Сравнительное исследование тест систем для выявления вич
Обновлено: 25.04.2024
Целью работы являлось сравнение пяти наиболее широко используемых на территории Российской Федерации тест-систем ИФА для обнаружения антител к вирусу иммунодефицита человека.
Ключевые слова
Об авторах
Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Пастера; Северо-Западный государственный медицинский университет имени И.И.Мечникова
Россия
Список литературы
4. Hemelaar J. Implications of HIV diversity for the HIV-1 pandemic. J. Infect., 2013 May, Vol. 66, No. 5, pp. 391–400. URL: DOI: 10.1016/j.jinf.2012.10.026.
5. Gaudy C., Moreau A., Brunet S., Descamps J.M., Deleplanque P., Brand D., Barin F. Subtype B human immunodeficiency virus (HIV) type 1 mutant that escapes detection in a fourth generation immunoassay for HIV infection. J. Clin. Microbiol., 2004, Vol. 42, pp. 2847–2849. 6. Ly T.D., Plantier J.C., Leballais L., Gonzalo S., Lemée V., Laperche S. The variable sensitivity of HIV Ag/Ab combination assays in the detection of p24 Ag according to genotype could compromise the diagnosis of early HIV infection. J. Clin. Virol., 2012, Vol. 55, pp. 121–127. URL: DOI: 10.1016/j.jcv.2012.06.012.
6. Qiu X., Sokoll L., Yip P., Elliott D.J., Dua R., Mohr P., Wang X.Y., Spencer M., Swanson P., Dawson G.J., Hackett J. Jr. Comparative evaluation of three FDA-approved HIV Ag/Ab combination tests using a genetically diverse HIV panel and diagnostic specimens.J. Clin. Virol., 2017 Jul., Vol. 92, pp. 62–68. URL: DOI: 10.1016/j.jcv.2017.05.005.
7. Баранова Е.Н., Шарипова И.Н., Денисова Н.М., Сусекина М.Е., Пузырев В.Ф., Саркисян К.А., Воробьева М.С., Бурков А.Н., Уланова Т.И. Возможности современных тест-систем при подтверждении ранней ВИЧ-инфекции // Вопросы вирусологии. 2009. Т. 54, № 5. С. 37–40. [Baranova E.N., Sharipova I.N., Denisova N.M. Susekina M.E., Puzyrev V.F., Sarkisyan K.A., Vorobyeva M.S., Burkov A.N., Ulanova T.I. The possibilities of modern test systems for the early confirmation of HIV infection. Questions of Virology, 2009, Vol. 54, No. 5, pp. 37–40 (In Russ.)].
8. Иванова Н.И., Пекшева О.Ю. Опыт выявления маркеров ВИЧ-инфекции с использованием нового ИФА-диагностикума ДС-ИФА-ВИЧ-АТ/АГ-СПЕКТР в лабораториях центров по профилактике и борьбе со СПИДом Приволжского Федерального округа // Клиническая лабораторная диагностика. 2009. № 3. С. 46–48. [Ivanova N.I., Peksheva O.Yu. Experience identifying markers of HIV with the new ELISA antigen of DS-ELISA-HIV-at/AG-SPECTRUM in the laboratories of the centers for the prevention and control of AIDS of the Volga Federal district. Clinical Laboratory Diagnostics, 2009, No. 3, pp. 46–48 (In Russ.)].
9. Распопина И.В., Панкова Л.В., Кожевникова И.В. Опыт выявления маркёров ВИЧ-инфекции с использованием нового ИФА-диагностикума Инвитролоджик ВИЧ 1,2-АГ/АТ // Вестник Челябинской областной клинической больницы. 2013. № 1 (20). С. 84. [Raspopina I.V., Pankova L.V., Kozhevnikov I.V. Experience of identifying markers of HIV with the new ELISA antigen of Envitrologic HIV-1,2-AG/AT. Bulletin of the Chelyabinsk Regional Clinical Hospital, 2013, No. 1 (20), pp. 84 (In Russ.)].
10. Шарипова И.Н., Ходак Н.М., Пузырев В.Ф., Бурков А.Н., Уланова Т.И. Сравнительное исследование специфичности тест-систем для диагностики ВИЧ-инфекции на категории образцов сывороток крови беременных женщин // Клиническая лабораторная диагностика. 2015. Т. 60, № 3. С. 38–41. [Sharipova I.N., Khodak N.M. Puzyrev V.F., Burkov A.N., Ulanova T.I. Comparative study of the specificity of test systems for the diagnosis of HIV infection in the category of blood serum samples of pregnant women. Clinical Laboratory Diagnostics, 2015, Vol. 60, No. 3, pp. 38–41 (In Russ.)].
11. Лисицина З.Н., Дмитриевская К.А., Коробан Н.В., Кондрашова Т.В. Иммунные тесты и диагностика острой стадии ВИЧ-инфекции // ВИЧ-инфекция и иммуносупрессии. 2017. Т. 9, № 2. С. 36–41. [Lisitsina Z.N., Dmitrievskaya K.A., Koroban N.V., Kondrashova T.V. Immune tests and diagnosis of the acute stage of HIV infection. HIV Infection and Immunosuppressive Disorders, 2017, Vol. 9, No. 2, pp. 36–41 (In Russ.)].
12. HIV assays: laboratory performance and other operational characteristics: rapid diagnostic tests (combined detection of HIV-1/2 antibodies and discriminatory detection of HIV-1 and HIV-2 antibodies): report 18. Geneva: World Health Organization, 2015.
13. Chaves P., Wesolowski L., Patel P., Delaney K., Owen S.M. Evaluation of the performance of the Abbott ARCHITECT HIV Ag/Ab Combo Assay. J. Clin. Virol., 2011 Dec., Vol. 52, Suppl. 1, pp. S51–S55. URL: DOI: 10.1016/j.jcv.2011.09.010.
14. Mitchell E.O., Stewart G., Bajzik O., Ferret M., Bentsen C., Shriver M.K. Performance comparison of the 4-th generation Bio-Rad Laboratories GS HIV Combo Ag/Ab EIA on the EVOLIS™ automated system versus Abbott ARCHITECT HIV Ag/Ab Combo, Ortho Anti-HIV 1+2 EIA on Vitros ECi and Siemens HIV-1/O/2 enhanced on Advia Centaur.J. Clin. Virol., 2013 Dec., Vol. 58, Suppl. 1, pp. e79–e84. URL: DOI: 10.1016/j.jcv.2013.08.009. 16. Product Package Insert. ARCHITECT HIV Ag/Ab Combo Reagent Kit. USA: Abbott Laboratories.
17. Лаповок И.А., Лопатухин А.Э., Киреев Д.Е. и др. Молекулярно-эпидемиологический анализ вариантов ВИЧ-1, циркулировавших в России в 1987–2015 гг. // Терапевтический архив. 2017. Т. 89, № 11. С. 44–49. [Lapovok I.A., Lopatukhin A.E., Kireev D.A. et al. Molecular epidemiological analysis of HIV-1 circulating in Russia in the years 1987–2015. Therapeutic Archive, 2017, Vol. 89, No. 11, pp. 44–49 (In Russ.)].
ВИЧ-инфекция – медленно текущая ретровирусная инфекция, характеризующаяся пандемическим распространением, развитием синдрома приобретенного иммунодефицита и летальным исходом. Поэтому своевременная и точная лабораторная диагностика этого заболевания имеет важное значение. Она основана прежде всего на идентификации вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) и выявлении специфических противовирусных антител. (3, 6, 8, 9)
При массовом скрининге доноров крови и групп риска с целью выявления специфических противовирусных антител используется метод иммуноферментного анализа (ИФА). Метод основан на иммобилизации вирусных антигенов на твердой фазе, сорбции на них антител и выявлении комплексов антиген-антитело с помощью конъюгата антивидового иммуноглобулина с ферментом (8). Преимущества данного метода: можно анализировать большие партии образцов при массовом обследовании населения, возможность автоматизации, использование оборудования, доступного для большинства лабораторий.
Основными показателями качества иммуноферментной тест-системы являются чувствительность и специфичность. Чувствительность – доля больных, для которых получен положительный результат в данной тест-системе, от общего количества обследованных больных. Специфичность – доля здоровых, для которых получен отрицательный результат в данной тест-системе, от общего количества обследованных здоровых (2, 10). Понятия “чувствительность” и “специфичность” тесно связаны с понятиями “ложноотрицательный” и “ложноположительный” результат. Таким образом, более чувствительной является та система, которая дает меньше ложноотрицательных результатов, а более специфичной – та, которая дает меньше ложноположительных результатов (4, 10, 11) .
Причинами ложноположительных результатов могут быть наличие у пациентов аутоиммунных, онкологических и инфекционных заболеваний. Сыворотки беременных женщин и пожилых людей при постановке ИФА также могут давать серопозитивные результаты (1, 2, 5, 7). Ложноотрицательные результаты возможны в случаях раннего инфицирования, когда уровень антител очень низкий, или в терминальной стадии болезни, характеризующейся глубоким поражением иммунной системы (3).
Целью данной работы является сравнительная оценка чувствительности и специфичности 8 иммуноферментных тест-систем для обнаружения антител к ВИЧ, используемых при скрининге.
В работе были использованы следующие диагностикумы: “ЭКОлаб-Вироностика IV” (“ЭКОлаб”), “ЭКОлаб-ЖЕНЕЛАВИЯ-Микст” (“ЭКОлаб”), “КомбиБест-анти-ВИЧ-1+2” (ЗАО “Вектор-Бест”), “ВИЧ-1, ВИЧ-2-ИФА-Авиценна” (СПб “Авиценна”), “СКРИН-ВИЧ” (ЗАО ПКБ им. И.И.Мечникова), “ПЕПТОСКРИН-2” (ООО “АмерКарД”), “ЭКОлаб-ТЕСТ-ВИЧ-1,2” (ЭКОлаб”), “Амеркард Анти-ВИЧ-1/2К” (ООО АмерКард”). Характеристика тест-систем представлена в таблице 1. Постановку ИФА и учет результатов проводили согласно инструкциям по применению тест-систем. Все образцы были протестированы в реакции иммунного блоттинга с использованием систем “БЛОТ-ВИЧ” (ЗАО “Биосервис”) и “ВЕСТЕРН БЛОТ ВИЧ-1” (“Organon”).
Табл.1 Характеристика ИФА-тест-систем для выявления антител к ВИЧ.
| тест-система | антиген | параметры тест-системы | субстрат | ||
| ВИЧ 1 | ВИЧ 2 | тип ИФА | |||
| Вироностика | рекомбинантный, вирусный лизат, пептиды | р 24gp 160 | env-антиген ВИЧ-2 | сэндВИЧ | ТМБ |
| Женелавия | пептиды, рекомбинантный | gp 41 gp 160 | gp 36 | непрямой | ОФД |
| Комби-бест | рекомбинантный | __ | __ | сэндВИЧ | ТМБ |
| АВИЦЕННА | синтетические пептиды | р 24 gp 120 gp 41 | gp 36 | непрямой | ТМБ |
| СКРИН-ВИЧ | рекомбинантный | р 24 р 17 gp 41 gp 120 | gp 110 gp 38 | непрямой | ОФД |
| ПЕПТОСКРИН-2 | пептиды | gp 41 gp 120 | gp 32 | непрямой | ОФД |
| ЭКОлаб-ТЕСТ ВИЧ 1,2 | рекомбинантный | р 24 р 17 gp 41 gp 120 | gp 38 | непрямой | ОФД |
| АМЕРКАРД | рекомбинантный | gp 41 р 55 | gp 32 | непрямой | ОФД |
Материалом для исследования служили 168 образцов сыворотки крови, включающие в себя сыворотки от ВИЧ - инфицированных (n=48), сыворотки от больных вирусными гепатитами В и С (n=35), а также сыворотки от пациентов, в крови которых не обнаружены антитела к ВИЧ (n=85) . Контрольная группа составила 20 здоровых доноров.
Учет результатов ИФА проводили на оборудовании фирмы Sanofi (Франция) – на ридере PR 2100 измеряли оптическую плотность (ОП) исследуемых образцов сыворотки крови. Уровень “среза” (ОП критическое) для каждой тест-системы рассчитывался согласно инструкциям. За “серую зону” принимали значения ОП в интервале + 10% от уровня “среза”. Образцы считали положительными, если значения их ОП были выше “серой зоны”. Образцы считали сомнительными, если значения их ОП находились в пределах “серой зоны”. Образцы считали отрицательными, если значения их ОП были ниже “серой зоны”.
Показатели специфичности в нашем исследовании варьировали от теста к тесту. Так, для здоровых доноров крови этот показатель составил 100%. При исследовании сывороток, полученных от больных вирусными гепатитами В и С специфичность изменялась от 3% (“Скрин-ВИЧ”) до 97% (“КомбиБест-анти-ВИЧ-1,2”) (таблица 2). Данный факт может быть объяснен, с одной стороны, недостаточной специфичностью оцениваемых диагностикумов, а с другой – наличием перекрестных реакций неспецифических факторов в сыворотках с компонентами тест-систем.
Табл. 2 Процент специфичности тест-систем для диагностики ВИЧ-инфекции.
| Диагностикум | доноры | ВИЧ-негативные в иммуноблоте | больные гепатитом В и С |
| “Вироностика” | 100 % | 75 % | 88 % |
| “Женелавия” | 100 % | 84,3 % | 88 % |
| “Комби-Бест” | 100 % | 90 % | 97 % |
| “Авиценна” | 89,5 % | 52,5 % | 60 % |
| “Скрин-ВИЧ” | 100 % | 17,5 % | 3 % |
| “Пептоскрин-2” | 93,8 % | 62,5 % | 74 % |
| “ЭКОлаб-тест ВИЧ 1,2” | 89,5 % | 28,3 % | 26 % |
| “АмерКард” | 87,3 % | 55,8 % | 74 % |
При оценке ложноположительных результатов нами были получены следующие данные (табл.3)
Табл.3 Процент ложноположительных результатов в ИФА-системах.
| Тест-Система | ВИЧ-негативные в иммуноблоте | больные гепатитом В и С | ||
| серая зона, % | ложнополо-жительные результаты, % | серая зона, % | ложнополо-жительные результаты, % | |
| “Вироностика” | 10 | 16,7 | 2,8 | 8,6 |
| “Женелавия” | 8,3 | 11,7 | 2,8 | 8,6 |
| “Комби-Бест” | 4,2 | 5,8 | 2,8 | * |
| “Авиценна” | 5,0 | 24,2 | 8,6 | 34,3 |
| “Скрин-ВИЧ” | 4,2 | 45,8 | 2,8 | 97,1 |
| “Пептоскрин-2” | 8,3 | 24,2 | 14,3 | 14,3 |
| “ЭКОлаб-тест ВИЧ 1,2” | 9,2 | 32,5 | 17,1 | 60,0 |
| “АмерКард” | 7,5 | 36,7 | 20,0 | 5,7 |
* таких результатов нет
Таким образом, наибольшей специфичностью обладают тест-системы “Комби-Бест”, “Женелавия” и “Вироностика”. Остальные тест-системы дают высокий процент ложноположительных результатов, которые не подтверждаются в иммуноблоте.
Процент выявления антител к ВИЧ в серопозитивных образцах практически во всех ИФА-системах составил 100%. В тест-системах “ЭКОлаб-Женелавия-Микст” и “Авиценна” чувствительность была 97,9%. Наименьшая чувствительность из исследуемых диагностикумов была в тест-системе “Пептоскрин-2” – 89,6%. Эти результаты могут свидетельствовать о недостаточной чувствительности перечисленных тест-систем и о высокой вероятности получения ложнонегативных результатов.
Результаты проведенного исследования позволяют сделать выводы о том, что для массового тестирования на ВИЧ-инфекцию наиболее подходят такие высоко специфичные и чувствительные тест-системы, как “Комби-Бест-анти-ВИЧ-1,2”, “ЭКОлаб-Вироностика IV” и “ЭКОлаб-Женелавия-Микст”. Остальные диагностикумы могут давать высокий процент как ложноположительных, так и ложноотрицательных результатов.
В заключении необходимо отметить, что при тестировании сыворотки крови на ВИЧ-инфекцию следует принимать во внимание неодинаковую чувствительность и специфичность различных тест-систем и использовать несколько диагностикумов с различным принципом постановки реакции, особенно для сывороток крови с низким уровнем антител к ВИЧ и для тестирования донорской крови.
Было исследовано 34 клинических образца, положительных по ВИЧ-1, в трех повторах для каждой серии тест-систем.
Все 34 клинических образца были определены как положительные на тест-системах ИммуноКомб II HIV 1&2 BiSpot трех разных серий и на тест-системах Детермин HIV 1/2.
Чувствительность Детермин HIV 1/2 по ВИЧ-1 составила:100%
Чувствительность ИммуноКомб II HIV 1&2 BiSpot по ВИЧ-1 составила:100%
2. Чувствительность на антитела к ВИЧ-2
Все положительные по ВИЧ-2 образцы были определены как положительные на тест-системах ИммуноКомб II HIV 1&2 BiSpot трех разных серий и на тест-системах Детермин HIV 1/2.
Чувствительность тест-систем Детермин HIV 1/2 по ВИЧ-2 составила:100%
Чувствительность тест-систем ИммуноКомб II HIV 1&2 BiSpot по ВИЧ-2 составила:100%
3. Исследование на сероконверсионных панелях
Тест-системы были испытаны на сероконверсионной панели HIV Seroconversion Panel (Catalog No. HIV 9017), Franklin, MA 02038 USA. Были получены следующие результаты:
Детермин HIV 1/2
ИммуноКомб II HIV 1&2 BiSpot
4. Специфичность.
Специфичность тест-систем оценивалась с использованием стандартной панели сывороток и сывороток доноров крови, не содержащих антитела к ВИЧ и маркеров гепатитов В и С.
Было исследовано 160 сывороток доноров крови, не содержащих антитела к ВИЧ и маркеров гепатитов В и С, в трех повторах для каждой серии тест-систем.
Все сыворотки доноров крови были определены как отрицательные на тест-системах ИммуноКомб II HIV 1&2 BiSpot трех разных серий и на тест-системах Детермин HIV 1/2.
Специфичность тест-систем Детермин HIV 1/2 составила: 100%
Специфичность тест-систем ИммуноКомб II HIV 1&2 BiSpot составила: 100%
5. Воспроизводимость.
Для подтверждения воспроизводимости результатов, 34 положительных по ВИЧ-1 образца сыворотки крови человека были исследованы на 10 тест-системах ИммуноКомб II HIV 1&2 BiSpot.
Для всех исследованных положительных образцов был получен положительный результат. Различий в результатах полученных для одной сыворотки на разных тест-системах не наблюдалось.
6. Стабильность
Стабильность тест-систем Детермин HIV 1/2 и ИммуноКомб II HIV 1&2 BiSpot оценивалась в условиях ускоренного старения. Тест-системы были выдержаны в течение 7 суток при температуре +37 ° C, после чего был произведен контроль чувствительности на ВИЧ-1 и ВИЧ-2.
Снижения чувствительности тест-систем Детермин HIV 1/2 и ИммуноКомб II HIV 1&2 BiSpot при хранении в течение 7 суток при +37 ° C не наблюдалось.
Заключение по результатам испытаний
Во время испытаний тест-системы Детермин HIV 1/2 и ИммуноКомб II HIV 1&2 BiSpot продемонстрировали чувствительность 100% при строго специфическом определении антител к ВИЧ-1 и ВИЧ-2.
Исследованные тест-системы основаны на разных принципах: тест-система ИммуноКомб II HIV 1&2 BiSpot является иммуноферментной, тест-система Детермин HIV 1/2 — иммунохроматографичеcкой. Этим обусловлены их особенности:
Тест-система Детермин HIV 1/2 позволяет поставить анализ за более короткое время (15 мин); интерпретация результатов невозможна после 60 минут; результаты на ВИЧ-1 и ВИЧ-2 появляются в виде единой полосы.
Тест-система ИммуноКомб II HIV 1&2 BiSpot позволяет поставить анализ за 36 мин; результаты анализа стабильны в течение длительного времени и могут сохраняться для документирования; результаты по ВИЧ-1 и ВИЧ-2 появляются в разных точках, что позволяет проводить дифференцированное определение. При исследовании сероконверсионной панели тест-система ИммуноКомб II HIV 1&2 BiSpot, определяет более ранние сероконверсионные сыворотки, чем тест-система Детермин HIV 1/2.
При высокой чувствительности и специфичности тест-системы Детермин HIV 1/2 и ИммуноКомб II HIV 1&2 BiSpot удобны в работе, не требуют дополнительного оборудования, специальных мер предосторожности и дополнительных специальных помещений. Представляется целесообразным использование тест-систем в качестве экспресс метода для диагностики ВИЧ в лабораториях всех уровней, у постели больного и в полевых условиях.
Диагностика ВИЧ-инфекции, обычно, базируется на выявлении антител к ВИЧ. Классические серологические тесты для выявления антител к ВИЧ делятся на тест-системы для скрининга антител (первичная диагностика) и тест-системы для подтверждения, т.е. идентификации ВИЧ – позитивных образцов сывороток крови человека.
Проведение обследования единичных тестов на ВИЧ необходимо в регионах с низким показателем распространения ВИЧ-инфекции. При этом требуется использовать высокоспецифичные, одноразовые тесты для индивидуального обследования единичных сывороток крови человека.
Это особенно важно в тех регионах, где отсутствуют условия функционирования диагностической лаборатории – отсутствует специальное оборудование, электричество, нет персонала, обученного постановке иммуноферментного анализа или иммунного блоттинга. Кроме того, могут отсутствовать условия для забора на анализ и обработки крови из локтевой вены для получения образцов сывороток или плазмы крови.
Для проведения оперативных мероприятий по дальнейшему предотвращению распространения ВИЧ-инфекции, анализ должен быть проведен максимально быстро. В последние годы для этого разработаны и приобретают всё большее значение простые/быстрые тесты исследования, когда время анализа одного образца – до 15 минут или максимально – до 40 минут.
Технология производства одноразовых, простых/быстрых тестов (П/Б) настолько усовершенствована в последние годы, как свидетельствуют многочисленные испытания, проведенные в различных странах мира, что по качеству и результатам П/Б – тесты вполне могут быть приравнены к классическим тест-системам. ВОЗ рекомендует лабораториям, для которых приобретение тест-систем для иммунного блоттинга является сложным из-за высокой стоимости этих наборов, использовать комбинации ИФА – тест-систем и П\Б-тестов. Поэтому понятно, насколько важно качество П/Б-тестов, особенно при использовании их для первичного анализа – ложноотрицательный результат такого анализа и отсутствие возможности проведения анализа классическим методом ИФА может иметь неблагоприятные последствия. Такая же ситуация может сложиться и при применении П/Б-тестов при ургентных ситуациях – родовспоможении, травмах и т.д.
П/Б-тесты должны быть устроены таким образом, чтобы максимально минимизировать риск заражения для оператора, производящего как забор пробы на анализ, так и непосредственно анализ. П\Б-тесты должны сохранять свои свойства при хранении и транспортировании при различных температурных условиях окружающей среды, т.е. при температуре от 2 o C до 30 o C, а иногда до 45 o C.
Индивидуальный одноразовый П/Б-тест должен содержать все необходимые реагенты, готовые к употреблению, включать обязательно внутренний контроль и быть предельно простым в применении, чтобы максимально сократить возможность технических ошибок.
Начиная с 1988 года, когда появились первые разработки П/Б-тестов, ВОЗ была предложена Программа объективного изучения операционных характеристик этих тестов: чувствительность, специфичность, температура инкубации при проведении анализа, срок годности, температура хранения и транспортирования, простота постановки теста, использование для анализа не только образцов сыворотки или плазмы крови, но и цельной крови человека.
Для производства П/Б-тестов применяются различные технологии – метод иммунохроматографии, метод иммунофильтрации, метод латекс-агглютинации, модифицированный метод ИФА – иммуно-дот.
Анализ проведенных исследований в институте Тропической медицины (Бельгия) показывает, что большая часть применяемых в настоящее время быстрых тестов пригодна для исследования как сыворотки и плазмы, так и цельной крови человека. По чувствительности и специфичности эти тесты не уступают классическому ИФА, и при этом имеют преимущества по простоте и быстроте проводимого исследования индивидуальных проб сывороток.
Три из пяти представленных тестов являются тестами, в основе которых лежит принцип иммунохроматографии.
На мембране иммобилизованы рекомбинантные и пептидные антигены ВИЧ-1 и ВИЧ-2. Каждый из 3-х тестов имеет свои принципиальные особенности технологии и проведения анализа, однако, главная цель – быстро (15-30 мин) провести анализ пробы сыворотки (плазмы) крови человека без применения специального оборудования и особых лабораторных условий.
Тест представляет собой набор реагентов для качественного и дифференцированного выявления антител к ВИЧ-1 и ВИЧ-2 в сыворотке (плазме) крови человека.
Все реагенты, необходимые для постановки теста, в готовом виде размещены в ячейках проявочной ванны (6 рядов по 12 ячеек).
В ячейки проявочной ванны опускаются зубцы пластикового гребня. На поверхности каждого зубца этого гребня нанесены в разных точках пептидные антигены ВИЧ-1, рекомбинантный антиген ВИЧ-2 и внутренний контроль реакции – антитела к человеческому IgG.
В ячейках разных рядов проявочной ванны, в которые опускаются зубцы пластикового гребня, находятся необходимые для проведения ИФА-реакции реагенты: разбавитель образца сыворотки, конъюгат, промывочный раствор (в 3 рядах) и раствор хромогенного субстрата.
Препарат представляет собой оригинальную разработку, которая позволяет проводить иммуноферментный анализ без применения специального оборудования и с минимальным участием оператора.
Оператор должен только через определенные промежутки времени извлекать зубцы гребня из ячеек одного ряда и помещать их в ячейки следующего ряда. С помощью одного гребня могут быть исследованы одновременно 10 сывороток и 2 контроля (К+ и К-). Постановка анализа на 1 гребне занимает не более 40 мин.
По окончании анализа и выявлении в исследованной сыворотке антител к ВИЧ-1 и/или к ВИЧ-2 на зубцах гребня в определенных местах должны проявиться 2 или 3 пятна, при отрицательном результате – одно пятно.
Во всех анализах были получены результаты, соответствующие исходным характеристикам сывороток, входящих в данную панель (табл. 20)
| №пп | ВИЧ-экспресс | Иммунокомб Биспот ВИЧ1,2 | Multispot HIV1/HIV2 | Genie II | Determine HIV1/2 | ||
| С.23 | С.24 | С.25 | С.010216010220 | MS 350 | С.010121 | 70218U100 | |
| 1 | - | - | - | - | - | - | - |
| 2 | - | - | - | - | - | - | - |
| 3 | - | - | - | - | - | - | - |
| 4 | - | - | - | +сл. | - | - | - |
| 5 | + | + | + | + | + | + | + |
| 6 | + | + | + | + | + | + | + |
| 7 | + | + | + | + | + | + | + |
| 8 | + | + | + | + | + | + | + |
| 9 | + | + | + | + | + | + | + |
| 10 | + | + | + | + | + | + | + |
| 11 | + | + | + | + | + | + | + |
| 12 | + | + | + | + | + | + | + |
| 13 | + | + | + | + | + | + | + |
| 14 | + | + | + | + | + | + | + |
| 15 | + | + | + | + | + | + | + |
| 16 | + | + | + | + | + | + | + |
| 17 | + | + | + | + | + | + | + |
| 18 | + | + | + | + | + | + | + |
| 19 | + | + | + | + | + | + | + |
| 20 | + | + | + | + | + | + | + |
| 21 | + | + | + | + | + | + | + |
| 22 | + | + | + | + | + | + | + |
| 23 | + | + | + | + | + | + | + |
| 24 | + | + | + | + | + | + | + |
Быстрый подтверждающий тест – иммуноблот ИммуноКомб ВИЧ 1+2 КомбФирм по результатам этих же Госиспытаний рекомендован для постановки окончательного диагноза и подтверждений наличия антител к ВИЧ (приказ 292 от 30.07.2001).
В 2003 году согласно Указанию Зам. Министра здравоохранения РФ – Г.Г.Онищенко были проведены Государственные испытания препаратов, предназначенных для серодиагностики ВИЧ-инфекции.
Для изучения были предоставлены следующие П/Б-тесты:
Для изучения пяти П/Б-тестов, представленных на Госиспытания 2003 г. были использованы следующие материалы:
Результаты испытания П/Б-тестов представлены в табл.21
Таблица 21. Изучение 5 простых/быстрых тестов (П/Б тесты)на стандартных панелях ГИСК им.Л.А.Тарасевича.
| П/Б тесты | Serodia HIV 1/2 | Determine HIV1/2 | Иммунокомб II ВИЧ1+2 Биспот | Genie II HIV1/HIV2 | Retrocheck HIV WB | |
| Стандартные панели | ВИЧ 1+ ОСО 422821202П 16 сывороток | 16/16 | 16/16 | 16/16 | 15/16 | - |
| ВИЧ 2+ ОСО 422821602П 8 сывороток | 8/8 | 8/8 | 8/8 | 8/8 | - | |
| ВИЧ - ОСО 422821402П 20 сывороток | 0/20 | 0/20 | 0/20 | 0/20 | 0/20 | |
| Референс-сыворотка ВИЧ-2 1 сыворотка | 1/1 | 1/1 | 1/1 | 1/1 | - | |
| Референс-панель ОСО 422832704 24 сыворотки | - | - | - | 0/4 20/20 | ||
Пять вышеуказанных П/Б-тестов были изучены на клиническом материале, специально отобранном для этих исследований и аттестованном предварительно методом ИФА и в иммуноблоте.
В панели клинического материала были представлены:
Характеристика сывороток и результаты испытаний пяти П/Б-тестов представлены в таблицах 22,23,24.
Таблица 22. Изучение 5 простых/быстрых тестов (П/Б тестов) на клиническом ВИЧ-позитивном материале.
| П/Б тесты | Serodia HIV 1/2 | Deter-mine HIV1/2 | Иммунокомб II ВИЧ1+2 Биспот | Genie II HIV1/ HIV2 | Retro- check HIV WB | ||||
| Характеристика сывороток в ИФА и ИБ | шифр | ИФА (О.П.) | иммуно-блот*** | ||||||
| анти-тела* | анти-ген** | ||||||||
| 1г | >3,0 | 0,391 | ВИЧ-1 | + | + | + | + | + | |
| 2г | >3,0 | 0,198 | ВИЧ-1 | + | + | + | + | + | |
| 3г | >3,0 | 0,231 | ВИЧ-1 | + | + | + | + | + | |
| 5г | 1,24 | 2,008 | неопред | + | + | + | - | + | |
| 6г | >3,0 | 0,026 | ВИЧ-1 | + | + | + | + | + | |
| 7г | >3,0 | 0,229 | ВИЧ-1 | + | + | + | + | + | |
| 8г | >3,0 | 0,364 | ВИЧ-1 | + | + | + | + | + | |
| 9г | >3,0 | 0,360 | ВИЧ-1 | + | + | + | + | + | |
| 10г | >3,0 | 0,157 | ВИЧ-1 | + | + | + | + | + | |
| 11г | >3,0 | 0,252 | ВИЧ-1 | + | + | + | + | + | |
| 12г | >3,0 | 1,196 | ВИЧ-1 | + | + | + | + | + | |
| 1т | 0,312 | 0,056 | отрицат | - | - | - | - | - | |
| 2т | 1,08 | 0,049 | отрицат | + | - | - | - | - | |
| 3т | 1,02 | 0,183 | отрицат | + | - | - | - | - | |
| 4т | >3,0 | 0,135 | неопред | + | + | + | + | + | |
| 5т | >3,0 | 0,325 | неопред | + | + | + | + | + | |
| 6т | >3,0 | 0,151 | ВИЧ-1 | + | + | + | + | + | |
| 7т | 1,83 | 0,053 | отрицат | - | - | - | - | - | |
| 8т | >3,0 | 0,849 | ВИЧ-1 | + | + | + | + | - | |
| 9т | >3,0 | 0,034 | ВИЧ-1 | + | + | + | + | + | |
| 10т | >3,0 | 0,024 | неопред | + | + | + | + | + | |
| 11т | 2,39 | 0,022 | неопред | + | + | + | + | + | |
| 12т | 1,97 | 0,126 | неопред | + | + | - | - | - | |
| 13т | >3,0 | 0,036 | ВИЧ-1 | + | + | + | - | + | |
| 14т | >3,0 | 0,048 | неопред | + | + | + | + | + | |
| 15т | 0,167 | 0,032 | отрицат | - | - | - | - | - | |
* - тест-система "Genscreen Plus HIV Ag/Ab" производства фирмы "Bio-Rad" (ОП крит. 0,172)
** - тест-система "Genetic Systems HIV-1 Ag" производства фирмы "Bio-Rad" (ОП крит. 0,101)
*** - тест-система "New Lav Blot I" производства фирмы "Bio-Rad"
Таблица 23. Изучение 5 простых/быстрых тестов (П/Б тестов) на сероконверсионной панели BBI № 9017
| П/Б тесты | Serodia HIV 1/2 | Deter-mine HIV1/2 | Иммунокомб II ВИЧ1+2 Биспот | Genie II HIV1 /HIV2 | Retro-check HIV WB | ||||
| Сыворотки панели | шифр | ИФА (О.П.) | иммуно-блот*** | ||||||
| анти-тела* | анти- ген** | ||||||||
| 1 | 0,032 | 0,041 | отрицат | - | - | - | - | - | |
| 2 | 0,022 | 0,046 | отрицат | - | - | - | - | - | |
| 3 | 0,041 | 0,034 | отрицат | - | - | - | - | - | |
| 4 | 0,70 | 0,035 | отрицат | - | - | - | - | - | |
| 5 | 0,113 | 0,033 | отрицат | - | - | - | - | - | |
| 6 | 0,248 | 0,036 | отрицат | - | - | + | - | - | |
| 7 | 0,822 | 0,053 | отрицат | - | - | + | - | - | |
| 8 | 2,142 | 0,110 | отрицат | - | - | + | - | + | |
| 9 | 1,824 | 0,195 | неопред | + | - | + | - | + | |
| 10 | 2,878 | 0,176 | неопред | + | + | + | + | + | |
| 11 | >3,0 | 0,085 | неопред | + | + | + | + | + | |
* - тест-система "Genscreen Plus HIV Ag/Ab" производства фирмы "Bio-Rad" (ОП крит. 0,106)
** - тест-система "Genetic Systems HIV-1 Ag" производства фирмы "Bio-Rad" (ОП крит. 0,108)
*** - тест-система "New Lav Blot I" производства фирмы "Bio-Rad"
При исследовании сывороток беременных (18 образцов), сывороток крови пациентов с диагнозом гепатит В и С (25 образцов), сывороток крови доноров (34 образца) , ни в одном случае не было выявлено ложно-положительных результатов, т.е. специфичность – 100% (табл.24).
Таблица 24. Специфичность простых/быстрых тестов (П/Б тестов) на серонегативных сыворотках
| П/Б тесты | Serodia HIV 1/2 | Determine HIV1/2 | Иммунокомб II ВИЧ1+2 Биспот | Genie II HIV1/HIV2 | Retrocheck HIV WB | |
| сыворотки | доноры | 0/34 | 0/34 | 0/34 | 0/34 | 0/34 |
| беременные | 0/18 | 0/18 | 0/18 | 0/18 | 0/18 | |
| гепатит С | 0/8 | 0/8 | 0/8 | 0/8 | 0/8 | |
| гепатит В+С | 0/5 | 0/5 | 0/5 | 0/5 | 0/5 | |
| гепатит В | 1±/12 | 0/12 | 0/12 | 0/12 | 0/12 | |
Таким образом, результаты испытаний П/Б-тестов показали, что все исследованные препараты обладают выраженной специфичностью, что особенно важно при проведении быстрого тестирования неизвестного сывороточного материала.
Можно сказать, что П/Б-тесты гарантированы, при правильной постановке и хорошем качестве сывороток, от ложно-положительных реакций.
Большинство исследованных П/Б-тестов имеют достаточную чувствительность при выявлении антител к ВИЧ-1 и ВИЧ-2, не уступающую чувствительность тест-систем для классического иммуноферментного анализа.
Это подтверждает предлагаемую ВОЗ стратегию, по которой в определенных случаях простые/ быстрые тесты (П/Б-тесты) могут с успехом заменять классический иммуноферментный анализ. При этом постановка серологического диагноза ВИЧ-инфекции ускоряется и значительно упрощается.
Весь клинический материал аттестован в лаборатории стандартизации и контроля МИБП против арбовирусных инфекций, риккетсиозов и СПИДа ГИСК им. Л.А. Тарасевича.
По-видимому, будущее серодиагностики ВИЧ-инфекции за простыми/ быстрыми тестами при условии их высокого качества, развитых и стандартизованных технологий и выраженной стабильности.
С использованием образцов крови от Российских пациентов, инфицированных ВИЧ
Центральный НИИ эпидемиологии МЗ РФ, Москва; 2 Эбботт лабориториз С. А., Москва
| Субтипы | До 1996 г. | 2001 г. | |
|---|---|---|---|
| A | 11 | 93 | |
| B | 42 | 2 | |
| C | 7 | G | 0,66 |
| G | 0,82 | ||
| F | 0,32 | ||
| F | 0,30 | ||
| F | 0,08 | ||
| F | 0,00 | ||
| F | 0,51 | ||
| F2 | 0,28 | ||
| A | 0,52 | ||
| A | 0,16 | ||
| A | 0,75 | ||
| A | 0,54 | ||
| A | 0,33 | ||
| A | 0,22 | ||
| CRF01_AE | 0,22 | ||
| CRF01_AE | 0,25 | ||
| CRF01_AE | 0,39 | ||
| CRF01_AE | 0,65 | ||
| CRF01_AE | 0,11 | ||
| CRF02_AG | 0,19 | ||
| CRF02_AG | 0,25 | ||
| CRF02_AG | 0,45 | ||
| C | 0,35 | ||
| C | 0,64 | ||
| C | 0,05 | ||
| C | 0,83 | ||
| C | > 0,63 | ||
| C | 0,53 | ||
| C | 0,42 | ||
| C | 0,09 | ||
| B | 0,06 | ||
| B | 0,20 | ||
| B | 0,04 | ||
| B | 0,08 | ||
| B | 0,01 | ||
| Mosaic | 0,46 | ||
| Mosaic | 0,63 | ||
| Mosaic | 0,28 | ||
| Mosaic | 0,38 |
В процессе испытаний было выявлено 17 образцов плазмы крови (8,2%) вне линейного диапазона "Cobas Amplicor Monitor v. 1.5": 12 образцов ниже линейного диапазона (т. е., с концентрацией менее 400 копий/мл) и 5 образцов выше линейного диапазона (т. е., с концентрацией выше 750.000 копий/мл). При анализе образцов с помощью "LCx HIV RNA Quantitative assay" было выявлено только 8 образцов ниже уровня линейного измерения (т. е., с концентрацией менее 178 копий/мл).
Типирование образцов от Российских пациентов показало, что наиболее распространенным субтипом ВИЧ в России является субтип А (93%) и в небольшом количестве присутствуют субтипы В (5%), G (1,5%) и С (0,5%). Все дискордантные результаты были получены на образцах, содержащих ВИЧ субтипа А. Причем, в 95,5% случаев результат, полученный с помощью "Cobas Amplicor Monitor v. 1.5", был выше результата, полученного с помощью "LCx HIV RNA Quantitative assay".
В настоящей работе было проведено исследование 207 образцов плазмы крови пациентов, проживающих в разных регионах России, а также панель образцов с ранее охарактеризованными субтипами которые были получены пациентов из разных стран мира.
При тестировании образцов с помощью "Cobas Amplicor Monitor v. 1.5" и "LCx HIV RNA Quantitative assay" была показана высокая корреляция результатов, что согласуется с ранее полученными данными Анализ результатов, полученных на панели образцов, содержащих разные субтипы ВИЧ, показал, что дискордантные результаты наблюдались с высокой частотой на образцах, содержащих субтипы А (50%), С (50%) и G (67%). Все дискордантные результаты, полученные на Российских образцах, соответствовали ВИЧ субтипа А (10,6%). Несоответствие частоты дискордантных результатов, полученных на панели субтипов ВИЧ и на образцах от Российских пациентов, объясняется, с одной стороны, разным распределением субтипов в этих группах (у Российских пациентов доминировал ВИЧ субтипа А 93%), а с другой стороны, специальным подбором образцов в панель субтипов. Полученные в нашей работе результаты совпадают с данными зарубежных авторов, согласно которым наибольшее количество дискордантных результатов наблюдалось на образцах, содержащих ВИЧ субтипа А [1, 2].
Читайте также: