Тест-системы для диагностики бруцеллеза животных в ра рск и рдск
Обновлено: 18.04.2024
Бруцеллез - зоонозная инфекция, характеризующаяся полиорганными патологиями и склонностью к хронизации. Значимым патогенетическим компонентом бруцеллеза является аллергическая реактивность. Передача бруцелл происходит в основном пищевым и водным путем, наиболее часто через молоко и мясо зараженных животных. У скотоводов может реализоваться воздушный и контактный путь передачи бруцеллеза. Диагноз устанавливается при выявлении возбудителя в крови, пунктате лимфатического узла или цереброспинальной жидкости. Серологическая диагностика может считаться достоверной при положительном результате сразу нескольких различных способов: ИФА, РЛА, РНГА, РИФ, РСК и др.
Общие сведения
Бруцеллез - зоонозная инфекция, характеризующаяся полиорганными патологиями и склонностью к хронизации. Значимым патогенетическим компонентом бруцеллеза является аллергическая реактивность. Бруцеллез классифицируют по характеру течения, различая острую (продолжительность до полутора месяцев), подострую (не более четырех месяцев), хроническую (более четырех месяцев) и резидуальную (отдаленные последствия) формы.
Причины бруцеллеза
Бруцеллез вызывается неподвижными полиморфными грамотрицательными микроорганизмами рода Brucella. Вид бруцелл, вызывающих инфекцию, оказывает влияние на тяжесть течения, наиболее тяжело протекает бруцеллез, обусловленный заражением Brucella melitensis. Бруцеллы высокоинвазивны, размножаются внутри клеток организма хозяина, но способны сохранять активность и вне клетки. В окружающей среде устойчивы, сохраняются в воде более двух месяцев, три месяца – в сыром мясе (30 дней - в засоленном), около двух месяцев - в брынзе и до четырех – в шерсти животных. Губительно для бруцелл кипячение, нагревание до 60 °С убивает их через 30 минут.
Резервуаром бруцеллеза являются животные, источником заражения для человека преимущественно являются козы, овцы, коровы и свиньи. В некоторых случаях возможна передача от лошадей, верблюдов, некоторых других животных. Выделение возбудителя больными животными происходит с испражнениями (кал, моча), молоком, амниотической жидкостью. Передача инфекции осуществляется преимущественно фекально-оральным механизмом, чаще всего пищевым и водным путем, в некоторых случаях возможна реализация контактно-бытового (при внедрении возбудителя через микротравмы кожи и слизистых оболочек) и аэрогенного (при вдыхании инфицированной пыли) пути.
Значительную эпидемиологическую опасность представляют собой молоко, полученное от больных животных и молочные продукты (брынза, кумыс, сыры), мясо, изделия из животного сырья (шерсть, кожа). Животные загрязняют испражнениями почву, воду, корм, что также может способствовать заражению человека непищевым путем. Контактно-бытовой и воздушно-пылевой пути реализуются при уходе за животными и обработке животного сырья.
При бруцеллезе у беременных существует вероятность внутриутробной передачи инфекции, кроме того, возможна постнатальная передача при лактации. Люди обладают высокой восприимчивостью к бруцеллезу, после перенесения инфекции в течение 6-9 месяцев сохраняется иммунитет. Повторное инфицирование бруцеллами отмечается в 2-7% случаев.
Симптомы бруцеллеза
Инкубационный период бруцеллеза в среднем составляет 1-4 недели, но при формировании латентного носительства удлиняется до 2-3 месяцев. Острый бруцеллез обычно развивается быстро, у пожилых лиц начало может быть постепенным (в этом случае больные отмечают продромальные явления в виде общего недомогания, бессонницы, разбитости, артралгий и миалгий с постепенным нарастанием интоксикации на протяжении нескольких дней). Температура тела резко поднимается до высоких цифр, потрясающий озноб чередуется с проливным потом, развивается интоксикация, чаще всего умеренная, несмотря на выраженную температурную реакцию.
Лихорадочный период чаще всего составляет несколько дней, иногда затягиваясь до 3 недель или месяца. Больные отмечают расстройства сна, аппетита, головные боли, эмоциональную лабильность. На пике температурной кривой отмечается гиперемия и отечность лица и шеи на фоне общего побледнения. Выявляется умеренная полилимфоаденопатия – лимфатические узлы, преимущественно шейные и подмышечные, несколько увеличены в размерах и умеренно болезненные на ощупь. При острой форме также могут отмечаться более характерные для подострого течения бруцеллеза фиброзиты и целлюлиты – плотные болезненные образования по ходу сухожилий и мышц размером с горошину (иногда достигают размеров мелкого куриного яйца).
Подострый бруцеллез
Данная форма заболевания часто сопровождается фиброзами и целлюлитами. При тяжелом течении возможно развитие инфекционно-токсического шока, осложнения в виде воспаления оболочек сердца (перикардит). Подострая форма бруцеллеза сопровождается проявлениями аллергии – высыпаниями, дерматитом, сосудистыми реакциями и т.п.). Первым делом обычно страдает суставной аппарат: развиваются реактивные полиартриты, бурситы и тендовагиниты. Для мужчин характерно поражение яичек и их придатков, у женщин возможны нарушения менструаций, эндометриты. Бруцеллез при беременности может способствовать ее преждевременному прерыванию.
Хронический бруцеллез
Протекает волнообразно, с проявлением симптоматики полиорганных поражений. При этом общеинтоксикационный синдром (лихорадка и интоксикация) обычно выражены умерено, температура редко превышает субфебрильные значения. Промежутки между обострениями заболевания могут продолжаться 1-2 месяца. В случае формирования нового инфекционного очага внутри организма происходит ухудшение общего состояния. Симптоматика хронического бруцеллеза зависит от преимущественного поражения той или иной функциональной системы возбудителем и выраженности аллергического компонента.
Часто развиваются воспаления суставов (артриты) и окружающих тканей, соединительнотканные патологии (фиброзы, целлюлит) в области поясницы и крестца, локтевых суставов. Иногда развивается спондилит, значительно ухудшающий состояние больных ввиду интенсивных болей и ограничения в движении. Суставы часто подвергаются деструкции и деформации.
Нередки у больных бруцеллезом невриты (в том числе воспаления зрительного и слухового нерва) и радикулиты, воспаления нервных сплетений, парестезии. Длительное течение заболевания способствует развитию реактивного невроза. При хроническом бруцеллезе также характерны аллергические воспаления половых желез и расстройства фертильности (бесплодие у женщин, импотенция у мужчин). Длительность заболевания может составлять 2-3 года и увеличиваться при повторном инфицировании.
Резидуальный бруцеллез
Резидуальный бруцеллез – отсроченные последствия инфекции – связан с формированием патологической реактивности. Ввиду перестройки иммунологической структуры организма возможны специфические реакции организма – субфебрильная температура тела, психологические девиации, патологии суставов, соединительнотканных образований.
Кроме того, бруцеллез может оставлять после себя серьезные дегенеративные изменения фиброзной ткани, в особенности значимые в области нервных стволов и сплетений – высока вероятность развития контрактур, возникновения неврологической симптоматики (парезы, нейропатии). Длительное течение заболевания способствует формированию стойких функциональных нарушений со стороны опорно-двигательных структур ввиду необратимой деструкции суставных тканей и связочного аппарата (анкилоз и спондилез, контрактуры, мышечные атрофии). Нередко такие последствия бруцеллеза являются показанием к хирургической коррекции.
Диагностика
Бактериологическая диагностика производится в условиях специализированных лабораторий, оборудованных для работы с возбудителями особо опасных инфекций. Бруцеллы выделяют из крови, ликвора, пунктатов лимфоузлов, производя бакпосев биологического материала на питательных средах. Ввиду значительных трудозатрат выделение возбудителя редко производят в диагностических целях, достаточным для подтверждения диагноза является определение антигенов к бруцеллам в крови пациента и серологических тестов.
Антигены выявляются с помощью ИФА, РКА, РЛА и РАГА. Исследованию подвергается обычно сыворотка крови, но возможно обнаружение антигенов и в спинномозговой жидкости. Определение антител осуществляют при помощи РА, РНГА, РСК, РИФ, а также реакции Райта и теста на взаимодействие бруцелл с сывороткой больного. Достаточным для диагностирования считается положительный результат не менее чем в 3-4 различных серологических тестах. Начиная с 20-25 дня болезни и в течение длительного периода (несколько лет) после выздоровления отмечается положительная реакция на кожную пробу Бюрне (подкожное введение бруцеллина).
Лечение бруцеллеза
Амбулаторное лечение показано при легком течении инфекции. В случае тяжелого течения и угрозы осложнений производят госпитализацию. На период лихорадки больным показан постельный режим. Этиотропная терапия подразумевает назначение антибиотиков различных групп, один из препаратов обязательно должен обладать способностью проникновения сквозь клеточную стенку. Эффективно применение следующих антибиотиковых пар: рифампицин с доксициклином или офлоксацином, доксициклин со стрептомицином. В случае развития рецидива назначают повторный курс антибиотикотерапии.
В дополнение к базовой терапии назначают патогенетические и симптоматические средства: дезинтоксикационную терапию (в зависимости от тяжести интоксикации), иммуностимулирующие средства (экстракт тимуса крупного рогатого скота, пентоксил), новокаиновые блокады при спондилите и интенсивном радикулите, противовоспалительные средства (нестероидные препараты и кортикостероиды в зависимости от течения и суставных проявлений).
Ранее в комплексной терапии бруцеллеза применяли лечебную вакцину, но в настоящее время от этой практики отказываются ввиду выраженного подавления иммунитета и способности вакцины провоцировать аутоиммунные процессы. Во время ремиссий больным рекомендовано санаторно-курортное лечение, физиотерапевтическое воздействие (УВЧ, кварц, радоновые ванны и др.) и лечебная физкультура.
Прогноз и профилактика
Обычно бруцеллез не становится причиной смерти больных, прогноз, как правило, благоприятен. В случаях длительного течения и развития стойких деструктивных дефектов суставного аппарата возможно ограничение трудоспособности.
В комплекс профилактических мер, направленных на снижение заболеваемости бруцеллезом людей включается ветеринарный контроль за состоянием здоровья сельскохозяйственных животных, а также санитарно-гигиеническое нормирование условий производства, хранение и транспортировки пищевых продуктов, ежегодные профилактические обследования работников сельского хозяйства.
Сельскохозяйственный скот подлежит плановой вакцинации, Также специфическая профилактика с помощью прививок живой бруцеллезной вакциной показана лицам, непосредственно работающим с животными. К средствам индивидуальной профилактики также относится спецодежда для работы с животным сырьем, строгое следование правилам личной гигиены.
Продукция \ Диагностикумы \ Набор компонентов для диагностики бруцеллеза животных в РА, РСК, РДСК
Набор компонентов для диагностики бруцеллеза животных в РА, РСК, РДСК
Состав набора: антиген бруцеллезный единый для РА, РСК, РДСК; сыворотка бруцеллезная сухая; сыворотка крови КРС негативная сухая.
Набор состоит из следующих компонентов:
- антиген бруцеллезный единый для РА, РСК, РДСК - взвесь инактивированных бруцелл вида abortus - 4 флакона по 20 см3 или 8 флаконов по 10 см3;
- сыворотка бруцеллезная сухая - сыворотка крови быков (волов), гипериммунизированных культурой бруцелл вида abortus - 2 флакона по 2 см3;
- сыворотка крови крупного рогатого скота негативная сухая - 2 флакона по 2 см3.
Внешний вид
По внешнему виду компоненты Набора представляют собой:
- антиген - непрозрачную жидкость серо-белого цвета, с выпадающим при хранении осадком микробных клеток, гомогенизирующимся при встряхивании;
- сыворотки бруцеллезная и негативная сухие - пористую массу бежевого цвета с желтоватым оттенком полностью растворяющуюся в дистиллированной воде в течение 5 минут с образованием прозрачной жидкости светло-желтого цвета без механической примеси, хлопьев, плесени.
Назначение
Набор предназначен для исследования 300 проб сывороток крови животных с целью определения их благополучия по бруцеллезу.
Принцип метода
Принцип РА и РСК (РДСК) основан на способности S-бруцеллезного антигена взаимодействовать с гомологичными агглютинирующими и (или) комплементсвязывающими антителами сыворотки крови животных, больных бруцеллезом или иммунизированных бруцеллезными агглютиногенными вакцинами с проявлением соответственно феномена агглютинации и (или) связывания комплемента.
Форма выпуска
Антиген и сыворотки в вышеуказанных объемах выпускают в стеклянных
флаконах, герметично укупоренных резиновыми пробками и обкатанных алюминиевыми колпачками.
Упаковка
Флаконы с компонентами Набора упаковывают коробки с перегородками, обеспечивающими их неподвижность и целостность.
Условия хранения
Набор транспортируют и хранят в сухом темном месте при температуре 2 - 8°С.
Срок годности
Срок годности Набора - 24 месяца с даты выпуска при соблюдении условий хранения и транспортирования.
ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА БРУЦЕЛЛЕЗА
Animals. Laboratory diagnostics of brucellosis. Serological methods
Предисловие
Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены в ГОСТ 1.0-2015 "Межгосударственная система стандартизации. Основные положения" и ГОСТ 1.2-2015 "Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, обновления и отмены"
Сведения о стандарте
1 РАЗРАБОТАН Федеральным государственным бюджетным учреждением "Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов" (ФГБУ "ВГНКИ")
2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии
3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 7 июня 2017 г. N 99-П)
За принятие проголосовали:
Краткое наименование страны по МК (ИСО 3166) 004-97
Сокращенное наименование национального органа по стандартизации
Минэкономики Республики Армения
Госстандарт Республики Беларусь
Госстандарт Республики Казахстан
4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 22 июня 2017 г. N 582-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 34105-2017 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 июля 2018 г.
5 ВЗАМЕН ГОСТ 25385-91 в части серологических методов диагностики
1 Область применения
Настоящий стандарт распространяется на все виды млекопитающих животных и устанавливает следующие методы серологической диагностики бруцеллеза:
- реакция агглютинации с S- и R-бруцеллезными антигенами;
- пластинчатая реакция агглютинации с антигеном, окрашенным бенгальской розовой (роз бенгал проба);
- реакция связывания комплемента;
- реакция длительного связывания комплемента на холоде;
- реакция непрямой гемагглютинации;
- реакция иммунодиффузии в геле агара с олигополисахаридным антигеном;
- реакция иммунодиффузии в геле агара с R-бруцеллезным антигеном;
- кольцевая реакция с молоком;
Примечание - Методы применимы ко всем видам бактерий рода Brucella.
2 Нормативные ссылки
В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:
ГОСТ 12.0.004-2015 Система стандартов безопасности труда. Организация обучения безопасности труда. Общие положения
ГОСТ 12.1.005-88 Система стандартов безопасности труда. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны
ГОСТ 12.4.011-89 Система стандартов безопасности труда. Средства защиты работающих. Общие требования и классификация
ГОСТ 1625-2016 Формалин технический. Технические условия
ГОСТ 2651-78 Натрия бихромат технический. Технические условия
ГОСТ 4204-77 Реактивы. Кислота серная. Технические условия
ГОСТ 4220-75 Реактивы. Калий двухромовокислый. Технические условия
ГОСТ 4233-77 Реактивы. Натрий хлористый. Технические условия
ГОСТ 5962-2013 Спирт этиловый ректификованный из пищевого сырья. Технические условия
ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия
ГОСТ 9147-80 Посуда и оборудование лабораторные фарфоровые. Технические условия
ГОСТ 12026-76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия
ГОСТ 16317-87 Приборы холодильные электрические бытовые. Общие технические условия
ГОСТ 16445-2012 Сыворотка гемолитическая для реакции связывания комплемента. Технические условия
ГОСТ 16446-2012 Комплемент сухой для реакции связывания комплемента. Технические условия
ГОСТ ИСО/МЭК 17025-2009 Общие требования к компетентности испытательных и калибровочных лабораторий
ГОСТ 17206-96 Агар микробиологический. Технические условия
ГОСТ 18704-78 Кислота борная. Технические условия
ГОСТ 23519-93 Фенол синтетический технический. Технические условия
ГОСТ 25134-2013 Бруцеллин ВИЭВ. Технические условия
ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры
ГОСТ 25794.1-83 Реактивы. Методы приготовления титрованных растворов для кислотно-основного титрования
ГОСТ 29230-91 (ИСО 835-4-81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 4. Пипетки выдувные
ГОСТ 33675-2015 Животные. Лабораторная диагностика бруцеллеза. Бактериологические методы
Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодному информационному указателю "Национальные стандарты", который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по выпускам ежемесячного информационного указателя "Национальные стандарты" за текущий год. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.
3 Термины, определения и сокращения
3.1 В настоящем стандарте применены термины с соответствующими определениями по ГОСТ 33675.
3.2 В настоящем стандарте применены следующие сокращения:
- РА - реакция агглютинации;
- РСК - реакция связывания комплемента;
- РБП - пластинчатая реакция агглютинации с бруцеллезным роз бенгал антигеном;
- РДСК - реакция длительного связывания комплемента;
- РИД - реакция иммунодиффузии;
- ЛПС - липополисахаридный антиген;
- О-ПС - олигополисахаридный антиген;
- РНГА - реакция непрямой гемагглютинации;
- КР с молоком - кольцевая реакция с молоком;
- ИФА - иммуноферментный анализ;
- ИХА - иммунохроматографический анализ;
- PKг-G - раствор конъюгата, конъюгированного с пероксидазой;
- ФСБ-Т - фосфатно-солевой буферный раствор с твином;
- РБР-С - разводящий буферный раствор для сывороток;
- К+ - инактивированная сыворотка крови животных, содержащая специфические антитела класса G к бактериям рода Brucella (положительный контрольный образец);
- К- - инактивированная сыворотка крови животных, не содержащая специфических антител к бактериям рода Brucella (отрицательный контрольный образец).
НАСТАВЛЕНИЕ ПО ДИАГНОСТИКЕ БРУЦЕЛЛЕЗА ЖИВОТНЫХ
Руководитель Департамента ветеринарии Е.А.Непоклонов 29 сентября 2003 г. N 13-5-02/0850
1. ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ
1.1. Бруцеллез - инфекционная, хронически протекающая болезнь животных.
Возбудитель - бактерии из рода бруцелла, в который входят шесть самостоятельных видов: мелитензис (овец и коз), абортус (крупного рогатого скота), суис (свиней), канис (собак), овис (баранов и овец) и неотома (кустарниковых крыс).
Микроорганизмы первых четырех видов вызывают бруцеллез животных, а пятого вида - инфекционный эпидидимит баранов (ИЭ).
От животных, больных бруцеллезом, могут заражаться люди, для которых наиболее опасен возбудитель бруцеллеза овец и коз.
1.2. Диагноз на бруцеллез у животных ставят на основании результатов бактериологического, серологического, молекулярно-генетического и аллергического исследований с учетом эпизоотологических данных и клинических признаков болезни, руководствуясь при этом санитарными и ветеринарными правилами по профилактике и борьбе с заразными болезнями, общими для человека и животных.
1.2.1. При установлении диагноза на бруцеллез необходимо учитывать следующее:
- различные виды возбудителя являются патогенными, в основном, для животных соответствующего вида. Бруцеллы видов мелитензис, абортус и суис могут мигрировать на животных других видов;
- клинические признаки бруцеллеза у животных не характерны. Наиболее часто клиническое проявление болезни у маточного поголовья - аборт, у свиноматок наблюдается мумификация плодов.
При абортах отмечается утолщение плодовых оболочек, образование на них фибринозных или гнойных хлопьев. Бруцеллез сопровождается нередко поражением суставов (артриты), синовиальной системы (тендовагиниты, бурситы), половой системы (у самок - эндометрит, вагинит, у самцов - орхит, эпидидимит);
- патологоанатомическая картина при бруцеллезе не имеет характерных особенностей, позволяющих использовать их для диагностики этой болезни. Только у свиней на слизистой оболочке матки иногда находят желтовато-гнойные или казеозные узелки величиной с просяное зерно, так называемый "милиарный бруцеллез матки";
- у баранов, больных бруцеллезом, в семенниках и придатках обнаруживают некротические или гнойные очаги различной величины; отмечают заполнение полости мошонки серозно-гнойным транссудатом, разрастание фиброзной ткани, сращение придатка с семенником и общей влагалищной оболочкой, иногда атрофию семенников.
1.3. Диагностика бруцеллеза включает лабораторные (бактериологическое, серологическое и молекулярно-генетическое) исследования материала и аллергическое исследование свиней в хозяйствах.
Плановые серологические исследования являются основным методом выявления больных и подозрительных по заболеванию животных.
Бактериологическую диагностику проводят в случае аборта или при появлении у животных других признаков (бурситы, гигромы, орхиты, эпидидимиты и прочие), вызывающих подозрение на данное заболевание. Одновременно проводят серологическое исследование сывороток крови этих животных.
Молекулярно-генетическое исследование (ПЦР) проводят в случае аборта и при появлении у животных других клинических признаков, вызывающих подозрение на бруцеллез, а также при получении положительных и сомнительных результатов серологического исследования на бруцеллез животных, не иммунизированных противобруцеллезными вакцинами, из хозяйств, благополучных по данному заболеванию.
1.4. При взятии проб крови, молока и патологического материала, а также проведении лабораторных исследований необходимо соблюдать меры, предупреждающие заражение людей и обсеменение объектов внешней среды, руководствуясь при этом действующими правилами и инструкциями.
2. ВЗЯТИЕ МАТЕРИАЛА ОТ ЖИВОТНЫХ И ПЕРЕСЫЛКА ЕГО ДЛЯ ЛАБОРАТОРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1. Материал для лабораторных исследований отбирают от каждого животного в отдельности.
2.2. Для бактериологического исследования на бруцеллез направляют абортированный плод с плодовыми оболочками (от свиноматок берут не менее трех плодов) или селезенку, печень, желудок плода с содержимым, перевязанный со стороны пищевода и двенадцатиперстной кишки, и околоплодную жидкость.
Для прижизненной диагностики бруцеллеза от животных берут кровь, молоко, содержимое гигром (бурситов) и абсцессов. При диагностическом убое - дополнительно селезенку, печень, подчелюстные, заглоточные, предлопаточные, надколенные, подколенные, надвыменные, парааортальные, тазовые лимфатические узлы и половые органы. Жидкий материал берут в стерильную посуду (пробирки, банки).
При взятии содержимого гигром, бурс в области поражения выстригают шерсть, кожный покров дезинфицируют 70%-ным спиртом и смазывают настойкой йода. Затем стерильным шприцем с иглой большого диаметра делают пункцию, отсасывают содержимое гигромы (бурсы) и переносят его в стерильную пробирку с резиновой пробкой.
Перед взятием проб молока у коров вымя обмывают теплой водой, соски обрабатывают 70%-ным спиртом. Для исследования из каждой доли вымени берут последние порции молока в количестве 10-15 мл в отдельные стерильные пробирки с резиновыми пробками.
У овец и коз пробы молока берут путем пункции цистерны вымени. Для этого животное фиксируют в боковом положении, вымя у основания соска протирают 70%-ным спиртом и смазывают настойкой йода. Стерильным шприцем с иглой делают пункцию у основания соска и после попадания иглы в цистерну (о чем судят по свободному движению конца иглы) набирают в шприц молоко и переносят его в стерильную пробирку с резиновой пробкой.
Молоко должно быть доставлено в лабораторию и исследовано в день взятия пробы. Если это невозможно, молоко консервируют сухой борной кислотой (0,1 г на 10 мл) или генцианвиолетом (0,4 мл 1%-го спиртоводного раствора краски на 10 мл молока). Консервированное молоко пригодно для исследования в течение 10 дней.
2.2.1. Отобранные для бактериологического исследования пробы упаковывают в целлофан или пергаментную бумагу, помещают в непроницаемую тару (ящик, банка, полиэтиленовый пакет) и в этот же день направляют в лабораторию. От абортировавшего животного одновременно с патологическим материалом направляют кровь (сыворотку крови) для серологического исследования на бруцеллез. Если в течение 24-30 ч взятый материал доставить в лабораторию не представляется возможным, его консервируют стерильным 30%-ным водным раствором химически чистого глицерина. Материал заливают консервирующей жидкостью в количестве, превышающем его объем в 4-5 раз. Крупные плоды направляют в неконсервированном виде.
2.3. Для серологического исследования в лабораторию направляют кровь (сыворотку крови) и молоко.
2.3.1. Кровь у животных берут из яремной вены (у свиней - из яремной, ушной или хвостовой; у собак - головной предплечья или латеральной подколенной голени; у лисиц и песцов - из бедренной вены; у норок путем отсечения подушечки среднего пальца задней лапы или кончика хвоста в стерильные пробирки по 5-7 мл (от пушных зверей по 1-2 мл). Пробирки нумеруют и составляют опись проб.
Консервирование сывороток проводят:
- добавлением 0,05 мл (1 капля) 5%-го раствора фенола на каждый миллилитр сыворотки при тщательном перемешивании;
- сухой борной кислотой (2-4% к объему сыворотки) до получения насыщенного раствора и образования на дне пробирки небольшого осадка;
- путем однократного замораживания.
Неконсервированные сыворотки пригодны для исследования в течение 6 сут со дня взятия крови при условии хранения их при 4-8 °С.
Сыворотки, консервированные фенолом или борной кислотой, пригодны для исследования в течение 30 сут; замороженные сыворотки - в течение 3 сут после однократного оттаивания.
Мутные, проросшие, гемолизированные сыворотки исследованию на бруцеллез не подлежат.
2.3.2. Для исследования на бруцеллез в кольцевой реакции пробу цельного свежего молока от коровы (буйволицы) берут сборную из каждой доли вымени одного удоя в одну стерильную пробирку в количестве 10-15 мл. При этом, если молоко берут перед дойкой, то первые порции молока сдаивают. Пробы молока на рынках берут из каждой отдельной посуды (бидон, фляга и проч.) после тщательного его перемешивания. Пробирки нумеруют и составляют опись проб.
Молоко исследуют свежее (охлажденное до 4-10 °С или неохлажденное) или консервированное добавлением в каждую пробу одной капли 10%-го раствора формалина на 5 мл молока. Консервированное молоко пригодно для исследования в течение 2-3 сут. Перед исследованием молоко необходимо тщательно перемешать для равномерного распределения сливок.
При массовом исследовании молока работу по отбору проб и постановке кольцевой реакции можно проводить непосредственно на ферме в специально отведенном помещении.
Не разрешается исследовать в кольцевой реакции молоко от коров (буйволиц), больных маститом или болезнями, сопровождающимися повышением температуры тела, а также молоко животных в первые две недели после родов. Молоко, имеющее повышенную кислотность (30° по Тернеру и выше), исследованию не подлежит, т.к. антиген обесцвечивается.
2.4. На направляемый в лабораторию материал заполняют сопроводительный документ установленной формы.
3. БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА БРУЦЕЛЛЕЗА
3.1 Бактериологическую диагностику бруцеллеза проводят в случае аборта или при появлении у животных других признаков (бурситы, гигромы, орхиты, эпидидимиты и прочие), вызывающих подозрение на данное заболевание.
3.2 Бруцеллы обнаруживают бактериоскопией мазков из патологического материала, выделением культуры бруцелл на питательных средах и, при необходимости, путем постановки биологической пробы на морских свинках.
3.3 Бактериоскопическое исследование
Из доставленного на исследование патологического материала делают по два мазка из каждого объекта. При исследовании абортированных плодов мазки готовят из содержимого желудка, жидкости брюшной и грудной полостей, печени, селезенки, а также котиледонов плодовых оболочек. Из паренхиматозных органов, котиледонов и другого плотного материала делают мазки-отпечатки, жидкий материал наносят на предметные стекла пипеткой.
Мазки, фиксированные над пламенем горелки, окрашивают по Граму и одному из следующих специальных методов: по Стампу (модифицированный метод Циль-Нильсена), Козловскому или Шуляку-Шину (см. Прил. N 1, п.1). При микроскопии мазков учитывают, что бруцеллы - мелкие, грамотрицательные, расположенные отдельно, попарно или кучно коккобактерии, окрашивающиеся по Стампу, Козловскому или Шуляку-Шину в красный цвет.
3.4. Бактериологическое исследование
3.4.1 Для культивирования бруцелл используют мясо-пептонный печеночный бульон (МППБ), печеночный глюкозо-глицериновый бульон (ПГГБ), мясо-пептонный печеночно-глюкозо-глицериновый агар (МППГГА), печеночный глюкозо-глицериновый агар (ПГГА), картофельный агар, эритрит-агар, сывороточно-декстрозный агар, печеночно-сывороточный агар и печеночно-аминопептидный агар, (см. Прил. N 1, п.2) и другие питательные среды, предназначенные для этой цели.
3.4.2 Перед посевом материала кожу абортированного плода с поверхности по белой линии протирают тампонами, смоченными 5%-ным раствором фенола. Стерильными ножницами вскрывают брюшную стенку и грудную клетку плода, содержимое грудной и брюшной полостей набирают пастеровскими пипетками и высевают в 1 пробирку с бульоном и 2 пробирки с агаром, а содержимое желудка - в 2 пробирки с бульоном и не менее 5 пробирок с агаром.
Из печени и селезенки вырезают кусочки размером не менее 2,0х1,5х2,5 см, увлажняют их спиртом, обжигают с поверхности и растирают в стерильной ступке с песком. Затем в ступку добавляют равное количество стерильного физиологического раствора и вновь растирают. Полученную взвесь пастеровской пипеткой по 0,1-0,2 мл высевают на поверхность предварительно подсушенных плотных сред (в пробирках или чашках). Допускается высев материала пастеровской пипеткой из органов (место прокола органа предварительно прижигают раскаленным шпателем). Из каждого органа делают посев на 1 пробирку с бульоном и 2 пробирки с агаром.
Если в лабораторию доставлен только желудок плода, высев проводят не менее чем на 10 пробирок агара.
При поступлении нескольких плодов от одного животного посевы делают из органов и тканей каждого плода отдельно.
Из плодовых оболочек и плаценты вырезают кусочки тканей с утолщенными ворсинками и стенками, наличием на поверхности фибрина или гнойного экссудата (выбирают менее загрязненные участки без некротических изменений).
Для уничтожения посторонней микрофлоры кусочки плаценты помещают в чашку Петри и заливают 3%-ным раствором гидроокиси калия на 30 мин. Затем их обмывают стерильным физиологическим раствором, готовят из этого материала суспензию в ступке со стерильным песком и делают посев пастеровской пипеткой на чашки со средой, содержащей бактериостатические препараты: генцианвиолет 1:200000 (0,1 мл 0,5%-го спиртоводного раствора на 100 мл среды) или кристаллвиолет 1:100000, генцианвиолет и малахитовую зелень в концентрации каждой краски 1:200000, уксуснокислый натрий из расчета 12,5 мг на 100 мл среды и др.
Содержимое бурс, гигром высевают на 3-4 чашки с плотной питательной средой, содержащей бактериостатические препараты.
Пробы молока центрифугируют 30 мин при 3000 об./мин. Верхний слой (сливки) и осадок набирают в пастеровскую пипетку и по 0,1-0,2 мл вносят на 3-4 чашки с агаром, содержащим бактериостатические препараты. Молоко, консервированное генцианвиолетом или другими консервантами, высевают на среды без бактериостатических веществ.
3.4.3. Для выращивания культур посевы помещают в термостат при 37-38 °С.
При исследовании материала от крупного рогатого скота половину засеянных пробирок и чашек культивируют в обычных условиях, другую - в атмосфере с повышенным содержанием углекислого газа (10-15%) в -инкубаторе или эксикаторе (микроанаэростате). Аналогичные условия можно создать в пробирках, закрытых резиновыми пробками или залитых парафином.
Перед парафинированием пробирки закрывают ватными пробками, пронося последние над пламенем горелки. Затем верхнюю часть пробки обрезают, а оставшуюся часть углубляют на 0,5-1,0 см внутрь пробирки и заливают расплавленным парафином.
Необходимое содержание углекислого газа в эксикаторе можно получить путем:
- заполнения части объема углекислым газом из баллона или аппарата Киппа;
- внесения бикарбоната натрия и серной или соляной кислоты (0,48 г бикарбоната натрия и 5 мл 25%-го раствора кислоты или 0,4 г бикарбоната натрия и 0,35 мл концентрированной соляной кислоты на 1 л объема);
- сжигания ваты, смоченной спиртом. При этом пробирки и чашки с посевами должны занимать не более половины объема эксикатора. Для определения концентрации углекислого газа в эксикаторе можно использовать химический метод (см. Прил. N 1, п.3).
3.4.4. Посевы выдерживают в термостате при 37-38 °С в течение 30 сут. Первичный осмотр посевов проводят через 24-48 ч. Пробирки с агаром и бульоном, заросшие посторонней микрофлорой, обезвреживают путем автоклавирования при 1,5 атм. в течение 1 ч.
В дальнейшем для обнаружения роста бруцелл посевы просматривают каждые 3-4 сут визуально, при необходимости через лупу или малом увеличении микроскопа. При отсутствии роста часть поверхности агара орошают посевным материалом.
При значительном росте посторонней микрофлоры (80% и более засеянных пробирок) бактериологическое исследование прекращают.
При просмотре посевов обращают внимание на характер роста микробов. На поверхности агара бруцеллы образуют мелкие, блестящие, выпуклые, с ровными краями и гладкой поверхностью просвечивающиеся колонии, имеющие в отраженном свете голубоватый оттенок, в падающем свете - сероватый. С возрастом колонии мутнеют и приобретают более темную окраску, что связано с появлением пигмента.
В бульоне бруцеллы образуют равномерное помутнение и пристеночное кольцо, возвышающееся над уровнем бульона, а в дальнейшем небольшой осадок на дне пробирки. В отраженном свете пристеночное кольцо имеет голубоватый оттенок.
При обнаружении роста на жидких средах и отсутствии характерного роста на агаре из каждой пробирки готовят мазки, которые окрашивают одним из специальных методов, и делают пересев на чашки с плотной средой для выделения чистой культуры. Пересевы на чашках культивируют так же, как и высевы из патологического материала.
Выделенные культуры идентифицируют по тинкториальным (окраска мазков по Граму и одним из специальных методов - по Стампу, Козловскому или Шуляку-Шину), морфологическим, культуральным свойствам и в реакции агглютинации на стекле с использованием набора компонентов для серологической дифференциации бруцелл.
Для постановки пластинчатой реакции агглютинации на стекле необходимы следующие компоненты: испытуемая культура, набор для серологической дифференциации бруцелл (выпускается биопредприятием), 0,5%-ный фенолизированный физиологический раствор рН 7,0-7,2.
4.2. Постановка и учет результатов реакции агглютинации в пробирках (РА).
4.2.1. Реакцию агглютинации в пробирках с бруцеллезным антигеном применяют при
диагностике бруцеллеза у крупного рогатого скота, овец, коз, лошадей, буйволов, верблюдов, оленей,
собак, пушных зверей и животных других видов.
4.2.2. Компоненты реакции агглютинации:
испытуемые сыворотки крови (см. подпункт 2.3.1);
позитивная бруцеллезная сыворотка, изготовленная биопредприятием или полученная от
больного бруцеллезом животного. На этикетке флакона с такими сыворотками указывают титры в РА
и РСК и дату изготовления;
негативная сыворотка (сыворотка крови здоровых животных), изготовленная биопредприятием
или полученная в лаборатории;
антиген бруцеллезный единый для РА, РСК и РДСК (см. Приложение N 2, п. 6);
раствор хлорида натрия. При исследовании сывороток крови крупного рогатого скота, лошадей,
верблюдов, собак, пушных зверей и морских свинок для разведения испытуемых сывороток и
антигена используют фенолизированный (0,5-процентный) физиологический раствор хлорида
натрия (0,85-процентный), при исследовании сывороток крови овец, коз, буйволов - 5-процентный
и оленей - 10-процентный фенолизированный раствор хлорида натрия (см. Приложение N 2, п. 1).
4.2.3. Постановка реакции агглютинации.
Реакцию агглютинации проводят в объеме 1 мл в четырех разведениях:
при исследовании сывороток крови овец, коз, буйволов, оленей и собак - 1:25, 1:50, 1:100 и
крупного рогатого скота, лошадей и верблюдов - 1:50, 1:100, 1:200 и 1:400;
пушных зверей и морских свинок - 1:10, 1:20, 1:40 и 1:80.
При массовых исследованиях допускается постановка реакции в первых двух разведениях.
Разлив компонентов реакции проводят индивидуальными мерными пипетками или
групповыми дозаторами Флоринского.
Для исследования каждой испытуемой сыворотки крови требуется 5 пробирок. В пробирках
первого ряда делают основное разведение. Для этого сыворотку крови крупного рогатого скота,
лошадей и верблюдов берут в дозе 0,1 мл, вносят в пробирки и добавляют к ней 2,4 мл
соответствующего раствора хлорида натрия, получают разведение сыворотки 1:25. Сыворотку крови
овец, коз, буйволов, оленей и собак берут в дозе 0,2 мл и добавляют 2,3 мл соответствующего
раствора хлорида натрия (разведение 1:12,5), а сыворотку крови пушных зверей и морских свинок
берут в дозе 0,3 мл и добавляют 1,2 мл соответствующего раствора хлорида натрия (разведение 1:5).
Таким образом делают основное разведение испытуемых сывороток в пробирках первого ряда
штатива (по 10 проб в ряду).
После приготовления основного разведения сывороток в первом ряду в пробирки третьего,
четвертого и пятого рядов вливают по 0,5 мл соответствующего раствора хлорида натрия. Затем из
пробирок первого ряда при помощи группового дозатора Флоринского переносят в пробирки второго
и третьего рядов по 0,5 мл основного разведения сывороток (1:25, 1:12,5 или 1:5). В пробирках
третьего ряда сыворотки смешивают с раствором хлорида натрия, по 0,5 мл этого разбавления
переносят в пробирки четвертого ряда и так же из пробирок четвертого ряда - в пятый. Из пробирок
пятого ряда по 0,5 мл жидкости удаляют. Таким образом делают последовательные двукратные
разведения одновременно 10 сывороток.
После этого в каждую пробирку второго, третьего, четвертого и пятого рядов с разведенными
сыворотками вносят при помощи группового дозатора Флоринского или другого дозирующего
устройства по 0,5 мл антигена, предварительно разбавленного в соотношении 1:10 соответствующим
раствором хлорида натрия. После добавления антигена разведение сывороток в каждой пробирке
удваивается и в зависимости от вида исследуемых животных будет составлять соотношения: 1:50,
1:100, 1:200 и 1:400; 1:25, 1:50, 1:100 и 1:200 или 1:10, 1:20, 1:40 и 1:80.
В пробирки первого ряда бруцеллезный антиген не вносят, и они служат контролем качества
сыворотки. При наличии хлопьев, фибрина, эритроцитов и посторонних примесей результаты
реакции агглютинации не учитывают.
При массовых исследованиях сыворотки разливают индивидуальной микропипеткой (с грушей)
или групповыми дозаторами Флоринского в две пробирки в дозах 0,02 и 0,01 мл (сыворотки
крупного рогатого скота, лошадей и верблюдов) или 0,04 и 0,02 мл (при исследовании сывороток
овец, коз, буйволов, оленей и собак). Затем в каждую пробирку добавляют по 1,0 мл антигена,
разведенного соответствующим раствором хлорида натрия в соотношении 1:20. При этом разведения
сывороток будут соответствовать соотношениям 1:50 и 1:100 или 1:25 и 1:50.
При постановке реакции агглютинации одновременно с испытуемыми сыворотками ставят
с негативной сывороткой в тех же разведениях, как с испытуемыми;
с позитивной бруцеллезной сывороткой в разведениях до ее предельного титра.
После добавления к испытуемым и контрольным сывороткам антигена штативы с пробирками
осторожно встряхивают и помещают в термостат при 37 - 38 °С на 16 - 20 часов, затем выдерживают
при комнатной температуре в течение 1 часа, после чего проводят учет реакции.
4.2.4. Учет реакции агглютинации. Результаты реакции учитывают визуально и определяют в
крестах по следующей схеме:
++++ (4 креста) - полное просветление жидкости, микробные тела
осели на дно пробирки в виде "зонтика", при легком
встряхивании "зонтик" разбивается на хлопья и
а жидкость остается прозрачной (100% агглютинации);
+++ (3 креста) - неполное просветление жидкости и хорошо выраженный
"зонтик" (75% агглютинации);
++ (2 креста) - просветление жидкости, "зонтик" умеренно выражен
+ (1 крест) - едва заметное просветление жидкости, "зонтик"
слабо, при встряхивании заметно небольшое
хлопьев или комочков (25% агглютинации);
- (знак минус) - просветления жидкости и образования "зонтика" не
наступило, на дне пробирки виден "пунктик" осевших
микробов антигена, при легком встряхивании
За титр антител принимают последнее разведение сыворотки, в котором произошла
агглютинация не менее чем на 2 креста (++), что соответствует количеству международных единиц
(ME) антител в 1 мл сыворотки (например, сыворотка с конечным титром РА 1:100 содержит 100 ME,
1:200 - 200 ME и т.п.).
Для более объективной оценки результатов РА в крестах готовят стандарты мутности,
соответствующие 0 (нулю), 25, 50 и 75% просветления жидкости.
В четыре пробирки последовательно наливают 1, 2, 3 и 4 мл антигена, разведенного 1:10. Затем
в том же порядке в три первые пробирки добавляют 3, 2 и 1 мл фенолизированного
физиологического раствора. В четвертую пробирку раствор не добавляют. После встряхивания
пробирок жидкость из каждой из них переносят по 0,5 мл в серологические пробирки и добавляют по
0,5 мл фенолизированного физиологического раствора. Полученные стандарты соответствуют 75, 50
и 25% просветления жидкости. В последней, четвертой пробирке просветление отсутствует.
Стандарты мутности готовят каждый раз при постановке РА и выдерживают в термостате
одновременно с основной реакцией.
Степень просветления в пробирках с исследуемыми сыворотками определяют визуально путем
сравнения со стандартами и результаты реакции выражают в крестах.
При массовых исследованиях сывороток в двух разведениях все сыворотки, давшие
агглютинацию с оценкой не менее чем на 2 креста (++) в каком-либо из указанных разведений,
исследуют повторно в четырех разведениях.
4.2.5. Диагностическая оценка реакции агглютинации.
Реакцию считают положительной при наличии агглютинации с сыворотками крови крупного
рогатого скота, лошадей и верблюдов начиная с разведения 1:100 (100 ME - международных единиц
антител), коз, овец, буйволов, оленей и собак - с разведения 1:50 (50 ME), пушных зверей и морских
свинок - с разведения 1:10 (10 ME) с оценкой не менее чем на 2 креста.
Реакцию считают сомнительной при наличии агглютинации только в разведении 1:50 (50 ME) с
сыворотками крови крупного рогатого скота, лошадей и верблюдов и в разведении 1:25 (25 ME) с
сыворотками овец, коз, буйволов, оленей и собак с оценкой не менее чем на 2 креста.
При получении сомнительного результата реакции сыворотку крови данного животного
исследуют повторно через 3 - 4 недели.
На неблагополучных по бруцеллезу фермах животных, при исследовании которых будет
получена дважды сомнительная РА, относят к положительно реагирующим.
В заключении лаборатории о результатах исследования должна быть сообщена диагностическая
оценка каждой пробы (положительная, сомнительная, отрицательная) и конечное разведение (титр)
сыворотки, в котором получен соответствующий результат, выраженное в международных единицах
(например: конечный титр сыворотки крови крупного рогатого скота 1:100 с оценкой 2 креста или
более - "положительная 100 ME"; конечный титр сыворотки 1:50 с оценкой 2 креста или более -
"сомнительная 50 ME").
Суммарные результаты исследования испытуемых сывороток, серию антигена, срок его
годности, а также предельный титр позитивной сыворотки записывают в журнал серологических
4.3. Постановка и учет реакции связывания комплемента (РСК) и реакция длительного
связывания комплемента на холоде (РДСК).
4.3.1. Реакцию связывания комплемента применяют при диагностике бруцеллеза у крупного
рогатого скота, овец, коз, свиней, лошадей, оленей, собак, пушных зверей и животных других видов.
Реакцию длительного связывания комплемента, как более чувствительную, применяют вместо
РСК при исследовании на бруцеллез сывороток животных указанных видов, а также при диагностике
инфекционного эпидидимита баранов.
4.3.2. Компоненты реакций и их подготовка к работе:
испытуемые сыворотки крови (см. подпункт 2.3.1);
позитивная бруцеллезная или овисная сыворотка, изготовленная на биофабрике или полученная
от больного животного. На этикетках флаконов с сыворотками указывают титр в РСК (РДСК) и дату
негативная сыворотка (сыворотка крови здоровых животных), изготовленная на биофабрике
или полученная в лаборатории.
Испытуемые и контрольные (позитивную и негативную) сыворотки инактивируют в водяной
бане в день постановки реакции: для РСК - при 60 - 62 °С в течение 30 мин. (сыворотки крови ослов
и мулов - при 64 - 65 °С, буйволов - при 62 - 64 °С в течение 30 мин., свиней - при 60 - 62° в течение
50 мин.); для РДСК сыворотки крови животных всех видов - при 63 - 64 °С в течение 30 мин.;
антиген бруцеллезный единый для РА, РСК и РДСК или овисный для РДСК в рабочем титре,
указанном предприятием, его изготовившим (см. Приложение N 2, п. 6);
комплемент - сыворотка крови морской свинки (свежая, консервированная добавлением 4%
борной кислоты или лиофильно высушенная). При использовании в качестве комплемента свежей
или консервированной сыворотки и при получении каждой новой серии сухого комплемента
проводят титрование его в гемолитической системе для определения активности (см. Приложение N
Сухой биофабричный комплемент растворяют в физиологическом растворе, как указано на
этикетке. Берут такое количество ампул (флаконов), в которых содержится необходимое для
проведения всего опыта количество комплемента. Содержимое ампул (флаконов) сливают в одну
пробирку, осторожно смешивают, берут 0,5 мл и разводят физиологическим раствором 1:20 для
титрования. Остальное количество комплемента хранят в холодильнике при плюс 2 - 4 °С;
гемолитическая сыворотка (гемолизин) - для РСК в удвоенном титре, для РДСК - в утроенном.
Титрование гемолизина проводят периодически один раз в 3 месяца и при использовании каждой
новой серии (см. Приложение N 2, п. 5);
эритроциты барана - 2,5-процентная от осадка взвесь эритроцитов в физиологическом растворе
для РСК и 3-процентная для РДСК (см. Приложение N 2, п. 3).
Для приготовления гемолитической системы соответствующую взвесь эритроцитов и
гемолитическую сыворотку в рабочем разведении смешивают в равных объемах и выдерживают в
термостате при 37 °С в течение 15 - 20 мин. При смешивании гемолизин вливают во взвесь
физиологический раствор - 0,85-процентный раствор химически чистого хлорида натрия в
дистиллированной воде рН = 7,3 - 7,4 или физиологический раствор, содержащий ионы магния и
кальция (см. Приложение N 2, п. 2).
Рабочие разведения всех компонентов для РСК или РДСК готовят перед постановкой реакции
и проверяют их на антикомплементарность и гемотоксичность по следующей схеме:
¦ Комплемент в разведении ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ - ¦ - ¦ -
¦ Гемолизин в рабочем титре ¦ 0,2 ¦ - ¦ 0,2 ¦ - ¦ -
¦ Антиген в рабочем титре ¦ 0,4 ¦ - ¦ - ¦ 0,4 ¦ -
¦ Эритроциты (2,5% или 3%) ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2
¦ Физиологический раствор ¦ - ¦ 0,6 ¦ 0,6 ¦ 0,2
¦ водяная баня 10 минут при 37 -
¦ Результат: гемолиз полная задержка
В реакциях используют компоненты, не обладающие антикомплементарными и
4.3.3. Постановка реакции связывания комплемента.
Реакцию проводят в водяной бане при 37 - 38 °С в объеме 1 мл (по 0,2 мл каждого компонента -
сыворотки, антигена, комплемента, гемолизина и эритроцитов).
Перед постановкой главного опыта проводят титрование комплемента в бактериолитической
системе на позитивной (бруцеллезной) сыворотке, негативной сыворотке крови того вида животных,
которых исследуют, и одной сыворотке, взятой из исследуемой партии.
Каждую сыворотку разводят 1:5 физиологическим раствором (1 мл сыворотки + 4 мл
физиологического раствора), инактивируют, как указано в подпункте 4.3.2, и разливают по 0,2 мл в
два ряда по 10 пробирок. Затем в пробирки каждого ряда вносят комплемент (разведенный 1:20) в
возрастающих дозах от 0,02 мл до 0,2 мл с интервалом 0,02 мл и недостающее до 0,2 мл (в каждой
пробирке) количество физиологического раствора.
После разлива комплемента в первый ряд пробирок с каждой сывороткой вносят по 0,2 мл
антигена в рабочем разведении, а во второй ряд - по 0,2 мл физиологического раствора. Пробирки
ставят в водяную баню при 37 - 38 °С на 20 мин. Затем во все пробирки добавляют по 0,4 мл
гемолитической системы, встряхивают их и вновь ставят в водяную баню на 20 мин., после чего
Схема титрования комплемента в бактериолитической системе (на примере негативной
Читайте также: