Взятие и пересылка патологического материала при сибирской язве

Обновлено: 24.04.2024

4.1. Микроскопического - в день поступления материала, бактериологического - до трех суток, биологического - до десяти суток.

5. Обнаружение возбудителя сибирской язвы в сырье животного происхождения и объектах внешней Среды

5.1. Цель исследования.

Исследования объектов внешней Среды и сырья животного происхождения проводят:

при необходимости установить или подтвердить источник или фактор передачи возбудителя инфекции животному или человеку;

для выявления обсемененности возбудителем сибирской язвы отдельных субъектов в случаях, предусмотренных соответствующими инструкциями;

в целях обнаружения возбудителя сибирской язвы в местах старых скотомогильников при строительных, мелиоративных, гидротехнических и других работах, связанных с выемкой и перемещением грунта;

для подтверждения результатов исследования шкурок мерлушки и козлика в случае положительной реакции преципитации.

5.2. Взятие материала для исследования

5.2.1. Отбор проб шерсти. Для бактериологического исследования берут из разных мест упаковки не менее пяти образцов массой около 2 г каждый (лучше брать пучки загрязненной шерсти). Если шерсть упакована в кипы, берут не менее десяти образцов из разных мест каждой кипы, а также свернувшуюся внутри обшивки пыль. Образцы от одной кипы объединяют и упаковывают вместе.

5. Обнаружение возбудителя сибирской язвы в сырье животного происхождения и объектах внешней среды

5.1. Цель исследования.

Исследования объектов внешней среды и сырья животного происхождения проводят:

для выявления обсемененности возбудителем сибирской язвы отдельных объектов в случаях, предусмотренных соответствующими инструкциями;

для подтверждения результатов исследования шкурок мерлушки и козлика в случаях положительной реакции преципитации.

5.2. Взятие материала для исследования.

5.2.1. Отбор проб шерсти. Для бактериологического исследования берут из разных мест упаковки не менее пяти образцов массой около 2 г каждый (лучше брать пучки загрязненной шерсти). Если шерсть упакована в кипы, берут не менее десяти образцов из разных мест каждой кипы, а также свернувшуюся внутри обшивки пыль, Образцы от одной кипы объединяют и упаковывают вместе.

5.2.2. Отбор проб кожевенно-мехового сырья. Для исследования берут кусочки размером 33 см с периферических незагнивших и незаплесневевших участков шкурок рядом с местами, откуда брали пробы для контрольного исследования. При наличии на внутренней стороне шкурки кровоподтеков или инфильтратов пробы берут и из этих мест.

5.2.3. Отбор проб кормов. Концентрированные корма (зерно, отруби, комбикорм) отбирают в зависимости от условий их хранения.

При наличии незатаренных кормов первичные пробы отбирают из расчета одна проба массой не менее 10 г на 4 м 2 поверхности, но не менее пяти проб от каждого закрома , партии. Первичные пробы берут как из поверхностных, так и из глубоких слоев корма равномерно по всей площади.

При наличии затаренных кормов отбор проб проводят согласно следующей таблице.

Пробы отбирают сухим стерильным пробным щупом. После взятия проб от каждого объекта (партии) щуп очищают и обжигают огнем паяльной лампы.

20. Сибирская язва. При подозрении на сибирскую язву вскрытие трупов запрещается. Для исследования от трупа животного берут кровь из надреза уха илипериферических сосудов или отрезают ухо.

Место надреза предварительно тщательно дезинфицируют и после взятия Кров и прижигают огнем или раскаленным металлическим предметом. Кровь наносят на стекло толстым слоем и высушивают без дополнительной фиксации другими средствами.

Отрезанное ухо пересылают в герметически закрытой посуде. Ухо отрезают с той стороны, на которой лежит труп. Предварительно его туго перевязывают шпагатом у основания в двух местах и отрезают между перевязками. Не снимая шпагата, отрезанное ухо завертывают в чистую тряпочку или марлю, пропитанную 3%-ным раствором карболовой кислоты и снаружи обертывают пергаментной бумагой. Место отреза уха на трупе прижигают огнем.

В том случае, если подозрение на сибирскую язву появилось в процессе вскрытия трупа, вскрытие тотчас же приостанавливают, и для исследования посылают мазок крови или ухо, как указано выше.

Подозрение на заболевание свиней сибирской язвой обычно возникает при наличии опухоли в области шеи. Если подозрение возникло во время вскрытия трупа свиньи, то дальнейшее вскрытие при этом прекращают, a для бактериологического исследования берут участки отечной соединительной ткани, заглоточные и брыжеечные лимфатические узлы и кусочки селезенки. Для исследования на сибирскую язву кожевенного сырья при помощи реакции преципитации посылают кусочки кожи величиной 10X10 см.

21. Бруцеллез. Для бактериологического исследования в лабораторию посылают: абортированный плод целиком с плодовыми оболочками или, в исключительном случае, желудок плода с его содержимым, перевязанный со стороны пищевода и двенадцатиперстной кишки; плодовые оболочки с котиледонами, портальные и мезентериальные лимфатические злы. В крайнем случае на исследование можно послать слизь и другие выделения из матки абортировавшего животного и молоко в стерильной посуде. Для серологического исследования в лабораторию посылают сыворотку или кровь.

22. Туберкулез. При подозрении на туберкулез легких для исследования берут мокроту из трахеи путем введения в нее стерильного ватного тампона на проволоке через трахеотубус.

При подозрении на туберкулез вымени для исследования берут молоко. При этом руки должны быть тщательно вымыты и продезинфицированы спиртом.

После предварительного обмывания и дезинфекции вымени 70°-ным спиртом первые порции молока (из подозрительной четверти вымени) сдаивают, а затем берут порции молока в начале, в середине и в конце дойки, общим количеством 160—250 мл. Бутылку закрывают стерильной пробкой или стерильным ватным тампоном.

Для бактериологического исследования материала от убитых или павших животных на туберкулез посылают кусочки пораженной ткани со свежими, еще неинкапсулированными и необызвествленными поражениями. Взятый материал консервируют в 30%-ном стерильном водном растворе глицерина.

Трупы павших или убитых птиц для исследования на туберкулез направляют целиком. Для гистологического исследования посылают кусочки пораженных органов и лимфатических узлов, фиксированные в 10%-ном растворе формалина.

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Лабораторная диагностика и обнаружение возбудителя сибирской язвы

1. РАЗРАБОТАНЫ: Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (С.Д.Кривуля, Н.Д.Пакскина); ФГУЗ Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора (Е.И.Еременко, А.Н.Куличенко, Н.П.Буравцева, О.И.Цыганкова, А.Г.Рязанова, Е.А.Цыганкова, Л.Ю.Аксенова); ФГУЗ Российский научно-исследовательский противочумный институт "Микроб" Роспотребнадзора (Н.А.Осина, И.Н.Шарова, В.Е.Куклев, Е.А.Плотникова, Т.В.Бугоркова); ФГУЗ Иркутский научно-исследовательский институт Сибири и Дальнего Востока Роспотребнадзора (А.В.Родзиковский, З.Ф.Дугаржапова); ФГУЗ Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора (А.В.Липницкий, А.М.Барков, И.А.Баркова, В.В.Алексеев); ФГУЗ Противочумный центр Роспотребнадзора (В.Е.Безсмертный, С.М.Иванова, В.А.Подледнев); ФГУН Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии Роспотребнадзора (Л.И.Маринин, И.А.Дятлов, Н.А.Шишкова, А.Н.Мокриевич); ФГУН Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии Роспотребнадзора (Г.А.Шипулин, С.Б.Яцышина); ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии Россельхозакадемии (Ю.О.Селянинов, И.Ю.Егорова).

2. РЕКОМЕНДОВАНЫ к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 3 июля 2008 г. N 2).

3. УТВЕРЖДЕНЫ И ВВЕДЕНЫ В ДЕЙСТВИЕ Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г.Онищенко 29 июля 2008 г.

4. Введены в действие с 1 сентября 2008 г.

5. С введением в действие данных методических указаний при осуществлении государственного санитарно-эпидемиологического надзора методические указания "Лабораторная диагностика сибирской язвы у животных и людей, обнаружение возбудителя в сырье животного происхождения и объектах внешней среды", утвержденные 01.09.86 начальником Главного управления ветеринарии Госагропромкомитета СССР и начальником Главного управления карантинных инфекций Минздрава СССР, применению не подлежат.

1. Область применения

1.1. Настоящие методические указания предназначены для специалистов органов и учреждений Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, а также могут быть использованы специалистами других заинтересованных организаций.

1.2. В методических указаниях определены порядок забора, хранения, транспортирования и выполнения лабораторных исследований биологического материала от больных и умерших людей, животных с подозрением на сибирскую язву, а также материала из объектов окружающей среды, подозрительного на контаминацию возбудителем данного заболевания.

ВНИИВВиМ - Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии;

ГИСК - Государственный институт стандартизации и контроля;

ГКИ - Государственный контрольный институт;

ДДМ - диско-диффузионный метод;

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота;

ИФА - иммуноферментный анализ;

ЛФ - летальный фактор;

МПА - мясопептонный агар;

МПБ - мясопептонный бульон;

МПК - минимальная подавляющая концентрация;

МФА - метод флуоресцирующих антител;

ОФ - отечный фактор;

ПА - протективный антиген;

ПЦР - полимеразная цепная реакция;

РНГА - реакция непрямой гемагглютинации;

РТНГА - реакция торможения непрямой гемагглютинации;

"СОПЭК" - среда для сочетанного определения продукции экзотоксина и капсулы;

ЭДТА - этилендиаминтетераацетата динатриевая соль;

DCL - абсолютная летальная доза;

LD - половинная летальная доза;

MLVA - метод анализа областей генома с вариабельным числом тандемных повторов.

2. Нормативные и методические ссылки

2.1. Санитарно-эпидемиологические правила "Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности). СП 1.3.1285-03".

2.2. Санитарные правила "Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I-IV групп патогенности. СП 1.2.036-95".

2.3. "Сибирская язва. СП 3.1.089-96, ВП 13.3.1320-96".

2.4. Практическое руководство "Специфическая индикация патогенных биологических агентов", 2006.

2.5. Методические указания "Организация работы при исследованиях методом ПЦР материала, инфицированного микроорганизмами I-II групп патогенности. МУ 1.3.1794-03".

2.6. Методические указания "Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам. МУК 4.2.1890-04".

2.7. Методические указания "Обеззараживание биологического материала и объектов внешней среды, зараженных бактериями I-IV групп патогенности, при исследованиях методом ПЦР. МУ 3.5.5.1034-01".

2.8. Методические рекомендации по использованию этилового спирта с 3% перекиси водорода для фиксации на предметном стекле возбудителя сибирской язвы, 1984.

2.9. Методические рекомендации по отбору проб почвы для бактериологического исследования на наличие возбудителей сибирской язвы и актиномицетов-антагонистов, 1984.

2.10. Методические рекомендации "Использование 0,05-0,1% раствора Твина-80, как разводящей жидкости, для определения концентрации спор сибиреязвенного микроба", 1986.

2.11. Методические рекомендации "Определение гемолитической активности у сибиреязвенного микроба", 1989.

2.12. Методические рекомендации по проведению работ в диагностических лабораториях, использующих метод полимеразной цепной реакции. Основные положения, Госкомсанэпиднадзор РФ, 1995.

2.13. Методические рекомендации "Забор, транспортировка, хранение клинического материала для ПЦР-диагностики". МЗ РФ, ЦНИИЭ, 2004.

2.14. Методические рекомендации "Взаимодействие органов управления, учреждений и специализированных формирований при ликвидации последствий террористических актов с применением патогенных биологических агентов и опасных химических веществ. МР 0100/0556-04-34", 2005.

2.15. Инструкция по определению чувствительности возбудителей опасных инфекционных заболеваний к антибиотикам и химиопрепаратам, 1990.

3. Общие положения

Сибирская язва (Anthrax) - это острое инфекционное заболевание животных и человека, относящееся к группе особо опасных инфекций. Основным источником инфекции для человека при сибирской язве являются больные травоядные животные. Они в течение всего периода болезни выделяют возбудитель с мочой, испражнениями и слюной в почву, которая становится его дополнительным резервуаром. Заражение животных происходит главным образом алиментарным (через корм и питьевую воду, инфицированные спорами), реже - трансмиссивным (через укусы кровососущих насекомых) и воздушным путями.

В подавляющем большинстве случаев человек заражается сибирской язвой при разделке туш вынужденно убитого скота; употреблении в пищу полученных от него мяса или мясных продуктов; непосредственном контакте с трупами погибших животных, шерстью, шкурами, кожей, щетиной, зараженными возбудителем; уходе за больными животными. Возможно также заражение через укусы кровососущих насекомых, контаминированную почву и при вдыхании содержащего споры аэрозоля.

В зависимости от путей заражения у человека развивается кожная или висцеральная (кишечная, легочная) формы сибирской язвы. Любая из этих форм может приводить к развитию сепсиса и осложняться сибиреязвенным менингитом (генерализованная форма).

Возбудитель этой инфекции в 2001 г. в США был использован как средство биологического терроризма, что привело к человеческим жертвам и возникновению паники среди населения. Поэтому своевременная и точная лабораторная диагностика сибирской язвы приобретает сейчас особое значение.

Диагностика сибирской язвы у человека и животных основывается на эпизоотологических, эпидемиологических, клинических, лабораторных и патологоанатомических данных. Лабораторные исследования направлены на обнаружение и идентификацию возбудителя сибирской язвы, выявление специфических антител и аллергической перестройки в организме больных людей.

3.1. Краткие сведения о возбудителе сибирской язвы

Возбудитель сибирской язвы - В. anthracis, относится к семейству спорообразующих микроорганизмов Васillасеае, роду Bacillus. В роду Bacillus, насчитывающем 101 вид, выделяют группу видов Bacillus cereus, в которую входят близкородственные В. cereus, В. anthracis, В. thuringiensis, В. mycoides и недавно признанный новым видом психротолерантный микроб В. weichenstephanensis.

Морфология В. anthracis. В зависимости от стадии развития культуры, а также условий окружающей среды, возбудитель сибирской язвы может существовать в трех формах - в виде бескапсульных вегетативных палочек (бацилл), инкапсулированных палочек и спор.

Процесс спорообразования состоит из четырех основных стадий: подготовительной, образования проспор, готовых спор и зрелых спор. Спорогенез зависит от особенностей штамма, наличия тех или иных питательных веществ, рН среды, температуры выращивания, влажности и др.

При попадании спор в благоприятные условия (влажность, аэрация, температура, наличие необходимых питательных веществ) из них быстро образуются вегетативные клетки. Время прорастания спор может составлять несколько часов и зависит от температуры (оптимум - 37 °С) и других факторов.

Культурально-биохимические свойства. Сибиреязвенный микроб - факультативный анаэроб, оптимальная температура роста 34-37 °С, оптимальное значение рН 7,2-7,8, неподвижный, хорошо растет на обычных питательных средах - МПБ и МПА. Характер роста в совокупности с другими признаками учитывается при идентификации.

При посевах на чашки Петри с питательным агаром после суточной инкубации при (36±1) °С микроб формирует крупные шероховатые сухие матовые колонии в R-форме, с "шагреневой" поверхностью, с неровными краями и отходящими от них волнистыми отростками. При малом увеличении под микроскопом (7x10) они напоминают локоны волос или львиную гриву (прилож.7, рис.4).

Характерный придонный рост сибиреязвенного микроба в МПБ или 1%-й пептонной воде похож на комочек ваты, с трудом разбивающийся при встряхивании, при этом бульон остается прозрачным (прилож.7, рис.5).

Сибиреязвенный микроб способен разлагать с образованием кислоты без газа глюкозу, мальтозу, сахарозу и некоторые другие сахара, но не разлагает лактозу. Обладает относительно низкой протеолитической активностью и при посеве уколом в столбик 10-12%-го мясопептонного желатина и выращивании при 22 °С рост микроба напоминает елочку, опрокинутую верхушкой вниз; на 3-5 день желатин разжижается в виде воронки. Большинство сапрофитов полностью разжижает желатин в более короткие сроки. При росте на кровяном агаре с 3-5% дефибринированной крови барана через 20-24 ч гемолиз не наблюдается, в то время как многие сапрофиты дают быстрый гемолиз (через 12-18 ч при 37 °С). Большинство штаммов сибиреязвенного микроба не образует фермент лецитиназу. При росте на агаре с куриным желтком вокруг колоний не происходит помутнения среды в виде беловатой зоны, а при посеве на жидкую желточную среду желток не свертывается даже при 5-6-суточном инкубировании. Сапрофиты свертывают желток в течение 6-10 ч. Сибиреязвенный микроб, в отличие от сапрофитных бацилл, обладает низкой фосфатазной активностью и не способен разлагать фосфаты, добавляемые в питательную среду (тест на фосфатазу).

Большинство штаммов сибиреязвенного микроба чувствительны к пенициллину и при выращивании на МПА или МПБ в присутствии 0,5-0,05 ЕД/мл бензилпенициллина через 3 ч инкубирования образуют цепочки из шарообразных клеток - "жемчужное ожерелье" (прилож.7, рис.6).

До 95% штаммов сибиреязвенного микроба лизируется сибиреязвенными бактериофагами "Гамма", "К" и Fah-ВНИИВВиМ (прилож.7, рис.7).

Чувствительность к антибиотикам. Возбудитель сибирской язвы чувствителен к большинству антибиотиков - цефалоспоринам I поколения, тетрациклинам, рифампицинам, аминогликозидам и фторхинолонам. Пенициллин способен задерживать развитие сибиреязвенного микроба даже при низкой концентрации в питательной среде. К некоторым макролидам сибиреязвенный микроб умеренно устойчив, а к цефалоспоринам II-IV поколения устойчив.

Факторы вирулентности (агрессии). Возбудитель сибирской язвы обладает почти универсальной патогенностью для млекопитающих - человека и других приматов, сельскохозяйственных и диких животных, лабораторных животных.

Важнейшими факторами патогенности у микроба являются капсула и экзотоксины. Сибиреязвенный микроб образует их в инфицированном макроорганизме или при культивировании на искусственных питательных средах в специальных условиях.

Наличие капсулы необходимо на первых этапах инфекционного процесса для предотвращения опсонизации и фагоцитирования микроорганизма.

Типичные вирулентные штаммы В. anthracis образуют капсулу в организме больных людей и животных, а также при культивировании на 1%-м бикарбонатно-сывороточном агаре в атмосфере, содержащей 5-50% углекислоты или на жидкой среде ГКИ, содержащей 40% инактивированной бычьей (лошадиной) сыворотки и 60% раствора Хенкса. На 1%-м бикарбонатном агаре микроб растет в SM-форме в виде гладких, блестящих, влажных, слизистых колоний с неровными краями (прилож.7, рис.8).

Геном типичных штаммов сибиреязвенного микроба представлен одной кольцевой хромосомой и двумя плазмидами. Токсинообразование и капсулообразование детерминированы плазмидами рХО1 и рХО2. Отсутствие хотя бы одной из этих плазмид приводит к снижению вирулентности вплоть до полной ее утраты.

ПРАВИЛА ВЗЯТИЯ ПАТОЛОГИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА, КРОВИ, КОРМОВ И ПЕРЕСЫЛКИ ИХ ДЛЯ ЛАБОРАТОРНОГО ИССЛЕДОВАНИЯ

(УТВЕРЖДЕНЫ Главным управлением ветеринарии Министерства сельского хозяйства СССР 24 июня 1971 г. взамен Правил, утвержденных 4 июля 1958 г.)

Кроме того, в лабораторию направляют корма для различных видов исследований, а также кровь и другой материал от животных для биохимических анализов.

Во всех случаях взятия и пересылки материала специалист обязан руководствоваться изложенными ниже правилами, а также соответствующими инструкциями по борьбе с болезнями животных.

Взятие и пересылка патологического материала для бактериологического и вирусологического исследований

2. Патологический материал необходимо брать стерильными инструментами в стерильную посуду. Поверхность органа (ткани), от которого берут патологический материал, на месте разреза следует обжечь над пламенем или прижечь нагретой металлической пластинкой.

3. Патологический материал должен быть взят как можно раньше после смерти животного, особенно в теплое время года. Начавшееся разложение трупа может сделать его негодным для исследования.

Патологический материал отправляют в лабораторию в неконсервированном виде; в том случае, если невозможно доставить его в лабораторию в течение ближайших 24-30 часов, патологический материал посылают только в консервированном виде.

4. Для бактериологического исследования патологический материал (органы или их части) консервируют 30%-ным водным раствором химически чистого глицерина. Воду предварительно стерилизуют кипячением или автоклавированием в течение 30 минут. Материал можно консервировать также в стерильном вазелиновом масле. Материал заливают консервирующей жидкостью в количестве, в 4-5 раз превышающем его объем.

5. Материал, направляемый для вирусологических исследований, консервируют 30-50%-ным раствором химически чистого глицерина на физиологическом растворе поваренной соли. Физиологический раствор предварительно стерилизуют в автоклаве при 120° в течение 30 минут.

6. Небольшие трупы павших животных (поросят, ягнят, телят), а также трупы мелких животных лучше посылать целыми в непроницаемой таре.

7. Трубчатые кости посылают на исследование в целом виде, с неповрежденными концами, тщательно очистив их от мышц и сухожилий. Кости завертывают в марлю пли полотно, смоченное дезинфицирующей жидкостью (5%-ным раствором карболовой кислоты). Кости можно также посыпать поваренной солью и завернуть в полотно или марлю.

8. Кишечник перед посылкой для бактериологического и вирусологического исследований освобождают от фекальных масс, а концы кишечника перевязывают. На исследование посылают части кишечника с наиболее характерными патологическими изменениями. Кишечник помещают в банки с 30-40%-ным водным раствором глицерина или насыщенный водным раствором поваренной соли. Объем консервирующей жидкости должен превышать объем взятого материала в 5-7 раз.

9. Кал для исследования отправляют в стерильных стаканах, пробирках или банках, которые хорошо закрывают пергаментной бумагой. От трупов животных кал можно послать в отрезке невскрытого кишечника, завязанного с обоих концов. Кал в лабораторию должен быть доставлен не позднее 24 часов после его взятия.

10. При посылке для исследования участков кожи берут наиболее пораженные кусочки ее размером 1010 см. Кусочки кожи посылают в стерильной, герметически закупоренной посуде.

11. Кровь, гной, слизь, экссудат, мочу, желчь и другой жидкий патологический материал для бактериологического и вирусологического исследований посылают в запаянных пастеровских пипетках, стерильных пробирках или во флаконах, хорошо закрытых стерильными резиновыми пробками.

12. Кровь, гной, выделения из различных полостей, естественных отверстий и др. посылают для микроскопического исследования (для обнаружения в них микробов, кровепаразитов и для определения лейкоцитарной формулы) в виде мазков.

Предметные стекла предварительно кипятят в течение 10-15 минут в 1-2%-ном водном растворе соды, затем хорошо промывают чистой водой и насухо вытирают. Сухие стекла помещают в раствор спирт-эфира, взятых в равных частях, где и хранят до употребления.

У животных кровь берут из вены ушной раковины или края верхушки уха, у птиц - с поверхности гребня или подкрыльцовой вены. Шерсть на месте взятия крови выстригают или выбривают, кожу тщательно протирают ватными тампонами, смоченными сначала спиртом и затем эфиром. Инструменты (иглы, скальпель) должны быть стерильными.

Первую каплю крови удаляют стерильной ватой (исключение делается при исследовании крови на гемоспоридиозы, когда берут для мазка первую каплю крови), а следующую свободно выступившую каплю крови берут на предварительно подготовленное предметное стекло путем быстрого и легкого прикосновения к капле поверхностью стекла. Затем стекло быстро поворачивают вверх каплей и удерживают между пальцами левой руки в горизонтальном положении. К левому краю капли прикасаются под углом 45° шлифованным краем другого предметного (или покровного) стекла. Как только капля равномерно распределится по ребру этого стекла, его быстро проводят по поверхности предметного стекла слева направо, не доводя его до края на 0,5-1 см. Ширина мазков должна быть уже предметного стекла. Для каждого нового мазка берут свежую каплю крови.

Готовые мазки крови высушивают на воздухе; подсушивать их над пламенем или на солнце не рекомендуется. В холодное время года мазки делают в теплом помещении или на стеклах, подогретых на крышке теплого стерилизатора.

Метод фиксации мазков зависит от цели исследования (см. специальную часть Правил).

Правильно приготовленные мазки крови должны быть тонкими, равномерными и достаточной длины. На высушенных мазках и отпечатках острым предметом делают надпись с указанием номера или клички животного и даты приготовления мазка.

Мазки из тканей, гноя, органов и различных выделений готовят путем размазывания материала на предметном стекле стерильной палочкой или ребром другого предметного стекла до тонкого слоя. Частицы органов плотной консистенции, твердые узелки, а также вязкий материал целесообразно заключать между двумя предметными стеклами. После растирания помещенного между ними материала стекла разъединяют в противоположные стороны в горизонтальном направлении, в результате чего получаются два довольно тонких мазка. Иногда получают так называемые препараты-отпечатки. Для этого вырезанный острым скальпелем кусочек органа захватывают пинцетом и свободной поверхностью кусочка делают на стекле несколько тонких отпечатков.

Взятие крови для серологического исследования

13. У лошадей, крупного рогатого скота, верблюдов, оленей, овец и коз кровь берут из яремной вены в верхней трети шеи.

Иглы перед взятием крови от каждого животного обязательно стерилизуют кипячением. Шерсть на месте взятия крови тщательно выстригают, и кожу дезинфицируют спиртом или 3%-ным раствором карболовой кислоты. Нужно следить, чтобы кровь стекала по стенке в пробирку струей, а не каплями. Кровь, взятая каплями и вспененная, скорее гемолизуется и часто дает неправильные результаты показаний при исследовании. Нельзя допускать, чтобы кровь попадала на землю. Для этого надо пользоваться тазиком с дезинфицирующей жидкостью, куда спускают первую порцию крови.

У свиней кровь берут из уха (иглой или шприцем) или из кончика хвоста. Хвост предварительно обмывают водой с мылом и дезинфицируют спиртом или 3%-ным раствором карболовой кислоты, а затем кончик отрезают ножницами. После взятия крови копчик хвоста обрабатывают йодом, перевязывают или прижигают.

У птиц кровь берут из вены крыла или из гребешка.

Брать кровь надо по возможности утром, до кормления животных. Для серологического исследования от крупного рогатого скота, лошадей и других крупных животных, овец, свиней кровь берут в количестве 7-10 мл.

Взятую кровь выдерживают около часа при 30-35° для свертывания, а затем выносят в прохладное помещение для отстаивания. Через 10-12 часов отстоявшуюся сыворотку переливают в другие пробирки. Если сыворотка недостаточно отстоялась или верхний слой сгустка плотно прилегает к стенкам пробирки и отстаивание начинается снизу, то сгусток отделяют от стенок пробирки тонкой предварительно прокаленной и остывшей проволокой.

Сыворотка крови должна быть доставлена в лабораторию в течение первых суток и в исключительных случаях не позднее третьего дня после взятия крови.

При пересылке сыворотки на большое расстояние, особенно летом, ее необходимо консервировать 5%-ным раствором карболовой кислоты на физиологическом растворе из расчета на каждые 9 мл сыворотки 1 мл раствора карболовой кислоты или 1-2 капли раствора на 1 мл сыворотки. Раствор карболовой кислоты необходимо подливать по каплям при постоянном встряхивании пробирки с сывороткой.

Сыворотку или кровь можно консервировать также борной кислотой (в порошке) из расчета 0,05-0,07 г (на кончике скальпеля) на одну пробирку с кровью (сывороткой). Сыворотку можно консервировать также высушиванием.

Для высушивания сыворотку наносят на фильтровальную бумагу размером 55 см в количестве 0,4 мл и выдерживают в комнате при рассеянном свете до полного высыхания. После этого на каждой бумаге с высушенной сывороткой делают соответствующие записи простым карандашом и завертывают в пергаментную бумагу (каждую пробу отдельно), а затем упаковывают в конверт и в таком виде отсылают в лабораторию.

В лаборатории каждую пробу сухой сыворотки помещают в пробирку, заливают 2 мл физраствора, помещают в термостат на 6-10 часов или оставляют в комнате на 24 часа и затем исследуют. Сухие сыворотки сохраняют свои антигенные свойства от 40 до 130 дней.

Для серологического исследования в лабораторию можно отправлять и цельную кровь, не отделяя сыворотку, но при условии, что в пути ее не будут встряхивать и она не подвергнется гемолизу.

На каждой пробе сыворотки или крови указывают ее номер или кличку животного или фамилию владельца животного. Пробы направляют с описью в двух экземплярах (см. Приложение 2).

Пробирки с сыворотками плотно закрывают стерильными пробками и устанавливают для пересылки в строго вертикальном положении.

Зимой сыворотки упаковывают и пересылают так, чтобы они не замерзали.

Взятие материала для патологогистологического исследования

14. Для патологогистологического исследования материал берут от свежих трупов или убитых животных. Нужно брать те органы и ткани, где обнаружены те или иные патологические изменения. Из разных участков патологически измененных органов (тканей) вырезают тонкие, небольшие кусочки, но не более 1-2 см толщиной. Вместе с пораженными участками ткани захватывают и граничащую с ней нормальную ткань.

При иссечении кусочка учитывают микроскопическое строение того или иного органа и ткани. Так, кусочки из почки берут с таким расчетом, чтобы попадали оба слоя - корковый и мозговой. Из органов, имеющих во всех частях одинаковое строение, при иссечении необходимо захватывать и их капсулы.

После взятия материал тотчас помещают в фиксирующую жидкость, объем которой должен в 10 раз превышать объем взятого материала. В качестве фиксирующей жидкости лучше всего использовать 10%-ный водный раствор продажного формалина. За неимением формалина можно использовать в качестве фиксирующей жидкости 96%-ный чистый спирт. При применении спирта толщина кусочков ткани не должна превышать 0,5 см.

Фиксирующую жидкость во всех случаях через сутки необходимо заменить свежей.

Патологический материал фиксируют в стеклянной посуде или в крайнем случае в глиняной.

В холодное время года во избежание промерзания при пересылке материал, профилированный в формалине, как указано выше, перекладывают в 30-50%-ный раствор глицерина, приготовленный на 10%-ном формалине, или в 70%-ный спирт, или в насыщенный раствор поваренной соли.

На банку с кусочками органов и тканей наклеивают ярлык с указанием номера или клички животного, а внутрь ее опускают этикетку из плотной бумаги или картона с написанным на ней простым (не химическим) карандашом номером животного.

Помещать в одну посуду несколько объектов исследования от разных животных можно только при том условии, если каждый из них завязывают в марлю вместе с отдельной этикеткой.

Упаковка и пересылка патологического материала

15. Трупы мелких животных, части трупов крупных животных и отдельные органы в свежем (нефиксированном) виде отправляют для исследования в лабораторию только с нарочным. Посылаемый материал, особенно от животных, подозрительных по заболеванию инфекционной болезнью, должен быть тщательно упакован в плотный деревянный или металлический ящик, чтобы предупредить возможность рассеивания инфекции в пути. Перед упаковкой материал необходимо завернуть в холст или мешковину, смоченную дезинфицирующим раствором (фенольного креолина, лизола, известкового молока), и уложить в ящик со стружками, мякиной или опилками.

16. Части органов, жидкости, отправляемые в лабораторию почтой в фиксированном или консервированном виде, должны быть помещены в герметически закупоренную стеклянную посуду с притертой стеклянной, пластмассовой, резиновой или корковой пробкой. Пробка должна быть закреплена проволокой или бечевкой и залита менделеевской замазкой (сургучом, смолкой, парафином или воском), чтобы укупорка была непроницаемой для жидкости. Укупоренную посуду вкладывают в прочный плотный ящик и хорошо обкладывают ватой, паклей, стружками, опилками или другими упаковочными материалами.

Кости обертывают целлофаном, полиэтиленовой пленкой или смоченными в дезрастворе марлей или полотном и также упаковываются в ящики.

17. При пересылке почтой или с нарочным патологического материала от животных, подозрительных по заболеванию инфекционной болезнью, или явно инфицированного материала упаковка должна гарантировать доставку материала в целости и исключить возможность рассеивания возбудителей инфекции. На лицевой стороне посылки вверху должна быть надпись "Осторожно - стекло" и "Верх".

18. Стеклянную посуду, в которой заключен посылаемый материал с подозрением на наличие особо опасных болезней (сап, сибирская язва, эмфизематозный карбункул, бруцеллез, туляремия, перипневмония крупного рогатого скота, чума крупного рогатого скота, чума свиней, псевдочума птиц, ящур, бешенство), обязательно упаковывают в металлическую коробку, которую запаивают, пломбируют, или опечатывают, а затем упаковывают еще в деревянный ящик.

Если такой материал доставляют с нарочным, можно отправлять его в стеклянной, герметически закупоренной посуде, без металлической коробки, но в деревянном ящике.

19. На взятый патологический материал составляют сопроводительный документ (см. пункт 141).

Если при вскрытии посылки в лаборатории будут установлены несоответствие сопроводительному документу или порча патологического материала, об этом обязательно составляют акт, копию которого отправляют ветеринарному врачу, направившему материал в лабораторию.

Взятие и пересылка патологического материала при отдельных инфекционных болезнях

20. Сибирская язва. При подозрении на сибирскую язву вскрывать трупы запрещается. Для исследования от трупа животного берут кровь из надреза уха, периферических сосудов или отрезают и отсылают в лабораторию ухо.

Если подозрение на сибирскую язву появилось в процессе вскрытия трупа, вскрытие тотчас же приостанавливают и для исследования посылают ухо, как указано ниже.

Подозрение на заболевание сибирской язвой свиней обычно возникает при наличии опухоли в области шеи. Если подозрение возникло во время вскрытия трупа свиньи, то дальнейшее вскрытие прекращают, а для бактериологического исследования берут участки отечной соединительной ткани, заглоточные лимфатические узлы.

Место надреза предварительно тщательно дезинфицируют и после взятия крови прижигают огнем или раскаленным металлическим предметом. Кровь наносят на стекло толстым слоем и высушивают на воздухе без дополнительной фиксации.

Ухо отрезают с той стороны, на которой лежит труп. Предварительно его туго перевязывают шпагатом у основания в двух местах и отрезают между перевязками. Не снимая шпагата, отрезанное ухо завертывают в чистую тряпочку или марлю, пропитанную 3%-ным раствором карболовой кислоты, а затем обертывают целлофаном, полиэтиленовой пленкой или пергаментной бумагой и помещают в герметически закрытую посуду. Место отреза уха на трупе прижигают огнем.

Для исследования на сибирскую язву кожевенного сырья реакцией преципитации посылают кусочки кожи величиной 55 см в порядке, предусмотренном "Указаниями по ветеринарно-санитарной обработке заготовляемого кожевенного и мехового сырья".

21. Эмфизематозный карбункул и злокачественный отек. Для бактериологического исследования посылают в запаянных пипетках экссудат из воспаленного крепитирующего отека, а также препараты-отпечатки на предметных стеклах из пораженных частей мышц больных животных.

От трупов животных посылают кусочки печени, селезенки, почек и пораженных мышц в растворе глицерина (см. пункт 4) или же пересыпанные солью.

22. Брадзот овец. Для бактериологического исследования посылают кусочки печени, селезенки, мышц, подкожной клетчатки (если имеются отеки), содержимое тонких кишок, кусочки пораженных частей тонкого кишечника, сычуга и трубчатую кость.

Материал для бактериологического исследования берут только от свежих трупов.

23. Инфекционная энтеротоксемия овец. Для бактериологического и биологического исследований направляют содержимое тонкого отдела кишечника, перитонеальную жидкость, мезентериальные лимфатические узлы, паренхиматозные органы.

Для исследования в лабораторию направляют ухо, перевязанное у основания; от трупов свиней - участки отечной соединительной ткани и заглоточные, подчелюстные, а также другие лимфатические узлы, в которых имеются характерные патологоанатомические изменения.

Ухо отрезают с той стороны, на которой лежит труп. Предварительно его туго перевязывают шпагатом у основания в двух местах и отрезают между перевязками. Место отреза уха на трупе прижигают.

Если подозрение на сибирскую язву возникло при вскрытии трупа животного (кроме трупов свиней), вскрытие прекращают и на исследование отправляют часть селезенки.

1.2. Направление патологического на исследование. Патологический материал, подлежащий исследованию, помещают в чистую посуду (пробирки, банки).

Посуду с патологическим материалом помещают во влагонепроницаемую тару, обвязывают, пломбируют или опечатывают, делают надпись “Верх, осторожно!” и направляют в лабораторию с нарочным.

Сопроводительные документы к патологическому материалу от животного заполняют в соответствии с требованиями “Ветеринарного законодательства”.

2. Порядок проведения исследования

2.1. В лаборатории проводят микроскопическое исследование исходного патологического материала, делают посевы на питательные Среды, заражают лабораторных животных, при необходимости ставят реакцию преципитации, идентифицируют выделенные культуры.

Если ухо животного доставлено обескровленным, его обязательно исследуют и по реакции преципитации.

В случае доставки загнившего патологического матерела его исследуют только по реакции преципитации.

2.2. Микроскопическое (предварительное) исследование.

2.2.1. Из доставленного патологического материала делают мазки, фиксируют этиловым спиртом с добавлением 3% перекиси водорода (приложение, п. 1), окрашивают по Граму и на капсулу по Ребигеру, Михину, Ольту или Романовскому-Гимзе; при наличии люминесцирующих сывороток используют метод флуоресцирующих антител.

2.2.2. В мазках, окрашенных по Романовскому-Гимзе, Bac. anthracis - грамположительная палочка (прямая). Палочки располагаются короткими цепочками или попарно, концы их, обращенные друг к другу, резко обрублены, свободные концы обычно закруглены. В отдельных случаях (чаще в мазках от человека или свиней) форма микроба сибирской язвы может быть нехарактерной (короткие толстые или изогнутые, иногда зернистые палочки со вздутием посередине или на конце, возможно наличие “теней” микробов).

2.2.3. В окрашенных специальными методами мазках из свежего патологического материала сибиреязвенные палочки окружены капсулой, из свежего - микробы несколько увеличены, концы их закруглены, морфологическая стройность бацилл нарушена (они как бы изъедены), иногда отмечаются “тени”, а вместо капсул - слабоокрашенные обрывки.

2.2.4. Обрабатывают препараты люминесцирующими сыворотками в соответствии с наставлением по их применению.

Обнаружение в мазках специфического свечения позволяет подозревать наличие в исследуемой пробе возбудителя сибирской язвы.

По результатам микроскопического исследования немедленно дают предварительный ответ.

Читайте также: