Среда питательная для выделения трихомонад жидкая
Обновлено: 24.04.2024
Резюме. Лабораторная диагностика трихомониаза - обязательная составляющая при постановке диагноза урогенитальный трихомоноз. Обзор освещает диагностические методы, направленные на выявление простейшего, антигенов T.vaginalis, специфических антител и ДНК возбудителя. Отражены существующие проблемы в интерпретации результатов и сведения об эффективности применения того или иного метода в алгоритме обследования пациентов.
Ключевые слова: лабораторная диагностика, урогенитальный трихомониаз.
The laboratory diagnostic of genitourinary trichomoniasis (literature review)
Abstract. The laboratory diagnostics of trichomoniasis is strongly recommended for the diagnosis confirmation. Current review summarizes diagnostic methods directed to identification by morphology of protozoa, by antigenic properties of T.vaginalis, by specific antibodies and by the pathogen DNA detection. Overview reflects the existing problems in the interpretation of results and information about the efficacy of each method in the patient's examination algorithm.
Key words: laboratory diagnostics, urogenital trichomoniasis.
Трихомониаз в структуре ИППП
Одно из центральных мест в структуре заболеваемости инфекциями, передающимися половым путем, занимает трихомоноз. Он широко распространен в странах Африки, Южной и Юго-Восточной Азии, а также в странах с большим притоком эмигрантов. В последние годы продолжается положительная тенденция к снижению уровня заболеваемости трихомонозом, однако отмечается рост скрытых и малосимптомных форм инфекции, затрудняющих своевременную диагностику трихомониаза и лечение [7,11].
Особенно распространен трихомоноз среди женщин [33], однако вопрос о значении T.vaginalis в патологии беременности остается открытым из-за противоречивости информации по этому вопросу [23,26]. Клиническая картина урогенитального трихомоноза характеризуется отсутствием специфических признаков и примерно у 50 % инфицированных трихомонозом имеет место бессимптомный характер течения заболевания, т.е. возможно трихомонадоносительство [49]. Недовыявление трихомонад - причина неконтролируемого их распространения среди сексуально активного населения. В результате это приводит к развитию хронических орхоэпидидимитов и простатитов у мужчин, а также хронических аднекситов у женщин, что в итоге может служить причиной бесплодия, невынашивания беременности, патологии новорожденных [25,29].
Трихомоноз имеет важное медицинское, социальное и экономическое значение не только из-за высокой распространенности инфекции, но и из-за доказанной роли T.vaginalis как кофактора ВИЧ-инфекции и рака шейки матки [33].
Сравнительный анализ лабораторных методов диагностики трихомониаза
Диагностика урогенитального трихомониаза основывается на обнаружении в исследуемом материале T.vaginalis. Диагноз не может быть поставлен исключительно на основании клинической картины, поскольку патогномоничные симптомы встречаются только у 2 % пациенток. Ещё в 1980 году были представлены результаты, свидетельствующие о том, что если диагноз трихомоноза устанавливать только на основании клинической картины, то 88 % инфицированных T.vaginalis женщин будет дан ложноотрицательный результат, а у 29 % неинфицированных диагноз был бы поставлен ошибочно [27]. В связи с тем, что клинические симптомы зачастую не отражают реальной картины заболевания, в обязательном порядке необходимо применение лабораторных методов диагностики трихомониаза, причем актуальна задача своевременного проведения исследования.
До настоящего времени в соответствии с протоколом ведения больных урогенитальным трихомониазом [14] основными методами обнаружения трихомонад являются микроскопический и культуральный, т.е. прямая идентификация возбудителя в мазке либо при культивировании на питательной среде. Но сложилась парадоксальная ситуация: при высоком уровне заболеваемости трихомонозом в России отсутствует производственный выпуск стандартных, разрешенных к применению препаратов и питательных сред для диагностики трихомониаза. В практике используют зарубежные среды, что влияет на стоимость исследования, или приготовленные по прописям в лабораториях, что влияет на воспроизводимость и достоверность получаемых результатов.
Диагностика трихомониаза существенно осложнилась в последние годы в связи с распространенностью нетипичных округлых форм T.vaginalis, обнаруживаемых при световой микроскопии витальных препаратов [3].
Роль микроскопического метода при постановке диагноза
Исторически микроскопия - это первый метод в лабораторной диагностике трихомоноза. Его использование экономически целесообразно в силу простоты и возможности одновременного просмотра мазка и на другие возбудители. Микроскопия может производиться в нативном препарате или в препарате, окрашенном по различным методикам. Нативный препарат необходимо исследовать в течение 10 минут после забора материала, поскольку утрачивается подвижность возбудителя, клетка округляется и получение однозначного результата затрудняется [30]. В положительных случаях микроскопии нативного препарата трихомонады обнаруживаются в виде грушевидной, овальной или округлой формы по величине несколько превосходящей лейкоциты [5]. Для подвижных форм характерны толчкообразные движения за счет жгутиков и ундулирующей мембраны, которые особенно хорошо видны при исследовании в микроскопе с темнопольным конденсором. Необходимо отличать подвижность T.vaginalis от подвижных жгутиковых представителей семейства Bodonidae. Подвижные бактерии, прикрепленные к лейкоцитам и создающие ложное впечатление движения, также вероятно ошибочно идентифицировать как крупную трихомонаду.
Микроскопия окрашенных препаратов несколько повышает процент выявления трихомонад по сравнению с нативными препаратами в силу того, что учитываются не только типичные жгутиковые, но и амастиготные формы. Кроме того окрашенные препараты можно использовать для косвенной оценки воспалительного процесса - скопление лейкоцитов на клетках плоского эпителия или вокруг них. Еще один косвенный признак урогенитального трихомоноза - наличие большого количества слизи в исследуемом материале [6]. Правда, с увеличением количества лейкоцитов в отделяемом из уретры у мужчин больных урогенитальным трихомонозом, вероятность получения ложноположительных результатов культуральным и микроскопическим методами увеличивается [12].
В препаратах, окрашенных метиленовым синим, трихомонады наблюдаются в виде округлой или овальной формы, расположенные в слизи между клеточными элементами. Четко просматривается оболочка паразитов, эксцентрично расположенное ядро, интенсивно окрашенное в синий цвет, протоплазма - светло-синяя, вакуоли - бесцветные. При таком способе окраски трихомонады имеют характерный вид и хорошо распознаются [8]. Для более детального просмотра клетки и выявления хорошо идентифицируемых жгутиков следует использовать дифференциальные методы окраски по Романовскому-Гимзе, Лейшману.
В целом микроскопия нативного препарата считается высокоспецифичным тестом (99,8 %), но имеет низкую чувствительность - от 38 % до 82 %. [1,10 ,17,48]. Во многом это связано с высокой долей субъективизма при визуальной оценке результатов.
Питательные среды для культурального исследования
В связи с низкой чувствительностью микроскопического метода и в соответствии с протоколом ведения больных урогенитльным трихомониазом [14] идентификацию T.vaginalis следует проводить культуральным методом, считающимся, по мнению большинства исследователей, "золотым стандартом".
Первое in vitro культивирование T.vaginalis было проведено в 1915 г [36]. С тех пор разработаны разные варианты жидких и полужидких питательных сред для диагностики трихомониаза: среда Джонсона-Трасселя (СPLM), Даймонд среда, модифицированная Даймонд среда с добавлением тиогликолята натрия, среда Купферберг STS, среда Купферберг Difco, среда InPouch TV, среда TYM.
Известна попытка создания бессывороточной питательной среды для культивирования трихомонад [35]. Была предложена синтетическая питательная среда, в которой лошадиная сыворотка была заменена на бычий сывороточный альбумин и холестерин, совместно либо с глицериновыми жирными кислотами, либо со смесью жирных кислот. Однако на такой модифицированной среде скорость роста и урожай T.vaginalis были низкими.
В 70-80-х годах прошлого века в отделе микробиологии ЦНИИКВИ была разработана модифицированная среда Джонсона-Трасселя - среда СКДС [5]. В состав этой среды входят: смесь гидролизата казеина и гидролизина или аминопептида, отходы фармацевтической промышленности при изготовлении лизоцима, ферментативный гидролизат биомассы микроорганизмов, а также экстракт кормовых дрожжей. Коммерчески среда СКДС не выпускается.
В настоящее время отечественные производители выпускают следующие готовые питательные среды: питательная среда для выявления влагалищных трихомонад (ООО "Диагност-Мед", г. Омск), основа питательной среды для культивирования трихомонад (НПО "Микроген", г. Махачкала) и питательная среда СВТ для визуальной диагностики трихомониаза (НИИЭМ имени Пастера, г. Санкт-Петербург).
Исследования, посвященные сравнению питательных сред, немногочисленны. Так, в США в 1989 г. были проведены сравнительные испытания питательных сред, используемых для культивирования T.vaginalis. В качестве посевного материала они использовали клинические образцы вагинальных секретов от больных трихомонозом [43]. Частота обнаружения на разных питательных средах была следующей: Даймонд среда (93,9 %), модифицированная Даймонд среда с добавлением тиогликолята натрия (92,3 %), среда Купферберг STS (38,5 %) и среда Купферберг Difco (49,2 %). Были отмечены высокие ростовые свойства питательной среды Даймонд и положительный эффект добавления. Авторы, однако, указывают на низкую селективность исследованных питательных сред в отношении дрожжеподобных грибов (в 32 % случаев наблюдался рост дрожжеподобных грибов).
В Англии в 1997 г было проведено сравнительное исследование чувствительности питательных сред InPouch TV, Diamond и Джонсона-Трасселя [21]. В 4 мл каждой из трех сред добавляли по 30 мкл инокулюма. Результат оценивали на первые, вторые и четвертые сутки. Было показано, что наибольшей чувствительностью обладает питательная среда InPouch TV (87 %) по сравнению с Diamond (60 %) и Джонсона-Трасселя (57 %).
Культуральная диагностика трихомониаза напрямую зависит от выпускаемых питательных сред. В оптимальном алгоритме лабораторной диагностики обязательной ступенью должно быть культуральное исследование, причем с использованием качественных стандартизированных питательных сред [9]. Этот вывод подтверждается исследованиями, проведенными в 1990 г в ЦНИКВИ [2], которые показали, что подавляющее число больных трихомонозом (72,8 %), как среди женщин, так и среди мужчин, были выявлены при использовании культурального метода.
Методы, основанные на выявлении антигенов
Использование иммунохимических методов обнаружения антигенов возбудителя, таких как иммуноферментный анализ (ИФА) и реакция иммунофлуоресценции (РИФ), особенно актуально в случаях невозможности проведения культурального исследования или при расхождении результатов культурального и микроскопического методов.
Было показано, что чувствительность РИФ ниже, чем культурального исследования, но выше микроскопии нативного препарата [44]. Однако эта во многом субъективная методика к тому же требует отдельной обработки каждого мазка и люминесцентного микроскопа. Одновременная обработка всех проб в планшете и автоматическая детекция цветовых продуктов ферментативной реакции исправили некоторые основные недостатки РИФ.
В работах 80-х годов ИФА давал соизмеримый с культуральным методом процент положительных результатов. Однако авторы указывали, что из-за очевидной гетерогенности изолятов T.vaginalis при описываемых ими условиях ни один из них не имеет моноклональных антител, способных связываться с антигенами в клинических образцах [31,47]. Использование в качестве антигена отдельных иммуногенных белков для получения моноклональных антител несколько изменило сложившееся представление, и была продемонстрирована возможность обнаружения почти 90 % из протестированных клинических изолятов с положительным ответом.
Кроме того, явное преимущество этого метода перед методом "золотого стандарта" - это отсутствие строгих температурных требований. Авторы отмечают, что, возможно, важным звеном в получении достоверного результата служит процедура получения клинического материала, и важно использовать для образца буферный раствор, вследствие того, что помещение организма в фосфатно-солевой буферный раствор позволяет ему освобождать антигенную детерминанту, необходимую для связывания с антителом. Из этого следует, что ранее приписываемая гетерогенность T.vaginalis может быть обусловлена недоступностью антигенных детерминант для антитела, а не отсутствием антигена на поверхности трихомонады [34].
Стоит подчеркнуть, что в России отсутствуют коммерческие разрешенные к применению ИФА и РИФ тест-системы для диагностики трихомониаза.
Диагностическая ценность серологического метода
Изучением иммунологии трихомоноза занимаются уже долгое время [3]. В литературе мало информации о природе иммунного ответа при трихомонозе, неизвестно влияние макро и микроорганизмов на наличие или отсутствие симптомов. Однако понятно, что природа этого механизма неоднозначна и многообразна [20].
Большая часть противотрихомонадных антител принадлежит к IgG-классу [37]. Тем не менее, в сыворотках больных женщин выявляют повышенное содержание специфических IgM, и IgA антител, а при остром трихомонозе в вагинальных смывах отмечается увеличение IgA [28]. Для определения противотрихомонадных антител у пациентов в разные годы пытались использовать реакцию связывания комплимента (РСК) [18], внутрикожную пробу [8], реакцию пассивной гемагглютинации (РПГА) [32, 37, 38], реакцию непрямой иммунофлуоресценции (РНИФ) [13].
В 1981 году для серодиагностики трихомоноза впервые был использован метод иммуноферментного анализа (ИФА). При использовании в качестве "подложки" цельноклеточного антигена чувствительность составила всего 80,4 % [45]. Позднее были предприняты попытки использовать в качестве антигена цистеиновые протеиназы T.vaginalis, поскольку предполагается, что они вовлечены в патогенез. Специфичность в этом случае составила 100 %, однако чувствительность не превысила 90 % [20, 46].
В России подобных работ не проводилось, и, по мнению наших исследователей, чувствительность метода составляет чуть более 30 %, и его использование может быть рекомендовано только в качестве вспомогательного теста [16]. Низкая эффективность серологических методов в диагностике трихомониаза связана также с тем, что антитрихомонадные антитела могут циркулировать в сыворотке крови в течение длительного времени после лечения, а значит, практически невозможно дифференцировать текущую и пролеченную формы заболевания [19].
Методы, основанные на выявлении нуклеиновых кислот. Методы генодиагностики на основе определения специфических нуклеотидных последовательностей (мишеней) ДНК возбудителя появились сравнительно недавно. Уже в 1992 Riley D. E. впервые сообщил об использовании ПЦР в диагностике трихомоноза [41]. В работе было показано, что этот метод при использовании электрофоретического способа регистрации результатов помогает выявлять от 10 до 100 трихомонад в исследуемом материале.
Чувствительность и специфичность ПЦР во многом обусловлена правильным выбором мишеней для амплификации [42]. В наибольшей степени исследованные локусы в геномах простейших - это гены рибосомальных РНК, отличающиеся мультикопийностью (254 копии 18S рРНК/на клетку T.vaginalis) [22]. Наряду с геном 18S pРНК исследован ген бета-тубулина T.vaginalis. Использование праймеров из этого гена обеспечивало чувствительность равную 98 % в сравнении с культуральным методом системы InPouch [39]. Вместе с тем, оценивая эффективность праймеров, следует учитывать генетически обусловленную внутривидовую вариабельность Т.vaginalis. Сравнение пяти наборов диагностических праймеров показало, что чувствительность ПЦР, в первую очередь, зависит от выбора праймеров и, в меньшей степени, от способа регистрации результата: иммуноферментный метод детекции продуктов ПЦР показал лучший результат, чем электрофорез в геле [24].
Согласно современным представлениям, применение метода ПЦР оправдано при диагностике латентного течения трихомоноза, для выявления Т.vaginalis при микст-инфекции урогенитального тракта, при скрининговых исследованиях (в комплексе с микроскопическим методом), а также для контроля качества микроскопического исследования. В целом, эффективность диагностики существенно повышается при использовании ПЦР в сочетании с культуральным и/или микроскопическими методами исследования.
Заключение
Из-за отсутствия четкой клинической картины при хронических и стертых формах трихомоноза только лабораторные методы выявляют этиологический агент и устанавливают диагноз заболевания. В лабораторной диагностике острого трихомоноза при наличии в исследуемом материале типичных форм паразитов микробиологические методы дают однозначно интерпретируемые результаты, тогда как хронический трихомоноз, обусловленный неподвижными округлыми трихомонадами, представляет определенные трудности и требует использования комплекса лабораторных методов. Отметим, что, при очевидных преимуществах ПЦР, основным референс методом остается культуральное исследование.
Назначение набора для визуального выявления Trichomonas vaginalis
Набор СВТ предназначен для выявления Trichomonas vaginalis в отделяемом из цервикального канала и влагалища, в семенной жидкости, в секрете предстательной железы, в отделяемом уретры и в центрифугате мочи.
Набор рассчитан на проведение 100 определений наличия Trichomonas vaginalis в исследуемом материале.
Принцип метода
Метод определения основан на использовании питательной среды, компоненты которой обеспечивают оптимальные условия для роста Trichomonas vaginalis до количеств, необходимых для их визуальной оценки с помощью микроскопа, а селективный компонент подавляет рост простейших грибов и большинства представителей бактериальной флоры, потенциально содержащихся в образце.
Состав набора для визуального выявления Trichomonas vaginalis
Меры предосторожности при работе с набором для визуального выявления Trichomonas vaginalis
Потенциальный риск применения набора - класс 2а.
Набор СВТ предназначен только для in vitro диагностики. Компоненты набора в используемых концентрациях являются нетоксичными.
При работе с набором следует соблюдать "Правила устройства, техники безопасности, производственной санитарии, противоэпидемического режима и личной гигиены при работе в лабораториях (отделениях, отделах) санитарно-эпидемиологических учреждений системы Министерства здравоохранения СССР" (Москва, 1981 г.).
Оборудование и материалы для работы с набором для визуального выявления Trichomonas vaginalis
- термостат, поддерживающий температуру 37 ± 1 °С;
- дозаторы пипеточные или пипетки стеклянные.
Проведение анализа на базе набора для визуального выявления Trichomonas vaginalis
- Приготовление жидкой питательной среды
Во флакон с лиофилизированной питательной средой для выделения Trichmonas vaginalis добавить 100 мл дистиллированной воды. Содержимое флакона перемешать до полного растворения (в течение 1 мин.). Полученный прозрачный раствор от светло-соломенного до янтарного цвета разлить по 1 мл в пробирки для микропроб, закрыть и хранить до применения при температуре 2 - 8 °С не более 1 недели или при температуре минус 7 °С и ниже не более 3 месяцев.
Помутневшие в процессе хранения среды использовать для определения нельзя!
Перед взятием материала для посева обследуемому пациенту необходимо, по крайней мере, на 1 - 2 дня исключить применение местного лечения; в противном случае это может повлиять на результаты культивирования.
У мужчин материал отбирать после длительного воздержания от мочеиспускания в течение времени не менее 3 - 4 часов. Отделяемое слизистой оболочки брать петлей из глубины уретры, предварительно очистив ее отверстие тампоном, смоченным изотоническим раствором хлорида натрия. При малом количестве выделений до взятия материала необходимо провести массаж уретры в дистальном направлении.
У женщин образец из уретры и цервикального канала отбирать в зеркалах ватным тампоном, специальной щеточкой или ложечкой. Необходимо тщательно очистить наружное отверстие цервикального канала (при помощи большого марлевого тампона) от вагинальных выделений для предотвращения возможной контаминации.
Для более успешной диагностики забор материала необходимо производить из разных очагов поражения (уретра, предстательная железа и семенные пузырьки – у мужчин, влагалище, уретра, цервикальный канал - у женщин) в сочетании с анализами центрифугата свежесобранной мочи.
1 Методические указания № 2003/34 "Обеспечение качества подготовки образцов биологических материалов для цитологических исследований", МЗ РФ, Москва, 2003 г.
Посев материала в маркированные пробирки с предварительно прогретой до 37 °С питательной средой осуществлять щеточкой или тампоном однократного применения.
Пробирки со средой сразу после посева поместить в термостат при температуре 37 °С. Рекомендуется проводить просмотр сред на наличие Trichomonas vaginalis через 48 - 96 часов после посева, при отрицательном результате - еще через 7 - 10 дней.
При обильном росте Trichmonas vaginalis можно обнаружить методом микроскопии уже через 48 часов после посева. Наиболее интенсивно трихомонады размножаются в придонном слое среды, поэтому при контроле посевов материал надо брать с помощью пастеровской пипетки со дна пробирки, после чего на предметном стекле приготовить препарат "раздавленная капля" и просматривать в затемненном поле микроскопа при увеличении в 400 - 600 раз. При обильном росте в поле зрения можно видеть 5 - 50 и более трихомонад. При микроскопии среди клеточных элементов (эпителий, лейкоциты) трихомонады различают по их форме (грушевидная, овальная), характерны толчкообразные, поступательные и вращательные движения за счет жгутиков и ундулирующей мембраны.
Набор включает сухую питательную среду для выделения, идентификации Trichomonas vaginalis в образцах отделяемого из цервикального канала и влагалища, семенной жидкости, секрета предстательной железы, отделяемом уретры и в центрифугате мочи. Комплект №1 предназначен для одноэтапного визуального выявления, рассчитан на 100 определений
Функциональное назначение
Метод определения основан на использовании питательной среды, компоненты которой обеспечивают оптимальные условия для роста урогенитальных трихомонад до количеств, необходимых для их визуальной оценки с помощью микроскопа, а селективный компонент подавляет рост простейших грибов и большинства представителей бактериальной флоры, потенциально содержащихся в образце.
При обильном росте T. vaginalis можно обнаружить методом микроскопии уже через 48 часов после посева. Наиболее интенсивно трихомонады размножаются в придонном слое среды, поэтому при контроле посевов материал надо брать с помощью пастеровской пипетки со дна пробирки, после чего на предметном стекле приготовить препарат "раздавленная капля" и просматривать в затемненном поле микроскопа. При микроскопии среди клеточных элементов (эпителий, лейкоциты) трихомонады различают по их форме (грушевидная, овальная), характерны толчкообразные, поступательные и вращательные движения за счет жгутиков и ундулирующей мембраны.
Рекомендованный набор красителей для окрашивания по Граму.
В препаратах, окрашенных метиленовым синим, трихомонады наблюдаются в виде округлой или овальной формы, расположенные в слизи между клеточными элементами. Четко просматривается оболочка паразитов, эксцентрично расположенное ядро, интенсивно окрашенное в синий цвет, протоплазма - светло-синяя, вакуоли - бесцветные. При таком способе окраски трихомонады имеют характерный вид и хорошо распознаются. Для более детального просмотра клетки и выявления хорошо идентифицируемых жгутиков следует использовать дифференциальные методы окраски по Романовскому-Гимзе, Лейшману.
Технические характеристики
Среду Джонсона-Трасселя CPLM с цистеиновым пептон-печеночным переваром и мальзой без агар-агара и метиленового синего используют для селективного выделения культур трихомонад, вызывающих урогенитальный трихомониаз (Trichomonas vaginalis). Жидкую среду рекомендовано дополнить добавками лошадиной сыворотки и антибиотиков
Функциональное назначение
Трихомонады относятся к простейшим микроорганизмам жгутиконосцам. Являются возбудителем трихомониаза, инфицирует влагалище, мочеиспускательный канал у женщин, предстательной железы у мужчин. Трихомонады плохо выживают в транспортных средах, часто умирают от пересушивания тампона с образцом. Оптимально сразу же после забора образца пробу погружать в пробирку со средой, дополненной лошадиной сывороткой (RM1239), стрептомицином и пенициллином (FD094, FD099). Твердые среды для их культивирования обязательно содержат высокую концентрацию солей, питательных компонентов, восстанавливающих агентов и антибиотиков для подавления роста сопутствующих бактерий при отсутствии или низкой концентрации кислорода. Trichomonas vaginalis является анаэробным, не содержащим каталазу микроорганизмом.
Johnson и Trussell рекомендовали состав CPLM (цистиновый пептон-печеночный перевар с мальтозой) без агар-агара и метиленового синего. Печеночный и пептический перевар животной ткани служат источником азотистых питательных веществ, микроэлементов и других необходимых факторов роста. L-Цистеина гидрохлорид является редуцирующим веществом. Антибиотики подавляют рост бактерий, способствуя росту простейших. Для культивирования в анаэробных условиях требуется вносить массивный инокулюм
Технические характеристики
Читайте также: