Селективная среда для выделения пневмококков

Обновлено: 27.03.2024

Инфекция вызванная пневмококком (Streptococcus pneumoniae): диагностика, лечение, профилактика

Streptococcus pneumoniae (пневмококк) — грамположительный кокк, который при росте на питательных средах образует ланцетовидные пары. Чувствителен к оптохину, подвержен лизису в присутствии солей жёлчи.

При росте на кровяном агаре штаммы пневмококка обычно обладают частичным гемолизом (а-гемолиз), в то же время гемолитическая активность различных штаммов может меняться. Инфекционные заболевания, вызванные пневмококком, — одна из самых распространённых причин смерти пациентов во всём мире. В группу риска входят дети, пожилые пациенты, а также лица с сопутствующими заболеваниями.

Патогенез пневмококковой инфекции (Streptococcus pneumoniae)

Пневмококки окружены полисахаридной капсулой, препятствующей фагоцитозу. Существует более девяноста различных капсульных серотипов возбудителя с различным уровнем патогенности и способностью к инвазии. Полисахарид, входящий в состав капсулы, обладает выраженными антигенными свойствами.

Антитела к капсульным полисахаридам у различных серотипов пневмококка — протективные, в то же время возможны перекрёстные иммунные реакции между различными серотипами. Компоненты клеточной стенки микроорганизма также способны вызывать выраженный воспалительный процесс.

Кроме того, пневмококки имеют несколько факторов адгезии, способствующих прикреплению возбудителя к полисахаридам поверхности клеток, что способствует колонизации организма.

пневмококковая инфекция

Колонизация пневмококковой инфекции (Streptococcus pneumoniae)

Единственный источник инфекции — человек; носительство обычно протекает бессимптомно. Распределение серотипов зависит от региона, возраста пациента и социальной группы. Наиболее подвержены острой пневмонии дети первого года жизни.

Факторы, предрасполагающие к развитию тяжёлой инфекции: недостаточность комплемента, агаммаглобулинемия, ВИЧ-инфекция, алкоголизм и спленэктомия (удаление селезёнки). Немаловажную роль в развитии инфекционного процесса играют пневмококковые токсины: пневмолизин, нейраминидаза, гиалуронидаза и адгезины (например, пневмококковый поверхностный белок типа А).

Бактерии способны прикрепляться к пневмоцитам и проникать в кровоток, связываясь с рецепторами фактора агрегации тромбоцитов и активируя выработку пневмолизина или комплемент-индуцированного повреждения альвеол.

Клинические признаки инфекции вызванной пневмококком (Streptococcus pneumoniae)

Чаще всего Streptococcus pneumoniae вызывает острые отиты, синуситы и пневмонию. В 50—70% случаев причиной возникновения внебольничной пневмонии становятся пневмококки, при этом у 25—30% пациентов развивается бактериемия.

Прямое или гематогенное распространение инфекции приводит к развитию менингита и реже к целлюлиту, абсцессам, перитониту и эндокардиту. Бактериемия — тяжелейшее осложнение пневмококковой инфекции с высокой летальностью даже при соответствующем лечении.

Пневмококк считают второй из наиболее распространённых причин развития внебольничного менингита у детей, вакци-низированных против Haemophilus influenzae типа В, и основной причиной менингита у пациентов старше сорока лет. При этом отмечают достаточно высокий уровень смертности и вероятности развития осложнений.

пневмококковая инфекция

Чувствительность пневмококка (Streptococcus pneumoniae) к антибиотикам

Ранее при лечении пневмококковых инфекций самым эффективным препаратом был пенициллин, но позднее благодаря генетической модификации пенициллинсвязывающего белка большинство штаммов приобрело к нему устойчивость. В настоящее время в клинической практике используют эритромицин, цефалоспорины, тетрациклин, рифампицин и хлорамфеникол, но всё чаще сталкиваются с мультирезистентными штаммами.

Препаратом выбора продолжает оставаться пенициллин, а при менингите, вызванном менее чувствительными штаммами, применяют цефотаксим или цефтриаксон. В случае высокой устойчивости к пенициллину дополнительно назначают гликопептидные препараты (ванкомицин).

Профилактика заболевания вызванной пневмококком (Streptococcus pneumoniae)

Для профилактики пневмококковой инфекции применяют поливалентную капсульную полисахаридную вакцину для профилактики пневмококковых инфекций, эффективную при назначении пациентам в зрелом возрасте и менее действенную у лиц со сниженным иммунитетом и детей младше двух лет.

Недавно созданная конъюгированная вакцина обладает достаточно высокой иммуностимулирующей способностью у детей младшего возраста.

Редактор: Искандер Милевски. Дата обновления публикации: 18.3.2021

- Вернуться в раздел "Микробиология"

Информация на сайте подлежит консультации лечащим врачом и не заменяет очной консультации с ним.
См. подробнее в пользовательском соглашении.

Медицинская микробиология:

Микробиологическая диагностика пневмококковой инфекции

Вид материала и ход бактериологического исследования на пневмококк зависят от формы заболевания.

При пневмонии и поражениях бронхиального дерева основным материалом является мокрота (утренняя порция); кроме того, исследуют смывы с бронхов, получаемые при бронхоскопии, гной из абсцесса легкого или плевральную жидкость, которые берут путем пункции.

При культуральном исследовании мокроты необходимо учитывать два обстоятельства.

Во-первых, мокрота негомогенна, состоит из слизистых комочков, и микроорганизмы распределены в ней неравномерно. Поэтому необходима предварительная гомогенизация мокроты — растирание в ступке с песком (в стерильных условиях) или обработка муколитиками — веществами, растворяющими слизь (например, 0,5% ацетилцистеином, хемотрипсином), либо в гомогенизаторе.

Во-вторых, порции мокроты из нижних отделов респираторного тракта при прохождении через верхние отделы обязательно инфицируются микроорганизмами ротоглотки, среди которых могут быть и носительские пневмококки. Однако количество последних в пробах невелико, а агент воспаления легких или бронхов присутствует в мокроте в больших количествах. Поэтому гомогенизированную мокроту разводят серийно, с шагом 10, в 10 6 -10 7 раз, после чего делают посевы из раз-ведений по 0,1 мл. Только при наличии роста в разведении мокроты в 10 6 и выше (а бронхиальных смывов — в 10 4 ) выделенный микроорганизм считается возбудителем заболевания.

При воспалении среднего уха отделяемое берут ватным тампоном, укрепленным на проволочном стержне.

При подозрении на менингит исследуют спинномозговую жидкость (СМЖ), взятую при помощи люмбальной пункции со строгим соблюдением правил асептики.

Пневмококк (Streptococcus pneumoniae)

Жидкость при плевритах, асцитах, артритах также берут путем пунктирования в асептических условиях.

Гной при фронтитах, синуситах, отитах можно взять стерильным ватным тампоном во время хирургической операции или при спонтанном истечении.

Кровь у лихорадящих больных при подозрении на пневмококковую бактериемию берут стерильно из вены и без предварительной микроскопии засевают в специальные жидкие или двухфазные среды для гемокультур. Посевы инкубируют в термостате и делают из них высевы для получения чистых культур.

Первый день исследования. После взятия и обработки материала (мокрота, СМЖ, гной, плевральная и другие жидкости) из него готовят препараты-мазки, окрашенные по Граму; если при микроскопии видны грамположительные инкапсулированные диплококки ланцетовидной формы, то можно выдать предварительный ответ. Независимо от результатов бактериоскопии проводится полное бактериологическое исследование, цель которого — выделение чистой культуры и ее идентификация.

Основной средой для выделения чистой культуры пневмококка является питательный агар с добавлением 5-10% крови барана, лошади, кролика, который помещают в чашки Петри. Для подавления посторонней микрофлоры при исследовании материала из открытых полостей (легких, бронхов, пазух носа, среднего уха) на поверхность среды накладывают диск с антибиотиком мономицином или гентамицином, к которым пневмококк практически нечувствителен. Вокруг диска рост нормальной флоры подавляется.

Плевральную и другие жидкости из серозных полостей, а также инкубированную в жидкой среде кровь, высевают на 5%-ный кровяной агар.

Наиболее надежными признаками для дифференциации пневмококка и сходных с ним бактерий является его чувствительность к оптохину и желчи. Подлежащую дифференциации культуру засевают на кровяной агар с 0,00025% оптохина и на бульон с 10% желчи и для контроля — на эти же среды без оптохина и желчи. Возможно использование коммерческих дисков, пропитанных оптохином, а также самостоятельно приготовленных дисков, пропитанных раствором 20% желчи. В последнем случае диск накладывается на рост 22-24-часовой культуры на кровяном агаре; лизис наступает через 3 ч.

В качестве дополнительных признаков, позволяющих отличить пневмококк от сходных с ним (по морфологии клеток и колоний, а также α-гемолизу) энтерококков, можно применить следующие тесты: рост при температуре +10°С и +45°С; рост после прогревания бульонной культуры при 60°С в течение 30 мин; рост в бульоне с 6,5% хлорида натрия. Все эти пробы отрицательны у пневмококка, но положительны для энтерококка.

Третий день исследования. Готовят и микроскопируют окрашенные по Граму мазки из выросших культур. Морфологически пневмококк выглядит в культуре иначе, чем в мазках нативного материала (мокрота, СМЖ и т.д.). Клетки теряют ланцетовидную форму и образуют небольшие скопления или цепочки, состоящие из пар; капсула незаметна.

Учитывают результаты определения чувствительности выделенных культур к оптохину и желчи, а также данные других проб (если эти пробы были поставлены).

Возможна выдача окончательного ответа (о наличии или отсутствии в материале пневмококка). У выделенной культуры пневмококка определяют ее принадлежность к определенному серотипу (серогруппе), ряд признаков патогенности, а также чувствительность к антибиотикам.

Для серотипирования используют иммунные кроличьи сыворотки к наиболее распространенным типам (или хотя бы серогруппам). Реакция агглютинации не всегда пригодна из-за склонности пневмококка к спонтанному склеиванию. В таких случаях применяют реакцию набухания капсул на стекле по Neufeld, учитываемую при микроскопии смеси живой культуры с иммунной сывороткой.

В этой реакции специфические антитела, адсорбирующиеся на клеточной капсуле, создают оптический эффект утолщения капсулы по сравнению с клетками, взвешенными в изотоническом растворе хлорида натрия (контроль). Чтобы прозрачные капсулы были лучше заметны, в смесь бактерий и сыворотки, а также в контрольную взвесь вносят каплю 1% раствора метиленового синего. Видовую принадлежность культуры к S.pneumoniae можно подтвердить при помощи так называемой Омни-сыворотки, полученной путем иммунизации кроликов культурами всех типов пневмококка, в реакции набухания капсул или в агглютинации.

Пневмококк (Streptococcus pneumoniae)

Хорошие результаты серогруппирования получены с использованием реакции коагглютинации с коммерческим реагентом или приготовленным самостоятельно из взвеси формалинизированного стафилококка и иммунных сывороток.

Для выявления вирулентности выделенного штамма ставят пробы на пневмолизин, гиалуронидазу, определяют летальные дозы для мышей.

Пневмолизин можно определить качественным методом путем посева культуры в чашку на питательный агар с 2% лошадиной крови и 10% нормальной сыворотки с последующей инкубацией в анаэростате. Через 22—24 ч вокруг колоний образуется зона β-гемолиза. Более рационален количественный метод. Используют 24-часовую культуру пневмококка на бульоне с 0,001%-ным раствором лецитина. Такая культура содержит уже аутолизированные клетки. Делают ряд двукратных серийных разведений культуры (в пробирках или в лунках микротитратора) и в каждое добавляют равный объем 0,5%-ной взвеси эритроцитов (человека, барана). Смесь инкубируют 1 ч в термостате, а затем сутки — в холодильнике. Наивысшее разведение, при котором наблюдается лизис эритроцитов, принимают за титр пневмолизина. Этот метод позволяет сравнивать пневмолитическую активность различных штаммов.

Гиалуронидазу определяют по методу Мак-Клина-Смирновой с использованием в качестве субстрата гомогената пупочных канатиков.

Вирулентность для белых мышей (14-16 г) устанавливают путем внутрибрюшинного введения разведений суточной агаровой культуры. Высоковирулентными считаются штаммы, ЛД50 которых не превышает 10 3 КОЕ, низковирулентными — штаммы, ЛД50 которых свыше 10 6 КОЕ.

Экспресс-методы микробиологической диагностики пневмококковой инфекции. В инфицированных пневмококком жидкостях организма, в частности, в моче, находятся растворенные специфические капсульные антигены. Для их выявления применяют реакции латекс-агглютинации или коагглютинации на стекле, иммуноферментный анализ, реакцию иммунофлюоресценции. В качестве источника антител в этих реакциях используется или Омни-сыворотка, содержащая антитела ко всем серотипам пневмококка, или сыворотка к видовому поверхностному антигену.

Серологическая диагностика. К концу первой недели острой пневмококковой инфекции (пневмонии, менингита, отита и т.д.) специфические антитела к капсульным полисахаридам появляются в слюне (IgA), а к 7-10-му дню — уже в крови (IgG). Антитела удается выявить в реакции непрямой иммунофлюоресценции с использованием серотиповых штаммов (или аутоштамма), иммуноферментного анализа с применением типовых капсульных полисахаридов. Серологические реакции с использованием видовых пневмококковых антигенов не разработаны.

При интерпретации результатов серологических реакций следует помнить, что в крови детей в возрасте до 6 мес. содержатся материнские антитела (IgG), и с этого срока до 2 лет дети слабо реагируют на капсульные антигены. Кроме того, у более старших детей и взрослых могут содержаться антитела к пневмококку как следствие предшествующих встреч с этим микроорганизмом. Указанные обстоятельства снижают ценность серодиагностики пневмококковой инфекции. В пользу этиологического значения пневмококка при острой пневмонии может говорить нарастание специфических антител в 4 раза и более.

Хранение и транспортировка выделенных культур пневмококка. Хранение культур S. pneumoniae затруднено из-за его склонности к аутолизу. Для хранения рекомендуют засевать культуру в пробирку со скошенным кровяным агаром, но не инкубировать в термостате, а хранить при 4-7°С в холодильнике. В таком состоянии возможна и транспортировка культур. Для регенерации культуры засеянную среду инкубируют при 37°С в течение 1 сут.

Медицинская микробиология:

Среды для выделения и изучения стафилококков

а) Желточно-солевой агар. Среда предназначена для выделения стафилококков и выявления пигмента.

Для приготовления используют мясопептонный агар (pH 7,3±0,1) с добавлением 10% натрия хлорида. После розлива во флаконы по 100,0-200,0 мл агар стерилизуют в автоклаве в течение 20 мин при температуре 121°С.

Перед употреблением среду расплавляют, охлаждают до 45-50°С и добавляют 20% (по объему) стерильной желточной взвеси (1 желток куриного яйца на 150,0-200,0 мл стерильного изотонического раствора натрия хлорида). Среду быстро перемешивают, разливают в чашки, которые продолжительное время могут оставаться в холодильнике в полиэтиленовых пакетах. Готовая среда полупрозрачна, имеет беловатый цвет с легким кремовым оттенком.

Учет результатов производят через 36-48 ч инкубации в термостате при 35-37°С. На этой среде хорошо выявляются пигментные свойства микроорганизма, обусловленные липохромным пигментом. Вокруг колоний можно видеть радужный венчик за счет образования лецитовителлазы. Добавление к среде 10% стерильного снятого молока усиливает пигментообразование.

б) Желточная среда по Г.Н.Чистовичу. Среда предназначена для определения лецитиназной активности стафилококков.

К мясопептонному питательному агару, приготовленному по общепринятой прописи, добавляют 20% желточной взвеси (1 желток куриного яйца на 150,0-200,0 мл стерильного изотонического раствора натрия хлорида).

При определении лецитиназной активности по методу Чистовича исследуемую культуру стафилококка засевают на среду отдельными штрихами или бляшками. Посевы помещают в термостат при 36-37°С. Вокруг колоний стафилококка, продуцирующих лецигиназу, образуются четко выраженные зоны помутнения с радужным венчиком по периферии.

в) Среда Casman E.R. в модификации Ф.С.Флуера для получения стафилококкового энтеротоксина.

Состав:
Ферментативный гидролизат казеина
Цитрат железа — 0,25 г
KH2PO4 - 1,0 г
К2HPO4*3H2O - 1,0 г
MgSO4*7H2O - 0,2 г
L-цистин — 0,025 г
L-триптофан — 0,075 г
Ацетат натрия — 7,0 г
Кальция пантетонат — 0,0005 г
Тиамин гидрохлорид — 0,00004 г
Никотиновая кислота — 0,0012 г
Дистиллированная вода — до 1000,0 мл

Навески ингредиентов (кроме четырех — см. ниже) вносят в колбу с ферментативным гидролизатом казеина; объем ферментативного гидролизата вносится из расчета конечного содержания аминного азота в среде — 2,0 г/л. Затем вносят L-триптофан, предварительно растворенный в 3 мл 1N раствора НО. Общий объем воды доводят до 1 л дистиллированной водой, тщательно перемешивают. Подогревают (при частом перемешивании) и кипятят 1 мин для полного растворения. Устанавливают pH среды 7,3. Стерилизуют автоклавированием при 121°С в течение 15 мин.

Кальций пантетонат, тиамин гидрохлорид и никотиновую кислоту стерилизуют отдельно через миллипоровские фильтры и добавляют асептически в среду перед посевом.

Подготовка раствора кальция пантегоната: берут навеску 500,0 мкг, растворяют в 10,0 мл дистиллированной воды, стерилизуют пропусканием через миллипоровский фильтр и 1,0 мл стерильного пангентоната кальция асептически перед посевом добавляют к 1,0 л питательной среды перед посевом.

Подготовка раствора тиамина гидрохлорида: берут навеску 40,0 мкг, растворяют в 10,0 мл дистиллированной воды, стерилизуют пропусканием через миллипоровский фильтр и 1,0 мл стерильного раствора тиамин гидрохлорида асептически добавляют к 1,0 л питательной среды перед посевом.

Подготовка раствора никотиновой кислоты: берут навеску 12,0 мкг никотиновой кислоты, растворяют в 10,0 мл дистиллированной воды, стерилизуют пропусканием через миллипоровский фильтр и 1,0 мл стерильной никотиновой кислоты асептически добавляют к 1,0 л питательной среды перед посевом.

г) Бульон для энтеротоксигенных стафилококков HiMedia, Casein Hydrolysate Broth. Бульон используют для культивирования стафилококков с целью получения энтеротоксина, используемого в пробе на котятах и в серологических исследованиях.

Состав, г/л:
Гидролизат казеина кислотный — 20,0
Железа цитрат — 0,025
Калия дигидроортофосфат — 2,0
Магния сульфат — 0,20
L-цистин — 0,025
Натрия ацетат — 7,0
L-триптофан — 0,075
Кальция пантотенат — 0,0005
Тиамин — 0,00004
Никотиновая кислота — 0,0012
pH 7,3±0,2

Навеску среды 29,33 г вносят в 1000,0 мл дистиллированной воды. Тщательно размешивают. Подогревают (при частом помешивании) и кипятят 1 мин для полного растворения. Устанавливают pH. Разливают в соответствующие емкости. Стерилизуют при 121°С в течение 15 мин.

Полученные фильтраты тестируют на присутствие α- и β-гемолизинов. В случае положительного результата токсин денатурируют прогреванием или нейтрализуют иммунной сывороткой. После денатурации фильтраты можно вводить котятам и наблюдать за появлением рвоты.

Этот бульон можно использовать для приготовления плотной среды, если добавить в его состав агар. Культуры, выращенные на таком агаре, можно применять и для заражения других животных, и для исследования в системе антиген-антитело методом диффузии.

Готовая среда янтарной окраски, прозрачна или опалесцирует.

д) Бульон для получения и очистки токсина синдрома токсического шока (ТСТШ).

Состав:
Бактопентон Difco — 6,0 г
Никотиновая кислота — 1,0 мг
Солянокислый тиамин — 5,0 мг

Бактопептон Difco растворяют в 100,0 мл дистиллированной воды, устанавливают pH6,5 и проводят стерилизацию в течение 15 мин при 121°С. Никотиновую кислоту и солянокислый тиамин добавляют асептически в среду перед посевом. Предварительно берут 10,0 мг никотиновой кислоты, растворяют в 10,0 мл дистиллированной воды, стерилизуют пропусканием через миллипоровский фильтр и 1,0 мл добавляют к 100,0 мл среды перед посевом.

Раствор солянокислого тиамина готовят следующим образом: берут 50,0 мг солянокислого тиамина, растворяют в 10,0 мл дистиллированной воды, затем стерилизуют пропусканием через миллипоровский фильтр и асептически добавляют 1,0 мл к 100,0 мл основной среды.

е) Солевой бульон для обогащения материала, исследуемого на энтеротоксигенные стафилококки. К 100,0 мл мясопептонного бульона (МПБ) с pH 7,3 добавляют 6,5 г хлористого натрия и разливают в пробирки по 10,0 мл, стерилизуют в автоклаве при 121°С в течение 20 мин.

ж) Среда Фогель-Джонсона, плотная среда для выделения энтеротоксигенных стафилококков.

Состав:
Триптиказа — 1,0 г
Дрожжевой экстракт — 0,5 г
Глицин — 1,0 г
Маннит — 1,0 г
Хлористый литий — 0,5 г
Двузамещенный фосфат катия K2HPO4*3H2O — 0,5 г
Теллурит калия (1% раствор) — 2,0 мл
Феноловый красный — 0,0025 г
Агар — 1,6 г
Дистиллированная вода — 100,0 мл

Навески триптиказы, дрожжевого экстракта, глицина, маннита, хлористого лития, двузамещенного фосфата калия, фенолового красного и агара растворяют в 100,0 мл дистиллированной воды.

Устанавливают pH 7,2 и стерилизуют в автоклаве при 121°С 20 мин. Теллурит калия добавляют асептически в остуженную среду до 45°С перед посевом. Среду разливают в чашки Петри.

з) Теллурит-полимиксин-желточный агар (г/100 мл) для выделения энтеротоксигенных стафилококков.

Состав:
Триптон — 1,1 г
Дрожжевой экстракт — 0,55 г
Маннит — 0,55 г
Хлорид натрия NaCl — 2,2 г
Теллурит калия (1%-ный раствор) — 1,0 мл
Желток яйца (в 50 мл физиологического раствора) — 10,0 мл
Полимиксинсульфат (1%-ный раствор) — 0,04 мл
Агар — 2,0 г

Навески триптона, дрожжевого экстракта, маннита, хлористого натрия и агар добавляют в колбу с 100,0 мл дистиллированной воды, доводят до кипения.

Устанавливают pH среды 7,2 и стерилизуют в автоклаве при 121°С в течение 15 мин. В остуженную до 45°С среду асептически вносят раствор теллурита калия, взвесь желтка куриного яйца и полимиксин, после чего среду разливают в чашки Петри по 25,0 мл. Выросшие колонии стафилококка имеют черный цвет.

з) Среда Baird-Parker (г/100,0 мл) для выделения энтеротоксигенных стафилококков.

Состав:
Триптон — 1,0 г
Мясной экстракт — 0,5 г
Дрожжевой экстракт — 0,1 г
Глицин — 1,2 г
Пируват натрия — 1,0 г
Хлористый литий — 0,5 г
Теллурит калия (2,0%-ный раствор) — 0,5 мл
Желток яйца — 5,0 мл
Агар — 2,0
Вода дистиллированная — 100,0 мл

Все навески (кроме раствора теллурита и желтка) размешивают в 100,0 мл дистиллированной воды. Смесь нагревают при перемешивании и кипятят в течение 1 мин до полного расплавления ингредиентов. Устанавливают pH 7,1 и стерилизуют при 121°С в течение 15 мин. Основа среды может храниться в холодильнике в течение 1 мес. Перед употреблением в расплавленную и охлажденную до 45°С основу, соблюдая правила асептики, прибавляют из расчета на 100,0 мл среды 0,5 мл 2%-ного раствора теллурита калия и 0,5 мл эмульсии яичного желтка.

Среду тщательно перемешивают и разливают в чашки Петри в объеме не менее 20,0 мл на чашку. Чашки со средой могут быть использованы в течение 24-28 ч. Перед посевом чашки со средой подсушивают в термостате общепринятым способом.

Выросшие колонии S. aureus имеют черный цвет (за счет восстановления теллура) с зонами просветления и опалесценции (за счет лецитиназы).

и) Основа дифференцирующего агара (с плазмой) для стафилококков HiMedia, Coagulase Mannitol Agar Base. Среду с добавкой плазмы используют для выделения и дифференциации Staphylococcus spp. из патологического материала и для идентификации чистых культур S.aureus по способности коагулировать плазму и ферментировать маннит.

Состав, г/л:
Настой мозга и сердца — 5,0
Гидролизат казеина ферментативный — 10,5
Перевар соевой муки папаиновый — 3,5
Натрия хлорид — 3,5
Маннит — 10,0
Бромкрезоловый пурпурный — 0,02
Агар — 14,5
pH 7,4±0,2

Размешивают 47,0 г среды в 1000,0 мл дистиллированной воды. Кипятят до полного растворения частиц. Стерилизуют при 121°С в течение 15 мин. Охлаждают до 45-50°С и асептически добавляют до 7-15% (об.) стерильную предварительно проверенную плазму. Тщательно перемешивают и разливают в стерильные чашки Петри.

В случае ферментации маннита среда вокруг колонии закисляется, и индикатор бромкрезоловый пурпурный окрашивается в желтый цвет. Если микроорганизмы коагулируют плазму, вокруг их колоний образуется непрозрачная зона. Коагулазоотрицательными видами стафилококка маннит может ферментироваться с образованием желтой зоны, но она не будет мутной.

Готовая среда имеет лиловую окраску, слегка опалесцирует.

к) Среда для выявления термостабильной дезоксирибонуклеазы (ДНКазы) у энтеротоксигенных стафилококков. ДНКаза определяется по методу, основанному на метахроматических свойствах толуидина голубого.

К 1000,0 мл 0,05 М трис-буфера (оксиметиламинометан), pH 9,0, добавляют 0,3 г ДНК, затем 10,0 г агара Difco, 1 мл 0,01 М раствора CaCl2, 10,0 г хлористого натрия, 3,0 мл 0,1 М раствора толуидина голубого. Среду разливают в пробирки по 12-15 мл, закрывают резиновыми пробками и хранят в холодильнике до 3-5 мес.

Перед постановкой реакции среду растапливают и разливают в чашки Петри, подсушивают при 37°С в течение 1 ч, стерильно вырезают лунки диаметром 3 мм, отсасывают пипеткой агар и вносят в лунки пастеровской пипеткой взвеси испытуемых культур.

Для этого пробирки с суточным ростом испытуемых культур стафилококков на полужидком питательном агаре прогревают в кипящей водяной бане 15 мин и вносят в лунки в агаровой пластинке, содержащей ДНК и толлуидин голубой инкубируют при 37°С. В результате гидролиза ДНК, находящейся в среде, термостабильной ДНКазой стафилококков, образуются зоны просветления с розовым окрашиванием. Появление через 1-2 ч зон, окрашенных в розовый цвет, расценивается как положительная реакция на наличие термостабильной ДНКазы.

л) Молочно-солевой агар С.Л. Петрович (для определения каротиноидного пигмента стафилококков). К расплавленному мясопептонному агару с pH 7,2±0,2, содержащему 5-7,5% натрия хлорида, добавляют ex tempore 10% стерильного теплого молока, хорошо обезжиренного, тщательно перемешивают и разливают в стерильные чашки Петри.

Для определения чувствительности стрептококков используют следующие питательные среды:

  • Для методов серийных разведений в бульоне необходимо использовать бульон Мюллера-Хинтон с добавлением 2,0 - 5,0 % лизированной лошадиной крови. Кровь лизируют замораживанием-оттаиванием с последующим центрифугированием для освобождения от теней эритроцитов.
  • Для методов серийных разведений в агаре и ДДМ используют агар Мюллера-Хинтон с добавлением 5 % дефибринированной бараньей крови.

Указанные добавки асептически вносят в питательную основу после автоклавирования и охлаждения до 48 - 50 °С.

Определение чувствительности Streptococcus pneumoniae

Бета-лактамные антибиотики (в частности пенициллин) являются препаратами выбора для терапии пневмококковых инфекций. В то же время критерии интерпретации результатов определения чувствительности пневмококков к этим препаратам постоянно пересматриваются в связи с появлением новых клинических и экспериментальных данных об эффективности различных бета-лактамов при пневмококковых инфекциях, вызванных штаммами с различным уровнем чувствительности к пенициллину.

Механизм резистентности S.pneumoniae к пенициллину и другим бета-лактамным антибиотикам обусловлен изменением пенициллиносвязывающих белков (ПСБ) клеточной стенки. В результате ступенчатых мутаций уменьшается сродство ПСБ к бета-лактамным антибиотикам.

При этом установлено, что при лечении инфекций дыхательных путей, вызванных штаммами S.pneumoniae с промежуточным уровнем резистентности к пенициллину, бета-лактамные антибиотики остаются клинически эффективными, но применение их при менингите приводит к неудаче терапии.

В связи с этим при разработке критериев интерпретации результатов определения чувствительности S.pneumoniae к бета-лактамным антибиотикам было проведено подразделение штаммов по источникам выделения (инфекции дыхательных путей, ликвор) и пересмотрены критерии оценки чувствительности к амоксициллину, цефотаксиму и цефтриаксону. Критерии интерпретации результатов определения чувствительности к пенициллину не пересмотрены.

Следует обратить внимание на несколько важных особенностей определения чувствительности S.pneumoniae:

  • невозможность определения чувствительности к бета-лактамным антибиотикам (пенициллину, аминопенициллинам, цефалоспоринам, карбапенемам) ДДМ;
  • невозможность определения чувствительности S.pneumoniae к АБП методом разведений в агаре.

Поэтому определение чувствительности пневмококков к пенициллину и другим бета-лактамным антибиотикам подразумевает последовательное (выделение S.pneumoniae из нестерильных локусов) или одновременное (при тяжелых инфекциях, выделении пневмококков из крови и ликвора) выполнение двух исследований:

  • Скрининг с диском, содержащим 1,0 мкг оксациллина, с целью выявления возможной пенициллинорезистентности. Скрининговый метод позволяет разделить микроорганизмы на две группы: группу чувствительных штаммов и группу, в которую входят часть чувствительных, а также умеренно-резистентные и резистентные штаммы пневмококков.
  • Определение МПК пенициллина и других бета-лактамных антибиотиков методом разведений в бульоне или с помощью Е-тестов у штаммов, отнесенных ко второй группе по результатам скрининга.

Скрининг на наличие пенициллинорезистентности у штаммов S.pneumoniae

Постановка теста

Методика проведения исследования не отличается от обычной процедуры определения чувствительности пневмококков к АБП ДДМ.

Интерпретация результатов

  • При выявлении диаметра зоны подавления роста штамма пневмококка вокруг диска с 1 мкг оксациллина ≥ 20 мм, S.pneumoniae расценивается как чувствительный ко всем бета-лактамным антибиотикам.
  • При выявлении диаметра зоны подавления роста < 20 мм необходимо определение МПК всех бета-лактамных антибиотиков (пенициллина, аминопенициллинов, цефалоспоринов II - IV поколенй, карбапенемов) методами серийных разведений в бульоне или с помощью Е-тестов.

Макролиды и линкозамиды

Вторыми по значимости в лечении пневмококковых инфекций являются макролидные и линкозамидные антибиотики. Оценка чувствительности S.pneumoniae к перечисленным антибиотикам возможна как диско-диффузионным методом, так и методом серийных разведений. В связи с разнообразием механизмов устойчивости S.pneumoniae к макролидам в повседневной практике могут встречаться различные варианты перекрестной резистнетности микроорганизмов к АБП этой группы.

Однако в практических целях для характеристики чувствительности S.pneumoniae к рассматриваемой группе АБП достаточно оценить чувствительность к эритромицину и клиндамицину, что позволяет дифференцировать два основных фенотипа:

  • MLSB - перекрестная устойчивость ко всем макролидам, линкозамидам и стрептограминам В, обусловленная метилированием мишени действия препаратов.
  • М - устойчивость к 14- и 15-членным макролидам (при сохранении чувствительности к 16-членным макролидам, линкозамидам и стрептограминам), обусловленная активным выыедением АБП.

Фторхинолоны

Традиционные фторхинолоны (пефлоксацин, офлоксацин, ципрофлоксацин и ломефлоксацин) не являются адекватными для лечения пневмококковых инфекций, соответственно, оценивать чувствительность к этим препаратам нецелесообразно. В последние годы в лечении пневмококковых инфекций важное место заняли антипневмококковые фторхинолоны (левофлоксацин, спарфлоксацин, моксифлоксацин и гатифлоксацин). Частота устойчивости к перечисленным препаратам минимальна, однако, поскольку между ними не наблюдают полной перекрестной резистентности, возникает необходимость включения в исследование всей группы.

АБП других групп

Из антибиотиков других групп для лечения пневмококковых инфекций применяют ко-тримоксазол, хлорамфеникол, тетрациклины. Однако роль перечисленных препаратов в последние годы резко снижается в связи с нарастанием устойчивости, меньшей клинической эффективностью в сравнении с бета-лактамами, макролидами и антипневмококковыми фторхинолонами, также значительным числом нежелательных эффектов.

Для лечения тяжелых пневмококковых инфекций, вызванных штаммами с высоким уровнем устойчивости к антибактериальным препаратам других групп, в ряде случаев рекомендуется ванкомицин.

Критерии интерпретации результатов определения чувствительности S.pneumoniae (пограничные значения диаметров зон подавления роста и МПК АБП) приведены в таблице 17.

Таблица 17.

Определение чувствительности Streptococcus spp. группы "viridans"

Проводить определение чувствительности штаммов стрептококков группы "viridans", выделенных из нестерильных локусов в рутинной практике нецелесообразно. У штаммов, выделенных из стерильных в норме локусов организма, необходимо, в первую очередь, исследовать чувствительность к пенициллину. Воспроизводимые результаты при определении чувствительности стрептококков группы "viridans" к пенициллину удается получить только при помощи метода серийных разведений, ДДМ не пригоден для этой цели.

Штаммы, чувствительные к этому антибиотику, следует расценивать как чувствительные ко всем бета-лактамным антибиотикам. Часть штаммов, устойчивых к пенициллину, могут сохранять чувствительность к некоторым цефалоспоринам III поколения (цефотаксиму и цефтриаксону), IV поколения (цефепиму) и карбапенемам. Однако критерии интерпретации результатов определения чувствительности в настоящее время установлены только для цефотаксима и цефтриаксона.

Определенный интерес может представлять изучение чувствительности стрептококков группы "viridans" к эритромицину и другим макролидам, клиндамицину, тетрациклину и хлорамфениколу, однако клиническое значение получаемых при этом данных не определено.

В случае сниженной чувствительности или резистентности зеленящих стрептококков к пенициллину, при выдаче результатов тестирования клиницистам целесообразно рекомендовать проведение комбинированной терапии бета-лактамами с аминогликозидами, которые проявляют синергизм при совместном применении с бета-лактамами, несмотря на отсутствие у аминогликозидов собственной значимой активности в отношении стрептококков.

Определение чувствительности бета-гемолитических стрептококков

К бета-гемолитическим стрептококкам относятся микроорганизмы, принадлежащие к различным серологическим группам по Лансфельд (А, B, C, G). Среди них наибольшее клиническое значение имеют стрептококки группы А (Streptococcus pyogenes) и группы В (Streptococcus agalactiae).

Препаратами выбора для лечения инфекций, вызванных бета-гемолитическими стрептококками, являются бета-лактамы, причем достоверных случаев устойчивости к АБП этой группы не описано. Не описана и устойчивость к ванкомицину. Следовательно, оценивать чувствительность к указанным АБП в рутинной практике нецелесообразно.

При выделении из нестерильных локусов необходимость в оценке чувствительности возникает только для S.pyogenes и S.agalactiae. Примерный перечень препаратов для определения чувствительности этих микроорганизмов включает: макролиды (эритромицин) и линкосамиды (клиндамицин). С целью мониторига антибиотикорезистентности возможно определение чувствительности к хлорамфениколу и левофлоксацину. Для бета-гемолитических стрептококков, выделенных из стерильных локусов, необходимо определять чувствительность ко всем вышеперечисленным препаратам одновременно.

Примерный перечень АБП, рекомендуемых для определения чувствительности S.pneumoniae, стрептококков группы "viridans" и бета-гемолитических стрептококков, выделенных из различных локусов организма, представлен в таблице 18.

Таблица 18.

Критерии интерпретации результатов определения чувствительности Streptococcus spp. (кроме S.pneumoniae) (пограничные значения диаметров зон подавления роста и МПК АБП) приведены в таблице 19.

Читайте также: