведены сравнительные испытания питательных сред, используемых для культивирования T.vaginalis. В качестве посевного материала они использовали клинические образцы вагинальных секретов от больных трихомонозом [43]. Частота обнаружения на разных питательных средах была следующей: Даймонд среда (93,9 %), модифицированная Даймонд среда с добавлением тиогликолята натрия (92,3 %), среда Купферберг STS (38,5 %) и среда Купферберг Difco (49,2 %). Были отмечены высокие ростовые свойства питательной среды Даймонд и положительный эффект добавления. Авторы, однако, указывают на низкую селективность исследованных питательных сред в отношении дрожжеподобных грибов (в 32 % случаев наблюдался рост дрожжеподобных грибов).

В Англии в 1997 г было проведено сравнительное исследование чувствительности питательных сред InPouch TV, Diamond и Джонсона-Трасселя [21]. В 4 мл каждой из трех сред добавляли по 30 мкл инокулюма. Результат оценивали на первые, вторые и четвертые сутки. Было показано, что наибольшей чувствительностью обладает питательная среда InPouch TV (87 %) по сравнению с Diamond (60 %) и Джонсона-Трасселя (57 %).

Культуральная диагностика трихомониаза напрямую зависит от выпускаемых питательных сред. В оптимальном алгоритме лабораторной диагностики обязательной ступенью должно быть культуральное исследование, причем с использованием качественных стандартизированных питательных сред [9]. Этот вывод подтверждается исследованиями, проведенными в 1990 г в ЦНИКВИ [2], которые показали, что подавляющее число больных трихомонозом (72,8 %), как среди женщин, так и среди мужчин, были выявлены при использовании культурального метода.

Методы, основанные на выявлении антигенов

Использование иммунохимических методов обнаружения антигенов возбудителя, таких как иммуноферментный анализ (ИФА) и реакция иммунофлуоресценции (РИФ), особенно актуально в случаях невозможности проведения культурального исследования или при расхождении результатов культурального и микроскопического методов.

Было показано, что чувствительность РИФ ниже, чем культурального исследования, но выше микроскопии нативного препарата [44]. Однако эта во многом субъективная методика к тому же требует отдельной обработки каждого мазка и люминесцентного микроскопа. Одновременная обработка всех проб в планшете и автоматическая детекция цветовых продуктов ферментативной реакции исправили некоторые основные недостатки РИФ.

В работах 80-х годов ИФА давал соизмеримый с культуральным методом процент положительных результатов. Однако авторы указывали, что из-за очевидной гетерогенности изолятов T.vaginalis при описываемых ими условиях ни один из них не имеет моноклональных антител, способных связываться с антигенами в клинических образцах [31,47]. Использование в качестве антигена отдельных иммуногенных белков для получения моноклональных антител несколько изменило сложившееся представление, и была продемонстрирована возможность обнаружения почти 90 % из протестированных клинических изолятов с положительным ответом.

Кроме того, явное преимущество этого метода перед методом "золотого стандарта" - это отсутствие строгих температурных требований. Авторы отмечают, что, возможно, важным звеном в получении достоверного результата служит процедура получения клинического материала, и важно использовать для образца буферный раствор, вследствие того, что помещение организма в фосфатно-солевой буферный раствор позволяет ему освобождать антигенную детерминанту, необходимую для связывания с антителом. Из этого следует, что ранее приписываемая гетерогенность T.vaginalis может быть обусловлена недоступностью антигенных детерминант для антитела, а не отсутствием антигена на поверхности трихомонады [34].

Стоит подчеркнуть, что в России отсутствуют коммерческие разрешенные к применению ИФА и РИФ тест-системы для диагностики трихомониаза.

Диагностическая ценность серологического метода

Изучением иммунологии трихомоноза занимаются уже долгое время [3]. В литературе мало информации о природе иммунного ответа при трихомонозе, неизвестно влияние макро и микроорганизмов на наличие или отсутствие симптомов. Однако понятно, что природа этого механизма неоднозначна и многообразна [20].

Большая часть противотрихомонадных антител принадлежит к IgG-классу [37]. Тем не менее, в сыворотках больных женщин выявляют повышенное содержание специфических IgM, и IgA антител, а при остром трихомонозе в вагинальных смывах отмечается увеличение IgA [28]. Для определения противотрихомонадных антител у пациентов в разные годы пытались использовать реакцию связывания комплимента (РСК) [18], внутрикожную пробу [8], реакцию пассивной гемагглютинации (РПГА) [32, 37, 38], реакцию непрямой иммунофлуоресценции (РНИФ) [13].

В 1981 году для серодиагностики трихомоноза впервые был использован метод иммуноферментного анализа (ИФА). При использовании в качестве "подложки" цельноклеточного антигена чувствительность составила всего 80,4 % [45]. Позднее были предприняты попытки использовать в качестве антигена цистеиновые протеиназы T.vaginalis, поскольку предполагается, что они вовлечены в патогенез. Специфичность в этом случае составила 100 %, однако чувствительность не превысила 90 % [20, 46].

В России подобных работ не проводилось, и, по мнению наших исследователей, чувствительность метода составляет чуть более 30 %, и его использование может быть рекомендовано только в качестве вспомогательного теста [16]. Низкая эффективность серологических методов в диагностике трихомониаза связана также с тем, что антитрихомонадные антитела могут циркулировать в сыворотке крови в течение длительного времени после лечения, а значит, практически невозможно дифференцировать текущую и пролеченную формы заболевания [19].

Методы, основанные на выявлении нуклеиновых кислот. Методы генодиагностики на основе определения специфических нуклеотидных последовательностей (мишеней) ДНК возбудителя появились сравнительно недавно. Уже в 1992 Riley D. E. впервые сообщил об использовании ПЦР в диагностике трихомоноза [41]. В работе было показано, что этот метод при использовании электрофоретического способа регистрации результатов помогает выявлять от 10 до 100 трихомонад в исследуемом материале.

Чувствительность и специфичность ПЦР во многом обусловлена правильным выбором мишеней для амплификации [42]. В наибольшей степени исследованные локусы в геномах простейших - это гены рибосомальных РНК, отличающиеся мультикопийностью (254 копии 18S рРНК/на клетку T.vaginalis) [22]. Наряду с геном 18S pРНК исследован ген бета-тубулина T.vaginalis. Использование праймеров из этого гена обеспечивало чувствительность равную 98 % в сравнении с культуральным методом системы InPouch [39]. Вместе с тем, оценивая эффективность праймеров, следует учитывать генетически обусловленную внутривидовую вариабельность Т.vaginalis. Сравнение пяти наборов диагностических праймеров показало, что чувствительность ПЦР, в первую очередь, зависит от выбора праймеров и, в меньшей степени, от способа регистрации результата: иммуноферментный метод детекции продуктов ПЦР показал лучший результат, чем электрофорез в геле [24].

Согласно современным представлениям, применение метода ПЦР оправдано при диагностике латентного течения трихомоноза, для выявления Т.vaginalis при микст-инфекции урогенитального тракта, при скрининговых исследованиях (в комплексе с микроскопическим методом), а также для контроля качества микроскопического исследования. В целом, эффективность диагностики существенно повышается при использовании ПЦР в сочетании с культуральным и/или микроскопическими методами исследования.

Заключение

Из-за отсутствия четкой клинической картины при хронических и стертых формах трихомоноза только лабораторные методы выявляют этиологический агент и устанавливают диагноз заболевания. В лабораторной диагностике острого трихомоноза при наличии в исследуемом материале типичных форм паразитов микробиологические методы дают однозначно интерпретируемые результаты, тогда как хронический трихомоноз, обусловленный неподвижными округлыми трихомонадами, представляет определенные трудности и требует использования комплекса лабораторных методов. Отметим, что, при очевидных преимуществах ПЦР, основным референс методом остается культуральное исследование.

Центральная больница нефтяников Минздрава Азербайджанской Республики, Баку, Азербайджанская Республика

Токсическое влияние секреторных продуктов Trichomonas vaginalis на человеческие сперматозоиды in vitro

Журнал: Проблемы репродукции. 2015;21(6): 125‑132

Нарушение репродуктивного здоровья мужчин является одной из актуальных проблем медицины во всем мире. К сожалению, несмотря на выдающиеся достижения репродуктивной медицины, частота мужского бесплодия не только не снижается, но и имеет тенденцию к росту. В России, например, прирост абсолютного числа пациентов с мужским бесплодием за 10 лет составил 67,7% [1]. Особенностью патоспермии в России является существенное преобладание среди этиологических факторов инфекционно-воспалительных и аутоиммунных процессов репродуктивной системы по сравнению со странами Европы и Северной Америки [2].

Наиболее часто при воспалительных заболеваниях как у мужчин, так и у женщин из бесплодных пар выявлялась в виде моноинфекции или микстинфекции Trichomonas vaginalis [3] (род Trichomonas, семейство Trichomonadidae, отряд Trichomonadida, класс Parabasalea, тип Polymastigota) [4, 5]. Что не является случайностью, учитывая широкую распространенность этого патогена. По данным ВОЗ, в мире урогенитальным трихомониазом ежегодно заболевают около 200 млн человек. Считается, что около 10% населения Земли инфицированы T. vaginalis [5]. Наиболее широко трихомониаз распространен в Африке, Южной и Юго-Восточной Азии и странах с активными миграционными процессами [6]. По данным официальной статистики, несмотря на некоторую тенденцию к снижению, уровень заболеваемости трихомониазом в России в XXI веке высок и колеблется около 200—250 случаев на 100 000 населения [4, 7]. Количество пациентов кожно-венерологических диспансеров с инфекцией, вызванной T. vaginalis, составляет около 60% [8]. Ненамного лучше ситуация и у наших ближайших соседей: в Республике Беларусь уровень заболеваемости трихомониазом чуть ниже 200 на 100 000 населения [9], в Республике Казахстан — около 100 на 100 000 населения [10].

Исследования показали, что урогенитальный трихомониаз достаточно часто (20—40%) ассоциируется с субфертильностью и инфертильностью у мужчин [5]. При обследовании мужчин с хроническим урогенитальным трихомониазом патоспермия наблюдалась в 62% случаев, чаще всего авторы отмечали нарушение подвижности и жизнеспособности сперматозоидов [11].

В большинстве случаев (93%) трихомонадная инфекция у бесплодных мужчин протекает малосимптомно или вообще бессимптомно [12], что в настоящее время стало характерной особенностью этой инфекции [8, 11].

Особая острота проблемы трихомонадной инфекции обусловлена высокой частотой встречаемости метронидазолустойчивости, которая составляет от 5 до 20% штаммов, резистентных к препаратам 5’-нитроимидазольного ряда. К 2010 г. было известно о более 120 метронидазолустойчивых штаммах T. vaginalis, выделенных в разных странах мира [9].

Кроме того, трихомонады способны активно воздействовать на разные звенья иммунной системы организма-хозяина, значительно снижая ее эффективность [13—16]. Определенные сложности в последнее десятилетие возникают и в связи с широким распространением метаболически малоактивной округлой формы патогена, лишенной органоидов движения [7], которая плохо поддается диагностике и лечению [4].

Известно, что продуцируемые микроорганизмами вещества могут напрямую повреждать сперматозоиды [17—19], хроническая трихомонадная инфекция не является исключением и может приводить к повреждению сперматозоидов на ультраструктурном уровне [20]. Необходимо отметить, что негативное влияние инфекции на мужскую фертильность может наблюдаться и после элиминации возбудителя из организма, что объясняется, вероятно, сохранением неспецифического воспалительного процесса [20].

Все это делает актуальным всестороннее изучение T. vaginalis и особенностей ее воздействия на репродуктивную систему человека в общем и, в частности, на сперматозоиды.

Экспериментальное исследование влияния продуктов секреции T. vaginalis на человеческие сперматозоиды стало целью нашей работы.

Материал и методы

Получение клинических изолятов Trichomonas vaginalis и продуктов их секреции

В качестве биологического материала для выделения T. vaginalis использовали сперму пациентов с диагнозом по МКБ-10 А59.0 (урогенитальный трихомониаз). Всем пациентам дополнительно проводили исследование эякулята по протоколу ВОЗ с тестом на гипоосмотическое набухание сперматозоидов (HOS-тест). Некоторые характеристики исследуемого биологического материала приведены в табл. 1.


Таблица 1. Характеристика биологического материала (сперма), использованного для получения клинических изолятов T. vaginalis

В работе использовали бессывороточную селективную питательную среду для культивирования T. vaginalis (СВТ) производства ОНТ НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Пастера. Состав СВТ (на 1 л готовой среды): NaCl — 5,0 г, K 2 HPO 4 — 2,0 г, KH 2 PO 4 — 1 г, мальтоза — 6,0 г, солянокислый цистеин — 1,2 г, аскорбиновая кислота — 0,24 г, плацентарный бульон — 100,0 мл, дрожжевой экстракт — 11,0 г, аминопептид — 25 мл, лизат клеточной линии L-41 — 24 мл, бензилпенициллин — 1 000 000 МЕ/л, стрептомицин — 2 г/л, линкомицин — 0,57 г/л, флуконазол — 0,066 г/л [21].

Продукты секреции T. vaginalis готовили для эксперимента по следующей схеме:

1. В log-фазе роста проводили сбор Trichomonas vaginalis с последующей однократной промывкой сбалансированным солевым раствором Хенкса (HBSS) (NaCl — 8,0 г/л, KCl — 0,4 г/л, СаСl 2 — 0,14 г/л, MgSO 4 ·7H 2 O — 0,1 г/л, MgCl 2 ·6H 2 O — 0,1 г/л, Na 2 HPO 4 ·2H 2 O — 0,06 г/л, KH 2 PO 4 — 0,06 г/л, D-глюкоза — 1,0 г/л, NaHCO 3 — 0,35 г/л [22].

2. Отмытые T. vaginalis ресуспендировали в 1,0 мл HBSS (до концентрации 1,0·10 7 /мл) и инкубировали 60 мин при 37 °C (для максимального накопления продуктов секреции патогена) [13, 15, 16].

3. После инкубации супернатант культуральной среды центрифугировали 10 мин при 10 000 g, а затем пропускали через фильтр (диаметр 0,22 мкм) [13].

Отфильтрованный раствор продуктов секреции патогена использовали для дальнейших экспериментов.

Подготовка сперматозоидов для оценки токсических эффектов продуктов секреции T. vaginalis


Таблица 2. Характеристика тестового материала

Сперматозоиды для эксперимента выделяли после полного разжижения эякулята центрифугированием в градиенте перколла. Все растворы перколла готовили на HBS + BSA буфере рН 8,0 (0,13 М NaCl, 0,004 М KCl, 0,001 М CaCl 2 , 0,0005 М MgCl 2 , 0,014 М фруктозы, 0,01 М N2-гидроксиэтилпиперазин-N'-2-этансульфоновой кислоты и 1 мг/мл бычьего сывороточного альбумина) [23].

Отмытые таким образом сперматозоиды разводили жидкостью Гиние до концентрации 2,0·10 6 /мл. Жидкость Гиние готовили на основе свежего раствора Тироде с фруктозой по следующей схеме [23]:

1. Готовили раствор Тироде I (NaCl — 20%, CaCl — 0,5%, KCl — 0,5%, MgCl 2 — 0,25%).

2. Готовили раствор Тироде II (NaHCO 3 — 0,5%, Na 3 PO 4 — 0,25%).

3. Смешивали 4 мл раствора Тироде I в 50 мл дистиллированной воды и 2 мл раствораТироде II в 50 мл дистиллированной воды.

4. В полученный раствор добавляли 1,5 г фруктозы в 33 мл дистиллированной воды.

Подготовленные сперматозоиды использовали для дальнейших экспериментов ex tempore.

Анализ подвижности сперматозоидов

Исследование двигательных характеристик сперматозоидов проводили по стандартной методике в соответствии с рекомендациями Руководства ВОЗ 4-го издания [24].

Тест на гипоосмотическое набухание сперматозоидов (HOS-тест)

Тест на гипоосмотическое набухание сперматозоидов и оценку его результатов проводили по стандартной методике в соответствии с рекомендациями Руководства ВОЗ 5-го издания [25].

Статистическая обработка полученных результатов

Для статистической обработки результатов эксперимента проводили расчет среднего значения и стандартного отклонения [26]. Дизайн эксперимента предусматривал получение сверхмалых выборок, поэтому для выявления статистически значимых различий полученных результатов использовали непараметрические методы анализа, а именно U-критерий Вилкоксона—Манна—Уитни [27], так как в нашем случае критерий знаков и T-критерий Вилкоксона—Манна—Уитни из-за методических ограничений не позволяли корректно оценить полученные данные [28].

Результаты

В первом опыте (опыт-1) к 100 мкл подготовленных сперматозоидов добавляли 100 мкл продуктов секреции округлой формы T. vaginalis. Во втором опыте (опыт-2) к 100 мкл подготовленных сперматозоидов добавляли 100 мкл продуктов секреции грушевидной (жгутиковой) формы T. vaginalis.

Параллельно опытам ставили три контроля. Чтобы исключить влияние компонентов сбалансированного солевого раствора Хенкса, в первом контроле (контроль-1) к 100 мкл подготовленных сперматозоидов добавляли 100 мкл HBSS. Для исключения влияния компонентов среды для выделения трихомонад во втором контроле (контроль-2) к 100 мкл подготовленных сперматозоидов добавляли 100 мкл стерильной среды СВТ. Для общего контроля (контроль-3) к 100 мкл подготовленных сперматозоидов добавляли 100 мкл 0,85% раствора хлорида натрия.

Все контрольные и опытные образцы параллельно инкубировали 120 мин в термостате при температуре 37 °C. Общий план проводимого эксперимента представлен в виде схемы (см. рисунок).


Схема экспериментального исследования токсического влияния продуктов секреции T. vaginalis на человеческие сперматозоиды.

После инкубации проводили исследование двигательных характеристик сперматозоидов в контрольных и опытных образцах (табл. 3).

Во всех контрольных группах и в первой опытной группе статистически значимых различий выявить не удалось. Вторая контрольная группа показала статистически значимые отличия как от всех контрольных групп, так и от первой опытной группы. Так, сперматозоидов с подвижностью категории, а и a+b во второй группе было в среднем в 3 раза меньше, чем в контролях и в первой опытной группе.

Скорость сперматозоидов в среднем была почти в 2 раза ниже во второй опытной группе по сравнению и с контрольными группами, и с первой опытной группой.

Для оценки влияния продуктов секреции клинических изолятов T. vaginalis на функциональное состояние мембран сперматозоидов мы использовали тест на гипоосмотическое набухание сперматозоидов (HOS-тест).

Полученные результаты (табл. 4) не выявили статистически значимых различий между контрольными группами. Результаты, полученные в эксперименте с первой опытной группой, статистически значимо отличались от результатов контрольных групп. Еще более выраженные отличия от контрольных групп наблюдались во второй экспериментальной группе (средние значения отличались более чем в 3,5 раза) (см. табл. 4).


Таблица 4. Влияние продуктов секреции клинических изолятов T. vaginalis на функциональное состояние мембран сперматозоидов

Исследования T. vaginalis и факторов ее вирулентности представляют весьма сложную задачу. Геном этого патогена кодирует около 60 000 белков, что почти в 2 раза больше, чем у человека. Кроме того, часть генома T. vaginalis приобретена в ходе эволюции у прокариот, много транспозонов, встроенных элементов вирусных геномов, что свидетельствует о межвидовом обмене, который связан, вероятно, со способностью патогена фагоцитировать сопутствующую микрофлору [5]. Трихомонады гетерогенны по набору патогенных свойств, в настоящее время известно 8 серотипов и около 120 разновидностей T. vaginalis, которые отличаются антигенными свойствами, культуральными характеристиками, вирулентностью, инвазивностью, способностью к адгезии [5]. Доказано, что T. vaginalis может существовать в разных формах: грушевидной (жгутиковой), амебовидной и округлой (шаровидной) [4]. Причем патогенными для человека являются все три формы [29].

При экспериментальных исследованиях, проведенных J. Roh и соавт. [15], были получены убедительные доказательства токсического влияния продуктов секреции T. vaginalis на мышиные сперматозоиды: по сравнению с контролем наблюдалось двукратное снижение общей подвижности сперматозоидов, почти трехкратное снижение количества активно подвижных сперматозоидов, почти двукратное ухудшение показателей HOS-теста.

Оказалось, что 100% клинических изолятов T. vaginalis, продукты секреции которых не вызывали значимого воздействия на двигательные характеристики сперматозоидов, были из экспериментальной группы-1 (округлые формы). Объяснение этому мы видим в различии метаболической активности грушевидных и округлых форм T. vaginalis. Округлые формы характеризуются снижением физиологической активности патогена [29] и не вырабатывают или, что более вероятно, вырабатывают относительно мало токсичных для сперматозоидов экскреторных продуктов, влияющих на подвижность. Поэтому статистически значимое снижение двигательных характеристик сперматозоидов мы наблюдали только в экспериментальной группе-2, содержавшей клинические изоляты T. vaginalis грушевидной формы, обладающей высокой метаболической активностью.

Для оценки функционального состояния мембран сперматозоидов мы использовали HOS-тест. Тест на гипоосмотическое набухание сперматозоидов успешно используется у разных видов млекопитающих и птиц (свиньи, слоны, обезьяны, крысы, эму [30], буйволы, бараны, жеребцы, собаки [31], быки [32]), причем со схожими значениями осмолярности, что свидетельствует об универсальности и информативности HOS-теста при оценке функционального состояния сперматозоидов [33, 34] и прогнозирования их жизнеспособности [35]. Клинические наблюдения показали высокую корреляцию результатов HOS-теста и ВРТ (искусственная инсеминация) [36], а также корреляцию результатов HOS-теста и прогноза развития привычного невынашивания беременности [37], что подтверждает значимость этого исследования при оценке фертильности сперматозоидов. Также HOS-тест показал высокую информативность при оценке фертильности сперматозоидов в экспериментальных условиях, моделирующих бактериальную контаминацию спермы [38] и различные токсические воздействия [39, 40].

Тест на гипоосмотическое набухание сперматозоидов оказался более чувствительным и в нашем экспериментальном исследовании. HOS-тест статистически значимо реагировал как на секреторные продукты округлых форм (менее выраженно), так и на секреторные продукты грушевидных форм (более выраженно) T. vaginalis.

Таким образом, можно считать установленным факт токсического воздействия продуктов секреции и грушевидных (жгутиковые), и округлых форм T. vaginalis.

Секреторные продукты метаболически более активных грушевидных форм T. vaginalis оказывали и более сильное (по сравнению с округлыми формами) повреждающее действие на человеческие сперматозоиды, что выражалось в статистически значимом снижении двигательных характеристик сперматозоидов и нарушении функционального состояния мембран сперматозоидов (неблагоприятные результаты HOS-теста).

Округлая форма, хотя появляется преимущественно при неблагоприятных условиях и характеризуется снижением физиологической активности патогена, но не является стадией покоя или дегенеративной формой [29]. Результаты наших экспериментов показали, что секреторные продукты округлых форм T. vaginalis способны оказывать неблагоприятное воздействие на сперматозоиды человека, но значительно менее выраженное, чем грушевидные формы.

В ряде случаев инфекции репродуктивной системы мужчин, обусловленной округлыми формами T. vaginalis, двигательные характеристики сперматозоидов в течение некоторого времени могут сохраняться на уровне нормальных величин. Но учитывая, что при адаптации патогена к изменению условий внешней среды разные формы T. vaginalis могут переходить друг в друга [9, 41], следует считать опасными в плане неблагоприятного воздействия на фертильность сперматозоидов любые формы патогена.

Для раннего выявления повреждающего действия секреторных продуктов как грушевидных, так и округлых форм T. vaginalis целесообразно использовать тест на гипоосмотическое набухание сперматозоидов, который показал более высокую чувствительность к токсичным продуктам патогена. На наш взгляд, в связи с высоким риском развития нарушения функционального состояния мембран сперматозоидов и для контроля над эффективностью проводимой терапии необходимо включать тест на гипоосмотическое набухание сперматозоидов (HOS-тест) наряду со стандартной спермограммой в план исследования фертильности сперматозоидов мужчин с трихомонадной инфекцией в анамнезе.

Конфликт интересов отсутствует.

Читайте также: