Серологические методы диагностики стафилококков

Обновлено: 13.05.2024

Методы микробиологической диагностики стафилококковых заболеваний отражены в схеме 1. Выполняется следующий комплекс методов исследования.

Бактериоскопический метод– микроскопия мазков из материала от больного, окрашенных по Граму. Выявление в мазках кокков, располагающихся небольшими группами по 2-3 бактерии; типичное расположение в виде гроздьев винограда характерно для чистых культур стафилококка (рис. 1 – цветная вкладка).

Бактериологический метод. Исследуемый материал засевают на чашки с желточно-солевым (ЖСА) и кровяным МПА, инкубируют при 37 0 С сутки. На 2 день учитывают характер

роста колоний на обеих средах. На желточно-солевом агаре колонии стафилококка имеют ровные края, гладкую поверхность, вокруг колонии образуется радужный венчик в результате расщепления лецитина яичного желтка ферментом лецитовителлазой; цвет пигмента колоний варьирует от золотистого до белого. На кровяном МПА вокруг колоний образуются зоны

гемолиза. Из типичных для стафилококка колоний делают мазок, окрашивают его по Граму, микроскопируют. Оставшуюся часть колонии пересевают на скошенный МПА для получения чистой культуры. На 3 день проводят идентификацию выделенной культуры стафилококка с дифференциацией основных видов в соответствии с таблицей 2, определяют чувствительность к антибиотикам методом бумажных дисков и фаговар (набор для фаготипирования состоит из фагов 21 типа, разделенных на 4 группы; при внутрибольничных инфекциях наиболее часто встречаются фаговары 77 и 80).

Таблица 1. Этиология бактериальных раневых и гнойно-воспалительных инфекций

Грамположительные бактерии

Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Staphylococcus hyicus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus saprophyticus, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus hominis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, Erysipelotrix rhusiopathiae

Грамотрицательные бактерии

Burkholderia cepacia, Citrobacter koseri, Edwardsiella tarda, Eikenella corrodens, Enterobacter spp, Escherichia coli, Haemophylus influence, Klebsiella spp, Listeria monocytogenes, Moraxella catarrhalis, Proteus spp, Pseudomonas spp, Salmonella enterica, Serratia spp, Spirillum minus, Streptobacillus moniliformis, Vibrio vulnificus

Неспорообразующие грамположительные бактерии

Bacteroides spp, Prevotella spp, Porphiromonas spp, Fusobacterium spp, Veilonella spp

Неспорообразующие грамотрицательные бактерии

Peptostreptococcus spp, Propionibacterium spp

Cпорообразующие грамположительные бактерии

Clostridium perfringens, Clostridium novy, Clostridium oedematiens, Clostridium septicum, Clostridium sordelli, Clostridium histolyticum, Clostridium sporogenes, Clostridium ramosum

Схема 1. Микробиологическая диагностика стафилококковых инфекций

Материал: гной, раневое отделяемое, пунктаты из полостей и абсцессов, кровь, мокрота, моча, ликвор, рвотные массы, испражнения, остатки пищи.

Выявление грамположительных кокков (группами по 2-3 клетки) в мазках из материала от больного, окрашенных по Граму

РНГА или РН для определения α-антитоксина в сыворотке крови больных хроническими стафилококковыми инфекциями. ИФА для определения антител к стафилококку. Имеет вспомогательное значение

1 день. Посев материала на чашки с желточно-солевым (ЖСА), кровяным МПА, сахарным МПБ.

2 день - учет характера роста колоний. На ЖСА колонии стафилококка с ровными краями, гладкой поверхностью, радужным венчиком вокруг, цвет - от золотистого до белого.

На кровяном МПА - зоны гемолиза, в МПБ –равномерное помутнение. В мазке из колоний в окраске по Граму – кокки в виде гроздьев винограда. Пересев оставшейся части колонии на скошенный МПА для получения чистой культуры, а с сахарного МПБ на кровяной МПА и ЖСА для получения изолированных колоний.

3 день - идентификация выделенной культуры стафилококка, дифференциация видов по биохимическим свойствам, определение чувствительности к антибиотикам и фаговара. Выделение чистой культуры с ЖСА и кровяного МПА.

4 день. Заключение о виде стафилококка. Идентификация культуры, выделенной из сахарного МПБ

5 день. Заключение о виде стафилококка, выделенного из сахарного МПБ.

Таблица 2.Дифференциация основных видов стафилококка

S. epidermidis

S. saprophyticus

Анаэробная ферментация глюкозы

Анаэробная ферментация маннита

Чувствительность к новобиоцину

Обозначения: (+) – наличие признака; (-) – отсутствие признака; S- чувствительный;R– резистентный.

Для выявления плазмокоагулазыцитратную плазму крови кролика разводят в 2 раза, разливают по 0,4 мл в пробирки, куда вносят петлей культуру стафилококков. Результаты регистрируют через 2, 4, 24 часа. При наличии плазмокоагулазы образуется сгусток.

В некоторых случаях у выделенных чистых культур стафилококка определяют наличие ДНК-азы, каталазы, лизоцимной активности, фибринолизина, гиалуронидазы.

Лизоцимную активностьвыявляют по зонам просветления вокруг колоний стафилококка при его посеве на МПА в чашках Петри с культуройMicrococcus luteus.

Каталазный тест.Чистую культуру стафилококка вносят в каплю 3%-10%-го раствора перекиси водорода на стекле и растирают круговыми движениями. При наличии каталазы перекись водорода разлагается с образованием пузырьков кислорода.

Cерологический метод в диагностике стафилококковых инфекций имеет вспомогательное значение, используясь, в основном, для диагностики хронических процессов (остеомиелит, септикопиемия и др.). Для определения антител к токсину стафилококка применяют РНГА с эритроцитарным диагностикумом, нагруженным α-токсином стафилококка или РН (реакция нейтрализации гемолитической активности стафилококкового токсина антитоксинами сыворотки крови больного в присутствии эритроцитов кролика). У здоровых лиц титр стафилококкового антитоксина составляет 0,5-4 АЕ. Разработан также ИФА.

Клинически значимые виды стафилококка

Коагулазоположительные: S. aureus, S. hyicus

Коагулазоотрицательные: S. epidermidis, S. saprophyticus, S. haemolyticus,

Микроскопия золотистого стафилококка. Выявление скоплений грамположительных кокков и полиморфно-нуклеар-ных лейкоцитов при исследовании окрашенных мазков клинического материала может служить основанием для предварительного диагноза. Следует помнить, что результаты микроскопии нельзя считать достаточными для выдачи окончательного заключения.

Выделение золотистого стафилококка

Посев золотистого стафилококка проводят на простые питательные среды, обычно на тио-гликолевую среду и КА. Если существует риск контаминации образца, применяют дифференциально-диагностические среды. Наиболее часто используют молочно-солевой (или молочно-жел-точно-солевой) агар и солевой агар с маннитом, на них рост контаминирующей микрофлоры угнетает высокая концентрация NaCl. Кроме того, на молочно-солевом агаре (МСА) хорошо проявляется способность к пигментообразованию и разложению лецитина (лецитовителазная активность). В последнее время широкое распространение в качестве дифференциально-диагностической среды нашёл агар с колистином и налидиксовой кислотой.

Стафилококки хорошо растут на бульоне, сначала вызывая его равномерное помутнение, а затем образуя рыхлый хлопьевидный осадок. Они дают весьма характерный рост в желатине; через 24-28 ч (наряду с обильным ростом по ходу укола микробиологической иглы) наблюдают начальное разжижение среды, а на 4-5-е сутки образуется открытая вниз воронка, заполненная разжиженной средой.

Для внутривидовой дифференцировки золотистого стафилококка ( S. aureus ) применяют коагулазный тест (на наличие свёртывающего фактора), положительный у 95% изолятов (рис. 12-3). Существует ещё несколько дифференцирующих признаков.

Информация на сайте подлежит консультации лечащим врачом и не заменяет очной консультации с ним.
См. подробнее в пользовательском соглашении.

Стафилококки - бактерии округлой формы, способные образовывать скопления, напоминающие гроздья (staphyle - виноградная гроздь) . Грамположительные, факультативные анаэробы, хорошо размножаются на простых питательных средах и растут на средах с высокой концентрацией NaCI.

Это обширная группа бактерий, насчитывающая 27 видов, 14 из которых обнаруживаются на коже и слизистых человека. При этом лишь 3 вида способны вызывать болезни, поэтому относятся к условно-патогенной микрофлоре:

- эпидермальный стафилококк (S. epidermidis). Селится на любых слизистых и участках кожи. Наибольшую опасность представляет при операциях, например, может заноситься в организм с зараженным протезом – клапаном, шунтом и прочим. Наиболее частая причина нагноения катетеров. В большинстве случаев этот стафилококк лечения не требует, а вызванная им инфекция проходит сама после удаления протеза или замены катетера, а также очищения раны.

- сапрофитный стафилококк (S. s aprophyticus). Наименее опасен из всех условно-патогенных видов, чаще всего обитает в области мочеиспускательного канала и гениталий. Может вызывать цистит и уретрит.

- золотистый стафилококк (S. aureus ). Наиболее патогенный вид из всех существующих. Подавляющее большинство болезней, вызванных бактериями стафилококка, связаны именно с этим видом. При этом может также присутствовать в микрофлоре здорового человека.

Факторы вирулентности стафилококков, особенно S. aureus, связаны с их адгезией на рецепторах чувствительных клеток, колонизацией и агрессивными свойствами, проявляющимися в подавлении фагоцитоза. Из экзоферментов, продуцируемых главным образом S. aureus, существенную роль в патогенезе заболеваний играют плазмокоагулаза, гиалуронидаза, лецитиназа, фибринолизин, ДНК-аза. Стафилококки секретируют ряд токсинов, отличающихся друг от друга по механизму действия. К ним относятся мембраноповреждающие токсины. Золотистые стафилококки могут образовывать гистотоксины, к которым относятся энтеротоксины, вызывающие пищевую интоксикацию.

Преимущественное значение в патологии человека имеет S. aureus. В организм человека он может проникать различными путями. Их патогенность выражается в способности вызывать гнойно-воспалительные процессы в коже, подкожной клетчатке, лимфоузлах (фурункулы, карбункулы, маститы, абсцессы и др.), респираторном тракте (бронхиты, пневмонии, плевриты), ЛОР-органах (отиты, ангины, гаймориты, тонзиллиты и др.), органах зрения (конъюнктивиты, язвы роговицы), желчевыводящих путях (холециститы, холангиты и др.), мочеполовых органах (гломерулонефриты, уретриты, простатиты и др.), опорнодвигательном аппарате (остеомиелиты, артриты, миозиты), а также пищевые отравления. Генерализация любой формы местного процесса может привести к сепсису или септикопиемии.

Основной метод лабораторной диагностики - бактериологический, так же разработаны и внедрены серологические реакции. В случае необходимости (при интоксикациях) прибегают к биологической пробе.

Материалом для бактериологического исследования служат кровь, гной, слизь из зева, носа, отделяемое ран, мокрота (при стафилококковой пневмонии), испражнения (при стафилококковом колите), в случае пищевых интоксикаций - рвотные массы, испражнения, промывные воды желудка, подозрительные продукты.

Материал засевают на кровяной агар (гемолиз), на молочно-солевой (молочно-желточно-солевой) агар (угнетается рост посторонних бактерий за счет NaCl, лучше выявляются пигмент и лецитиназа). Выделенную культуру идентифицируют по видовым признакам, определяют у нее наличие основных признаков и факторов патогенности (золотистый пигмент, сбраживание маннита, гемолиз, плазмокоагулаза), обязательно проверяют чувствительность к антибиотикам, в случае необходимости проводят фаготипирование.

Из числа серологических реакций для диагностики гнойно-септических заболеваний применяют РПГА и ИФМ, в частности для определения антител к тейхоевой кислоте или к видоспецифическим антигенам.

Для определения энтеротоксигенности стафилококков используют три метода:

1) серологический - с помощью специфических антитоксических сывороток в реакции преципитации в геле обнаруживают энтеротоксин и устанавливают его тип;

2) биологический - внутривенное введение фильтрата бульонной культуры стафилококка кошкам в дозе 2-3 мл на 1 кг веса. Токсины вызывают у кошек рвоту и понос;

3) непрямой бактериологический метод - выделение из подозрительного продукта чистой культуры стафилококка и определение у него факторов патогенности.

Бактериоскопический метод – микроскопия мазков из материала от больного, окрашенных по Граму. Выявление в мазках кокков, располагающихся небольшими группами по 2-3 бактерии; типичное расположение в виде гроздьев винограда характерно для чистых культур стафилококка (рис. 1 – цветная вкладка).

Бактериологический метод.Исследуемыйматериал засевают на чашки с желточно-солевым (ЖСА) и кровяным МПА, инкубируют при 37 0 С сутки. На 2 день учитывают характер

Таблица 1.Этиология бактериальных раневых и гнойно-воспалительных инфекций

Аэробы

Анаэробы

Грамположительные бактерии Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Staphylococcus hyicus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus saprophyticus, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus hominis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, Erysipelotrix rhusiopathiae Грамотрицательные бактерии Burkholderia cepacia, Citrobacter koseri, Edwardsiella tarda, Eikenella corrodens, Enterobacter spp, Escherichia coli, Haemophylus influence, Klebsiella spp, Listeria monocytogenes, Moraxella catarrhalis, Proteus spp, Pseudomonas spp, Salmonella enterica, Serratia spp, Spirillum minus, Streptobacillus moniliformis, Vibrio vulnificus

Неспорообразующие грамположительные бактерии Bacteroides spp, Prevotella spp, Porphiromonas spp, Fusobacterium spp, Veilonella spp Неспорообразующие грамотрицательные бактерии Peptostreptococcus spp, Propionibacterium spp Cпорообразующие грамположительные бактерии Clostridium perfringens, Clostridium novy, Clostridium oedematiens, Clostridium septicum, Clostridium sordelli, Clostridium histolyticum, Clostridium sporogenes, Clostridium ramosum

Схема 1. Микробиологическая диагностика стафилококковых инфекций
Материал: гной, раневое отделяемое, пунктаты из полостей и абсцессов, кровь, мокрота, моча, ликвор, рвотные массы, испражнения, остатки пищи.
Микроскопический метод Выявление грамположительных кокков (группами по 2-3 клетки) в мазках из материала от больного, окрашенных по Граму Серологический метод РНГА или РН для определения α-антитоксина в сыворотке крови больных хроническими стафилококковыми инфекциями. ИФА для определения антител к стафилококку. Имеет вспомогательное значение Бактериологический метод 1 день. Посев материала на чашки с желточно-солевым (ЖСА), кровяным МПА, сахарным МПБ. 2 день -учет характера роста колоний. На ЖСА колонии стафилококка с ровными краями, гладкой поверхностью, радужным венчиком вокруг, цвет - от золотистого до белого.	На кровяном МПА - зоны гемолиза, в МПБ –равномерное помутнение. В мазке из колоний в окраске по Граму – кокки в виде гроздьев винограда. Пересев оставшейся части колонии на скошенный МПА для получения чистой культуры, а с сахарного МПБ на кровяной МПА и ЖСА для получения изолированных колоний. 3 день - идентификация выделенной культуры стафилококка, дифференциация видов по биохимическим свойствам, определение чувствительности к антибиотикам и фаговара. Выделение чистой культуры с ЖСА и кровяного МПА. 4 день.Заключение о виде стафилококка. Идентификация культуры, выделенной из сахарного МПБ 5 день.Заключение о виде стафилококка, выделенного из сахарного МПБ.

Таблица 2. Дифференциация основных видов стафилококка

Признаки	Виды стафилококков
S. aureus	S. epidermidis	S. saprophyticus
Плазмокоагулаза	+	-	-
Лецитиназа	+	-	-
Альфа-токсин	+	-	-
Анаэробная ферментация глюкозы	+	+	-
Анаэробная ферментация маннита	+	-	-
Чувствительность к новобиоцину	S	S	R

Обозначения: (+) – наличие признака; (-) – отсутствие признака; S - чувствительный; R – резистентный.

Для выявления плазмокоагулазы цитратную плазму крови кролика разводят в 2 раза, разливают по 0,4 мл в пробирки, куда вносят петлей культуру стафилококков. Результаты регистрируют через 2, 4, 24 часа. При наличии плазмокоагулазы образуется сгусток.

Лизоцимную активность выявляют по зонам просветления вокруг колоний стафилококка при его посеве на МПА в чашках Петри с культурой Micrococcus luteus.

Каталазный тест. Чистую культуру стафилококка вносят в каплю 3%-10%-го раствора перекиси водорода на стекле и растирают круговыми движениями. При наличии каталазы перекись водорода разлагается с образованием пузырьков кислорода.

Cерологический методв диагностике стафилококковых инфекций имеет вспомогательное значение, используясь, в основном, для диагностики хронических процессов (остеомиелит, септикопиемия и др.). Для определения антител к токсину стафилококка применяют РНГА с эритроцитарным диагностикумом, нагруженным α-токсином стафилококка или РН (реакция нейтрализации гемолитической активности стафилококкового токсина антитоксинами сыворотки крови больного в присутствии эритроцитов кролика). У здоровых лиц титр стафилококкового антитоксина составляет 0,5-4 АЕ. Разработан также ИФА.

Читайте также: