Среда для идентификации коринебактерий дифтерии

Обновлено: 25.04.2024

Медицинская микробиология:

Микробиологическая диагностика возбудителя дифтерии (C. diphtheriae)

Микробиологическая диагностика дифтерийной инфекции основана на классическом бактериологическом исследовании, являющимся золотым стандартом. Учитывая локализацию возбудителя (слизистые оболочки открытых полостей) при выделении и идентификации С. diphtheriae необходимо проводить его дифференциацию с близкими коринебактериями — комменсалами слизистых человека, а также со сходным патогеном домашнего скота С. ulcerans. Последний вызывает маститы коров и через молочные продукты передается человеку.

Однако заражение обычно не возникает, так как С. ulcerans не колонизирует слизистые оболочки человека. Но известны редкие случаи, когда С. ulcerans выделяют из зева здоровых лиц, больных ангинами и даже от людей с дифтериеподобными поражениями зева. В последних случаях заболевание, похожее на дифтерию, вызывают штаммы, выделяющие экзотоксин, сходный с дифтерийным. С. ulcerans обладает нейраминидазой и поражающей ткани фосфолипазой. Некоторые зарубежные авторы предлагают считать С. ulcerans вариантом C.diphtheriae.

Однако экологический признак — неспособность С.ulcerans в норме колонизировать человека не позволяет объединить оба вида. Но о возможности выделения С. ulcerans у человека, больного или бактерионосителя, необходимо помнить.

Морфологически С. ulcerans представляет собой овоидные клетки, беспорядочно расположенные. Колонии на кровяном теллуритовом агаре черные с серым ободком, сухие. Биохимически С.ulcerans активен — разлагает цистин и углеводы, как С. diphtheriae биотипа gravis (глюкозу, мальтозу, крахмал, декстрин) и вдобавок обладает уреазой, но не редуцирует нитраты.

Среди коринебактерий, населяющих слизистые оболочки зева и носа, следует иметь в виду ложнодифтерийную палочку Гофманна (С. pseudodiphtheriticum), С. xerosis, С. striatum. Эти коринебактерии отличаются от С. diphtheriae неспособностью восстанавливать теллур (их колонии на теллуритовых средах серые), отсутствием фермента цистиназы, иногда наличием уреазы, а также иным отношением к углеводам. О роли этих коринебактерий как потенциальных возбудителей оппортунистических гнойно-септических инфекций будет сказано в соответствующей статье на сайте.

Возбудитель дифтерии (Corynebacterium diphtheriae)

а) Взятие материала для исследования. Материалом для исследования на наличие дифтерийных бактерий служит отделяемое пораженных участков ротоглотки и носа; при редких локализациях — отделяемое конъюнктивы, влагалища, кожных поражений.

При обследовании здоровых лиц на дифтерийное бактерионосительство берется слизь из зева (миндалины, дужки) и носа (нижние носовые ходы). Для взятия проб используют стерильные ватные тампоны, укрепленные на палочках из дерева, нержавеющей стали или алюминия. Фибринозную пленку можно снять пинцетом. Материал берется натощак или не ранее, чем через 2 ч после еды. Отделяемое слизистой ротоглотки (налеты на миндалинах, дужках, язычке), а также носоглотки берется одним тампоном, а нижних носовых ходов — другим. При подозрении на экстрабуккальную дифтерию материал из каждого поражения берется отдельным тампоном; наряду с этим обязательно взятие слизи из зева и носа.

1. Первый день исследования. Для выделения коринебактерий дифтерии применяют прямой посев ватным тампоном (сухим или смоченным в транспортной среде) на селективную агаровую среду в чашку Петри. Оптимальной является среда с добавлением 10-15% гемолизированной крови (барана, лошади, морской свинки, донора); для подавления сопутствующей флоры в среду вносят 0,04% теллурита калия (кровяной теллуритовый агар, среда Клауберга-2.

Если исследуется материал от больного с подозрением на заболевание дифтерией, то уместен посев на селективную дифференциально-диагностическую среду - цистин-теллурит-сывороточный агар (среда Тинсдейла) в чашку Петри. Преимуществом среды является возможность отбора колоний, обладающих цистиназой, то есть образующих коричневые ореолы вокруг черных колоний (за счет образования сероводорода из цистина и последующего соединения с теллуром). Среда очень демонстративна, но недостаточно чувствительна. Поэтому она не рекомендуется для выделения С. diphtheriae от бактерионосителей, из носа больных дифтерией зева др. источников.

Через 48 ч на кровяных теллуритовых средах четко выявляются различия между колониями разных биотипов. Колонии биотипа gravis — аспидно-черные 1,0-1,5 мм в диаметре; через 48 ч благодаря фестончатому краю, радиальной исчерченности и приподнятому центру напоминают цветок маргаритки. Колонии биотипа mitis черные круглые слегка выпуклые, мельче, чем колонии биотипа gravis (0,5-1,5 мм в диаметре), с ровными краями; к концу вторых суток инкубации бывают окружены валиком. Колонии биотипа intermedius — слегка конусообразные круглые 0,5-1,0 мм в диаметре, с серо-черным центром и зернистой поверхностью.

Не дожидаясь формирования различий, на 2-й день исследования (чаще через 24 ч, реже через 48 ч) отбирают несколько подозрительных колоний. Из каждой делают отсев в пробирку со скошенным сывороточным агаром и одновременно — на среды для определения токсигенности и цистиназы.

Фермент цистиназу определяют путем посева части колонии уколом в столбик агаровой среды Пизу, содержащей нормальную сыворотку, цистин (субстрат искомого фермента) и уксусно-кислый свинец. Последний играет роль индикатора, который при соединении с H₂S, образующимся при расщеплении цистина, переходит в сернистый свинец — соединение темно-коричневого цвета. Посев на среду Пизу делают даже в том случае, если колония была снята со среды Тинсдейла и обладала коричневым ореолом.

Дифтерийные бактерии никогда не образуют уреазу, расщепляющую мочевину до СО₂ и NH₃, в отличие от некоторых других коринебактерий. Для ее выявления взвесь испытуемой культуры вносят в каплю (0,1 мл) реактива Заксе, содержащего спиртовой раствор мочевины и феноловый красный (в нейтральной среде — желтого цвета). Через 30 мин инкубации при 37°С под влиянием образовавшегося гидрата аммония (NH₄OH) смесь краснеет, что говорит о наличии уреазы.

Чтобы окончательно подтвердить (или отвергнуть) эти диагнозы, а также установить биотип культуры, признанной дифтерийной, выделенную коринебактерию засевают на среды для определения сбраживания углеводов — глюкозы, мальтозы, сахарозы, крахмала и декстрина. В этот же день иногда удается определить и токсигенность по появлению линий преципитации на специальной среде с антитоксической сывороткой, куда был сделан посев в предыдущий день.

4. Четвертый день. Учитывают результаты посевов на средах с углеводами и определяют культурально-биохимический тип выделенной культуры (или подтверждают выделение С. ulcerans). Устанавливают наличие токсигенности (если это не было сделано на 3-й день) или, в случае отсутствия линий преципитации, относят изучаемую культуру к нетоксигенным.

Итак, если питательные среды приготовлены правильно, то в большинстве случаев на 3-й день исследования (т.е. через 48 ч с момента его начала) возможна выдача окончательного ответа о выделении токсигенных дифтерийных бактерий (без указания биотипа). В случаях, если рост колоний при первичном посеве задерживается до 2 сут. и/или токсигенность не выявлена через 24 ч после посева на соответствующую среду, то выдача окончательного ответа задерживается еще на 1-2 сут. (т.е. до 72-96 ч с момента начала исследования).

В случае применения транспортной среды обогащения выдача окончательного ответа задерживается на 1 сутки.

При необходимости сохранения выделенной дифтерийной культуры ее отсевают на столбик полужидкого агара с 10% нормальной сыворотки и хранят в холодильнике.

Определение чувствительности выделенной культуры к антибиотикам. Чувствительность к пенициллинам, тетрациклинам, макролидам определяется диско-диффузионным методом.

Культуральные свойства дифтерийной палочки. Культуральные особенности биоваров дифтерии. Биохимическая активность палочки Клебса-Лёффлера. Бактериоцины дифтерии.

Культуральные свойства дифтерийной палочки. Дифтерийная палочка хорошо растёт при 36-37 °С; оптимум рН 7.4-8,0. Питательные среды должны содержать аминокислоты, витамины, ионы металлов (Са2+, Mg2+ Fe2+ и др.), играющие роль ростовых факторов. На сывороточных средах (например, среде Лёффлера) дают рост уже через 10-12 ч; за это время контаминирующая микрофлора обычно не успевает развиться. Наибольшее распространение получили среды с теллуритом, так как возбудитель резистентен к высоким концентрациям теллурита калия или натрии, ингибирующим рост сопутствующей микрофлоры.

На таких средах дифтерийная палочка образует серовато-чёрные колонии в результате восстановления теллурита до металлического теллура, аккумулирующегося внутри бактерий (рис. 8, см. цветную вклейку). В жидких средах образуют помутнение и осадок; их образование и характер варьируют у различных биоваров.

Биохимическая активность дифтерии

Палочка Клебса-Лёффлера сбраживает с образованием кислоты глюкозу, мальтозу, галактозу, декстрин; не разлагает сахарозу, лактозу, маннит. Способность разлагать крахмал и гликоген варьирует у различных штаммов, что используют для внутривидовой дифференцировки.

Дифтерийная палочка не гидролизует мочевину и не образует индол. Отсутствие способности ферментировать сахарозу и разлагать мочевину — дифференцирующий признак, отличающий дифтерийную палочку от других коринебактерий. Другой дифференцирующий признак — способность разлагать цистин. С. diphtheriae продуцирует каталазу, гиалуронидазу, нейраминидазу, ДНКазу, уреазу и др.

Цистиназная активность — дифференцирующий признак дифтерийной палочки. Дифтерийная палочка лизирует эритроциты морской свинки и кролика.

Биовары возбудителя дифтерии существенно различаются по культуральным и биохимическим свойствам. Среди дифференциально-диагностических биохимических тестов наиболее часто учитывают различия в способности разлагать углеводы и мочевину.

Бактериоцины дифтерии

Дифтерийная палочка образует бактериоцины (корицины), обладающие узким спектром действия. Гены, кодирующие синтез бактериоцинов, передаются плазмидами. Бактериоцины дифтерийной палочки образуют как токсигенные, так и нетоксигенные штаммы.

- Вернуться в оглавление раздела "Микробиология."

Информация на сайте подлежит консультации лечащим врачом и не заменяет очной консультации с ним.
См. подробнее в пользовательском соглашении.

Выявление дифтерийной палочки. Принципы микробиологической диагностики дифтерии. Диагностика дифтерии. Культивирование дифтерии. Определение токсигенности дифтерийной палочки.

С целью раннего выявления дифтерии и определения носителей дифтерийной палочки необходимы выделение и идентификация возбудителя, а также определение его способности к токсинообразованию. Материалом для исследования служат дифтеритические плёнки, слизь из носоглотки или отделяемое из подозрительных поражений кожных покровов.

Забор материала на дифтерию проводят двумя стерильными тампонами: один используют для посева, с другого делают мазки и окрашивают их по Граму и Найссеру. Взятый материал следует доставлять в лабораторию не позднее чем через 3 ч.

Бактериоскопия дифтерийной палочки

Окраска по Граму не является специфичной, так как дифтерийные палочки сравнительно плохо воспринимают красители, но позволяет косвенно идентифицировать непатогенные коринебактерии, располагающиеся в виде палисада (параллельно) или в виде китайских иероглифов. Окраска по Найссеру позволяет выявить характерные зёрна Бабеша-Эрнста и отличить дифтерийную палочку от ложнодифтерийной палочки С. pseudodiphtheriticum (С. hofmannii), часто обитающей в носоглотке.

Культивирование дифтерийной палочки

Бактерии дифтерии выделяют посевом на элективные среды с теллуритом (например, Клауберга II или Маклёода), ложнодифтерийная палочка (палочка Хофманна) теллур не восстанавливает (см. рис. 8 на вклейке). Для выделения чистой культуры дифтерии часть подозрительной колонии засевают на скошенный агар (или среду Ру), вторую часть — на твёрдую питательную среду для определения токсигенности и (не обжигая петли) проводят определение цистиназной активности (проба Пизу). При положительном результате наблюдают образование коричневого облачка вокруг линии укола. Чистую культуру идентифицируют на средах Хйсса, пользуясь укороченным пёстрым рядом (глюкоза, мальтоза, сахароза, мочевина), что позволяет отличить С. diphtheriae от непатоген пых коринебактерии (рис. 14-3).

Определение токсигенности дифтерийной палочки

Определение токсигенности дифтерийной палочки in vivo. Проводят подкожным или внутрикожным заражением 0,5-1,0 мл бактериальной культуры морских свинок массой 250 г. За 24 ч до заражения одно животное иммунизируют дифтерийным антитоксином. При положительном результате неиммунизированные животные погибают в течение 3-5 сут.

Фаготипирование дифтерийной палочки

Для дифференциальной диагностики возбудителей используют набор из 9 кори нефагов. С его помощью можно типировать большинство токсигенных и нетоксигенных штаммов биовара gravis.

Группа коринебактерий включает представителей родов Corynebacterium представленные неподвижными палочковидными бактериями, способными к ветвлению.

Коринебактерии. Corynebacterium diphtheriae

Род Corynebacterium семейства Corynebacteriaceae отдела Firmicutes образуют неподвижные прямые или слегка изогнутые палочки, окружённые микрокапсулой. Большинство видов коринебактерий — облигатные паразиты слизистых оболочек — патогенные и условно-патогенные для животных и человека виды.

Возбудитель дифтерии. Дифтерийная палочка ( палочка Клебса-Лёффлера ). Дифтерия. Гаротильо

Дифтерия — острое инфекционное заболевание, вызываемое Corynebacterium diphtheriae и её токсином. Дифтерийные палочки вызывают воспаление воздухоносных путей, реже кожных покровов. Токсин палочки Клебса-Лёффлера приводит к дегенерации периферических нервов, сердечной мышцы и других тканей.

Возбудитель дифтерии — Corynebacterium diphtheriae; впервые его выделил Э. Клебс (1883), а чистую культуру возбудителя получил Ф. Лёффлер (1884).

Эпидемиология дифтерии. Распространенность палочки дифтерии

Резервуар дифтерии — человек (больной, реконвалесцент, бактерионоситель); наибольшую эпидемическую опасность представляют больные лица. Реконвалесценты выделяют дифтерийную палочку в течение 15-20 сут. Основной путь передачи дифтерийной палочки — воздушно-капельный; также возможно заражение через предметы, используемые больным, и инфицированные пищевые продукты (обычно молоко).

При комнатной температуре во влажной атмосфере палочка Клебса-Лёффлера сохраняется долго. При 60 °С дифтерийная палочка отмирает в течение 10 мин; в высушенных плёнках выдерживает температуру 98 "С в течение 1 ч, а при комнатной температуре может сохраняться до 7 мес.

На игрушках дифтерийная палочка сохраняется до 2 нед, в пыли — до 5 нед, в воде и молоке — до 6-20 сут, на рассеянном свету остаётся жизнеспособным до 8 ч. Дезинфектанты и антисептики инактивирутют возбудителя дифтерии в течение 5-10 мин.

Пик заболеваемости дифтерией приходится на осенне-зимние месяцы.

Медицинская микробиология:

Среды, тесты для выделения, культивирования и идентификации коринебактерий дифтерии

Для первичного посева материала с целью выделения дифтерийных бактерий используют агаровые среды, содержащие гемолизированную кровь (барана, лошади, кролика, морской свинки, донора) и 0,03-0,04% теллурита калия, подавляющего рост сопутствующей флоры.

Коринебактерии дифтерии восстанавливают металлический теллур из его солей, что способствует окрашиванию их колоний в черный цвет. Наиболее распространенные среды: кровяной теллуритовый агар и один из его вариантов — среда Клауберга-2.

а) Теллуритовая среда для транспортировки и обогащения проб на С. diphtheriae. Среда, применяемая при невозможности доставки материала в течение 3 ч.

Состав:
Полужидкий (0,1%) агар на питательном бульоне, соответствующем требованиям С. diphtheriae
Нормальная сыворотка лошади или крупного рогатого скота — 10%
Теллурит калия K₂TeO₃ — 0,02%

Полужидкий агар разливают в пробирки по 4,5 мл, стерилизуют при 112°С 15 мин и хранят в холодильнике (не более 2 нед.).

Цвет готовой среды бледно-желтый, среда опалесцирует.

Тампоны с материалом из зева и носа сразу после взятия погружают в транспортную среду; по доставке в лабораторию пробирки помещают в термостат для обогащения (подращивания). На другой день тампоном, слегка отжатым о стенки пробирки, делают посевы на один из вариантов кровяного теллуритового агара.

б) Кровяной геллуритовый агар.

Состав:
Агар питательный — 100,0 мл
Кровь дефибринированная гемолизированная — 10,0 мл
Теллурит калия K₂TeO₃ — 0,03-0,04 г

К расплавленному и охлажденному до 45°С питательному агару добавляют 10% дефибринированной гемолизированной крови. Гемолиз достигается путем дву- или трехкратного попеременного замораживания и оттаивания. Можно достичь гемолиза эритроцитов при помощи дистиллированной воды. Для этого дефибринированную кровь отстаивают, удаляют надосадочную жидкость (плазму); к эритроцитарной массе добавляют дистиллированную воду в объеме, равном объему осадка.

Донорская кровь непосредственно из ампулы непригодна, так как содержит различные консервирующие добавки. При необходимости могут быть использованы эритроциты из ампулы для переливания крови после трехкратного отмывания изотоническим (0,85%) раствором натрия хлорида и подвергнутые гемолизу при помощи дистиллированной воды или замораживания/оттаивания.

К смеси агара и крови добавляют теллурит калия в конечной концентрации 0,03-0,04%, используя заранее заготовленный рабочий раствор (2%) теллурита калия. Его готовят путем растворения навески в дистиллированной воде на кипящей водяной бане 30 мин. 2%-ный раствор сохраняют в холодильнике не более 1 мес. Перед употреблением в случае образования в растворе осадка его снова прогревают на водяной бане до исчезновения хлопьев. К кровяному агару добавляют 1,5-2% (по объему) 2%-ного рабочего раствора теллурита.

После тщательного перемешивания среду разливают в чашки Петри и используют для первичного посева материала из зева и носа, а также для высева из транспортной среды. Цвет готовой среды вишнево-красный. Чашки с готовым кровяным теллуритовым агаром можно хранить в холодильнике не более 7 сут.

Основные ингредиенты среды Клауберга-2 (из расчета на 100,0 мл питательной агаровой основы):

Глицериновая смесь. К 40,0 мл дефибринированной крови добавляют 20,0 мл химически чистого глицерина, стерилизованного при 110°С 30 мин

Лаковая кровь. К 34,0 мл стерильной дистиллированной воды добавляют 16,0 мл дефибринированной крови

К 100,0 мл питательной агаровой основы, расплавленной и остуженной до 45°С, добавляют 2,0 мл прокипяченного 2%-ного раствора теллурита калия, 10,0 мл глицериновой смеси и 50,0 мл лаковой крови, тщательно перемешивают и разливают в чашки Петри.

г) Цистин-теллурит-сывороточный агар (среда Тинсдейла, модифицированная).

Состав:
1-%-ный раствор цистина на 0,1N растворе серной кислоты H₂SO₄ — 12,0 мл
0,1 N раствор натрия гидроксида NaOH — 12,0 мл
2%-ный раствор теллурита калия K₂TeO₃ — 1,8 мл
2,5%-ный раствор натрия тиосульфата Na₂S₂O₃ • 5Н₂О — 1,8 мл
Питательный агар для дифтерийных бактерий, pH -7,6 — 100,0 мл
Нормальная лошадиная сыворотка — 20,0 мл

К расплавленному и остуженному до 45°С питательному агару, pH-7,6-7,8, асепетически добавляют ингредиенты в следующей последовательности: раствор цистина, щелочь, раствор теллурита, раствор тиосульфата, нормальная сыворотка. После внесения каждого ингредиента среду тщательно перемешивают. Незастывшую среду разливают в чашки Петри. Среда должна быть полупрозрачна, кремовожелтого цвета.

С. diphtheriae через 24-48 часов инкубации вырастает в виде мелких (1 мм) черных блестящих колоний, окруженных черно-коричневым ореолом (за счет образования сероводорода). Среда применяется для посева материала только от лиц с подозрением на заболевание дифтерией. Для выявления бактерионосителей среда непригодна по причине ее низких ростовых качеств.

Среду используют для посева материала от больного с подозрением на заболевание дифтерией. Для этого ватный тампон, содержащий исследуемый материал (пленки, слизь из зева, носа, с поверхгости некротических участков и т.д.) вначале окунают концом в конденсационную воду, затем втирают в поверхность свернутой сыворотки. Через 6 часов инкубации дифтерийные бактерии вырастают в виде мелких точечных выпуклых колоний практически в чистой культуре, а сопутствующая флора еще не заметна. Из колоний готовят препараты-мазки, окрашенные синью Лёффлера. Среда может использоваться и для выращивания чистых культур С. diphtheriae.

е) Сывороточный агар (среда для культивирования чистых культур С. diphtheriae). К расплавленному и охлажденному до 45°С питательному агару добавляют 10% нормальной сыворотки лошади или крупного рогатого скота (стерильной или с консервантом — хлороформом). Среду разливают в пробирки по 2,5-3,0 мл и дают застыть в скошенном состоянии. Цвет готовой среды бледно-желтый (сходен с цветом исходной агаровой основы). Пробирки со скошенным сывороточным агаром могут храниться в холодильнике не более 6 дней.

ж) Реактивы и постановка теста на уреазу но методу Заксе. Готовят два раствора: раствор мочевины в спирте (реактив А) и водный забуференный раствор индикатора фенолового красного (реактив И).

Реактив А. Мочевина — 2,0 г
Этиловый спирт 96° — 2,0 мл
Вода дистиллированная — 4,0 мл
Реактив не стерилизуют, хранят в холодильнике.

Реактив В. 0,2%-ный раствор фенолового красного — 1,0 мл
Калия фосфат однозамещенный (KH₂PO₄) — 0,1 г
Калия фосфат двузамещенный (K₂HPO₄ • H₂O) — 0,1 г
Натрия хлорид — 0,5 г
Вода дистиллированная — 99,0 мл

Реактив стерилизуют однократно текучим паром 15 мин, хранят в холодильнике.

В стерильную пробирку вносят ex tempore 19 частей раствора В и 1 часть раствора А, смесь разливают в узкие пробирки по 0,1 мл, по числу испытуемых культур. В каждую пробирку вносят по нескольку петель испытуемой культуры (до помутнения жидкости). Пробирки помещают в термостат на 30 мин. При положительной реакции (наличии уреазы) смесь в пробирке приобретает красный цвет.

з) Среда Пизу (для определения цистиназы у коринебактерий). При невозможности использовать сухую коммерческую среду Пизу ее можно приготовить в лаборатории самостоятельно. В качестве основы берут 1,5%-ный питательный агар, приготовленный для С. diphtheriae на бульоне Мартена, среде ЛГВ, гидролизате казеина, рыбной муке или сухой агар для определения токсигенности. Реакция агаровой основы pH 7,6.

Состав:
1,5%-ный агар на бульоне Мартена или другой питательной основе, пригодной для дифтерийных бактерий, pH 7,6;
1%-ный раствор L-цистина в 0,1 N растворе H₂SO₄ или НС1;
0,1 N раствор NaOH;
10%-ный раствор ацетата свинца, свежеприготовленный и стерилизованный дважды текучим паром;
нормальная лошадиная или бычья сыворотка.

К 90,0 мл расплавленной (при 90°С) или свежесваренной питательной агаровой основы добавляют 2,0 мл 1%-ного раствора L-цистина в кислоте. Смесь перемешивают и добавляют к ней 2,0 мл 0,1 N раствора NaOH. После определения и подправления pH до 7,6 среду стерилизуют при 112°С в течение 30 мин и хранят в холодильнике. При необходимости агаровую среду расплавляют, охлаждают до 45-50°С и стерильно добавляют к ней 1,0 мл 10%-ного раствора ацетата свинца; смесь тщательно перемешивают, добавляют к ней 9,0 мл нормальной сыворотки и разливают в стерильные агглютинационные пробирки по 2,0-3,0 мл. Хранят в холодильнике.

В качестве 0,1 N растворов кислоты и щелочи можно использовать соответствующие фиксаналы.

Среда непрозрачна, имеет желтоватый цвет (цвет питательного агара).

Посев испытуемой культуры производят уколом. Через 20-22 ч по уколу и вокруг него на расстоянии 1,0 см от поверхности образуется темно-коричневое облачко ацетата свинца, окутывающее зону роста и свидетельствующее о расщеплении цистина. При отсутствии цистиназы потемнения среды не наблюдается.

и) Среда для определения токсигенности С. diphtheriae. В качестве основы используют пептон Мартена — продукт самопереваривания свиных желудков, смешанный с равным объемом мясной воды двойной концентрации (1 кг мясного фарша и 1000,0 мл воды), уплотненный агаром 1,5%. Для приготовления этой среды используют агары светлых сортов, обеспечивающих прозрачность. Среду категорически запрещается готовить в железной посуде (или в эмалированной посуде с выщербленной эмалью).

Навеску агара промывают в проточной воде в течение рабочего дня.

После 30-минутного подсушивания чашки засевают вдоль полоски с антитоксином испытуемыми колониями, снятыми непосредственно с кровяного теллуритового агара; каждую колонию засевают в виде отдельной бляшки.

Приготовление бумажек с крезоловым красным 0,1 г крезолового красного растворяют в 100,0 мл 95%-ного спирта и оставляют при температуре 37°С на 24 ч, часто встряхивая. На следующий день смачивают в этом растворе полоски фильтровальной бумаги и быстро высушивают. Ярко-желтый цвет бумажек в щелочной среде переходит в разные оттенки красного.

к) Приготовление раствора антитоксической сыворотки. Берут ампулу лечебной антитоксической противодифтерийной сыворотки (10 000 МЕ/мл), содержимое переносят в стерильную пробирку, куда добавляют стерильный изотонический (0,5%) раствор натрия хлорида до общего объема 10,0 мл. Полученный рабочий раствор, содержащий 1000 ME в 1,0 мл, хранят в холодильнике (не более 1 мес.). Перед постановкой теста на токсигенность из рабочего раствора стерильно отбирают объем, необходимый для приготовления нужного числа чашек. Отобранный объем разводят в 2 раза до конечной концентрации 500 МЕ/мл. Так, для приготовления двух чашек берут 0,25 мл исходного рабочего раствора, содержащего 1000 МЕ/мл, а для 5 чашек — 0,625 мл и т.д„ после чего рабочий раствор разводят вдвое (т.е. до 500 МЕ/мл).

Лежащие в пустой стерильной чашке стерильные полоски фильтровальной бумаги пропитывают полученным раствором антитоксина (500 МЕ/мл) — по 0,25 мл на каждую полоску (т.е. по 125 ME). Обожженным пинцетом полоски накладывают на агаровую среду по диаметру чашки Петри.

Читайте также: