Темнопольная микроскопия при сифилисе

Обновлено: 15.04.2024

Диагностика сифилиса имеет свои специфические черты и определенные методы. Поставить диагноз сифилис можно при наличии соответствующей клинической картины, а также при подтверждении со стороны дополнительных методов исследования – серологической, ПЦР-диагностики, микроскопического исследования. Микроскопия – наиболее давний метод диагностики большинства инфекционных заболеваний. В случае диагностики сифилиса используется темнопольная микроскопия, которая позволяет увидеть даже живые микроорганизмы.

Возбудителем сифилиса является бледная трепонема (бледная спирохета). Этот микроорганизм находится в межтканевом пространстве, между волокнами соединительной ткани, окружают русла лимфатических и кровеносных сосудов. Для того, чтобы точно определить наличие возбудителя сифилиса, биологический материал забирается для исследования с элементов сыпи, поверхности шанкров и со слизистых оболочек гениталий, ротовой полости и прямой кишки. В альтернативном случае возможен забор материала с лимфатических узлов (пункция узла).

Для того, чтобы исследование на сифилис в темном поле (темнопольная микроскопия) было максимально информативным, перед тем как собрать материал проводится гигиеническая обработка поверхности язвы или эрозии. В этом месте, с пораженной поверхности выделяется содержимое, в котором в большом количестве находится возбудитель. Ускорить процесс выделения, можно надавив на край раны. Если поверхность не повреждена, материал собирается путем поскабливания эрозии скальпелем.

Полученный биологический материал переносится на предметное стекло, изготавливается мазок, который затем и подвергается исследованию под микроскопом.

Темнопольная микроскопия ( Dark-field microscopy) – это микроскопический метод, который выполняется с помощью специального темнопольного микроскопа. — темнопольная микроскопия — это микроскопическое исследоваДанный метод получил свое широкое применение в диагностике сифилиса и некоторых других заболеваний в связи с тем, что спирохеты имеют плохую способность к окрашиванию красителями и их можно увидеть только при правильном направлении света. К тому же, темнопольная микроскопия позволяет увидеть бледную трепонему в живом состоянии.

Темнопольная микроскопия также является и одним из самых дешевых методов диагностики сифилиса. В ходе исследования, на предметное стекло направляется узкий пучок яркого света (при помощи конденсатора). Свет падает практически сбоку от препарата, а исследователь в объективе видит темное поле. Спирохеты в свою очередь отражают и преломляют этот свет (феномен Тиндаля), что образует интересный оптический эффект – трепонемы начинают выглядеть как светящиеся подвижные спирали с несколькими завитками.

Особую важность данный метод темнопольной микроскопии имеет при диагностике первичного серонегативного сифилиса (при отрицательных результатах КСР),при диагностике нейросифилиса (обнаружение спирохеты в ликворе) и диагностике реинфекции сифилиса.

Специальной подготовки со стороны пациента не следует. В случае выявления эрозий или шанкров в области половых органов, перед исследованием необходимо провести гигиеническую обработку этих областей.

Наличие у пациента эрозий и язв при подозрении на заражение бледной трепонемой (сифилисом)

Диагноз сифилиса подтверждается при обнаружении во время исследования бледных трепонем.

Существующие методы лабораторной диагностики сифилиса.

Сифилис является одной из самых известных и опасных венерических болезней. Сложно найти инфекцию, для лабораторных исследований которой применялся бы такой широкий спектр методов, как для сифилиса.

Лабораторное распознавание сифилиса отличается от диагностики других бактериальных инфекций тем, что, в отличие от многих патогенных микроорганизмов, Тreponema pallidum очень требовательна к составу искусственных питательных сред, и на обычных средах не размножается. Она растет на средах, содержащих почечную или мозговую ткань, в строго анаэробных условиях при температуре 35 °С.

Поэтому культивирование бледных трепонем на искусственных питательных средах возможно, но требует сложных специальных сред и анаэробной установки. При этом культуральные бледные трепонемы быстро теряют свою болезнетворность и меняют биологические (биохимические, физиологические) и морфологические свойства. Методы стабильного получения культур до настоящего времени отсутствуют.

Невозможность культивирования патогенных трепонем заставляет искать альтернативные методы определения микроорганизмов или антител к ним. Наряду с традиционными, открытыми в начале 20-го века, разрабатываются новые, более чувствительные и специфические методы. Эти методы должны удовлетворять следующим требованиям:

Разработанные к настоящему времени методы лабораторной диагностики сифилиса можно классифицировать различным образом. Они могут быть разделены по различным критериям:

прямые и непрямые (косвенные);
тесты на антитела и прямые тесты на антиген;
трепонемные (специфические) и нетрепонемные (неспецифические);
отборочные (скрининговые), подтверждающие и диагностические;
приборные и бесприборные.

Прямые и непрямые методы дагностики сифилиса

Прямые тесты — это методы непосредственного выявления возбудителя в материале из очагов поражения. Прямые методы диагностики позволяют установить окончательный диагноз сифилитической инфекции, т.к. основаны на обнаружении T. pallidum в биологических образцах. Исследования проводятся с помощью темнопольной микроскопии и молекулярно-биологических методов (прежде всего ПЦР). Эти методы используются при наличии видимых сифилитических поражений.

Прямые методы используются для диагностики ранних форм заболевания, первичного и вторичного сифилиса с клиническими появлениями (эрозивно-язвенными элементами); для подтверждения врожденного сифилиса (для анализа используют ткань пуповины, плаценты, органы плода, отделяемое слизистой оболочки носа, содержимое пузырей, отделяемое с поверхности папул).

микроскопия в темном поле (темнопольная микроскопия, ТПМ; dark field microscopy, DFM) и другие методы микроскопии;
метод прямой иммунофлюоресценции (ПИФ; direct immunofluorescent assay, DFA)
молекулярно-биологические методы детекции ДНК бледной трепонемы (полимеразная цепная реакция, ПЦР; polymerase chain reaction, PCR) и другие тесты на амплификацию нуклеиновых кислот (МАНК; nucleic acid amplification test, NAAT)
ДНК-зондирование или гибридизация нуклеиновых кислот (ГНК) ;
заражение кроликов инфицированным материалом от больных (rabbit infectivity test-RIT). Этот метод является старейшим, но в силу экономических, организационных трудностей, длительности в практике медицинских учреждений не используется.

Серологические (непрямые) методы дают возможность выявлять в крови больных или антитела, специфичные для определенного возбудителя инфекционного заболевания, или антигены (в большинстве случаев - белки) самих микроорганизмов. В основе всех серологических реакций лежит взаимодействие антигена и антитела. Методы серологической диагностики сифилиса базируются на выявлении антител к возбудителю сифилиса в сыворотке крови или в спинномозговой жидкости.

Трепонемные и нетрепонемные тесты

Распространенные нетрепонемные тесты — это липидные (реагиновые) реакции. Эти тесты связаны не с определением антител против трепонемы, но с определением антител IgM и IgG к липоидным материалам из разрушенных клеток организма больного сифилисом. Чаще всего эти тесты применяются для скрининга из-за простоты и дешевизны. В них используется нетрепонемный кардиолипиновый антиген, а сами тесты проводятся в разных вариантах:

1) флокуляционные тесты (продукт реакции выпадает в виде хлопьев): микрореакции на стекле с липидными антигенами —экспресс-метод диагностики (микрореакции преципитации — РМП), VDRL (Venereal Disease Research Laboratory test), RPR (Rapid Plasma Reagin test) и др.;

3) осадочные реакции, которые не используются в настоящее время (реакция преципитации Кана, цитохолевая реакция Закса — Витебского и др.).

В трепонемных тестах чаще всего используются антигены Treponema pallidum, нативные (штамм Никольса) или рекомбинантные. Тест, в котором используются живые спирохеты — реакция иммобилизации бледных трепонем (РИТ), в настоящее время выводится из клинической практики из-за дороговизны и сложности.

Групповые антигены являются общими для двух или более видов микробов, входящих в один род, а иногда относящихся и к разным родам. Специфические антигены имеются только у данного вида микроба или даже только у определенного типа либо подтипа внутри вида. Определение специфических антигенов позволяет дифференцировать микробы внутри рода, вида, подвида и даже типа (подтипа).

Видоспецифичные протеиновые трепонемные реакции определяют антитела к специфическим видовым антигенам Treponema pallidum:

В связи с наличием длительных латентных периодов заболевания и неспецифическим характером нетрепонемных тестов, при проведении скрининговых исследований все чаще используются тесты, основанные на определении специфических антител против трепонемы в пробах крови.

Другие методы лабораторной диагностики сифилиса

Гистоморфологические методы.

В исследовательских целях, при сифилитических поражениях, проводятся микроскопические исследования образцов пораженных тканей (твердого шанкра, сифилидов). В настоящее время, для диагностики сифилиса гистологические исследования используются редко, т.к. дифференциальная диагностика гистологических изменений представляет серьезные трудности. При трактовке гистоморфологических изменений в каждом конкретном случае необходимо обязательно учитывать клинические и лабораторные данные.

Адрес: г. Москва, Ленинский проспект, дом 82/2

Часы работы: Пн - Пт: с 10.00 до 20.00; Сб - Вс, праздники: с 11.00 до 18.00

Как нас найти (схема проезда):

Прямые методы диагностики служат для выявления бледной трепонемы (Т. pallidum) или генетического материала этого возбудителя в образцах, взятых из очагов поражения. Прямое выявление возбудителя сифилиса является абсолютным доказательством наличия заболевания. Найденный генетический материал (ДНК/РНК) может свидетельствовать как об активном, так и о ранее леченном сифилисе.

На ранней стадии болезни, возбудитель сифилиса активно размножается в очаге инфицирования, при этом антитела к антигенам бледной трепонемы (Treponema pallidum) начинают появляться только со второй недели после инфицирования. Бледная трепонема располагается в тканевых щелях, между волокнами соединительной ткани, вокруг лимфатических и кровеносных сосудов, в стенках и даже просветах лимфатических капилляров.

При медицинском обследовании, у пациентов с подозрением на сифилис, все высыпания на коже или слизистых оболочках следует считать сифилитическими. Исследованию на бледную трепонему подлежат все эрозивные и язвенные шанкры, мокнущие и эрозивные папулы, широкие кондиломы на коже и слизистых оболочках рта, половых органов и анальной области.

Материалом, который необходим для бактериологического исследования на бледную трепонему, является тканевая жидкость (серум). Если нет возможности исследовать высыпания (например, в случаях раннего сифилиса), то рекомендуется проводить пункцию увеличенного регионарного лимфатического узла с соблюдением всех правил асептики, то есть стерильными инструментами и соблюдая правила, направленные на предотвращение распространения микроорганизмов. Кроме того, образцы могут быть получены путем взятия спинномозговой жидкости (ликвора) или плодной жидкости.

Важным условием для обнаружения бледной трепонемы в пат. материалах является правильное взятие проб из сифилитических элементов. Затем содержимое полученных проб изучают в лаборатории.

Обнаружение бледной трепонемы методом темнопольной микроскопии (ТПМ).

В России в качестве рутинного метода прямой визуализации T. pallidum традиционно используется метод темнопольной микроскопии (ТПМ, dark field microscopy, DFM).

1. Конденсор темного поля

Исследование на бледную трепонему в темном поле зрения проводится с помощью стандартного микроскопа, снабженного конденсором темного поля.

Конденсор представляет собой двояковыпуклую линзу, прикрепляемую снизу предметного столика с таким расчетом, чтобы линза конденсора располагалась под отверстием предметного столика. Конденсор служит для собирания (конденсации) пучка световых лучей, что обеспечивает наибольшее освещение исследуемого предмета.

Неокрашенные живые бледные трепонемы не видны в световой микроскоп при обычном освещении препарата. Необходимые условия создаются путем замены обычного конденсора микроскопа особым конденсором, в котором центральная часть затемнена и проникновение лучей света происходит через узкую щель.

Вследствие получающегося при этом бокового освещения достигается отраженное свечение всех твердых частиц на темном поле (это называется "эффектом Тиндаля"), в том числе бледной трепонемы. Для получения темного поля необходим сильный источник света.

2. Бледная трепонема, характерные особенности при темнопольной микроскопии

Исследование в темном поле микроскопа позволяет изучать бледную трепонему (БТ) в живом виде, а также достоверно отличать её от других трепонем как по морфологическим признакам, так и по характерным особенностям движения.

Чтобы отличать бледную трепонему от морфологически сходных типов сапрофитных трепонем, бледные трепонемы при исследовании должны быть живыми. Темнопольное исследование взятого материала должно быть проведено немедленно, сразу после получения образца, поэтому оборудование должно быть подготовлено заранее.

В затемненном поле зрения бледная трепонема выглядит, как движущаяся тонкая спираль или тонкий нежный пунктир с серебристым оттенком, слабо преломляющие свет. Помимо этих бактерий, в препарате все поле зрения усеяно массой мельчайших светящихся точек, находящихся в хаотичном броуновском движении.

Бледные трепонемы движутся характерным образом: вращаются вокруг своей продольной оси, перемещаются в одном направлении, качаются наподобие маятника или совершают волнообразные, сократительные или сгибательные движения ("шагающая трепонема"). Бледная трепонема движется плавно, что является важной особенностью этого микроогранизма.

T. phagedenis, электронная микроскопия

В полости рта и на половых органах встречаются сапрофитные трепонемы: T . refringens и T. phagedenis (reiteri) в урогенитальном тракте и T. denticola в полости рта.

Непатогенные трепонемы морфологически сходны с T. pallidum. От них бледную трепонему отличает толщина, характер движения и форма завитков.

T.refringens колонизирует наружные половые органы. Эта бактерия движется быстро и неравномерно, отличается большей толщиной, отсутствием сгибательных движений, и более пологими и широкими завитками. T.denticola является представителем нормальной микрофлоры полости рта, ее завитки короче и направлены под более острым углом. В нормальной флоре наружных половых органов человека встречается также T. phagedenis.

Наличие непатогенных трепонем затрудняет исследования материала, взятого из поражений в полости рта или прямой кишке. При дифференциации трепонем может ошибиться даже опытный исследователь, поэтому присутствие этих микроорганизмов делает малодостоверным проведение исследования с данным материалом. Если необходимо провести тестирование материала, полученного из одного из указанных выше мест, то предпочтительнее выполнить DFA или NAAT (лучше отдать предпочтение методу ПИФ или молекулярно-биологическим методам).

Методом темнопольной микроскопии невозможно отличить бледную трепонему от патогенных возбудителей других трепонематозов — T. pallidum carateum (пинта), T. pallidum pertenue (фрамбезия), T. pallidum endemicum (беджель).

3. Применение темнопольной микроскопии для диагностики сифилиса

Микроскопию в темном поле можно применять для диагностики первичных и вторичных поражений кожи при сифилисе в результате заражения половым путем. В редких случаях этот метод можно использовать при третичном сифилисе (в последнем случае — если материал взят из глубины инфильтрата или со дна язвы).

Также с помощью этого метода исследуют поражения при раннем врожденном сифилисе, когда заражение плода бледной трепонемой произошло в утробе матери. Чтобы подтвердить диагноз "врожденный сифилис", для приготовления препарата для микроскопии можно использовать ткань пуповины, органы плода, выжатый сок плаценты, амниотическую (плодную) жидкость, отделяемое слизистой оболочки носа, содержимое пузырей (при ладонно-подошвенной сифилитической пузырчатке), тканевой жидкости (серума) с раздраженных папул.

Метод темнопольной микроскопии, используемый для диагностики сифилиса, отличается простотой, дешевизной, быстротой и достаточно высокой чувствительностью. Однако у него есть известные недостатки – невозможность диагностики скрытых и поздних форм сифилиса и непригодность для контроля излеченности. Даже многократный отрицательный результат микроскопического исследования на бледную трепонему не может исключить сифилис.

Кроме того, для проведения исследования методом ТПМ микроорганизмы T. pallidum должны быть подвижными. В условиях применения пациентами различных антибактериальных препаратов, в том числе для лечения других заболеваний, диагностическая чувствительность ТПМ снижается. В подобных случаях необходимо исследование методом прямой иммунофлюоресценции (ПИФ) или проведение серологического обследования на сифилис.

Для повышения информативности лабораторной диагностики разрабатываются более чувствительные и специфичные прямые тесты на основе молекулярно-биологических технологий, например различные модификации метода ПЦР.

Метод прямой иммунофлюоресценции (ПИФ)

При необходимости микроскопия возбудителя в темном поле может быть дополнена прямой реакцией иммунофлюоресценции (ПИФ, direct fluorescent antibody test, DFA).

Прямой метод иммунофлюоресценции (по Кунсу) основан на взаимодействии антител, меченых флюорохромом, с антигеном, который находится на клетке, в клетке или в тканях. В качестве флюорохрома используют флюоресцеинизотиоционат (ФИТЦ).

Метод прямой иммунофлюоресценции предусматривает прямое выявление T. pallidum в образце при обработке материала специфическими моноклональными антителами. При этом на запарафинированные мазки или биопсийный материал накладываются противотрепонемные антитела, меченные флюоресцирующим красителем. Затем, образующиеся комплексы антиген—антитело исследуют под люминесцентным микроскопом.

В результате взаимодействия анти- T.pallidum антител, меченных ФИТЦ, и бледной трепонемы при люминесцентной микроскопии наблюдается специфическое ярко-зеленое свечение: бледная трепонема флюоресцирует ярко-зеленым цветом, сохраняя все морфологические признаки спирохеты.

Забор образцов производится таким же образом, как и для темнопольной микроскопии, при этом сам метод ПИФ является более точным, чувствительным и специфичным, чем ТПМ.

Метод ПИФ имеет преимущества перед темнопольной микроскопией для выявления бледной трепонемы. Флюоресцирующие микроорганизмы проще детектировать, вероятность спутать их с другими видами трепонем снижена. При этом возможна дифференцировка патогенных трепонем от непатогенных при исследовании материала со слизистых полости рта и прямой кишки, фиксация препаратов перед транспортировкой в лабораторию. Для исследования может быть использован материал, полученный при биопсии или аутопсии.

Кроме того, применение ПИФ ограничено из-за отсутствия промышленного производства и сертификации соответствующих ингредиентов в ряде стран, в частности, ФИТЦ-меченых моноклональных антител к патогенной бледной трепонеме.

Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР)

Для диагностики сифилиса применяется прямой метод определения ДНК бледной трепонемы — метод ПЦР; это один из методов амплификации нуклеиновых кислот (МАНК, nucleic acid amplification test, NAAT).

Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) позволяет исследовать различные образцы (отделяемое сифилидов, биопсийный материал, биологические жидкости) в свежем, замороженном, фиксированном и парафинированном виде. В качестве объекта исследования методом ПЦР могут быть использованы соскобы шанкров и других высыпаний (папул, широких кондилом и т.д.), спинномозговая, амниотическая жидкость, сыворотка крови.

ПЦР–тесты для выявления ДНК бледной трепонемы были разработаны в 1991 году одновременно в нескольких лабораториях. Этот метод позволяет выявить и идентифицировать единственную молекулу ДНК бледной трепонемы среди сотен тысяч других молекул, что делает потенциально возможной диагностику нейросифилиса, третичного, врожденного сифилиса при наличии единичных трепонем в исследуемом материале.

Метод ПЦР высокоспецифичен, чувствителен и воспроизводим при правильном проведении и подготовке образцов. Однако, применительно к диагностике сифилиса, методы МАНК пока используется в исследовательских целях.

PCR в режиме реального времени (PCR-RT). Учет полученных результатов происходит автоматически в режиме реального времени по уровню свечения флюорохромных меток;
методика PCR-анализа с помощью обратной транскриптазы (PCR-ОТ);
мультиплексная PCR (PCR-М, М-ПЦР), которая позволяет в биологической пробе одновременно определять наличие возбудителей нескольких заболеваний.

Основными достоинствами метода ПЦР и его модификаций является универсальность (возможность обнаружить любые нуклеиновые кислоты), весьма высокая чувствительность (80 – 94,7 %) и высокая специфичность (до 100 %). Результат получается быстро, для анализа необходима проба малого объема (несколько микролитров). Современные методы ПЦР позволяют одновременно исследовать нескольких возбудителей заболеваний, а также получать документальный ответ в виде фотографий и вносить результаты диагностики на компьютерные информационные носители. К недостаткам метода ПЦР-анализа следует отнести высочайшие требования к оснащению лаборатории, качеству тест–наборов и регламенту исследования.

Метод ПЦР является дополнительным и может быть рекомендован, главным образом, для исследования отделяемого эрозивных и язвенных высыпаний при подозрении на первичный сифилис, особенно при их локализации на слизистой оболочке рта; при применении пациентами местных и системных антибактериальных средств накануне обращения к врачу; при отрицательных результатах серологических тестов в начале первичного периода, когда ошибка метода ТПМ особенно значима.

Развитие высокочувствительного метода ПЦР и разработка его модификаций, оценивается как весьма перспективное. Особую важность этот метод приобретает при диагностике первичного серонегативного сифилиса (при котором серологические исследования дают отрицательный результат), раннего скрытого, врожденного сифилиса и нейросифилиса.

Препятствием к широкому внедрению метода ПЦР для диагностики сифилиса является отсутствие в массовой доступности тест-систем, разрешенных к медицинскому применению. В США применение ПЦР рекомендовано лабораториям, располагающим соответствующими тест-системами (в том числе созданными в самих лабораториях, in house). В России и странах Восточной Европы широкое использование метода лимитируется небольшим количеством наборов реагентов, прошедших валидацию и разрешенных к медицинскому применению на территории соответствующих государст

NASBA

NASBA - Nucleic Acid Sequence-Based Amplification, амплификация, основанная на последовательности нуклеиновых кислот (другие переводы - реакция амплификации на основе нуклеотидной последовательности нуклеиновых кислот, реакция транскрипционной амплификации). Методика NASBA основана на выделении РНК микроорганизма (в отличие от полимеразной цепной реакции, где используется ДНК). Этот метод тестирования считается одним из самых перспективных и многообещающих направлений молекулярной диагностики.

Использование в качестве мишени для NASBA видоспецифических участков рибосомальной РНК обеспечивает методу высокую специфичность. Так как РНК — менее стабильный по сравнению с ДНК тип генетического материала, который быстрее деградирует при разрушении клеток, то на основании результатов выявления РНК можно судить о наличии в образце жизнеспособных микроорганизмов, например, после проведенного лечения. С практической точки зрения важно, что для проведения NASBA в лабораторных условиях используется то же оборудование, что и для проведения ПЦР в реальном времени (PCR-RT). Кроме того, исходный биоматериал после ПЦР может исследоваться методом NASBA. В результате этого существует возможность интегрирования указанного метода в протокол лабораторного обследования, что позволит верифицировать возбудителя

Отдельные исследовательские коллективы уже получают достаточно перспективные результаты при изучении сифилитической инфекции методом NASBA и NASBA-RT, используя в качестве качестве мишени фрагмент гена 16s рРНК бледной трепонемы. Полученные данные позволяют отнести метод NASBA к диагностически перспективным в изучении сифилитической инфекции наряду с имеющимися методами диагностики.

Заражение сифилисом лабораторных животных

Задолго до открытия бледной трепонемы многие ученые стали проводить эксперименты по заражению сифилисом разнообразных животных. В естественных условиях животные сифилисом не болеют, но возможно искусственное заражение некоторых их видов. Первые успешные опыты были проведены на шимпанзе в начале 20-го века. Дальнейшие опыты на обезьянах привели к ряду блестящих научных открытий, но ввиду трудностей содержания и дороговизны обезьян, основными лабораторными животными стали кролики. Опыты с другими животными (холоднокровными, птицами, различными млекопитающими) давали отрицательный или недостаточный для практического применения результат. Некоторое значение имели только данные, полученные на морских свинках и мышах.

Заражение сифилисом кроликов является старейшим методом прямого выявления бледной трепонемы, т.к. кролик является наиболее чувствительным и удобным лабораторным животным для привития сифилиса. Заражение кроликов производят инокуляцией (введением микроорганизмов в ткани, от латинского inoculatio - "прививка") инфекционного материала в яичко. Чувствительность кроликов к инфекции Treponema pallidum практически 100%, если во взятом для прививки материале содержится достаточное количество бледных трепонем.

Для диагностики сифилиса применяется множество методов исследования, различающихся по технике проведения и предназначению. Прямые методы направлены на обнаружение возбудителя в исследуемом материале с помощью микроскопии (микроскопия в темном поле и др.) или ПЦР.

Помимо методов прямой детекции бледной трепонемы (T. pallidum), при обследовании на сифилис широкое применение получили непрямые (серологические) методы исследования, выявляющие антитела к возбудителю сифилиса в сыворотке крови и цереброспинальной жидкости. К непрямым методам диагностики сифилиса относятся серологические реакции ИФА, РПГА, КСР, РИФ и РИФ-абс, РИБТ, ПЦР, экспресс-метод, иммуноблот и другие.

Серологические методы диагностики инфекционных заболеваний.

Серологические критерии диагностики основаны на специфических реакциях "антиген-антитело". Реагируют антигены (компоненты клеточных стенок, жгутиков, капсул, ДНК и токсинов) тех микроорганизмов, которые необходимо определить, с антителами, содержащимися в сыворотках. Между антигенами и соответствующими им антителами происходит связывание, что и положено в основу методов серологической диагностики. Серологические реакции применяются для определения неизвестного антигена (источником которого является бактерия, вирус, токсин и др.) с помощью известного антитела или для определения антитела в сыворотке с помощью известного антигена.

Серологические реакции классифицируют в зависимости от состояния антигена и особенностей среды, в которой взаимодействуют антиген и антитело, а также по способу проведения.

Для проведения серологических реакций испольуют множество лабораторных методов, таких, как агглютинация, преципитация, связывание комплемента, иммунофлуоресценция, иммуноферментный и радиоиммунный анализ и другие. Эти реакции позволяют эффективно проводить предварительную идентификацию микроорганизмов.

Сыворотки, которые необходимы для постановки серологических реакций, получают экспериментальным путем, в частности, их производят институты вакцин и сывороток, и предлагают в составе коммерческих диагностических наборов.

Серологические методы являются важным инструментом в диагностике и лечении инфекционных заболеваний человека и животных, поскольку с их помощью можно не только идентифицировать возбудителя заболевания, но и обнаружить в крови больных и переболевших специфические антитела к соответствующим возбудителям. Серологические методы в настоящее время являются самыми эффективными методами диагностики при невозможности или трудностях выделения возбудителя, и сравнительно редко дают ложноположительные и ложноотрицательные результаты.

Использование серологических методов для диагностики сифилиса

В основе серологических лабораторных методов диагностики сифилиса лежит способность организма давать иммунный ответ на появление возбудителя. С помощью серологических реакций в сыворотке (плазме) крови (или цереброспинальной жидкости) выявляют следы иммунного ответа на заражение, а именно антитела к антигенам бледной трепонемы, или же сами антигены.

Для того, чтобы установить специфический характер имеющихся клинических проявлений (т.е. что они являются следствием именно сифилиса) и, в дальнейшем, контролировать динамику патологического процесса, предложено большое количество серологических методов исследований. Эти же методы также широко применяют для скрининга населения.

В соответствии с действующими национальными руководствами и клиническими методическими рекомендациями, во многих странах мира при обследованиях населения с целью выявления больных сифилисом и при установлении клинического диагноза используются передовые серологические методы. Их применяют как при наличии клинических признаков болезни у пациентов, так и в латентные периоды.

Постановка серологических реакций — один из наиболее надежных методов диагностики сифилиса. Стандартизованные серологические реакции с регламентированной методикой постановки называются серологическими тестами на сифилис. Учитывая то, что почти все серологические реакции на сифилис в определенных условиях могут быть ложноположительными или ложноотрицательными, их следует ставить в комплексе и, при необходимости, в динамике.

Серологические реакции, которые используются для определения антител в сыворотке крови больного, отличаются друг от друга чувствительностью, специфичностью, сложностью постановки и стоимостью. Помимо классических методов, для эффективной серодиагностики сифилиса используются иммунологические тесты и технологии, получившие в 21 веке новый импульс к развитию.

Антитела выявляются различными иммунохимическими (серологическими) методами, среди которых осадочные реакции, иммуноферментный, иммунохемилюминесцентный, иммунохроматографический анализы, линейный иммуноблоттинг, исследование с применением проточной флюорометрии, технология иммуночипов и другие.

подтверждения клинического диагноза сифилиса,
постановки диагноза скрытого сифилиса,
контроля за эффективностью лечения, как один из критериев излеченности больных сифилисом,
профилактики сифилиса (скрининговое обследование определенных групп населения с целью выявления патологии).

Важнейшие свойства, необходимые серологическим тестам - чувствительность, специфичность, воспроизводимость

Решающим критерием при выборе метода лабораторной диагностики является его эффективность — чувствительность, специфичность и воспроизводимость.

Чувствительность — это доля положительных результатов у больных. Чувствительность метода определяется процентом положительных результатов исследования проб, заведомо содержащих специфические маркеры возбудителя (нпр., антигены возбудителя или антитела к ним).

Специфичность — доля отрицательных результатов теста у здоровых пациентов. Специфичность метода определяется процентом отрицательных результатов исследования проб, заведомо не содержащих специфические маркеры возбудителя. Таким образом, чем выше чувствительность и специфичность, тем надежнее и достовернее метод исследования.

К важным диагностическим критериям также относится воспроизводимость результатов при повторных исследованиях одних и тех же проб. Следует отметить, что, несмотря на значительные достижения в области высоких технологий, не существует методов, обеспечивающих 100% (абсолютную) чувствительность и специфичность во всех исследуемых биопробах.

В настоящее время в России официально регистрируются тест-системы, наборы, ингредиенты, обладающие при постановке реакции менее 95% чувствительностью и специфичностью. Таким образом, всегда существует возможность получения неадекватного результата.

Классификация тестов по типу применяемого антигена. Трепонемные и нетрепонемные тесты на сифилис

В современной венерологии для диагностических целей используется более десятка вариантов серологических реакций на сифилис, которые можно подразделить по разным критериям на различные категории. Классификацию проводят по методологии проведения исследований, области применения, скорости, дешевизне, требованиям к лабораторной оснащенности и т.д.

По типу используемых антигенов, диагностические тесты традиционно разделяют на две группы— нетрепонемные и трепонемные серологические тесты.

Трепонемные реакции теоретически более специфичны, однако они также дают ложноположительные результаты. Более того, они не позволяют дифференцировать нелеченный и излеченный сифилис. Результаты трепонемных реакций будут положительными в обоих случаях. Нетрепонемные реакции позволяют различать нелеченную или недавно перенесенную и излеченную инфекцию.

При обследовании рекомендуется проводить и трепонемную, и нетрепонемную реакции. Для установки и подтверждения диагноза "сифилис" требуются положительные результаты при проведении тестов обоих типов — трепонемных и нетрепонемных. Поэтому нетрепонемные тесты применяются в комбинации с трепонемными тестами, и проводятся до начала, в процессе и после окончания лечения в определенные временные интервалы.

1. Нетрепонемные тесты

RW — реакция Вассермана с липидными антигенами (реакция связывания комплемента с кардиолипиновым антигеном, РСКк)
реакция Канна (не используется в настоящее время),
цитохолевая реакция Закс-Витебского (не используется в настоящее время),
микрореакция преципитации с плазмой или инактивированной сывороткой (МРП или РМП),
RPR (тест быстрых плазменных реагинов, Rapid Plasma reagin),
TRUST (тест с толуидиновым красным и непрогретой сывороткой, Toluidin Red Unheated Serum Test).

Реактивность в нетрепонемных тестах обычно указывает на повреждение тканей и не всегда специфична в отношении сифилиса. Простота выполнения и низкая стоимость позволяет использовать их как отборочные реакции при установлении предварительного диагноза сифилиса.

2. Трепонемные тесты

В трепонемных тестах используются специфические антигены трепонем. Эти тесты обязательны для подтверждения диагноза (РПГА, РИТ, РИФ и ИФА). Они являются более сложными и дорогостоящими, чем тесты 1-й группы, но и более специфичными и чувствительными. Выявление антител в спинно-мозговой жидкости также производится с помощью трепонемных тестов.

Традиционные трепонемные реакции, подтверждающие диагноз сифилиса, требуют дорогого лабораторного оборудования и опытного персонала, поэтому они редко проводятся вне специализированных лабораторий. Однако сейчас их можно заменить простыми и быстрыми трепонемными реакциями, которые возможно проводить на местах и в которых используется цельная кровь. Проведение этих реакций не требует длительного обучения, специальных условий для хранения реактивов и оборудования.

Сравнительная дешевизна, удобство и практичность трепонемных экспресс- реакций привлекают к ним внимание не только как к методам подтверждения диагноза. Эти реакции могут применяться для скрининга сифилиса в рамках оказания первичной медицинской помощи (их можно проводить на местах, в том же лечебно-профилактическом учреждении) или в районах, где лаборатории не доступны. Однако поскольку антитела к T. pallidum определяются на протяжении ряда лет независимо от того, лечился больной или нет, трепонемные экспресс-реакции нельзя использовать для оценки эффективности лечения и дифференциальной диагностики нелеченного и излеченного сифилиса.

Классификация серологических методов диагностики сифилиса по типу определяемых антител

В современной дерматовенерологии для диагностики используются различные серологические реакции на сифилис. Часть методов, которые были актуальны ещё десять лет назад, перестают применяться из-за сложности или недостаточной специфичности. В зависимости от выявляемых антител, методы серологической диагностики сифилиса подразделяются на три группы:

1) флокуляционные: микрореакция на стекле с липидными антигенами —экспресс-метод диагностики (микрореакции преципитации — МРП), VDRL, CMF (cardiolipin microflocculation test), RPR и др.;

2) реакция связывания комплемента (РСК) с липидными антигенами: реакция Вассермана (РВ), качественная и количественная методика постановки, термостатная и на холоде (реакция Колмера);

3) осадочные реакции, которые в настоящее время не используются: реакция преципитации Кана, цитохолевая реакция Закса — Витебского и др.;

II. Групповые трепонемные реакции — определяются антитела к групповым трепонемным антигенам (входящим в состав микробной клетки как патогенных, так и сапрофитных трепонем):

III. Видоспецифичные протеиновые трепонемные реакции — определяются антитела к специфическим видовым антигенам Treponema pallidum:

Практическое использование серологических реакций на сифилис

За рубежом при массовых обследованиях населения и при необходимости экстренного выявления сифилиса используются нетрепонемные отборочные реакции (VDRL, RPR и др.). Для постановки диагноза требуется подтверждение в трепонемных тестах РИФ-Абс (FTA-ABS), РПГА или TPPA. В настоящее время, рекомендуется использовать ИФА, как замену VDRL в скрининговых тестах. Это связано с тем, что тест ИФА отличается чувствительностью, специфичностью, возможностью автоматизировать исследования, а также с разработкой диагностических тест-наборов. Кроме того, обосновывается реверсивная схема порядка исследования на сифилис, когда первыми используются трепонемные тесты.

С целью контроля за эффективностью терапии и для оценки активности инфекции рекомендуют VDRL в количественном исполнении. В качестве подтвердающего/дополнительного теста используется тест ИФА на противотрепонемные антитела IgM.

В отечественной практике используют комплекс серологических реакций (КСР), включающий реакцию микропреципитации (РМП) с кардиолипиновым антигеном и РСК с кардиолипиновым и трепонемным антигенами. В последнее время рекомендуется в КСР заменять РСК на ИФА или РПГА. Также используются РИФ (и ее модификации — РИФ-Абс и остальные), РИБТ.

Подходы к лабораторной серологической диагностике сифилиса в Российской Федерации

Внедрение в практику унифицированных методов клинических лабораторных исследований в СССР и Российской Федерации позволило ввести более прогрессивные диагностические методы, упорядочить работу клинико-диагностических лабораторий, повысить производительность труда, сократить дублирование лабораторных исследований и стало основой для разработки рациональных форм готовых наборов реактивов.

В 1985 году в СССР, в целях совершенствования диагностики сифилиса, нетрепонемная реакция РСК с неспецифическим (вассермановским) антигеном и осадочные реакции (цитохолевая и Кана) были исключены из диагностического комплекса, как менее чувствительные и не дающие дополнительной информации.

Вместо них, в составе комплекса серологических реакций на сифилис (КСР), было предусмотрено применение реакции связывания комплемента с трепонемным и кардиолипиновым антигенами (РСКт) и микрореакции преципитации с кардиолипиновым антигеном (РМП). Более высокая чувствительность и информативность этого комплекса реакций обеспечивала выявление не только реагинов, но и противотрепонемных антител.

1. РМП с кардиолипиновым антигеном с плазмой крови и инактивированной сывороткой крови. Отборочный тест в случае изолированного применения.

2. РСК с трепонемным и кардиолипидовым антигенами; качественная и количественная методики постановки, термостатная и на холоде;

4. Реакция иммунофлюоресценции (РИФ) в следующих модификациях: РИФ с абсорбцией (РИФ-абс) с сывороткой крови и капиллярной кровью, РИФ-200, РИФ с цельной спинномозговой жидкостью (РИФ-ц); качественные и количественные методики постановки. Диагностика скрытых и поздних форм сифилиса, распознавание ЛПР (ложно-положительных результатов)

5. Комплекс классических серологических реакций (КСР): РСК (реакции Вассермана) с кардиолипиновым и трепонемным антигенами + РМП. Профилактическое обследование населения на сифилис, диагностика всех форм сифилиса, контроль эффективности лечения, обследование лиц, контактных по сифилису.

С целью совершенствования лабораторной диагностики сифилиса, повышения качества работы и предупреждения дальнейшего распространения заболеваемости сифилисом рекомендовано заменить РСК в комплексе серореакций (КСР) при диагностике сифилиса на ИФА и РПГА в качестве отборочных и подтверждающих тестов, т.к. эти тест-системы являются высокочувствительными, специфическими и воспроизводимыми.

1. РМП и зарубежные аналоги (VDRL, RPR и аналогичные микрореакции) в качестве отборочных тестов при обследовании населения на сифилис. Постановка РМП осуществляется с плазмой или инактивированной сывороткой крови.
2. Иммуноферментный анализ (ИФА). Антиген из культуральных или патогенных бледных трепонем. Диагностические реакции, в том числе для ликвородиагностики. В связи с простотой постановки и наличием коммерческих тест-систем могут использоваться как отборочные тесты.
3. Реакция пассивной гемагглютинации (РПГА). Антиген из культуральных или патогенных бледных трепонем. Отборочные и диагностические реакции.
4. Качественный и количественный варианты РИФ (РИФ-абс, РИФ-ц, РИФ с капиллярной кровью из пальца). Антиген - патогенная бледная трепонема штамма Никольса.
5. Комплекс серологических реакций (КСР) на сифилис, состоящий из реакции связывания комплемента (РСК) с трепонемным и кардиолипиновым антигенами, и РМП. Возможно заменить реакцию связывания комплемента на ИФА или РПГА также в сочетании с РМП. КСР относится к диагностическим тестам.
6. Реакция иммобилизации бледных трепонем (РИБТ), в которой в качестве антигена используют патогенные бледные трепонемы штамма Никольса. РИБТ относятся к диагностическим подтверждающим тестам.

Таким образом, последовательность обследования пациентов на сифилис в учреждениях здравоохранения рекомендуется планировать следующим образом:

1. При первичном обследовании производится постановка отборочной (скрининговой) реакции микропреципитации (РМП) или ее модификации (RPR, TRUST, VDRL) в количественном и качественном вариантах и в случае положительного результата - любого специфического подтверждающего трепонемного теста (РПГА, ИФА, КСР, РИФ, РИТ);

2. После окончания терапии ставится РМП или ее модификация и по снижению титра судят о динамике инфекционного процесса и эффективности терапии. Подтверждением эффективности проведенной терапии считается снижение титра в 4 и более раз в течение 1 года.

3. По окончании этого срока осуществляется постановка той же специфической реакции, что и при первичном обследовании. Следует учитывать, что специфические трепонемные тесты могут оставаться положительными (не негативировать) в течение ряда лет, а в отдельных случаях остаются положительными на всю жизнь.

Московская медицинская академия им. И.М. Сеченова

Современные лабораторные методы и алгоритмы диагностики сифилиса

Журнал: Клиническая дерматология и венерология. 2015;14(6): 56‑61

Дано описание современных подходов к лабораторной диагностике сифилиса. Описаны прямые тесты (темнопольная микроскопия, прямая иммунофлюоресценция Treponema pallidum, полимеразная цепная реакция), позволяющие выявить самого возбудителя или его генетический материал. Приведены наиболее часто применяемые нетрепонемные и трепонемные тесты, используемые в серологической диагностике сифилиса; показания и ограничения к их применению. Дано описание двух современных алгоритмов, применяемых при серологическом обследовании больного с подозрением на сифилис: традиционного и реверсионного, описаны их достоинства и недостатки. Статья представляет интерес для практических врачей — дерматовенерологов, урологов, акушеров-гинекологов, врачей клинической лабораторной диагностики, в поле зрения которых могут оказаться больные манифестными и скрытыми формами сифилиса.

Московская медицинская академия им. И.М. Сеченова

Сифилис — системное инфекционное заболевание, вызываемое бледной трепонемой (Treponema pallidum, subspecies pallidum), остается общемировой проблемой здравоохранения.

В Москве в последние годы отмечена стойкая тенденция к снижению заболеваемости сифилисом. В 2013 г. уровень заболеваемости сифилисом составил 20,4 на 100 000 населения. Однако эпидемиологическая ситуация продолжает оставаться напряженной: в структуре сифилиса преобладают скрытые формы, растет число поздних форм инфекции, что диктует необходимость усиления эпидемиологического контроля над распространением заболевания и широкого применения врачами-дерматовенерологами современных высокочувствительных и специфичных методов лабораторной диагностики сифилиса [1].

Все лабораторные методы диагностики сифилиса подразделяются на прямые, позволяющие выявлять возбудителя или его генетический материал непосредственно в очагах поражения, и непрямые — для выявления антител к возбудителю сифилиса в сыворотке крови (серологическая диагностика).

При назначении пациенту лабораторного обследования по поводу сифилиса не следует забывать о том, что абсолютным критерием постановки диагноза является непосредственное выявление возбудителя заболевания — бледной трепонемы (T. pallidum) или его генетического материала [2].

T. pallidum в образцах, полученных из райц-серума сифилидов или инфицированных лимфоузлов при раннем сифилисе, можно обнаружить с помощью следующих прямых методов исследования:

• микроскопия в темном поле микроскопа, или темнопольная микроскопия (ТПМ);

• прямая иммунофлюоресценция (ПИФ) (для образцов из поражений в полости рта или из других очагов, где возможна контаминация трепонемами-комменсалами);

• полимеразная цепная реакция (ПЦР).

Наиболее убедительным доказательством инфицирования сифилисом является прямая визуализация T. pallidum в темном поле зрения [3].

Материалом для темнопольной микроскопии является серозное отделяемое с поверхности эрозии, язвы, мацерированной или экскориированной, эрозированной папулы или бляшки, иногда — содержимое пунктата лимфоузла. При исследовании в темном поле бледная спирохета выглядит в виде нежной подвижной спирали, слабо светящейся серебристым блеском. Исследование в темном поле микроскопа позволяет изучать T. pallidum в живом виде, а также дифференцировать ее от других трепонем как по морфологическим признакам, так и по характерным особенностям движения, что позволяет поставить диагноз даже без учета данных серологических тестов.

Вторым методом выявления возбудителя сифилиса в очагах поражения является метод ПИФ. В результате взаимодействия моноклональных антител анти-T. pallidum, меченных ФИТЦ, и бледной трепонемы, полученной из очагов поражения и помещенной на предметное стекло, при люминесцентной микроскопии наблюдается специфическое ярко-зеленое свечение. Метод удобен при исследовании материала, полученного со слизистой оболочки полости рта и прямой кишки, при биопсии или аутопсии. За счет использования видоспецифических моноклональных антител метод позволяет дифференцировать патогенную T. pallidum от трепонем-комменсалов [4]. В России данный метод не применяют ввиду отсутствия промышленного производства и сертификации соответствующих ингредиентов, в частности, моноклональных антител к патогенной бледной трепонеме, меченных ФИТЦ.

ПЦР позволяет обнаружить единственную молекулу ДНК возбудителя среди миллионов других молекул. Метод основан на принципе естественной репликации ДНК и заключается в размножении (амплификации) в пробирке определенных участков ДНК возбудителя в процессе повторяющихся температурных циклов. На каждом этапе вновь синтезированные молекулы копируются ферментом ДНК-полимеразой, благодаря чему происходит многократное удвоение специфических фрагментов ДНК [5].

Источниками обнаружения генетического материала возбудителя при постановке ПЦР у больных сифилисом могут являться: райц-серум (тканевая жидкость) генитальных язв, биопсийный материал кожных сифилидов, спинномозговая жидкость, амниотическая жидкость, плацента, периферическая кровь и семенная жидкость. Наиболее адекватным для исследования является райц-серум генитальных язв.

Чувствительность и специфичность метода ПЦР при исследовании райц-серума сифилидов при первичном сифилисе достигает 94,7—98,6%, при вторичном 80—98,6% и более выражена по сравнению с темнопольной микроскопией [6].

Широкое применение при обследовании на сифилис получили непрямые, серологические методы исследования, принцип которых заключается в выявлении в сыворотке или плазме крови или спинномозговой жидкости пациентов антител, ассоциированных с сифилитической инфекцией.

Первой серологической реакцией для диагностики сифилиса была реакция связывания комплемента, предложенная в 1906 г. Вассерманом, Нейсcером и Бруком [7]. Однако в настоящее время этот метод, ставший в свое время революционным и положивший начало серологической диагностике сифилиса, считается морально устаревшим: он длительно выполняется, субъективно интерпретируется, часто дает ложноотрицательные и ложноположительные результаты и не подлежит стандартизации.

Современные серологические тесты, применяемые для диагностики сифилиса, подразделяются на две большие группы: нетрепонемные (НТТ) и трепонемные (ТТ).

В НТТ на сифилис используется антиген нетрепонемного происхождения — кардиолипин-холестерол-лецитиновый комплекс [8, 9].

Основными видами НТТ, рекомендуемыми к применению на территории России, в настоящее время являются:

— РМП — реакция микропреципитации с плазмой и инактивированной сывороткой;

— RPR — тест быстрых плазменных реагинов (Rapid Plasma Reagins), или быстрый, или ускоренный плазмареагиновый тест;

— VDRL (Venereal Disease Research Laboratory) — тест исследовательской лаборатории венерических заболеваний.

Могут быть также использованы следующие их аналоги при условии, если тест-система имеет разрешение к медицинскому применению на территории Российской Федерации:

TRUST — тест с толуидиновым красным и непрогретой сывороткой (Toluidin Red Unheated Serum Test);

RST — тест на скрининг реагинов (Reagin Screen Test);

USR — тест на реагины с непрогретой сывороткой (Unheated Serum Reagins) [10, 11].

Показаниями к применению НТТ на сифилис являются:

• проведение скрининга населения на сифилис;

• контроль эффективности терапии (по титру антител в парных сыворотках, полученных до и после лечения);

• определение активности инфекции (по высоте титра антител).

НТТ просты в исполнении, недороги, не требуют специального оборудования и длительного времени; при этом реакции являются высоко чувствительными и специфичными.

Чувствительность РМП варьирует в зависимости от стадии заболевания: от 81% при первичном сифилисе до 94—99% при вторичном и скрытых формах сифилиса. Чувствительность зарубежных тестов варьирует от 59 до 100%, специфичность — от 93 до 99%.

После адекватного специфического лечения сифилиса содержание антител к возбудителю сифилиса, выявляемых в НТТ, постепенно снижается, тесты из резко положительных становятся слабоположительными, а затем отрицательными. В связи с этим НТТ используют для оценки эффективности лечения.

Ограничениями применения НТТ являются ранние стадии сифилиса (период инкубации, начало первичного периода), так как данные реакции становятся позитивными лишь спустя 2—3 нед после появления твердого шанкра, и поздние стадии (поздний скрытый и третичный сифилис, сифилис с поражением внутренних органов и нервной системы), так как лабильные преципитины первыми элиминируются из организма при длительном течении сифилитической инфекции. К числу недостатков НТТ следует отнести также субъективный визуальный учет, хотя в настоящее время разработаны системы для видеоцифровой регистрации результатов с их переводом в цифровые данные.

Следует иметь в виду, что антитела, определяемые в НТТ на сифилис, могут выявляться при ряде острых и хронических инфекционных и соматических заболеваний, которые сопровождаются гибелью клеток и разрушением тканей, что может стать причиной ложноположительных результатов НТТ, которые встречаются при скрининге населения на сифилис в 1—3% случаев [12].

В ТТ применяется антиген трепонемного происхождения — патогенная бледная трепонема, рекомбинантные белки, полученные генно-инженерным способом или пептиды, полученные путем искусственного химического синтеза.

Основными ТТ, рекомендуемыми к применению на территории России, в настоящее время являются:

ИФА — иммуноферментный анализ (ELISA — Enzymelynced immunosorbent assay, EIA – Enzyme immunoassay);

РПГА — реакция пассивной гемагглютинации (ТРНА, TPPA — Treponema pallidum hemagglutination assay, Treponema pallidum partiсle agglutination assay);

РИФ — реакция иммунофлюоресценции (FTA Fluorescent treponemal antibody);

ИХЛ — иммунохемилюминесценция (СLIA — Chemiluminescence Immunoassay);

Простые быстрые тесты у постели больного — ПБТ (РОС — point of care tests);

РИБТ (РИТ) — реакция иммобилизации бледных трепонем (TPI — Treponema pallidum immobilization test) [13, 14].

Показаниями к применению ТТ являются:

• подтверждение положительных результатов НТТ;

• дополнительное подтверждение в случае расхождения результатов скринингового ТТ и последующего НТТ;

• скрининг населения на сифилис (ИФА, РПГА, простые быстрые тесты).

К числу несомненных достоинств ТТ относится их высокая чувствительность и особенно специфичность, возможность подтверждения (верификация) результатов НТТ.

Часть ТТ (ИФА, ИХЛ, иммуноблоттинг) может быть автоматизирована и выполняться на анализаторах с получением объективного отчета в электронном виде. Для РПГА имеется возможность видеоцифровой регистрации результатов.

ТТ могут быть использованы для подтверждения клинического диагноза сифилиса на ранних стадиях инфекции, когда НТТ еще отрицательны, но есть клинические, эпидемиологические или анамнестические подозрения на сифилис. Однако чувствительность при первичном сифилисе этих тестов в совокупности недостаточна (76—86%) в основном за счет РИБТ, которая становится позитивной, начиная со второй половины первичного периода сифилиса.

Ранние стадии сифилиса (начало первичного периода сифилиса, период инкубации) могут быть диагностированы при использовании IgM-тестов, которые выявляют ранние трепонемоспецифические IgM, первыми появляющимися в организме больного сифилисом в ответ на внедрение возбудителя (варианты РИФ-абс IgM, ИФА-IgM, ИХЛ-IgM, IgM-иммуноблоттинга) [15—19].

Трепонемные методы хорошо выявляют вторичный и скрытый сифилис (чувствительность составляет 98—100%) [20].

ТТ могут быть использованы для установления ретроспективного диагноза сифилиса, а также для распознавания ложноположительных результатов НТТ.

С использованием ряда ТТ (ИФА, РПГА, ИХЛ, ПБТ) можно проводить скрининг отдельных категорий населения на сифилис (доноры, беременные, больные офтальмологических, психоневрологических, кардиологических стационаров, ВИЧ-инфицированные).

ТТ не могут быть использованы для контроля эффективности лечения, так как длительно остаются положительными после окончания лечения сифилиса (в особенности РИБТ, РПГА). Они сложнее в техническом отношении, чем НТТ, что несколько ограничивает их применение.

В настоящее время существуют два основных подхода к проведению скрининга и обследования больных на сифилис: первый подход характеризуется началом обследования с назначения НТТ, второй — когда обследование начинается с ТТ.

Рис. 1. Традиционный алгоритм серологического скрининга на сифилис (из лекции Фриго Н.В. на цикле усовершенствования врачей, РМАПО, 2012).

Контрольное обследование после лечения проводится с помощью РМП или ее модификации в полуколичественном варианте. По снижению ее титра судят об эффективности терапии

Заключительное обследование проводят не ранее чем через 1 год. Ставится та же специфическая реакция, что и при первичном обследовании. Наличие ее положительных результатов не является препятствием для снятия пациента с учета [13].

Традиционный алгоритм скрининга на сифилис имеет свои преимущества и недостатки. Несомненным преимуществом является то, что он выявляет активную инфекцию. Однако данный алгоритм дает высокий процент ложноположительных результатов, нуждается в подтверждении ТТ и может пропустить ранний первичный сифилис или пролеченную инфекцию.

Рис. 2. Реверсионный алгоритм серологического скрининга на сифилис (из лекции Фриго Н.В. на цикле усовершенствования врачей, РМАПО, 2012).

При положительном результате ТТ следует постановка НТТ с определением титра антител.

Если НТТ дает отрицательный результат, проводится дополнительное тестирование с использованием второго чувствительного и специфичного (подтверждающего) ТТ (например, РПГА).

При отрицательном результате дополнительного подтверждающего теста (РПГА–) делается вывод о том, что человек не болен сифилисом; при этом положительный результат скринингового ТТ (первый) расценивается как ложноположительный.

При положительном результате (РПГА+) делается вывод о том, что у человека имеется сифилис в настоящем или был перенесен в прошлом.

Можно привести ряд аргументов в пользу использования реверсионного алгоритма:

• возможность автоматизации ТТ;

• высокая производительность (до 180 тестов в час);

• отсутствие или сведение до минимума ручных манипуляций (безопасность персонала и высокое качество исследований);

• низкая себестоимость при больших объемах тестирования (поток);

• отсутствие ложнонегативных реакций и феномена прозоны (высокая чувствительность);

• возможность детекции IgM антител — потенциальная возможность диагностики раннего сифилиса.

Главным преимуществом реверсионного алгоритма является то, что он выявляет ранний или пролеченный сифилис, что может быть пропущено при традиционном скрининге. Вместе с тем он также имеет ряд недостатков: реверсионный алгоритм нуждается в постановке НТТ для подтверждения активной инфекции и контроля эффективности терапии, может давать ложноположительные результаты (из-за недостаточно высокой специфичности тестов), не позволяет дифференцировать активную и пролеченную инфекцию (и это его основной недостаток!).

Проблемы возникают чаще всего при наличии положительного результата ТТ и отрицательного результата НТТ. Тактика в этом случае должна быть следующей.

• При несовпадении результатов скринингового ТТ и НТТ (ТТ+, НТТ–) необходима постановка дополнительного подтверждающего ТТ.

• Подтверждающий Т.Т. должен иметь чувствительность не ниже, а специфичность — выше, чем скрининговый ТТ.

• В качестве дополнительного подтверждающего теста в этих случаях может быть рекомендована РПГА (РИФабс не рекомендуется ввиду более низкой аналитической чувствительности в сравнении с другими ТТ) [24].

• Результаты скрининга следует анализировать с учетом клинической картины заболевания и анамнестических данных пациентов (в частности, полноты и качества проведенного специфического лечения по поводу ранее перенесенного сифилиса).

Таким образом, приведенные данные свидетельствуют о том, что в распоряжении дерматовенерологов и врачей других специальностей в настоящее время имеется большой арсенал как прямых, так и непрямых лабораторных методов исследования для диагностики сифилиса. Рациональное использование имеющихся технологий и алгоритмов диагностики позволяет осуществлять эпидемиологический надзор и контроль над распространением сифилиса на территории города Москвы и других субъектов Российской Федерации.

Читайте также: