Вестерн блот анализ хеликобактер

Обновлено: 19.04.2024

Сегодня для диагностики инфекции Helicobacter pylori применяется достаточно широкий спектр различных тестов. Но у каждого из них есть свои особенности, которые могут влиять на точность исследования.

Рассмотрим некоторые из них.

Гистологический метод (при заборе биопсии)

Несмотря на высокую чувствительность гистологического метода, на его точность может оказать влияние количество биоптатов и место их забора, учитывая тот факт, что бактерии Н. pylori могут быть неравномерно распределены по слизистой оболочке желудка.

Быстрый уреазный тест. Маленький кусочек слизистой желудка при биопсии помещают в специальный раствор. Если Н. pylori обнаруживается, то за счет продуцируемой уреазы раствор будет менять цвет на малиновый. Результат доступен через 15-30 минут.

Ложноположительные результаты редки, однако в желудке есть много бактерий, которые могут продуцировать уреазу и окрашивать тестовый раствор.
Ложноотрицательный результат может быть при малой степени обсемененности слизистой оболочки желудка Н. pylori.

Серологический метод (наличие антител к Н. pylori в крови)

Данный метод малоинформативен у пациентов со слабым иммунным ответом, ранней стадией инфицирования, т.к. антитела IgG появляются не ранее, чем через месяц после инфицирования.
Несмотря на то, что уровень антител в процессе успешной эрадикации падает, серологическая реакция остается положительной в течение ряда лет, поэтому данный метод нельзя использовать для контроля эффективности антихеликобактерной терапии.

Анализ кала на антиген H. pylori

Достаточно точный метод, но при запорах, затруднительных актах дефекации может разрушаться оболочка Н. pylori.

13С-уреазный дыхательный тест

Ложноотрицательные результаты редки, но могут наблюдаться после выполнения гастроскопии с биопсией непосредственно перед тестом и у пациентов, перенесших резекцию желудка, а также при значительном снижении секреции желудка.
При этом ложноположительные тесты могут быть из-за расщепления мочевины бактериями во рту или бактериями, содержащими уреазу в желудке.

Для повышения точности диагностики этой инфекции рекомендуется проводить комплексное тестирование.

Высокоспецифичный тест диагностики и мониторирования H. pyloi - ассоциированного гастрита и язвенной болезни желудка и 12-перстной кишки.

Метод Вестерн-блота для определения антител к H. Pylori, в отличие от обычного ИФА, даёт дифференцированные сведения о наличии антител к целому спектру антигенов возбудителя. Это достигается электрофоретическим разделением белков экстракта H. Pylori. В результате выявляется порядка 15 антигенов (полный антиген), что значительно повышает информативность исследования.

Использующиеся в анализе антигены разделяют на три категории:

1 категория - перекрёстнореагирующие и неопределённые антигены;
2 категория - уреаза В (антиген с м.в. 66 кДа);
3 категория - видоспецифичные и высокоспецифичные антигены.

Данная диагностическая система прямо отличает специфические антигены от неспецифических. Поэтому вестерн-блот метод гарантирует высокую специфичность исследования.

Клинические изоляты H. Pylori можно разделить на 2 типа. Штаммы H. pylori I типа могут экспрессировать специфический вакуолизирующий цитотоксин (VacA) и цитотоксин-ассоциированный белок (CagA). Штаммы, не способные синтезировать этот белок, относят к типу II. Инфекции, вызванные агентом I типа, оказываются более патогенными, клинические симптомы включают гастрит и образование язв, возможны отдалённые последствия в виде злокачественной лимфомы и аденокарциномы желудка. Указанные белки входят в состав специфических антигенов, используемых для тестирования антител к H. Pylori методом иммуноблота, что также даёт дополнительную информацию для специалистов.

Состав используемых для выявления антител к H. Pylori специфических антигенов:

АНТИГЕН	СПЕЦИФИЧНОСТЬ
CagA p120	белок, ассоциированный с цитотоксином А, высокоспецифичен
VacA p95	вакуолизирующий цитотоксин А, высокоспецифичен
p75	неспецифичен
FSH p57	белок жгутиковых, неспецифичен, обуславливает перекрёстную реактивность с другими бактериями, содержащими уреазу
Ure B p66	тяжёлая субъединица уреазы, обуславливает перекрёстную реактивность с другими бактериями, содержащими уреазу
гомолог HSP p57	гомолог белка теплового шока, неспецифичен
флагеллин p54	неспецифичен, обуславливает перекрёстную реактивность с другими бактериями, содержащими флагеллин
p50	неспецифичен
p41	неспецифичен
p33	предположительно специфичен
CMP p30	Белок наружной мембраны, видоспецифичен
UreA p29	лёгкая субъединица уреазы, высокоспецифичен
p26	высокоспецифичен
CMP p19	белок наружной мембраны, видоспецифичен
p17	предположительно специфичен

Антитела класса IgA появляются спустя некоторое время после контакта с H. Pylori. Этот тип антител (секреторные антитела), характерен больше для слизистых оболочек, где они образуются локально и обеспечивают местную защиту. IgA не всегда обнаруживаются в крови. Положительные результаты по IgA к H. Pylori хорошо коррелируют с активностью гастрита, считается, что повышенный титр IgA может выполнять роль маркёра хронической инфекции.

Специальная подготовка не требуется. Рекомендуется взятие крови не ранее чем через 4 часа после последнего приема пищи. С общими рекомендациями для подготовки к исследованиям можно ознакомиться здесь >>.

Высокоспецифичный тест, выявляющий факт инфицирования H. pylori.

Использующиеся в анализе антигены разделяют на три категории:

1 категория - перекрёстнореагирующие и неопределённые антигены;
2 категория - уреаза В (антиген с м.в. 66 кДа);
3 категория - видоспецифичные и высокоспецифичные антигены.

Состав используемых для выявления антител к H. Pylori специфических антигенов:

АНТИГЕН	СПЕЦИФИЧНОСТЬ
CagA p120	белок, ассоциированный с цитотоксином А, высокоспецифичен
VacA p95	вакуолизирующий цитотоксин А, высокоспецифичен
p75	неспецифичен
FSH p57	белок жгутиковых, неспецифичен, обуславливает перекрёстную реактивность с другими бактериями, содержащими уреазу
Ure B p66	тяжёлая субъединица уреазы, обуславливает перекрёстную реактивность с другими бактериями, содержащими уреазу
гомолог HSP p57	гомолог белка теплового шока, неспецифичен
флагеллин p54	неспецифичен, обуславливает перекрёстную реактивность с другими бактериями, содержащими флагеллин
p50	неспецифичен
p41	неспецифичен
p33	предположительно специфичен
CMP p30	Белок наружной мембраны, видоспецифичен
UreA p29	лёгкая субъединица уреазы, высокоспецифичен
p26	высокоспецифичен
CMP p19	белок наружной мембраны, видоспецифичен
p17	предположительно специфичен

Антитела класса IgG появляются в крови вслед за IgM антителами (которые впоследствии исчезают через несколько недель после первого контакта с возбудителем инфекции). Инфекция H. Pylori обычно не проходит сама по себе, патологический агент может присутствовать в течение всей жизни человека. IgG выявляются в сыворотке крови многие годы, являясь индикатором инфицирования. Отсутствие специфических IgG позволяет с высокой степенью достоверности отвергнуть диагноз H. pylori-ассоциированного гастрита или язвы, хотя их присутствие не является абсолютным доказательством данного заболевания.

Еще не так давно считалось, что гастрит вызывают неправильное питание, еда всухомятку, стрессы и отсутствие горячего супа на обед. Потом ученые обнаружили связь этой болезни с бактерией хеликобактер пилори — и с тех пор подход к лечению заболеваний ЖКТ кардинально изменился.

Можно ли заразиться через посуду в ресторане, вызывает ли хеликобактер рак и нужно ли избавляться от бактерии, которая живет в организме 80% белорусов, рассказал врач-гастроэнтеролог с 40-летним опытом работы Георгий Матвеевич Усов.

Георгий Усов,
врач-гастроэнтеролог высшей категории
Минского клинического консультативно-диагностического центра,
кандидат медицинских наук

— Что такое хеликобактер? Это патогенная бактерия или условно-патогенная?

— Хеликобактер пилори (Helicobacter pylori) — бактерия, которая была открыта австралийскими учеными Робином Уорреном и Барри Маршаллом. За это открытие в 2005 году они получили Нобелевскую премию.

Хеликобактер — патогенная бактерия. Наличие ее в организме человека приводит к поражению слизистой оболочки желудка и двенадцатиперстной кишки и развитию таких заболеваний, как хронический гастрит, язва желудка и двенадцатиперстной кишки, рак желудка, мальтома желудка.

Сегодня хеликобактер — самая распространенная хроническая инфекция в мире.

— Какие факторы в таком случае провоцируют развитие гастрита, язвы, рака? И могут ли эти болезни возникнуть без участия хеликобактера?

— При наличии хеликобактера у всех людей выявляется какое-либо заболевание желудка. Выявление конкретного заболевания зависит от штамма хеликобактера. Штаммы H. руlori, имеющие в своем составе определенные генотипы, предрасполагают к развитию язвенной болезни и рака желудка. И если язвой желудка и двенадцатиперстной кишки или онкологическими заболеваниями заболевают не все инфицированные люди, то гастритом — все.

Верно и то, что данные болезни могут возникать и без хеликобактер пилори.

Кроме гастритов, связанных с хеликобактером, имеются гастриты, связанные с забросом содержимого двенадцатиперстной кишки в желудок, так называемые рефлюксные (химические) гастриты, гастриты, связанные с образованием антител к слизистой оболочке желудка (аутоиммунные гастриты).
Причиной язв может быть прием нестероидных противовоспалительных препаратов, ацетилсалициловой кислоты, изредка нервные факторы, погрешности в еде.
Причиной раковых заболеваний могут быть погрешности в питании, канцерогенные вещества, поступающие в пищу, курение, наследственная предрасположенность и др.

— Как передается эта бактерия человеку? Можно ли заразиться от животных? А в ресторане через посуду?

— Путь передачи хеликобактера контактно-бытовой. Бактерия передается:

через недостаточно чистую посуду, когда люди едят из одной тарелки или пьют из одной чашки, едят пищу друг у друга;
в семье, когда родители пробуют пищу перед тем, как дать ее ребенку, или облизывают соску малыша;
в случае использования людьми одной зубной щетки;
через губную помаду;
при отсутствии мытья рук после туалета и перед едой;
через сексуальные поцелуи.

Хеликобактер также выявлен у кошек и собак, вследствие чего существует возможность заражения человека от них. Что касается ресторана, то, если грязная посуда плохо обрабатывается, появляется высокая возможность заражения хеликобактером.

— Какой процент людей в Беларуси живет с хеликобактером? Почему этот показатель выше, чем в Западной Европе и США?

— Качественных эпидемиологических исследований по распространению хеликобактера среди населения Беларуси не проводилось. Проводились лишь относительно небольшие исследования среди населения отдельных областей и отдельных групп населения.

Считается, что распространенность хеликобактера среди белорусов составляет около 70-80%.

Среди населения РФ по ряду исследований в отдельных российских регионах распространенность составляет от 65 до 90%. Данный показатель выше, чем в Западной Европе и США, в связи с недостаточно качественным соблюдением гигиены в нашей стране.

— Какие симптомы должны заставить человека сдать анализ на хеликобактер? Какие из них неочевидные, не связанные напрямую с ЖКТ?

— Диспепсические расстройства (боли, жжение в эпигастральной области — верхних отделах живота, тошнота, плохой аппетит, тяжесть в эпигастральной области, рвота и т. д.) требуют обследования на хеликобактер.

В некоторых случаях хеликобактер может быть причиной также:

железодефицитной анемии;
халитоза (плохого запаха изо рта);
крапивницы.

Однако следует помнить, что данные заболевания могут возникать и по множеству других причин.

— Какие анализы на выявление хеликобактер существуют? Какие из них самые объективные?

— Существует несколько разновидностей анализов.

Гистологическое исследование биопсийного материала из слизистой желудка, причем следует исследовать слизистую как антрального отдела, так и тела желудка.
Быстрый уреазный тест. Тест выполняется в момент гастроскопии. Биопсия слизистой берется из полости желудка, помещается в среду, содержащую мочевину и такой индикатор, как феноловый красный. Уреазы преобразуют мочевину в аммиак, вследствие чего повышается рН среды, и желтый цвет образца (отрицательный) меняется на красный (положительный).
С13-уреазный дыхательный тест на немецкой аппаратуре, достоверность которого более 92%.
Российская модификация дыхательного теста — хелик-тест, достоверность которого, по данным ряда российских авторов, составляет от 30 до 80%.
Определение антител к хеликобактеру IgM и IgG в крови.
Исследование антигенов хеликобактера в кале.

Самыми объективными из анализов являются гистологический тест, С13-уреазный дыхательный тест на аппаратуре немецкой фирмы FAN, исследование антигенов хеликобактера в кале и быстрый уреазный тест. Исследование крови на антитела к хеликобактер пилори приемлемо при первичном исследовании до лечения хеликобактера. В то же время для контрольного исследования оно не годится, так как антитела к хеликобактеру остаются повышенными в течение нескольких лет в крови после излечения от хеликобактера, давая ложноположительный результат.

Хелик-тест из-за низкой достоверности нигде в мире, кроме нескольких стран СНГ, не применяется.

— Что делать, если анализ положительный? Влияет ли, например, количественное значение антител в крови на степень опасности бактерии для здоровья?

— При положительном анализе на хеликобактер решается вопрос о проведении антихеликобактерной терапии. На степень опасности для здоровья количественное значение хеликобактера существенного значения не имеет, ибо высокая обсемененность хеликобактером в ряде случаев в наших исследованиях приводила к значительно меньшим изменениям слизистой оболочки, чем низкая, или существенно не отличалась. Причина — в индивидуальной резистентности (восприимчивости) организма к хеликобактеру.

При незначительных превышениях IgA желательно провести другой метод исследования хеликобактера, например С13-уреазный дыхательный тест или исследование кала на антигены хеликобактера, чтобы подтвердить или опровергнуть положительный результат.

— Всегда ли положительный анализ говорит о необходимости лечения? В каких случаях хеликобактер не лечат?

— Раньше считалось, что лечение хеликобактера следует проводить, только если имеются клинические проявления заболевания. Сейчас в связи с выявлением существенной роли хеликобактера в развитии рака желудка лечение рекомендуют проводить всем больным с хеликобактерной инфекцией.

В некоторых странах, в частности, Японии, лечение хеликобактера проводится всем больным бесплатно. При этом тем людям, которые отказываются лечиться от хеликобактера, при развитии у них рака желудка не оплачивают страховку.

У лиц с язвами желудка и двенадцатиперстной кишки санация хеликобактера приводит к уменьшению появления новых язв в три раза.

Лечение хеликобактера НЕ проводят:

больным с аллергией и/или непереносимостью препаратов, предназначенных для лечения хеликобактера;
тем, у кого все схемы лечения оказались неэффективными;
отказывающимся от лечения пациентам.

На мой взгляд, больным с хроническим гастритом, у которых имеются лишь незначительные изменения слизистой оболочки желудка, от лечения можно временно воздержаться.

Лечение детей не проводят: существует большая вероятность повторного заражения из-за нахождения в детском коллективе и развития ряда побочных реакций, особенно при повторном лечении. Для детей желательно выделение отдельной посуды и соблюдение правил личной гигиены.

— Какое лечение назначается?

— Излечиться от хеликобактера полностью возможно только при назначении антибиотиков и блокаторов протоновой помпы (антисекреторных лекарственных средств — прим. ред.), усиливающих эффект антибиотиков, в ряде случаев в сочетании с препаратами висмута.

В последнее время выявлено бактерицидное действие некоторых пробиотиков в отношении хеликобактера.

Например, существует препарат, содержащий инактивированные бактерии пробиотического штамма Lactobacillus reuteri. Однако подобные препараты полностью от хеликобактера не излечивают.

— Должны ли параллельно лечиться домашние? Может ли такое быть, что у одного из членов семьи есть хеликобактер, а у остальных — нет?

— Да, лечение взрослых членов семьи при наличии у них хеликобактера должно проводиться, детям из-за указанных выше причин — нет. При этом наличие хеликобактера у всех членов одной семьи необязательно. Это зависит от индивидуальной резистентности организма к бактерии. В исследованиях и клинической практике неоднократно были случаи, когда хеликобактер не обнаруживался у отдельных членов семьи. Поэтому лечению всегда должны предшествовать анализы.

Обзор

На рисунке — вооруженный противник, хеликобактер собственной персоной. Пришедший на сигнал о помощи Т-лимфоцит еще не знает, на что он способен.

рисунок автора статьи

Автор

Редакторы

Партнер номинации — компания SkyGen: передовой дистрибьютор продукции для life science на российском рынке.

Генеральный партнер конкурса — международная инновационная биотехнологическая компания BIOCAD.

Всякий преступник непременно делает
какую-нибудь оплошность и выдает себя.
Оскар Уайльд. Портрет Дориана Грея

Досье преступника

Helicobacter pylori — грамотрицательная спиралевидная бактерия. Она относится к семейству Helicobacteraceae, имеет несколько жгутиков, обеспечивающих перемещение клетки по слизистой желудка. Исходя из физиологических свойств, H. pylori является микроаэрофилом — микроорганизмом, растущим при низких концентрациях кислорода в среде, что частично объясняет место его колонизации. Важное биохимическое свойство этой бактерии — уреазная активность, то есть способность ферментативно расщеплять мочевину. Это нужно для защелачивания среды.

Уреазный тест для диагностики инфекции хеликобактера

Уреазная активность имеет в первую очередь диагностическое значение: быстрый уреазный тест позволяет зафиксировать сдвиг pH среды желудка в щелочную сторону. Для его проведения пациент выпивает раствор мочевины с изотопом углерода 13 C. Поскольку уреаза расщепляет мочевину до аммиака и углекислого газа, изотоп углерода будет содержаться в последнем при наличии инфекции. После взятия выдыхаемого воздуха в нем смотрят отношение углекислого газа с изотопом к обычному.

По данным метаанализа 2017 года [1] более половины населения планеты являются носителями хеликобактерной инфекции: среди 14 006 публикаций с 1970 по 2016 год, посвященных H. pylori, был произведен тщательный отбор всех случаев. Картину распространения можно увидеть на рисунке 1.

Рисунок 1. Распространенность инфицирования H. pylori на континентах. Бордовым цветом обозначены максимально инфицированные регионы и части света — большая часть Евразии, Бразилия, страны Центральной Африки.

CagA — опасное оружие

Почему многие люди могут спокойно сосуществовать с бактерией и не испытывать никакого дискомфорта, в то время как другие инфицированные наизусть знают дорогу в кабинет гастроэнтеролога? Дело в том, что у нашего преступника есть оружие — фактор патогенности, вызывающий структурные и функциональные изменения в клетках желудка — cagA (cytotoxin-associated gene A). В геноме бактерии есть так называемые островки патогенности (PAI) — области, где закодированы белки системы секреции IV типа. Это белковые комплексы, благодаря которым осуществляется транспорт различных белков-субстратов из бактериальной клетки в эукариотическую. В частности продукта гена — CagA — в клетку хозяина. Однако cagA не обладает сходной последовательностью у всех штаммов бактерии: в зависимости от аминокислотного состава выделяют западную специфическую последовательность этого гена (Western cagA specific sequence, WSS) и его восточно-азиатскую специфическую последовательность (East Asian cagA specific sequence, EASS) [2]. Кроме того, в участке, который непосредственно кодирует фактор патогенности, могут наблюдаться различия в нуклеотидной последовательности со стороны 3′-конца [3]. В других случаях кусок PAI может отсутствовать вовсе, на основании чего выделяют несколько участков полиморфизма 3′-конца (A, B, C, D), представленных на рисунке 2.

Рисунок 2. Схема PAI у H. pylori. Зеленым цветом обозначены внутренняя и наружная мембраны микроба с периплазматическим пространством между ними. В мембраны встроен белковый комплекс системы секреции IV типа, благодаря которой CagA попадет в эпителиоцит желудка.

Один в поле воин

Условно процесс инфицирования человека хеликобактером можно разделить на три основные стадии — активная фаза, стационарная фаза и фаза колонизации. В активную фазу бактерия быстро передвигается при помощи своих жгутиков в пилорический отдел желудка. Уреаза, о которой говорилось выше, сдвигает pH в сторону щелочного. Затем происходит связывание со специфическими рецепторами, в том числе фукозосвязывающим рецептором. CagA проникает в клетку, а микроб начинает колонизацию, после чего цикл повторяется вновь и вновь, индуцируя воспаление и другие дегенеративные процессы [4].

Именно из-за фукозосвязывающего рецептора микроб представляет бóльшую опасность для людей с первой группой крови по системе AB0 [5]. А все дело в том, что антиген Льюиса эритроцитов является одним из рецепторов, способствующим адгезии хеликобактера. Результаты очередного метаанализа показывают, что H. pylori имеет такое сродство только в этой группе крови и при этом не связан с другими и резус-фактором [6].

Улики — новые и не очень

Есть большое число публикаций, где описана роль матриксных металлопротеиназ в возникновении воспаления при инфицировании человека различными микроорганизмами — например, Pseudomonas aeruginosa [7] или Borrelia burgdorferi [8]. Матриксные металлопротеиназы (MMP) — это ферменты, которые разрушают внеклеточный матрикс. Они классифицируются по своей субстратной специфичности. Например, коллагеназы разлагают коллаген, эластазы — эластин. Исследование на клеточной линии AGS (клетки человеческой аденокарциномы желудка) и других клеточных линиях показало, что синтез MMP-7, MMP-1, MMP-25 и, в частности, MMP-10, повышается в ответ на присутствие микроба [9]. В клетках AGS уровень мРНК измеряли при помощи RT-qPCR (reverse transcription quantitative polymerase chain reaction) — ПЦР с использованием обратной транскриптазы. Уровень MMP-10 также определили путем вестерн-блоттинга. Если вы еще не знакомы с данными методами, прочитать о них можно здесь [35]. Однако я сделаю акцент на исследовании, где эксперименты проводились на мышах и биологическом материале пациентов с инфекцией H. pylori [10].

Рисунок 3. Индукция MMP-10 в ответ на H. pylori детектируется различными иммунологическими методами.
а — В образцах, обведенных прямоугольниками, представлены матриксные металлопротеиназы, уровень которых был зафиксирован антителами. Невооруженным глазом видно, что образцы с MMP-10 самые яркие из представленных.
б — Уровень продукции MMP-10 по результатам qPCR в группе инфицированных пациентов (n = 65) выше, чем в контрольной (n = 40).
в — Корреляция между уровнем синтеза MMP-10 и колонизацией микроорганизма, измеренной в логарифме от количества 16S рДНК на 1 нг ДНК хозяина.
г — Уровень производства MMP-10 высок в группе с H. pylori дикого типа (n = 34), но при этом разница между контрольной группой (n = 40) и группой со штаммом без CagA (n = 31) очень мала.
д — У мышей с инфицированием патогенным штаммом синтез MMP-10 сначала растет, а затем снижается после девятой недели, а при инфицировании △cagA, то есть штаммом с нокаутом этого гена, (по 5 мышей на группу) незначительно колеблется относительно контроля.
е и ж — Уровень MMP-10 сравнили в этих группах также на вестерн-блоттинге и иммуногистохимии соответственно. Результаты говорят сами за себя!

Рисунок 4. Только взгляните на эту красоту! Иммуногистохимия желудочного эпителия (окрашивание антителами и идентификация под флуоресцентным микроскопом).
а — Эпителий желудка человека слева и мыши справа с окрашиванием ядер (DAPI) — синий, H+/K+ATPазы — зеленый (маркер обкладочных клеток), а в красном цвете — наша главная улика, MMP-10.
б — Аналогичное окрашивание, но с нюансом — использовался маркер главных клеток — пепсиноген, на основании чего можно сделать вывод, что содержание MMP-10 высокое в обоих типах клеток.

В самое пекло

Рисунок 5. На поле выходит новый игрок — хемокин CXCL16, за которым следуют T-клетки. Клетки AGS проинкубировали с хеликобактером, затем собрали супернатант и переместили в лунку с полупроницаемой мембраной. Миграциию Т-клеток оценивали с помощью метода transwell assay: меньше всего клеток мигрирует в лунках с добавлением siRNA против MMP-10.

А винить-то кого?

Мы постепенно приближаемся к разгадке — каким образом MMP-10 взаимодействует с эпителием желудка и как это приводит к гастриту и язве? Вернемся к исследованию [9]. В статье рассматривается роль сигнального пути EGFR — рецептора эпидермального фактора роста. Основная задача данного пути — стимуляция клеточного роста и дифференцировки. Оказалось, что он связан и с повышением синтеза MMP-10. Как мы уже хорошо усвоили, наиболее эффективный способ проверить, влияет ли та или иная молекула на активность другой — выключить что-то в середине и посмотреть, что будет в конце. Поэтому благодаря ингибированию отдельных белков каскада, исследователи смогли выстроить ось от EGF до MMP-10. Еще в одном раннем исследовании [11] показали, что EGF-зависимый каскад ингибируется белком p38, а вследствие этого снижается производство MMP-1.

Рисунок 6. Сигнальный путь EGFR. После того, как СagA проникает в клетку, он фосфорилируется киназами и вместе с активацией Src-киназы через EGF-зависимый путь увеличивает синтез MMP-10.

Выходит, что на индукцию MMP-10 влияют минимум два фактора — IL-22 со стороны иммунной системы и СagA со стороны хеликобактера. А далее следует то, что мы так долго ждали: MMP-10 взаимодействует с белками собственной защиты организма — β-дефензинами и Reg3. Классическая роль Reg3 заключается в проявлении антимикробной активности, хотя сейчас его рассматривают даже как гормон [12]. В присутствии H. pylori содержание Reg3 падает. При этом на мышах, которые не могут вырабатывать MMP-10 и IL-22, наблюдается противоположный эффект.

Наконец, собрав все улики, мы с чистой совестью можем представить картину, изображенную на рисунке 7. Однако не спешите радоваться, ведь это лишь одно преступление.

Рисунок 7. Схема раскрытого преступления. Продукт гена cagA проникает в эукариотическую клетку и фосфорилируется. В таком виде СagA и IL-22 активируют сигнальный путь EGPR, в результате чего с помощью киназы ERK в клетке повышается продукция MMP-10. Последняя нарушает естественную защиту клетки в лице Reg3a, что усиливает колонизацию хеликобактером. Эпителиоцит посылает сигнал в виде хемокина CXCL 16, что вызывает миграцию T-киллеров и прогрессию воспаления.

Другие орудия

На самом деле у H. pylori наряду с CagA есть еще одно весьма опасное оружие — VacA (vacuolating cytotoxin) [13]. Более 20 лет назад он вызывал у специалистов недоумение из-за противоречивых данных [14]. Одни работы показывали, что VacA имеет высокое сродство только к особым клеткам-мишеням [15], [16], другие утверждали обратное — вызываемые им адгезия и пиноцитоз неспецифичны [17]. Механизм действия VacA заключается в том, что он формирует каналы в мембране, после чего она становится проницаемой для низкомолекулярных веществ. Последующий транспорт организуется связываем цитоскелета, а именно F-актина [18] и проникновением в так называемые GEEC (англ. glycosylphosphatidylinositol-anchored protein-enriched endosomal compartments — области клетки, богатые белками, заякоренными гликозилфосфотидилинозитолом). Эти области также называют VCV — VacA containing vacioles (VacA-содержащие вакуоли) [19]. Интересно, что токсин неизвестным образом проникает в митохондрии. В статье [14] предположили несколько вариантов. Первая идея заключается в том, что Vac-содержащие вакуоли (VCV) сливаются с мембраной митохондрий и помогают переносить VacA внутрь них. Однако ей противоречит предположение, что VCV не сливаются с митохондриями, а лишь соприкасаются с ними. Еще одна гипотеза гласит, что VCV не задействованы в перемещении токсина VacA вовсе. Вместо вакуолей, транспорт осуществляет белок-переносчик, находящийся непосредственно в мембране митохондрий.

Рисунок 8. VacA хулиганит не меньше CagA. Загадочный внутриклеточный транспорт VacA с тремя возможными путями попадания в митохондрии:
1) Транспорт VacA при помощи VCVs (VacA containing vacuoles).
2) VacA проникает в митохондрии с помощью транспортера.
3) VacA находится между VCVs и митохондриями.

Связь с бронхиальной астмой

Тромбоциту тоже досталось

Если с бронхиальной астмой еще не все понятно, то вот вам реальная жертва — ни в чем не повинные тромбоциты. Оказывается, H. pylori связан с такой патологией как идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура (ITP) [24]. Это аутоиммунное заболевание, при котором в организме вырабатываются антитела к собственным тромбоцитам, что приводит к довольно тяжелым последствиям. В 2010-м обнаружили связь между антителами к CagA и пониженным содержанием тромбоцитов в крови у пациентов с H. pylori, причем количество тромбоцитов приходило в норму при проведении эрадикационной терапии (специальная схема приема антибиотиков для избавления от хеликобактера). Результаты подтвердились и в исследовании [25], где у пациентов отслеживали содержание тромбоцитов в зависимости от времени после эрадикации H. pylori, а также подтвердились в другой новой работе [26].

Он и здесь замешан.

Настало время подробнее поговорить о роли хеликобактера в канцерогенезе. Высказывались разные гипотезы на этот счет, но все равно было непонятно, каким образом бактерия может быть причастна к возникновению рака. Один из механизмов — печальная классика — ингибирование белка p53, известного благодаря своей способности отправлять клетку в апоптоз, путем активации определенных сигнальных каскадов [27].

Рисунок 9. Сигнальные пути, индуцируемые CagA, которые регулируют продукцию белка p53. Последовательная активация протеинкиназ посредством CagA приводит к снижению активности белка p53. Другой путь — влияние на экспрессию гена p53. Результат один — снижение надзора за возникновением опухолевых процессов в клетке.

Рисунок 10. Схема эксперимента. а — Изъятие биологического материала и последующий анализ NGS. б — Скорость мутаций в молекулах различных РНК.

Есть достаточно интересные данные о том, что диффузные В-крупноклеточные лимфомы (DBCL) у пациентов с инфекцией H. pylori являются более чувствительными к химиотерапии по сравнению с лимфомами неинфицированных [29]. Для этого проанализировали случаи 95 пациентов, 46 из которых были HP-позитивными и 49 — HP-негативными, а затем у них оценили индексы выживаемости — пятилетней (англ. event-free survival, EFS) и общей (англ. overall survival, OS). Более того, у инфицированных с высокой экспрессией cagA в опухолевых клетках ситуация обстояла лучше: оба индекса выживаемости были выше, чем у неинфицированных. Возникает резонный вопрос — как это работает? Возможно, хеликобактер настолько агрессивно действует на все компоненты клеточного звена желудка, что опухоль больше не может активно продолжать рост и становится уязвимой для лечения.

Как с этим бороться?

Рисунок 11. Необычные антитела против MMP-10 — новый шаг на пути к лечению. а — Сравнение структуры канонических антител и использованных в работе. б — Протестированные антитела продемонстрировали селективное ингибирование MMP-10.

Исследователи полагают, что данный подход можно будет использовать как таргетную терапию во многих заболеваниях, к которым причастна MMP-10, не только H. pylori. Вы спросите: зачем нам знать про каких-то там лам? Дело в том, что работа является экспериментальной. Не исключено, что подобные антитела можно синтезировать и при помощи иммунизации человека. Должно быть проведено необходимое количество исследований, показывающих, что все это работает как надо. На это нужно лишь время.

Эпилог

В заключение хочу сказать следующее:

Мы рассмотрели только что
Его опасные повадки.
Неуязвимость и коварство,
а в организме — неполадки.
Надежда робкая питает,
Что выбраны мишени верно,
Преодоления день настанет,
Долой злодея непременно!

Литература

Eradication Treatment of Helicobacter pylori Infection Based on Molecular Pathologic Antibiotic Resistance

Читайте также: