Ящур где провести анализ

Обновлено: 19.04.2024

Анализ поможет определить, какие микроорганизмы населяют тонкий кишечник человека. В основе исследования — определение в крови химических веществ, которые выделяют бактерии (в том числе анаэробные), грибы и некоторые вирусы.

Приём и исследование биоматериала

Когда нужно сдавать анализ Анализ микробиоты по Осипову (биотоп "Тонкая кишка")?

Показания к исследованию микробиоты кишечника методом ГХ-МС по Осипову:

подозрение на нарушение микрофлоры тонкой кишки;
частые запоры или диарея;
синдром раздражённого кишечника — нарушение функции кишечника;
язвенный колит;
болезнь Крона — хроническое воспалительное заболевание кишечника;
приём антибиотиков;
нарушение стула после COVID-19.

Подробное описание исследования

Микробиота и её функции

Микробиота — совокупность микроорганизмов, которые населяют кожу и слизистые оболочки желудочно-кишечного тракта, полостей носа и рта, органов мочеполовой системы.

Самой многочисленной считается микробиота кишечника — на неё приходится около 60% всех бактерий, колонизирующих тело человека.

Основные виды полезных бактерий-комменсалов:

лактобактерии,
бифидобактерии,
кишечные палочки (типичные).

Условно патогенные (оппортунистические) бактерии обычно безвредны для здоровых людей и в небольшом количестве присутствуют в организме для поддержания разнообразия микрофлоры. Но если баланс кишечной микробиоты нарушается, например, из-за сбоя в работе иммунной системы, то такие бактерии быстро размножаются и могут причинить вред.

Виды условно патогенных микроорганизмов:

энтеробактерии (эшерихии, бактерии рода протей, клебсиеллы): могут вызвать инфекционные заболевания желудочно-кишечного тракта, лёгких, мочеполовой системы, печени, желчевыводящих путей;
неферментирующие грамотрицательные бактерии (псевдомонады, нейссерии, легионеллы): вызывают заболевания мочевыводящих путей и органов репродуктивной системы, кишечника, а также пневмонии, менингиты, отиты;
грамположительные кокки (стафилококки, стрептококки, энтерококки) и анаэробные бактерии: возбудители гнойно-воспалительных заболеваний;
грибы: провоцируют инфекции органов желудочно-кишечного тракта.

Одна из основных функций микробиоты — синтез короткоцепочечных жирных кислот (КЦЖК), основного источника энергии для клеток слизистой оболочки кишечника. Также КЦЖК защищают организм от патогенов и токсинов, обладают противоопухолевым и противовоспалительным эффектом, стимулируют развитие нормальной микрофлоры, регулируют кислотно-щелочной баланс и поддерживают усвоение калия, магния, хлора, натрия и воды.

Другие функции микробиоты кишечника:

выведение из организма отработанных биологически активных веществ, в том числе ферментов;
выработка гормонов, мочевой кислоты, незаменимых аминокислот и нейропептидов — биологически активных соединений, которые участвуют в обмене веществ.

Изучение микробиоты продолжается. Появились исследования, в которых доказана взаимосвязь между нарушением микрофлоры кишечника и сахарным диабетом второго типа, ожирением, сердечно-сосудистыми заболеваниями.

Есть данные о взаимодействии кишечной микробиоты и нервной системы: микробиота производит нейроактивные молекулы — ацетилхолин, серотонин, дофамин — главные медиаторы сигналов в центральной нервной системе. Если состав микробиоты нарушается, то заболевания центральной нервной системы могут прогрессировать.

Нарушение микробиоты при постковидном синдроме

В желудке, двенадцатиперстной и прямой кишке есть белки-рецепторы к вирусу SARS-CoV-2. Вирус связывается с рецепторами и проникает в клетки. При этом в слизистой оболочке кишечника может развиться воспаление, на фоне которого часто возникают гастроэнтерологические симптомы: диарея, синдром мальабсорбции — нарушение усвоения питательных веществ, дисбактериоз — состояние, при котором страдает микрофлора кишечника.

Нарушение микробиоты сохраняется и в постковидном периоде. Примерно у 6% переболевших дисбактериоз сопровождается расстройствами дефекации.

Диагностика состояния микробиоты: газовая хроматография — масс-спектрометрия

Для оценки состояния микробиоты используют различные лабораторные методы. Один из них — газовая хроматография — масс-спектрометрия (ГХ-МС).

Газовая хроматография — масс-спектрометрия — аналитический метод, разработанный российскими учёными во главе с профессором микробиологии Георгием Андреевичем Осиповым. В основе метода лежит определение микроорганизмов по так называемым микробным маркерам — жирным кислотам, которые производятся бактериями в процессе жизнедеятельности.

У каждого вида бактерий — свой уникальный набор жирных кислот, который можно идентифицировать с помощью газовой хроматографии — масс-спектрометрии. По этому набору можно судить о составе микробиоты — просто по анализу крови и без предварительного культивирования микроорганизмов, в отличие от метода микробиологической диагностики.

Основные преимущества газовой хроматографии — масс-спектрометрии:

универсальность: метод подходит для любого биоматериала;
высокая чувствительность и достоверность;
одновременное определение более 50 видов бактерий, грибков и некоторых вирусов;
возможность выявить анаэробы — бактерии, которые живут и размножаются в бескислородной среде;
отсутствие противопоказаний к проведению исследования.

Особенности и преимущества методики

Ящур (лат. — Aphtae epizooticae; англ. — Foot-and-Mouth disease) — остро протекающая высококонтагиозная вирусная болезнь домашних и диких парнокопытных животных, характеризующаяся лихорадкой и афтозными поражениями слизистой оболочки ротовой полости, бесшерстных участков кожи головы, вымени, венчика, межкопытцевой щели и сопровождающаяся нарушением движения; у молодых животных — поражением миокарда и скелетных мышц (см. цв. вклейку). Иногда ящуром болеет человек.
Историческая справка, распространение, степень опасности и ущерб. Ящур известен человечеству более 400 лет. Болезнь животных, сопровождающуюся обильным слюноотделением, неоднократно отмечали в ряде стран Европы в XVII—XIX вв.
Вирус ящура — первый из возбудителей вирусных болезней животных — открыт в 1897 г. немецкими учеными Лефлером и Фрошем. В начале XX в. французские, немецкие и английские ученые установили множественность типов возбудителя, что имело большое практическое значение в разработке средств диагностики и профилактики болезни.
Ящур регистрируется во многих странах мира. По данным МЭБ, ежегодно 55. 70 стран становятся неблагополучными по ящуру. Сведения о заболевании животных ящуром в России стали появляться в литературе с середины XIX в. В XIX—XX вв. ящур в России регистрировался периодически в виде эпизоотии, охватывающих значительные территории страны. С 1989 г. Россия благополучна по ящуру, но периодически возбудитель заносится на нашу территорию из неблагополучных, в частности сопредельных, стран. Благодаря разработанной стратегии болезнь удается ликвидировать в первичных очагах.
В современных условиях люди ящуром практически не болеют.
Ящур может наносить большой экономический ущерб и в настоящее время. Так, при эпизоотии ящура у свиней на Тайване в 1997 г. общий экономический ущерб составил около 10 млрд долл. США. При современной интеграции европейских стран возникновение в них ящура привело к серьезным экономическим и социальным проблемам. При эпизоотии ящура типа О в Великобритании в 2001 г. в течение 6 нед возникло свыше 1000 ящурных очагов и общий экономический ущерб составил более 20 млрд долл. США.
Возбудитель болезни — очень мелкий РНК-содер-жащий вирус, относящийся к роду риновирусов семейства Picornaviridae. Вирус имеет сложный антигенный состав: различают 7 серологических типов (О, А, С, САТ-1, САТ-2, САТ-3, Азия-1). Каждый тип имеет определенное число вариантов (подтипов): тип А имеет 32 варианта, О — 13, С - 5, САТ-1 - 7, САТ-2 - 3, САТ-3 — 4, Азия-1 — 2. В мире тип О вызывает заболевание в 38 % случаев, А — в 33, С — в 26 %. На территории нашей страны за годы эпизоотии регистрировали в основном ящур типов А (76,4 %) и О (19,2 %). Однако в последние годы превалирующим, как и в остальном мире, стал ящур типа О. Типы и варианты вируса различаются иммунологически: каждый из них может вызывать заболевание животного, иммунного к другим типам и вариантам вируса.
Вирус хорошо репродуцируется в культуре клеток эпителиальных тканей восприимчивых животных с проявлением ЦПД. Обладает высокой вирулентностью: лимфа из афт в разведении 1 : 106 вызывает ящур у восприимчивых животных. Пассирование вируса проводят на лабораторных животных (морских свинках, мышатах, крольчатах). В организме животных вирус индуцирует образование антител, специфических для каждого серотипа возбудителя. Поэтому серологические реакции используются для дифференциации серотипов и вариантов вируса ящура.
Возбудитель ящура по устойчивости к химическим дезинфицирующим средствам относится к устойчивым (2-я группа). Вирус устойчив к эфиру, хлороформу, четыреххлористому углероду, не инактивируется 1%-ным раствором фенола, 75%-ным этиловым спиртом, выдерживает действие лизола и толуола в концентрациях, губительно действующих на ряд других вирусов и бактерий. Устойчивость вируса значительно повышается, если он содержится в отторгнутых стенках афт. На горных пастбищах может сохраняться до следующего пастбищного сезона; в сточных водах в холодное время года выживает до 103 дней, в летнее — 21 день, осенью — 49 дней. На шерстном покрове животных вирус сохраняется до 50 дней, на одежде—до 100, в помещениях — до 70, в кормах —до 30. 150, почве—до 40. 150, в свежем молоке (4°С)—до 15, в колбасах — до 56 дней. В соленых и копченых продуктах — до 50 дней. В быстрозамороженном мясе (ниже —20 °С) вирус может сохраняться годами. В 50%-ном растворе глицерина на фосфатном буфере (рН 7,2) при 4.„8 °С вируссодержащий материал сохраняет инфекционность в течение 40 дней. Данный консервант используют при пересылке материалов в лабораторию.
Наиболее эффективными при проведении дезинфекционных мероприятий при ящуре являются 1. 2%-ные горячие растворы гидроксида натрия и калия, губительно действующие на вирус ящура в первые 10. 30 мин, 2%-ный формалин — 10 мин, виркон С 1: 200, 1%-ный йо-дез, 4%-ный раствор пероксида водорода.

Эпизоотология. Высочайшая контагиозность болезни, длительное носительство вируса в организме животных и продолжительное сохранение его во внешней среде, широкий спектр восприимчивых домашних и диких животных, множественность типов и подтипов вируса — все эти факторы обеспечивают устойчивость возбудителя, сохранение его в природе и воспроизведение эпизоотологического процесса
Восприимчивые виды животных: Парнокопытные животные (свыше 100 различных видов, в том числе дикие). Наиболее восприимчивы крупный рогатый скот, свиньи, козы, а также овцы, буйволы, яки и северные олени, иногда верблюды, человек). Молодые (2. 3 мес) более восприимчивы и переболевают тяжелее

Источники возбудителя инфекции — больные животные, в том числе находящиеся в инкубационном периоде болезни; вирусоносители (более 400 дней).

Резервуар возбудителя инфекции — дикие парнокопытные животные (сайгаки, лоси, кабаны, косули и др.)
Способ заражения и механизм передачи возбудителя. Возбудитель попадает во внешнюю среду с выдыхаемым воздухом, слюной, молоком, выделениями из носа и глаз, спермой, с мочой, фекалиями, содержимым афт. Факторами передачи возбудителя ящура являются необеззараженные продукты и сырье, полученные от больных ящуром животных, а также загрязненные выделениями больных животных корма, вода, подстилка, предметы ухода, одежда и обувь людей, транспортные средства. Быть промежуточными пассивными носителями вируса и механически распространять его за пределы эпизоотического очага могут невосприимчивые к ящуру животные — собаки, кошки, лошади и домашняя птица при тесном контакте с больными животными и контаминированной вирусами средой. Второстепенная роль в распространении ящура принадлежит крысам и мышам, а также мухам, клещам и другим насекомым как механическим переносчикам вируса. Заражение животных происходит преимущественно через слизистые оболочки ротовой полости, при поедании контаминированных кормов и пищевых отходов, приеме воды или молока, при облизывании различных инфицированных предметов, а также через поврежденную кожу вымени и конечностей (чаще) и аэрогенно при совместном содержании Интенсивность проявления эпизоотическо-
го процесса В виде спорадических вспышек характерна для стран, осуществляющих систематическую вакцинопрофилактику. Ящур, как правило, проявляется в форме эпизоотии, иногда панзоотии

Сезонность проявления болезни, периодичность. Ящур регистрируется в течение года чаще в весенний и осенний периоды. Периодичность 5. 10 лет Факторы, способствующие возникновению и распростране-
нию ящура Активизация механизмов передачи и источников распространения при ящуре тесно связана с хозяйственной деятельностью человека

Диагностика и дифференциальная диагностика. Своевременная диагностика ящура, определение типа и варианта вируса имеют важное значение для быстрой локализации и ликвидации инфекции при первой вспышке заболевания, а также предупреждения его дальнейшего распространения.
Диагноз ставят на основании эпизоотологических данных, клинических признаков болезни, патологоанатомических изменений и результатов лабораторных исследований.
Из эпизоотологических данных при диагностике учитывают следующее: 1) круг восприимчивых животных — парнокопытные; 2) степень распространения и быстроту охвата — в течение 10. 15 дней заболевает большая часть животных хозяйства; 3) хозяйственные связи предприятия с неблагополучными по ящуру хозяйствами в данном районе, области, республике; 4) отсутствие выраженной связи болезни с сезонностью и природно-климатическими условиями; 5) данные предшествующей вакцинации и переболевания животных ящуром.
Подозрение на ящур вызывает любое заболевание восприимчивых животных, характеризующееся появлением везикулярной сыпи в ротовой полости, на конечностях и вымени, повышенной саливацией, чмоканьем, затрудненным приемом и пережевыванием корма, а при осмотре ротовой полости — обнаружением афт и эрозий. Кроме того, обращают внимание на хромоту, афты на венчике и в межкопытной щели, иногда спадение рогового башмака, афты на сосках и болезненность последних при доении и сосании (при этом сильно выражен защитный рефлекс). В период угрозы появления ящура необходимо обращать внимание на угнетенное состояние животного, снижение аппетита и секреции молока, повышение температуры тела и др.
Лабораторная диагностика ящура
Исследуемый материал: у крупного рогатого скота берут стенки созревших непрорвавшихся афт с языка, у свиней — с пятачка или вымени, у мелкого рогатого скота — с беззубого края нижней челюсти, кожи меж-копытной щели или венчика; кровь в момент температурной реакции; из трупов молодняка — лимфатические узлы головы и заглоточного кольца, поджелудочную железу, мышцу сердца. Для исследования на вирусоноси-тельство берут зондом соскобы со слизистой оболочки глотки или пищевода.
Сбор, консервирование и пересылку материалов для лабораторной диагностики ящура проводят в соответствии с действующей инструкцией и методическими указаниями.
В качестве экспресс-метода диагностики в настоящее время широко применяют ИФА и ПЦР.
По результатам лабораторных исследований хозяйство считают неблагополучным по ящуру в любом из следующих случаев: 1) положительные результаты (с оценкой не менее чем три креста) в РСК при исследовании патологического материала и определении типа вируса с учетом клинико-эпизоотологических данных; 2) развитие у морских свинок (через 24.„72 ч после введения им материала) первичных афт, а затем генерализованного процесса, сопровождающегося появлением вторичных афт на языке и подошвенной поверхности передних лапок; 3) развитие парезов и параличей у трех мышат (4. 5-дневного возраста) после заражения их патматериа-лом, а затем их гибель при нормальном физиологическом состоянии трех контрольных животных.
Ретроспективная диагностика с целью определения типа и варианта вируса ящура, вызвавшего в прошлом заболевание, основана на идентификации антител в РДП, РИД, НРИФ, реакции серозащиты на мышатах в РН в культуре клеток.
При дифференциальной диагностике ящура необходимо исключить вирусный везикулярный стоматит, вирусную диарею, злокачественную катаральную горячку, чуму крупного рогатого скота, оспу, некробактериоз, инфекционный ринотрахеит, контагиозную эктиму, катаральную лихорадку овец, везикулярную экзантему свиней, стоматит, травматические заболевания, отравления некоторыми веществами. Болезни с везикулярным синдромом исключают биопробой
Иммунитет, специфическая профилактика. Переболевшие животные приобретают иммунитет к тому типу и варианту вируса, который вызвал заболевание. Продолжительность иммунитета у крупного рогатого скота 8. 12 мес, у свиней 8. 10, у овец около 18 мес. Колостральный иммунитет хорошо выражен, однако телята, не получившие молозива, не имеют сывороточных антител. У телят пассивная защита сохраняется до 3 мес.
Для иммунопрофилактики ящура и борьбы с эпизоотиями в неблагополучных и непосредственно угрожаемых хозяйствах разработаны и применяются инактивированные вакцины с профилактической целью, а также для вынужденной обработки животных в неблагополучных и угрожаемых по ящуру зонах (табл. 5.3).
Профилактика. Множественность типов возбудителя ящура, разнообразный механизм передачи и широкий диапазон восприимчивых животных представляют собой основные проблемы борьбы с ящуром.
Система противоящурных мероприятий в нашей стране базируется на научно обоснованном прогнозировании эпизоотической ситуации, предусматривает зональный принцип их осуществления. Приоритетными в системе являются общие ветеринарно-санитарные меры по предотвращению заноса вируса ящура, а в районах перманентной угрозы и в зонах высокой степени риска возникновения и распространения ящура наряду с ними предусматривается вакцинопрофилактика.
Лечение. Лечение проводится только в странах, где ящур имеет значительное распространение. При возникновении первичного ящурного очага на территории России лечение больных животных не проводят.
В начальной стадии болезни эффективна серотерапия с использованием гипериммунной сыворотки или крови (сыворотки) реконвалесцентов. Чтобы снизить заболеваемость и летальность среди животных и предупредить развитие осложнений, больным улучшают условия содержания, часто поят, назначают диетические корма (трава, мучные болтушки), симптоматическое лечение в виде дезинфицирующих растворов или мазей для обработки пораженных слизистых оболочек и кожи. Внутривенно вводят глюкозу, применяют антибиотики и сердечные средства.
Меры борьбы. При возникновении ящура мероприятия по ликвидации его определяются эпизоотической обстановкой, географическими условиями, методом ведения животноводства, уровнем развития страны и др. С учетом этого меры борьбы с ящуром в разных странах можно разделить на четыре направления.
1. Радикальный метод борьбы с ящуром (так называемый stamping out), заключается в немедленном убое всех больных, подозрительных по заболеванию и подозреваемых в заражении восприимчивых животных и отказе от вакцинации. Данный метод применяют в развитых благополучных странах при первичном появлении болезни. Этот метод может позволить полностью ликвидировать ящур в первичном очаге.
2. Отказ от профилактической иммунизации животных, а в случае возникновения ящура убой (уничтожение) животных в очаге и проведение вынужденной вакцинации вокруг очага инфекции.
3. Систематическая профилактическая иммунизация восприимчивых животных в угрожаемых зонах. При возникновении ящура убой (уничтожение) больных и проведение кольцевой вакцинации вокруг очага инфекции (успешно применяется в нашей стране).
4. Комплексный метод борьбы с ящуром, заключается в сочетании метода убоя заболевших и подозрительных по заболеванию животных с активной иммунизацией восприимчивого поголовья

Вакцины, применяемые для профилактической и вынужденной вакцинации сельскохозяйственных животных против ящура:

Мероприятия по ликвидации ящура при проведении санитарно-карантинных мероприятий. Комплексный метод применяют в зонах, ранее неблагополучных по ящуру, в пограничных зонах, особенно при угрозе заноса ящура, в зонах действия институтов и предприятий, занятых изготовлением противоящурных биопрепаратов. В случае возникновения ящура больных и подозрительных по заболеванию животных изолируют или убивают. Неблагополучную зону карантинируют, всех животных в угрожаемой зоне иммунизируют. Этот метод следует считать наиболее эффективным, так как мероприятия направлены на все звенья эпизоотической цепи.
При организации мероприятий следует различать эпизоотический очаг, неблагополучный пункт и угрожаемую по ящуру зону.
Карантин снимают через 21 день после выздоровления последнего заболевшего животного в данном пункте.
Ограничения после снятия карантина достаточно жесткие. Запрещены: вывоз и ввоз животных в течение 1 года после снятия карантина; использование пастбищ и скотопрогонных трактов в течение 1 года. Привитых животных можно вводить через 21 день после вакцинации. Переболевшие животные в течение 3 мес после снятия карантина могут быть отправлены на убой только на мясокомбинат данной области. Неболевших, но вакцинированных животных можно отправлять на убой через 21 день после вакцинации. Продукты животного и растительного происхождения, имевшие контакт с вирусом ящура, используют на месте.
Меры по охране людей от заражения ящуром. Ящур у человека возникает очень редко. Заражение происходит при уходе за больными животными, чаще болеют люди с ослабленным организмом или дети при употреблении сырого молока от больных коров. Прогноз чаще благоприятный. Выздоровление наступает через 10. 15 дней.
Личная профилактика в неблагополучных пунктах сводится к запрещению потребления сырого мяса, молока и молочных продуктов. Обязательны кипячение или пастеризация молока. Необходима осторожность при уходе за больными животными (мытье и дезинфекция рук, спецодежды — фартука, перчаток, сапог).

ГОСТ 25384-82
(СТ СЭВ 2597-80)

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ СОЮЗА ССР

Методы лабораторной диагностики ящура

Domestic animals. Methods of laboratory diagnostics of foot-and-mouth disease

Срок действия с 01.01.83
до 01.01.88*
_______________________________
* Ограничение срока действия снято
по протоколу Межгосударственного Совета
по стандартизации, метрологии и сертификации
(ИУС N 2, 1993 год). - Примечание изготовителя базы данных.

РАЗРАБОТАН Министерством сельского хозяйства СССР

ВНЕСЕН Министерством сельского хозяйства СССР

Член Коллегии А.Д.Третьяков

УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Постановлением Государственного комитета СССР по стандартам от 11 августа 1982 г. N 3155

Настоящий стандарт распространяется на крупный и мелкий рогатый скот, свиней, верблюдов, а также на все виды диких парнокопытных и мозоленогих животных, восприимчивых к ящуру, и устанавливает методы лабораторной диагностики ящура.

Стандарт предназначается для научно-исследовательских учреждений, республиканских и областных (краевых) ветеринарных лабораторий.

Стандарт полностью соответствует СТ СЭВ 2597-80.

1. МЕТОДЫ ОТБОРА ПРОБ

1.1. Для проведения диагностических исследований на ящур отбирают стенки и содержимое афт (лимфа) на слизистой оболочке языка (у крупного рогатого скота), на пятачке (у свиньи), на коже венчика и межпальцевой щели (у крупного и мелкого рогатого скота, свиней, верблюдов и др.). При отсутствии афт отбирают пробы крови в момент температурной реакции у животных, а из трупов молодняка всех видов животных - лимфатические узлы головы и заглоточного кольца, поджелудочную железу и мышцу сердца.

Для проведения ретроспективных диагностических исследований на ящур отбирают пищеводно-глоточную слизь. Отбор пищеводно-глоточной слизи производят в любое время после предполагаемого заболевания животных.

1.2. Для проведения диагностики серологическим методом отбирают не менее 5 г стенок или содержимого афт. Масса проб остальных материалов, предназначенных для выделения вируса ящура и его последующей идентификации, должна быть не менее 10 г.

При невозможности получения указанных количеств проб допускается отбирать максимально возможное количество патологического материала для проведения последующей расплодки вируса в культурах клеток.

1.3. Пробы патологического материала без признаков разложения помещают во флаконы с завинчивающимися или притертыми пробками и замораживают, а при отсутствии условий замораживания - заливают консервирующей жидкостью. Для консервирования стенок и содержимого афт используют консервирующую жидкость, состоящую из равных объемов нейтрального глицерина и забуференного 0,15 М раствора хлористого натрия или среды для культивирования клеток (без сыворотки). Пробы остального патологического материала консервируют растворами антибиотиков с широким спектром действия или глицерин-фосфатным буфером.

1.4. Флаконы с пробами снабжают этикеткой с указанием вида животных, наименования патологического материала и его количества, консерванта, времени отбора и адреса отправителя. Флаконы с пробами помещают в небьющийся контейнер со льдом или хладоносителем и доставляют на исследование в возможно короткий срок, но не позднее 48 ч с момента отбора. Если пробы могут быть доставлены в течение 6-12 ч с момента отбора, замораживание и консервация проб не обязательны.

1.5. Поступившие на исследование стенки афт освобождают от консервирующей жидкости отмыванием в 2-3 сменах стерильного 0,15 М раствора хлористого натрия или среды для культивирования клеток, взвешивают, измельчают сначала ножницами, а затем в ступке с песком или с помощью гомогенизатора и смешивают в соотношении 1:1 или 1:2 с 0,15 М раствором хлористого натрия. Полученные 50 или 33% суспензии выдерживают в течение 20 мин при температуре 4 °С, а затем очищают 20% (по объему) хлороформа или флюорокарбона в течение 5-7 мин и осветляют центрифугированием с частотой вращения 3000 об/мин в течение 15 мин.

1.6. Содержимое афт (лимфа) разбавляют равным количеством 0,15 М раствора хлористого натрия и подвергают очистке и осветлению в соответствии с п.1.5.

1.7. Пробы лимфоузлов, мышцы сердца, поджелудочной железы и свернувшейся крови сначала обрабатывают в соответствии с п.1.5, а затем разбавляют средой для культивирования клеток.

Полученные суспензии при невозможности немедленно использовать для постановки биопробы замораживают и хранят при температуре минус 20 °С.

1.8. Суспензии, полученные в соответствии с пп.1.5 и 1.6, делят на три неравные части. Меньшую из них (около 1 см), предназначенную для вирусологических исследований (постановки биопробы), консервируют антибиотиками и хранят при температуре минус 20 °С. Другую часть (2-3 см), предназначенную для исследования в РСК, прогревают при температуре 56 °С в течение 40 мин, а оставшуюся (1,5-2 см) - хранят без прогревания. Перед постановкой РСК обе эти пробы центрифугируют в течение 20 мин с частотой вращения 3500-4000 об/мин.

2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1. Серологический метод

Сущность метода заключается в обнаружении специфического антигена того или иного типа и варианта вируса ящура непосредственно в материале, полученном от животных с клиническими признаками заболевания, с помощью реакции связывания комплемента (РСК).

2.1.1. Аппаратура, материалы и реактивы

2.1.1.1. Для проведения исследования применяют:

центрифугу настольную с угловым ротором и частотой вращения до 5000 об/мин;

холодильник с температурой минус 20 °С;

холодильник с температурой от 0 до 8 °С;

баню водяную или термостат;

шкаф сушильный с регулируемой температурой в диапазоне от 100 до 200 °С;

электрофотоколориметр или спектрофотометр;

пробирки стеклянные по ГОСТ 10515-75;

пластинки (панели) для микросерологических реакций типа Такачи;

наборы разбавителей и капельниц для микросерологических реакций типа Такачи;

пипетки вместимостью до 10 см с ценой деления 0,01 и 0,1 см по ГОСТ 20292-74*;

* На территории Российской Федерации действуют ГОСТ 29169-91, ГОСТ 29227-91-ГОСТ 29229-91, ГОСТ 29251-91-ГОСТ 29253-91, здесь и далее по тексту. - Примечание изготовителя базы данных.

колбы мерные вместимостью 50, 100 и 200 см по ГОСТ 1770-74;

комплемент морской свинки с титром не более 2,8% по ГОСТ 16446-78;

гемолизин кроличий к эритроцитам барана с титром 1:8000 по ГОСТ 16446-78;

эритроциты барана в виде дефибринированной крови, смешанной с равным объемом консерванта;

сыворотки морских свинок семи типов и актуальных для стран-членов СЭВ вариантов вируса ящура с титром в РСК не ниже 1:20;

антигены ящурные эталонные семи типов и актуальных для стран-членов СЭВ вариантов вируса с титром в РСК не ниже 1:4;

сыворотки и антигены для лабораторной диагностики везикулярных заболеваний свиней;

кислоту борную дважды перекристаллизованную;

* На территории Российской Федерации действует ГОСТ 975-88. - Примечание изготовителя базы данных.

натрий хлористый по ГОСТ 4233-77;

магний хлористый по ГОСТ 4209-77, х.ч.;

кальций хлористый по ГОСТ 4460-77, х.ч.;

среду питательную для культивирования клеток с 0,5% гидролизата лактальбумина (рН 7,4-7,6);

хлороформ по ГОСТ 20015-74* или флюорокарбон-113;

* На территории Российской Федерации действует ГОСТ 20015-88. - Примечание изготовителя базы данных.

консервант для эритроцитов; приготовленный следующим образом: последовательно растворяют в 100 см дистиллированной воды 6 г глюкозы, 4,5 г борной кислоты, дважды перекристаллизованной, и 0,85 г хлористого натрия. Полученный раствор стерилизуют кипячением в течение 3 дней по 30 мин;

раствор буферный веронал-мединаловый концентрированный, приготовленный следующим образом: растворяют в 1000 см кипящей дистиллированной воды 83 г хлористого натрия, 18,4 г веронала, 1,15 г хлористого магния и 0,22 г хлористого кальция. Раствор охлаждают, затем растворяют 0,22 г мединала, стерилизуют автоклавированием и хранят при температуре 4 °С. Рабочий раствор готовят непосредственно перед постановкой РСК разбавлением концентрированного раствора четырьмя объемами дистиллированной воды.

2.1.2. Подготовка к исследованию

2.1.2.1. Суспензии стенок и содержимого афт, полученные в соответствии с пп.1.5, 1.6 и 1.8, разводят с 1:2 до 1:32 0,15 М раствором хлористого натрия, вероналовым буфером или средой для культивирования клеток и разливают в серологические пробирки по 0,1 см или в лунки панелей для микросерологических реакций по 0,025 см. Число пробирок (лунок), заполняемых каждым разведением исследуемой суспензии, должно быть равно числу штаммоспецифических сывороток и контролей на антикомплементарность и гемолитические свойства.

2.1.2.2. Для приготовления гемолитической системы эритроциты барана трехкратно отмывают от консерванта 0,15 М раствором хлористого натрия, каждый раз осаждая их центрифугированием с частотой вращения 600 об/мин в течение 5-7 мин и готовят рабочую суспензию смешиванием 2 см осадка с 98 см разбавителя. К полученной суспензии эритроцитов при постоянном перемешивании приливают постепенно равный объем гемолизина, разведенного 0,15 М раствором хлористого натрия с таким расчетом, чтобы его конечное разведение было в 4 раза концентрированнее предельного гемолитического титра, указанного на этикетке. Затем суспензию выдерживают в течение 15-20 мин в водяной бане при температуре 37 °С или при комнатной температуре.

При постановке РСК на панелях для микрореакций концентрацию эритроцитов в гемсистеме увеличивают в 2 раза.

2.1.2.3. Для приготовления рабочего разведения комплемента содержимое нескольких ампул с сухим препаратом растворяют в первоначальном объеме дистиллированной воды, определяют предельный титр, обусловливающий гемолиз 50% эритроцитов гемсистемы, приготовленной согласно п.2.1.2.2, и разводят 0,15 М раствором хлористого натрия или вероналовым буфером из расчета 5 CH в 0,1 см (если РСК ставят в пробирках) или в 0,025 см (при постановке РСК на панелях для микрореакций).

2.1.2.4. Рабочие разведения типоспецифических ящурных сывороток готовят на 0,15 М растворе хлористого натрия или вероналовом буфере из расчета получения раствора в 2 раза более концентрированного, чем их предельный титр, т.е. они должны содержать 2 сывороточных единицы (СЕ). Вариантноспецифические сыворотки разводят до предельного титра. Вместо типоспецифических сывороток могут быть использованы вариантноспецифические в предельном, двух- и четырехкратном титрах (1, 2 и 4 СЕ).

2.1.2.5. Рабочие разведения эталонных (контрольных) яшурных антигенов готовят на 0,15 М растворе хлористого натрия или вероналовом буфере. Они должны быть в 2 раза концентрированнее, чем их предельный титр, т.е. должны содержать 2 антигенных единицы (АЕ).

2.1.2.6. Рабочие разведения сывороток и антигенов для лабораторной диагностики везикулярных заболеваний сельскохозяйственных животных готовят по пп.2.1.2.4 и 2.1.2.5.

2.1.3. Проведение исследования

2.1.3.1. В пробирки (лунки), заполненные в соответствии с п.2.1.2.1, вносят равные объемы штаммоспецифических сывороток, взятых в рабочем титре, и рабочего разведения комплемента, содержащие 5 CH. В контролях исследуемого патологического материала на антикомплементарность заменяют сыворотки равным объемом разбавителя, а в контроле на гемолитические свойства - разбавителем заменяют и комплемент. Все полученные смеси тщательно встряхивают и помещают в водяную баню пли термостат при 37 °С на 30 мин, после чего к ним добавляют суспензию эритроцитов, сенсибилизированных гемолизином, в объеме 0,2 см (пробирки) или 0,05 см (лунки), энергично встряхивают и выдерживают при 37 °С в течение 20 мин.

Пробирки или панели извлекают из термостата или водяной бани и осаждают эритроциты центрифугированием в течение 5 мин с частотой вращения 600 об/мин или отстаиванием в течение 2-3 ч при комнатной температуре.

При исследовании недоброкачественных афтозных материалов, а также при исследовании сердечной мышцы объем исследуемых суспензий увеличивают в 4 раза при сохранении объема и концентрации остальных компонентов реакции в обычных пределах.

1. БОЛЕЗНИ, ОБЩИЕ ДЛЯ ВСЕХ ИЛИ НЕСКОЛЬКИХ ВИДОВ ЖИВОТНЫХ

1.2. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ВЫДЕЛЕНИЮ И ИДЕНТИФИКАЦИИ ШТАММОВ ВИРУСА ЯЩУРА

ОДОБРЕНЫ И РЕКОМЕНДОВАНЫ 15 октября 1973 г., б/н

I. ВЫДЕЛЕНИЕ ВИРУСА ЯЩУРА

Для выделения вируса из патологического материала необходимо располагать достаточным количеством такого материала, иметь восприимчивых к вирусу ящура сельскохозяйственных или лабораторных животных, а также чувствительные к вирусу культуры клеток; располагать условиями, исключающими возможность выноса вируса за пределы диагностической лаборатории.

1. Правила отбора патологического материала

Для исследования отбирают патологический материал в виде стенок афт от 2. 3 больных животных в количестве не менее 5 г. У крупного рогатого скота берут стенки созревших непрорвавшихся афт с языка, у свиней - с "пятачка" или вымени, у мелкого рогатого скота - с беззубого края верхней челюсти, с кожи межкопытной щели или венчика. Афты должны быть свежими, плотной консистенции, не издавать гнилостного запаха.

Материалом для исследования могут служить и лимфатические узлы или костный мозг, реже другие паренхиматозные органы. Для прижизненного обнаружения вируса ящура можно использовать слюну и кровь больных животных. Для исследования на вирусоносительство у животных специальным зондом берут соскоб слизистой оболочки глотки и пищевода.

При отборе патологического материала пользуются стерильным инструментом или посудой. Патологический материал помещают в стерильные флаконы или банки с навинчивающимися колпачками с плотной резиновой прокладкой, в которые до 1/3 объема наливают консервирующую жидкость, состоящую из смеси равных частей химически чистого глицерина и фосфатно-буферного раствора рН 7,4. 7,6. На флаконы наклеивают этикетку с наименованием вида патологического материала, даты отбора и адреса хозяйства.

Флаконы или банки с отобранным материалом ставят в металлический непроницаемый контейнер, опечатывают и помещают в термос со льдом. К материалу прилагают сопроводительную записку, в которой указывают дату взятия материала, от какого вида животных и какой материал взят, сообщают подробную эпизоотическую обстановку по ящуру в хозяйстве.

2. Подготовка материала к исследованию

При доставке в лабораторию стенок афт от больных животных для определения типа и варианта вируса ящура необходимо в максимально короткий срок провести исследование в РСК. С этой целью из афтозного материала готовят антиген по следующей методике. Стенки афт отмывают физиологическим раствором рН 7,4. 7,6, высушивают фильтровальной бумагой, взвешивают, измельчают и растирают в фарфоровой ступке с битым нейтральным стеклом до получения однородной массы.

Антигены для РСК готовят в виде 33%-ной суспензии (1:3) путем добавления к полученному весу афтозного материала двойного количества физиологического раствора. Полученную взвесь экстрагируют при комнатной температуре в течение 2 ч и промораживают при температуре -6. -20°С в течение 5…18 ч.

После размораживания антиген центрифугируют 10. 15 мин при 6000 об/мин. Затем надосадочную жидкость сливают и инактивируют при 58°С в течение 40 мин. После инактивации надосадочную жидкость повторно центрифугируют и используют в РСК.

Эффективность выделения вируса из патологического материала повышается при очистке и концентрировании вируссодержащих суспензий. Для этой цели в суспензию используемого материала добавляют фреон-113 в равном количестве к ее объему или хлороформ (10% к объему суспензии). После гомогенизации в течение 15. 20 мин и центрифугирования в течение 20 мин проводят концентрирование надосадочной жидкости полиэтиленгликолем с молекулярным весом 6000. К надосадочной жидкости добавляют 7,5% полиэтиленгликоля, встряхивают до растворения и оставляют в холодильнике при температуре 4°С на 2 ч. Затем центрифугируют при 4000. 6000 об/мин в течение 20 мин. Надосадочную жидкость удаляют, а образовавшийся осадок разбавляют фосфатным буфером или физиологическим раствором в объеме, в 10. 20 раз меньшем, чем исходное количество взятой суспензии. Подготовленный материал используют для испытания на наличие вируса.

3. Выделение вируса

На основании опыта отечественных и зарубежных исследователей для выделения вируса ящура может быть предложена следующая схема (рис.1).

Лучшим, хотя и дорогостоящим, методом обнаружения вируса ящура в патологическом материале является биопроба на крупном рогатом скоте. 10%-ную суспензию полученного материала вводят телятам в возрасте 3 мес. и старше, по 0,1 мл в слизистую оболочку языка в нескольких точках. Появление афт на месте введения материала с последующим подтверждением специфичности материала в РСК свидетельствует о наличии вируса ящура. Этот метод применяется в диагностической практике очень редко. Чаще всего для постановки биопроб используют мышат-сосунов 4. 6-дневного возраста и морских свинок весом не менее 500 г. Мышатам-сосунам 10%-ную суспензию испытуемого материала вводят под кожу в дозе 0,2 мл или внутрибрюшинно в дозе 0,1 мл. Появление парезов и параличей конечностей, а затем гибель мышат с подтверждением специфичности в РСК свидетельствует о наличии вируса ящура в испытуемом материале. Морским свинкам 10%-ную суспензию испытуемого материала вводят методом туннелирования внутрикожно в плантарную поверхность лапок. Появление афт на месте введения материала с последующим подтверждением их специфичности в РСК свидетельствует о наличии вируса ящура.

Схема выделения вируса

Высокочувствительным методом выделения вируса является инокуляция культур клеток. В этих целях чаще всего используют однослойную культуру первично-трипсинизированных клеток почек свиней (СП). 10%-ную суспензию испытуемого материала вносят в 4. 6 пробирок с культурой клеток. Для этого удаляют питательную среду и добавляют 0,1. 0,2 мл испытуемого материала. Лучше испытуемый материал инокулировать в увеличенных дозах (20 мл) в большие сосуды типа матрасов Повитской емкостью до 5 л. Пробирки или матрасы оставляют в горизонтальном положении около часа для контакта клеток с испытуемым материалом. После этого добавляют питательную среду. Наблюдение за инфицированными культурами клеток ведут в течение трех дней. При появлении выраженного цитопатического действия (++++) культуральную жидкость собирают и сохраняют в замороженном состоянии. Специфическая дегенерация клеток при подтверждении ее специфичности в РСК свидетельствует о наличии вируса ящура в испытуемом материале.

II. МЕТОДЫ ИДЕНТИФИКАЦИИ ВИРУСА

1. Серологические методы

А. Реакция связывания комплемента по 100%-му гемолизу

Наставление по определению типов и подтипов (вариантов) вируса ящура утверждено Главным управлением ветеринарии МСХ СССР 27 августа 1968 г.

Реакция связывания комплемента применяется для определения типов и подтипов (вариантов) вируса ящура, вызвавших заболевание животных, а также для проверки производственных штаммов вируса ящура при изготовлении вакцин и лабораторных штаммов в научно-исследовательской работе.

Компоненты реакции:

а) гемолизин - сыворотка кроликов, гипериммунизированных эритроцитами барана;

б) эритроциты барана - в виде 2%-ной взвеси (из осадка отмытых эритроцитов) на физиологическом растворе;

в) комплемент - свежая или сухая нормальная сыворотка морских свинок;

г) сыворотки морских свинок, гипериммунизированных стандартными типовыми производственными или эпизоотическими штаммами вируса ящура;

д) антигены контрольные - из эталонов типовых и производственных штаммов вируса ящура, испытуемые - из эпизоотических, производственных или лабораторных штаммов вируса от крупного рогатого скота, овец, свиней, крольчат и животных других видов;

е) физиологический раствор - 0,85%-ный раствор химически чистой поваренной соли на дистиллированной воде.

а) Гемолизин

Для определения титра гемолизина из него готовят серию разведений на физиологическом растворе и затем испытывают его активность в этих разведениях.

Выпускаемый биофабрикой гемолизин консервирован глицерином (1:1), поэтому для приготовления первого разведения 1:100 берут 0,2 мл гемолизина и 9,8 мл физиологического раствора. Затем в отдельной пробирке готовят следующее разведение - 1:1000, для чего к 1 мл гемолизина в разведении 1:100 добавляют 9 мл физиологического раствора. Разведение 1:1000 является основным, из которого готовят все последующие: 1:1500, 1:2000, 1:3000, 1:4000 и т.д.

Приготовление разведений гемолизина

Водяная баня 10 мин при температуре 37. 38°С, после чего проводят учет реакции.

Титром гемолизина считается наивысшее разведение, дающее полный гемолиз эритроцитов.

Рабочим разведением гемолизина считается четырехкратная концентрация от его предельного титра.

Титрование гемолизина

В дальнейшем перед постановкой реакции гемолизин обычно не титруют, а рабочее разведение готовят, исходя из предельного титра, установленного при его выпуске биофабрикой и указанного на этикетке. Например, если предельный титр гемолизина 1:3000, рабочее разведение будет 1:750. Поскольку гемолизин, выпускаемый биофабрикой, консервирован глицерином (1 часть глицерина на 1 часть гемолизина), для приготовления рабочего разведения гемолизина берут вдвое больше, т.е. 2:750, или 0,2 мл гемолизина и 74,8 мл физиологического раствора.

Для дальнейшей работы гемолизин в рабочем разведении смешивают с равным количеством 2%-ной взвеси эритроцитов. Полученная смесь называется гемолитической системой (гемсистемой).

б) Эритроциты

Полученную кровь барана дефибринируют, фильтруют через марлю в центрифужные пробирки, затем центрифугируют 10 мин при 2000. 3000 об/мин. Сыворотку отсасывают, а к осадку эритроцитов добавляют примерно 8. 10-кратное количество физиологического раствора, все тщательно перемешивают и снова центрифугируют, как указано выше. Затем жидкость над осадком удаляют, а к осадку добавляют свежую порцию физиологического раствора, смешивают и центрифугируют. Эту операцию отмывания эритроцитов от сыворотки повторяют до тех пор, пока жидкость над осадком не станет бесцветной (обычно для этого требуется отмывать 3. 5 раз). По окончании отмывания жидкость над осадком тщательно отсасывают пипеткой, а из осадка эритроцитов готовят 2%-ную взвесь. Для этого берут 2 мл отмытых эритроцитов и 98 мл физиологического раствора. Для удобства дальнейшей работы готовят гемсистему, которую в процессе употребления часто взбалтывают, так как эритроциты быстро оседают на дно сосуда.

в) Комплемент

Комплемент выпускается биофабриками в сухом виде. Его можно получить и самим, приготовив свежую неинактивированную сыворотку крови от здоровых морских свинок. Титруют комплемент в гемолитической системе и обязательно в день постановки реакции.

Титрование комплемента

Комплемент исследуют в разведении 1:20 в следующих дозах: 0,05; 0,10; 0,15 и т.д. с интервалами 0,05 до 0,40 мл. В каждую пробирку недостающее количество до объема 0,5 мл доливают физиологическим раствором (в первую пробирку 0,45 мл физиологического раствора, во вторую - 0,40, в третью - 0,35 и т.д.). Это будет соответствовать 0,5; 1,0; 1,5; 2; 2,5; 3; 3,5 и 4% цельного комплемента, содержащегося в дозе 0,5 мл разведения с физиологическим раствором.

Водяная баня 15 мин при температуре 37. 38°С, после чего проводят учет реакции.

Титром комплемента считается наименьшее его количество, дающее полный гемолиз эритроцитов. Для работы по определению типов вируса ящура пригоден комплемент, дающий при этих условиях титр не ниже 2,5%.

В дальнейшем для постановки главного опыта комплемент берут с постоянным излишком в 2 условные единицы от титра в его гемолитической системе. Например, если титр комплемента в гемолитической системе 1,5% (см. схему титрования комплемента), для получения рабочего разведения комплемента следует взять 2,5%, что составляет 2 единицы. Разведение комплемента делают из нативного цельного комплемента.

г) Сыворотки

Типоспецифические и вариантные гипериммунные ящурные сыворотки готовят на биофабриках (в институтах) и используют для определения типов и подтипов (вариантов) вируса ящура.

Типоспецифические и вариантные ящурные антигены готовят из тканей больных ящуром крольчат на биофабриках и в институтах.

Испытуемый антиген (стенки афт с языка крупного рогатого скота, с "пятачка" или вымени свиней, с венчика, межкопытной щели или беззубого края верхней челюсти мелкого рогатого скота и т.д.) готовят по методике, описанной выше (см. п.2). Присланный на исследование патологический материал в виде стенок афт или других тканей берут в количестве, необходимом для постановки РСК. Остаток патологического материала хранят в холодильнике при температуре -6. -20°С в консерванте и используют для дальнейшего изучения. В случае отрицательных результатов РСК допускается расплодка испытуемого материала на 4. 6-дневных мышатах, морских свинках или культуре ткани.

Определение типов вируса ящура

При определении типов вируса ящура перед проведением главного опыта позитивные ящурные сыворотки и антигены не титруют, а используют их в удвоенных титрах. Например, если предельный титр сыворотки, указанный на этикетке, 1:40, то ее удвоенным титром будет разведение 1:20. Если предельный титр антигена, указанный на этикетке, 1:6, то его удвоенным титром будет разведение 1:3.

Испытуемый антиген в реакции исследуют цельным (33%-ная взвесь) и в разведениях 1:2; 1:4, 1:8.

Читайте также: