Ученые встроили в геном кишечной палочки
Обновлено: 23.04.2024
Биологи создали штамм кишечной палочки, в котором сразу несколько кодонов заменили на синонимичные, а соответствующие транспортные РНК вовсе удалили из клеток. Измененные бактерии стали устойчивы к действию бактериальных вирусов. Затем ученые внесли в геном кишечной палочки гены, кодирующие новые транспортные РНК, и бактерии стали встраивать в полипептидные последовательности неканоничные аминокислоты. В результате биологи создали новый штамм, потенциально применимый в производстве: такие бактерии не смогут пострадать от заражения вирусами, и при этом способны производить больший спектр химических соединений. Работа опубликована в Science.
В генетическом коде единица измерения – кодон, последовательность из трех нуклеотидных остатков, которые обозначают начало синтеза полипептида, включение определенной аминокислоты в последовательность или сигнализируют об остановке синтеза. В природе используется 64 кодона (триплета), и большинство аминокислот кодируются сразу несколькими из них. В процессе трансляции (синтеза полипептидной цепи) транспортные РНК, несущие на себе ту или иную аминокислоту, распознают соответствующий ей кодон в матричной РНК. Если убрать некоторые транспортные РНК из клетки, то соответствующие кодоны в ее геноме станут нечитаемыми. Ученые ранее предполагали, что таким образом можно будет создать клетку с новыми свойствами, например, с устойчивостью к вирусам (фагам). Это свойство очень понадобилось бы в биотехнологическом производстве: бактерии в биореакторах оказались бы защищены от поражения фагами. Кроме того, лишив некоторые кодоны смысла, можно придать им новый – и заставить клетки производить гетерополимеры с неканоническими аминокислотами. Однако эти гипотезы еще не тестировали экспериментально.
До этого ученые показывали на клетках кишечной палочки E. coli, что удаление из генома последовательности, кодирующей один из трех белков-факторов терминации (RF1), увеличивает устойчивость бактерий к некоторым фагам: в результате такой модификации триплет TAG просто перестает быть стоп-кодоном (сигналом об окончании синтеза полипептидной цепи). Однако TAG редко используется фагами для остановки трансляции, и даже в отсутствие RF1 бактериальные вирусы продолжают производить свои копии, тем более что нечитаемость стоп-кодона не мешает синтезу вирусных белков полной длины. В то же время триплеты, кодирующие аминокислоты, как минимум в десять раз более распространены в вирусных геномах. Ученые предположили, что в неспособных прочитать какой-либо из таких кодонов клетках вирусы будут намного менее активно реплицироваться. Кроме того, используя освободившиеся кодоны, можно зашифровать в генетическом коде непривычные для клетки мономеры, а не аминокислоты. В теории, так можно закодировать и полимеры, полностью состоящие из неканонических мономеров.
Ранее в одной из работ ученые из Кембриджского университета под руководством Джейсона Чина (Jason Chin) устранили избыточность генетического кода в бактерии E. coli, заменив несколько кодирующих аминокислоту серин кодонов на синонимичные. Полученный штамм исследователи назвали Syn61.
Бактерии, у которых заменены некоторые кодоны и удалены соответствующие транспортные РНК, устойчивы к действию вирусов: фагам необходимы эти тРНК для синтеза вирусных белков.
Статичное изображение руки, полученное с помощью секвенирования бактерий после внедрения в их CRISPR-кассеты олигонуклеотидов, кодирующих пиксели
Seth L. Shipman et al / Nature Letter 2017
В качестве кадров фильма были взяты пять фотографий Эдварда Мейбриджа, который в некотором роде считается прародителем современного кино, хотя его работы на двадцать лет предшествуют первым настоящим киносъемкам. Он снимал лошадей, используя множество фотоаппаратов одновременно, создав таким образом технику хронофотографии. В частности, он разрешил спор по поводу того, что происходит с ногами галопирующей лошади — отрываются они все разом от земли в какой-то миг или нет (съемки, в ходе которых бегущие лошади ногами дергали за нити, связанные с затворами разных фотоаппаратов, показали-таки, что да, такой миг имеется). Ученые выбрали знаменитые фотографии лошади по кличке Энни Джи, которые были сняты в 1887 году.
Выяснилось, что эффективность встраивания олигонуклеотида (и, соответственно, правильную окраску и позицию соответствующих пикселей) повышали такие параметры, как содержание пиримидинов (GC-контент), отсутствие внутренних мотивов, похожих на PAM (protospacer adjacent motif — мотивов, окружающих будущий спейсер, которые повышают эффективность его встраивания в CRISPR) и малое число внутренних однонуклеотидных повторов. Ученые подчеркивают, что понимание механизмов работы иммунной системы CRISPR важно не только в контексте записи кино, но и в рамках методик геномного редактирования и других связанных с CRISPR технологий.
Это не первый раз, когда ученые помещают информацию, не имеющую отношения к биологическим системам, внутрь геномов — так, в ДНК уже записывали книги, операционные системы и клипы в высоком разрешении, причем в последовательность нуклеиновой кислоты удавалось умещать до 200 мегабайт данных. В данном проекте примечательно, что работа шла с живыми организмами, которые умеют сохранять хронологический порядок искусственных записей, а кроме того, являются гораздо более надежным "сейфом" для их хранения, чем неживые биомолекулы. В дальнейшем ученые надеются научиться применять подобные методики к клеткам млекопитающих, в частности, для лучшей их идентификации и отслеживания хода их работы. Мечтой Сета Шипмана, руководителя проекта, является такого рода работа с нейронами человека.
Ученным из Кембриджа удалось изменить геном микроба – кишечной палочки. Микроорганизм контролируется искусственными молекулами, что позволило управлять стойкостью к антибиотикам на генном уровне. Бактерия имеет самый большой геном, созданный в лаборатории
Работа над созданием искусственного генома и производство лекарств
Генные инженеры надеются, что искусственные организмы будут создавать лекарства или другие вещества, производство которых обходится сложно и дорого. Впрочем то, что микроорганизмы могут производить лекарства, не новость. Например, генетически модифицированные бактерии на протяжении многих лет вырабатывают гормон инсулин, с помощью которого больные диабетом регулируют уровень сахара в крови.
Те же бактерии, которых биохимики используют для производства инсулина, группа ученых под руководством Джейсона Чина из Кембриджского университета в настоящее время задействует для создания синтетического генетического материала. Это самый большой искусственный геном из когда-либо созданных, о чем имеется отметка в журнале Nature.
Для создания кишечной палочки с синтетическим геномом ученым пришлось воспроизвести в лаборатории четыре миллиона пар оснований. Для сравнения, искусственный организм Вентера содержал около миллиона таких строительных блоков ДНК.
С чего всё начиналось: компьютерный дизайн бактерии
Живой организм с полностью синтетическим геномом
Обычные, природные клетки используют 64 различных таких тройных кода (кодона). Геном Syn61 ученые изменили так, чтобы он производил все необходимые аминокислоты только с 61 кодоном. Таким образом, в геномном пространстве остается кодон из трех искусственных аминокислот, с помощью которых организм мог бы производить материалы с совершенно новыми свойствами.
Краткое досье: особенности бактерии E.coli Syn61
E.coli Syn61 может только расшифровать свой собственный генетический материал. Бактерия не способна установить контакт с другими природными организмами, так как не может прочитать их генетический код. А значит, и передать другим бактериям устойчивость к антибиотикам. Поэтому ученые вовсе не обеспокоены, что их методикой будут злоупотреблять.
Скептически относятся исследователи и к возможности создания человека из искусственного генетического материала. Геном человека во много раз сложнее, чем у бактерии. Для этого должны быть воссозданы 3,3 миллиарда пар оснований. В настоящее время исследователи уже даже отказываются от слишком затратного создания генома пивных дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Хотя он состоит из 12 миллионов пар оснований и пока лишь небольшая его часть была произведена искусственно.
"Нам даже удалось встроить два независимых друг от друга логических устройства в одну бактерию, которые выделяют два разных типа светящихся белков. Это открывает дорогу для создания биосенсоров, целиком умещающихся в одну клетку. Кроме того, подобную систему легко трансплантировать и в другие виды микробов", — рассказывает Ким Джонмын (Kim Jongmin) из Гарвардского университета (США).
За последнее десятилетие биотехнологи разработали множество миниатюрных био-устройств, повторяющих функции их неживых аналогов. В частности, существует уже несколько десятков ДНК-компьютеров, полноценное вычислительное устройство и дисплей из колоний кишечной палочки, а два года назад биологи из США создали биокомпьютер, объединяющий несколько разных штаммов микробов.
Все подобные "био-цифровые технологии" обладают двумя общими недостатками – их работу фактически нельзя изменить, не меняя полностью ДНК микробов, и они работают крайне медленно из-за того, с какой скоростью считывается ДНК и распространяется информация в мире микробов. По этой причине ученые создали достаточно много простых биокомпьютеров, исполняющих одну логическую операцию, и крайне редко пытались создать что-то более сложное.
Джонмын и его коллеги смогли обойти эту проблему, создав первый универсальный биокомпьютер, способный исполнять все функции полупроводниковых процессоров, заменив нити ДНК, обычно используемые в подобных бактериальных "процессорах", на короткие молекулы РНК, похожие по своей форме на булавки или шпильки.
Эти шпильки, как объясняют ученые, могут менять свою форму в том случае, если к ним присоединяется другая молекула РНК с подходящим набором "букв". Это важно по той причине, что форма нити РНК определяет то, может ли рибосома, клеточная фабрика по сборке белков, прочитать ее и собрать полноценную белковую молекулу, заставляющую клетку поменять свое поведение или подать определенный сигнал.
Соответственно, комбинируя разные типы шпилек и соединяющихся с ними нитей ДНК, можно создать аналоги логических элементов в полупроводниковых чипах, способных исполнять те же операции, такие как И, ИЛИ, исключающее ИЛИ и НЕ.
Здесь в дело вступает второе важное свойство этих молекул РНК – они являются полностью синтетическими и похожие на них молекулы не встречаются внутри микробов. Это позволяет "склеивать" фактически любое количество таких "логических узлов", не опасаясь того, что их работе будут мешать процессы внутри самих микробов или соседние логические цепочки.
Руководствуясь подобными идеями, ученые создали несколько универсальных вычислительных блоков из молекул РНК, способных обрабатывать все четыре базовых логических операции и проверять любые логические выражения. Убедившись в том, что они работают, они объединили несколько таких блоков в сложную систему из 444 звеньев, исполняющую 12 логических операций и обрабатывающую пять разных химических сигналов.
Подобные РНК-компьютеры, как отмечают ученые, могут в будущем использоваться для наблюдений за сложными процессами внутри живых клеток, а также для создания "живых" датчиков, способных распознавать различные изменения в условиях среды и сообщать об этом человеку.
ТАСС, 2 ноября. Биохимики воссоздали тирский пурпур – краску, которая была одной из основ экономического могущества древней Финикии. Для этого ученые модифицировали геном кишечной палочки. О том, где можно будет использовать такую бактериальную "краску" на практике, ученые рассказали в статье для научного журнала Nature Chemical Biology.
"Наши микробы можно использовать прямо в качестве красителя, который может проникать в волокна тканей и насыщать их пурпуром. Кроме того, геном микробов можно модифицировать геном так, что краситель приобретет зеленый или желтый цвет. В перспективе благодаря этому можно будет генерировать бактериальные краски любых цветов, что позволит избавиться от токсичных растворителей и побочных продуктов производства синтетических красок", – пишут ученые.
Историки считают, что пурпурную краску открыли жители Финикии – региона на восточном побережье Средиземного моря, центр которого располагался в современном Ливане. В пользу того, что пурпур появился именно в этом регионе, говорит само его название – с древнегреческого оно переводится как "багряный" (впрочем, сами финикийцы себя так не называли – в историю вошло именно греческое наименование как народа, так и страны).
Ученые считают, что финикийцы начали производить пурпур примерно 3,6 тыс. лет назад. Следы его производства ученые нашли еще в XIX веке в окрестностях древних городов Тира и Сидона. Эти следы представляли собой гигантские груды раковин пурпуроносных моллюсков, которые находились у городских стен.
Пурпур, особенно его тирская разновидность, высоко ценили представители всех античных цивилизаций. Дело в том, что покрашенная им одежда не выгорала на солнце и не линяла, а ее цвет был уникальным. Пурпур стоил очень дорого, поскольку для производства небольшого количества этой краски нужно было обработать огромное количество моллюсков-иглянок из рода Murex, организм которых вырабатывает различные вариации индиго – синего органического пигмента.
Производство пурпура практически полностью прекратилось в начале XIII века – после того, как Константинополь временно оккупировали крестоносцы. Окончательно секрет его изготовления был утерян в 1453 году, после того, как столицу Византии захватили османы.
Только в начале прошлого столетия немецкий химик Пауль Фридлендер выяснил, что тирский пурур состоял из вещества диброминдиго. Первые простые методики его лабораторного синтеза появились лишь в 2010 году. Однако они оказались непригодны для промышленного производства пурпура, поэтому он по-прежнему остается одним из самых дорогих и недоступных красителей мира.
Бактериальный пурпур
Корейские биохимики под руководством профессора Национального университета Сеула (Республика Корея) Кима Бёнги решила эту задачу. Они встроив в ДНК обычной кишечной палочки (Escherichia coli) гены, которые нужны для синтеза диброминдиго.
Эти участки генома ученые позаимствовали у различных микробов, в том числе стрептомицетов и морских бактерий из рода Methylophaga, которые питаются метиловым спиртом. Благодаря этому ученые помогли этим генам адаптироваться для работы в клетках кишечной палочки.
Таким оразом корейские биохимики "научили" кишечную палочку захватывать триптофан – простейшую ароматическую аминокислоту, а также соли брома, и использовать их для производства практически неограниченного количества молекул диброминдиго.
Эти же микробы, как отмечают ученые, можно использовать для решения одной из главных проблем при покраске тканей, с которой сталкивались еще финикийцы. Дело в том, что пурпур не растворяется в воде, из-за чего им сложно окрашивать ткань. Однако бактерии могут легко проникать в волокна и колонизировать их, и производя краску, и доставляя ее прямо на текстиль.
Руководствуясь этими соображениями, ученые вырастили "пурпурную палочку" и пропитали ее питательным раствором восемь разных типов тканей, начиная с хлопка и заканчивая акрилом. Оказалось, что микробы успешно проникли и размножились внутри всех тканей, кроме полиэфира. То есть такую бактериальную краску можно будет использовать для многих видов текстиля.
Ким Бёнги и его коллеги подготовили несколько других разновидностей этой кишечной палочки, несколько поменяв структуру генов, которые участвуют в производстве диброминдиго. Благодаря этому они создали красный, коричневый, синий и бежевый аналоги пурпура. В перспективе благодаря подобным бактериальным краскам человечество сможет отказаться от производства индиго и других красителей при помощи "грязных" химических методов, подытожили ученые.
Читайте также: