Животные сельскохозяйственные методы лабораторной диагностики лептоспироза

Обновлено: 19.04.2024

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ СОЮЗА ССР

Методы лабораторной диагностики лептоспироза

Agricultural animals. Methods of laboratory diagnostics of leptospirosis

Дата введения 1993-01-01

1. РАЗРАБОТАН И ВНЕСЕН Главным управлением ветеринарии Министерства сельского хозяйства и продовольствия

2. УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Постановлением Комитета стандартизации и метрологии СССР от 27.12.91 N 2240

3. СРОК ПРОВЕРКИ - 1996 г.

5. ССЫЛОЧНЫЕ НОРМАТИВНО-ТЕХНИЧЕСКИЕ ДОКУМЕНТЫ

Обозначение НТД, на который дана ссылка

2.2.2.1; 2.2.2.3; 2.2.2.4; 2.2.2.6

2.2.2.8; 2 2.2.9; 2.2.2.11

2.2.2.8; 2.2.2.9; 2.2.2.10; 2.2.2.11

2.2.2.8; 2.2.2.9; 2 2.2.10; 2.2.2.11

2.1.1.1; 2.2.2.4; 2.2.2.6; 2.2.2.8; 2.2.2.9; 2.2.2.10

2.2.2.2; 2.2.2.3; 2.2.2.4; 2.2.2.5; 2.2.2.6; 2.2.2.7; 2.2.2.8; 2.2.2.10; 2.2.2.13

Настоящий стандарт распространяется на методы лабораторной диагностики инфекционной болезни - лептоспироза, вызываемой возбудителем вида Leptospira interrogans.

Диагноз на лептоспироз устанавливают на основании эпизоотологических, эпидемиологических, клинических и патологоанатомических данных с обязательным подтверждением диагноза лабораторными исследованиями.

1. МЕТОД ОТБОРА ПРОБ

1.1. Материалом для исследований служит кровь, моча, органы и ткани, а также трупы мелких животных. От трупов крупных животных берут сердце, кусочки паранхиматозных органов, почку, транссудат из грудной и брюшной полостей, перикардиальную жидкость, мочевой пузырь с содержимым, спинномозговую жидкость.

Абортированный плод доставляют в лабораторию целиком или берут желудок с содержимым, сердце и паренхиматозные органы плода.

1.2. Кровь для серологического исследования берут в количестве 5-10 см не ранее чем через 5-7 сут после проявления клинических признаков болезни или через 90 сут - для крупного рогатого скота, 60 сут - для свиней и животных других видов после введения вакцины. Кровь для бактериологического исследования берут в период лихорадки на 1-7 сут болезни.

1.3. Мочу собирают при естественном мочеиспускании в чистые пробирки. У коров и свиноматок допускается брать мочу катетером.

Мочу микроскопируют непосредственно в хозяйствах.

1.4. Почку извлекают в невскрытой капсуле. Сердце, мочевой пузырь и желудок плода берут с содержимым, для чего накладывают лигатуры на соответствующие сосуды и сфинктеры. Каждый орган или кусочек органа заворачивают в целлофановый пакет.

1.5. Ликвор, транссудат, спинномозговую жидкость и другие жидкие субстраты насасывают стерильным шприцем или пипеткой в стерильные пробирки.

1.6. Пробами для гистологического исследования служат кусочки коркового слоя почек и печени объемом не более 1 см, консервированные 10%-ным раствором формалина.

1.7. Пробы патологического материала должны быть исследованы с момента взятия в течение 6 ч в летнее время и 10-12 ч при хранении его в охлажденном состоянии.

1.8. Микроскопия мочи должна быть закончена при температуре: 30-40 °С в течение 3 ч, 25-30 °С - 4-5 ч, 20-25 °С - 6-8 ч, 16-20 °С - 10-12 ч с момента взятия.

1.9. Взятые пробы помещают в ящик, опечатывают и направляют в лабораторию с нарочным (курьером).

В сопроводительном документе к пробам патологического материала указывают время гибели животного или время взятия проб при жизни.

2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Серологический метод

Метод основан на обнаружении специфических антител в крови животных реакцией микроагглютинации (РМА) и реакцией иммуноадсорбции (РИА).

2.1.1. Реакция микроагглютинации

2.1.1.1. Аппаратура, материалы, реактивы

Центрифуга со скоростью вращения не менее 10000 об/мин.

Микроскоп биологический по ГОСТ 8074.

Конденсор темного поля.

Осветитель с точечной лампой.

Пластинки с лунками или пробирки Флоринского.

Пипетки градуированные вместимостью 1, 2, 5 и 10 см по ГОСТ 20292*.

* На территории Российской Федерации действуют ГОСТ 29169-91, ГОСТ 29227-91-ГОСТ 29229-91, ГОСТ 29251-91-ГОСТ 29253-91. - Примечание изготовителя базы данных.

Натрий хлористый х.ч. по ГОСТ 4233 или ч.д.а. 0,85%-ный раствор в дистиллированной воде. Раствор разливают во флаконы или бактериологические пробирки и стерилизуют в автоклаве при температуре 120 °С в течение 30 мин.

3.1. ПРОФИЛАКТИКА ИНФЕКЦИОННЫХ БОЛЕЗНЕЙ

ПРОФИЛАКТИКА И БОРЬБА С ЗАРАЗНЫМИ БОЛЕЗНЯМИ, ОБЩИМИ ДЛЯ ЧЕЛОВЕКА И ЖИВОТНЫХ

Санитарные правила СП 3.1.091-96

Ветеринарные правила ВП 13.3.4.1310-96

Дата введения - с момента публикования

УТВЕРЖДАЮ Начальник Департамента ветеринарии Министерства сельского хозяйства и продовольствия Российской Федерации - Главный государственный ветеринарный инспектор Российской Федерации В.М.Авилов 18 июня 1996 г.

УТВЕРЖДАЮ Первый заместитель председателя Госкомсанэпиднадзора России - заместитель Главного государственного санитарного врача Российской Федерации С.В.Семенов 31 мая 1996 г.

Сборник содержит основные действующие на территории Российской Федерации правила и методические документы, регламентирующие деятельность по борьбе и профилактике инфекционных (паразитарных) болезней, предназначен для работников службы Роспотребнадзора, а также представляет интерес для специалистов многих других ведомств и областей знания.

1. Область применения

1.1. Настоящие Правила обязательны для выполнения на всей территории Российской Федерации государственными органами, предприятиями и иными хозяйственными субъектами, учреждениями, организациями, общественными объединениями, независимо от их подчинения и форм собственности, должностными лицами и гражданами.

2. Нормативные ссылки

2.4. Государственная система санитарно-эпидемиологического нормирования Российской Федерации.

2.6. Инструкция "Проведение ветеринарной дезинфекции объектов животноводства".

2.7. Инструкция по дезинфекции сырья животного происхождения и предприятий по его заготовке, хранению и обработке.

2.8. Методические рекомендации "Эпидемиология, диагностика, клиника и профилактика лептоспироза". Минздрав РСФСР, 1987.

2.9. Методические указания по эпидемиологии и профилактике лептоспироза. Минздрав, СССР, 1979.

2.10. Методические указания по борьбе с серой крысой в природных очагах иктерогеморрагического лептоспироза. Минздрав, 1984.

2.11. Инструкция о мероприятиях по профилактике и оздоровлению животных от лептоспироза. 1992.

2.12. Методические указания по лабораторной диагностике лептоспироза животных. 1976.

2.13. Государственный стандарт Союза СССР "Животные сельскохозяйственные. Методы лабораторной диагностики лептоспироза" ГОСТ 25386-91.

2.14. Наставление по применению поливалентной вакцины ВГНКИ против лептосипроза животных. 1992.

2.15. Наставление по применению вакцины против лептоспироза животных (концентрированной). 1994.

2.16. Наставление по применению вакцины ассоциированной против лептоспироза и парвовирусной инфекции свиней. 1989.

2.17. Наставление по применению вакцины ассоциированной против лептоспироза и эмфизематозного карбункула крупного рогатого скота. 1986.

2.18. Наставление по применению вакцины ассоциированной против лептоспироза и кампилобактериоза крупного рогатого скота. 1991.

2.19. Наставление по применению вакцины против лептоспироза собак. 1994.

2.20. Наставление по применению вакцины лептоспирозной инактивированной жидкой. 1981.

2.21. Наставление по применению вакцины против чумы плотоядных, инфекционного гепатита, аденовироза, парвовирусного энтерита и лептоспироза собак (гексаканивак). 1991.

3. Общие сведения о лептоспирозе

Лептоспироз - зоонозная природноочаговая инфекционная болезнь диких, домашних животных и человека, широко распространенная в различных ландшафтно-географических зонах мира.

Источники возбудителей лептоспирозной инфекции подразделяются на две группы. К первой относятся грызуны и насекомоядные, являющиеся основными хозяевами (резервуаром) возбудителей в природе: ко второй - домашние животные (свиньи, крупный рогатый скот, овцы, козы, лошади, собаки), а также пушные звери клеточного содержания (лисицы, песцы, нутрии), формирующие антропургические (сельскохозяйственные) очаги.

Возбудители лептоспироза - микроорганизмы рода Leptospira.

Патогенные лептоспиры представлены 202 сероварами, которые по степени антигенного родства объединены в 23 серологические группы.

На территории Российской Федерации возбудителями лептоспироза сельскохозяйственных животных и собак являются лептоспиры серогрупп pomona, tarassovi, grippotyphosa, canicola, hebdomadis, icterohaemorrhagiae, canicola; в природных очагах установлена циркуляция лептоспир серогрупп grippotyphosa, pomona, sejroe, javanica, icterohaemorrhagiae, bataviae, australis, autumnalis. В этнологической структуре лептоспирозных заболеваний человека преобладают лептоспиры серогрупп grippotyphosa, pomona, icterohaemorrhagiae, canicola, sejroe.

Основной путь передачи инфекции - водный, меньшее значение имеют контактный и пищевой (кормовой).

В организм человека и животных лептоспиры проникают через незначительные повреждения кожи и неповрежденные слизистые оболочки полости рта, носа, глаз, желудочно-кишечного и мочеполового трактов.

4. Профилактика и борьба с лептоспирозом сельскохозяйственных и домашних животных

4.1. Основанием для подозрения на неблагополучие хозяйства по лептоспирозу служат клинические признаки болезни и патологоанатомические изменения, характерные для этой инфекции, обнаружение специфических антител в крови животных. Диагноз лептоспироза во всех случаях должен быть подтвержден лабораторными исследованиями.

4.2. В целях своевременного выявления лептоспироза проводят исследование сыворотки крови животных в реакции микроагглютинации (РМА):

- на племпредприятиях, станциях (пунктах) искусственного осеменения и в племенных хозяйствах (фермах) всех производителей два раза в год;

- свиней, крупный и мелкий рогатый скот, лошадей - перед вводом (ввозом) и выводом для племенных и пользовательных целей (за исключением животных на откорм) поголовно;

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ СОЮЗА ССР

Методы лабораторной диагностики лептоспироза

Agricultural animals. Methods of laboratory diagnostics of leptospirosis

Дата введения 1993-01-01

1. РАЗРАБОТАН И ВНЕСЕН Главным управлением ветеринарии Министерства сельского хозяйства и продовольствия

2. УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Постановлением Комитета стандартизации и метрологии СССР от 27.12.91 N 2240

3. СРОК ПРОВЕРКИ - 1996 г.

5. ССЫЛОЧНЫЕ НОРМАТИВНО-ТЕХНИЧЕСКИЕ ДОКУМЕНТЫ

Обозначение НТД, на который дана ссылка

2.2.2.1; 2.2.2.3; 2.2.2.4; 2.2.2.6

2.2.2.8; 2 2.2.9; 2.2.2.11

2.2.2.8; 2.2.2.9; 2.2.2.10; 2.2.2.11

2.2.2.8; 2.2.2.9; 2 2.2.10; 2.2.2.11

2.1.1.1; 2.2.2.4; 2.2.2.6; 2.2.2.8; 2.2.2.9; 2.2.2.10

2.2.2.2; 2.2.2.3; 2.2.2.4; 2.2.2.5; 2.2.2.6; 2.2.2.7; 2.2.2.8; 2.2.2.10; 2.2.2.13

1. МЕТОД ОТБОРА ПРОБ

Мочу микроскопируют непосредственно в хозяйствах.

1.9. Взятые пробы помещают в ящик, опечатывают и направляют в лабораторию с нарочным (курьером).

2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Серологический метод

2.1.1. Реакция микроагглютинации

2.1.1.1. Аппаратура, материалы, реактивы

Центрифуга со скоростью вращения не менее 10000 об/мин.

Микроскоп биологический по ГОСТ 8074.

Конденсор темного поля.

Осветитель с точечной лампой.

Пластинки с лунками или пробирки Флоринского.

Пипетки градуированные вместимостью 1, 2, 5 и 10 см по ГОСТ 20292*.

Текст ГОСТ 25753-83 Животные сельскохозяйственные. Методы лабораторной диагностики болезни Ауески

ЖИВОТНЫЕ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫЕ

МЕТОДЫ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ БОЛЕЗНИ АУЕСКИ

ГОСТ 25753-83 (СТ СЭВ 3454-81)

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР ПО СТАНДАРТАМ

РАЗРАБОТАН Министерством сельского хозяйства СССР ИСПОЛНИТЕЛИ

Л. В. Селиванов, Э. М. Прохорова, Т. И. Малахова

ВНЕСЕН Министерством сельского хозяйства СССР

Член Коллегии Л. Д. Третьяков

УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Постановлением Государственного комитета СССР по стандартам от 22 апреля 1983 г. № 2016

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ СОЮЗА ССР

ЖИВОТНЫЕ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫЕ Методы лабораторной диагностики болезни Ауески

Agricultural animals. Methods of laboratory diagnostics for Morbus Aujeski

Постановлением Государственного комитета СССР по стандартам от 22 апреля 1983 г. № 2016 срок действия установлен

с 01.07.84 до 01.07.89

Несоблюдение стандарта преследуется по закону

Настоящий стандарт распространяется на крупный рогатый скот, овец, свиней и других животных (пушных зверей, собак и кошек), невакцинированных живыми вакцинами, и устанавливает методы лабораторной диагностики болезни Ауески.

Стандарт применяют при диагностировании заболевания животных в лабораториях ветеринарных научно-исследовательских учреждений.

Стандарт полностью соответствует СТ СЭВ 3454—81.

1. МЕТОД ОТБОРА ПРОБ

1.1. Для проведения биологической пробы и выделения вируса патологический материал берут от животных в период максимального проявления клинических признаков болезни (температурная реакция, угнетение, нервная клиника, зуд, расчесы). От вынужденно убитых и павших животных патологический материал должен быть взят и исследован в летнее время в течение 6 ч, а при условии хранения его в охлажденном состоянии в течение 10—12 ч.

1.2. В лабораторию доставляют больных животных, трупы животных или кусочки тканей и органов (головного и спинного мозга, легких, печени, селезенки, лимфатических узлов, миндалин) , от абортировавших животных — плоды и плаценту.

1.3. Для серологического исследования пробы крови от исследуемых животных берут в стерильные пробирки в количестве не менее 5 см 3 .

Перепечатка воспрещена © Издательство стандартов, 1983

Сыворотку получают методом отстоя и хранят ее до 10 сут при температуре плюс 4°С. Допускается более длительное хранение сыворотки при температуре минус 20°С. Сыворотка должна быть прозрачной без признаков гемолиза.

1.4. Патологический материал доставляют в лабораторию с сопроводительным документом, в котором указывают наименование хозяйства, вид и возраст животного, эпизоотические данные, клиническую и патолого-анатомическую картину, сведения о проведении иммунизации животных и применяемой вакцине.

2. МЕТОД БИОЛОГИЧЕСКОЙ ПРОБЫ

Сущность метода заключается в воспроизведении заболевания у здоровых кроликов путем инокуляции патологического материала.

2.1. Аппаратура, материалы и реактивы Для проведения испытания применяют:

центрифугу с частотой вращения не менее 3000 об/мин;

термостат с температурой нагрева 37 °С;

пробирки стеклянные по ГОСТ 25336—82;

пипетки мерные по ГОСТ 20292—74;

шприцы вместимостью 1 или 2 см 3 ;

чашки Петри до ГОСТ 25336—82;

раствор физиологический стерильный, рН = 7,2;

раствор солевой буферный стерильный, pH = 7,2;

антибиотики широкого спектра действия.

2.2. Подготовка к исследованию

2.3. Проведение исследования

Для проведения биологической пробы используют кроликов массой 2—2,5 кг. Надосадочную жидкость, приготовленную по п. 2.2, вводят двум кроликам внутримышечно в дозе 1—2 см 3 .

2.4. Обработка результатов

Биопробу считают положительной, если животные погибают с клиническими признаками болезни Ауески (нервная клиника, зуд, расчесы) через 2—10 сут после инокулирования суспензии патологического материала. Если животные погибают без призна

ков болезни Ауески, биопробу повторяют, используя патологический материал первого пассажа*

Гибель кроликов после введения суспензии патологического материала от свиней без признаков зуда и расчесов может свидетельствовать о выделении вакцинных штаммов вируса болезни Ауески.

Гибель кроликов после введения суспензии патологического материала от пушных зверей без (признаков зуда и расчесов может свидетельствовать о выделении вакцинных штаммов вируса болезни Ауески, патогенных для пушных зверей.

Для идентификации вируса проводят выделение вируса в культуре клеток с последующей постановкой реакции нейтрализации.

3. МЕТОД ВЫДЕЛЕНИЯ ВИРУСА В КУЛЬТУРАХ КЛЕТОК

Сущность метода заключается в выявлении цитопатического действия (ЦПД) вируса в культуре клеток и его последующей идентификации.

3.1. Аппаратура, материалы и реактивы Для проведения исследования применяют: термостат с температурой нагрева 37 °С; центрифугу с частотой вращения не менее 3000 об/мин; весы лабораторные с погрешностью взвешивания не более 0,01 г;

шкаф сушильный; микроскоп любой марки; холодильники; баню водяную;

аппарат для трипсинизации тканей; пипетки мерные по ГОСТ 20292—74; пробирки стеклянные по ГОСТ 25336—82; чашки Петри по ГОСТ 25336—82; фильтры стерилизующие разных размеров; раствор солевой буферный стерильный, pH = 7,2; среды ростовую питательную и поддерживающую; раствор трипсина;

соду двууглекислую по ГОСТ 4201—79;

сыворотку крупного рогатого скота для культуры клеток; антибиотики и препараты микостатические; феноловый красный по ГОСТ 4599—73; раствор трипана голубого;

вирус болезни Ауески с титром не ниже 10 4 ТЦДзо/см 3 ;

сыворотку животных, не содержащую антител к вирусу болезни Ауески (отрицательную);

сыворотку специфическую гипериммунную против болезни Ауески (положительную).

3.2. Подготовка к исследованию — по п. 2.2.

3.3. Проведение исследования

В пробирки с культурой клеток вносят по 0,2 см 3 каждого испытуемого материала. Для каждой пробы используют 4—6 пробирок. Пробирки с зараженной культурой клеток выдерживают в термостате при 37 °С в течение 30 мин. Затем из пробирок с культурой клеток удаляют надосадочную жидкость и добавляют 1,8 см 3 поддерживающей питательной среды, содержащей антибиотики.

В контроле используют 4—б пробирок с незараженной культурой клеток, в которой проводят смену питательной среды. Пробирки с зараженной культурой клеток и контрольные инкубируют при температуре 37 °С в течение 2—5 сут и ежедневно микроскопируют для учета цитопатических изменений. При появлении цитопатичеоких изменений культуральную жидкость из каждой пробирки объединяют и производят идентификацию выделенного вируса. Если испытуемый материал токсичен для клеток или невозможно определить специфичность ЦПД, проводят дополнительный пассаж.

3.4. Обработка результатов

Результат исследования испытуемого материала считают положительным, если в культуре клеток обнаруживается цитопатоген-ное действие вируса, которое проявляется в округлении клеток, появлении гигантских клеток и клеточном лизисе с отпадением пораженных клеток от стекла.

В контрольных культурах (незараженных) не должно быть цитопатических изменений.

По результатам вирусологического исследования болезнь Ауески диагностируют, если видовая принадлежность выделенного вируса в культуре клеток подтверждена в реакции нейтрализации (метод идентификации вируса).

4. МЕТОД ИДЕНТИФИКАЦИИ ВИРУСА

Сущность метода заключается в обнаружении подавления цитопатического действия вируса в культуре клеток с помощью положительной сыворотки.

4.1. Аппаратура, материалы и реактивы — по п. 3.1.

4.2. Проведение исследования

Перед постановкой реакции нейтрализации положительную и отрицательную сыворотки разбавляют в соотношении 1:10 питательной средой для культуры клеток, содержащей антибиотики, и прогревают в водяной бане при температуре 56 °С в течение 30 мин. В два ряда пробирок (по 7 шт.) вносят по 2 см 3 сыворотки в каждую пробирку: в первый ряд — положительную, во второй—отрицательную.

Готовят десятикратные разведения испытуемого вируса от 10" 1 до 10~ 5 * 7 на питательной среде для культуры клеток в объемах, достаточных для постановки реакции, и вносят в два ряда пробирок с сыворотками, начиная с разведения 10 -7 , в объеме по 2 см 3 на пробирку. Пробирки со смесью разведений вируса и сыворотки встряхивают и выдерживают в термостате при температуре 37 °С в течение 1 ч. Затем каждую смесь сыворотки с разведениями вируса вносят по 1 см 3 в 4 пробирки с культурой клеток. Пробирки инкубируют в термостате при температуре 37 °С.

4.3. Обработка результатов

Результаты реакции учитывают по цитопатическому действию вируса через 2—5 сут. Для этого определяют титр исследуемого вируса в присутствии положительной и отрицательной сывороток и выражают его в логарифмах ТЦД5э_/счз. Титр вычисляют по методу Рида и Менча. Видовую принадлежность вируса устанавливают при наличии разности в титрах вируса с отрицательной и положительной сыворотками не менее чем на два логарифма.

5. СЕРОЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД ИССЛЕДОВАНИЯ

Сущность метода заключается в специфическом свойстве нейтрализующих антител сыворотки крови подавлять способность вируса вызывать цитопатическое действие в культуре клеток.

5.1. Аппаратура, материалы и реактив ы—по п. 3.1.

5.2. Подготовка к исследованию

Для групповой диагностики исследуют пробы сывороток в разведениях 1:2 или 1:4 в культуре клеток против 1000 ТЦД50/0,1 см* вируса. Для контроля благополучного стада допускается исследование смеси сывороток от пяти животных. Для подтверждения положительного диагноза сыворотки исследуют в разведениях от 1 : 2 до 1:16.

Испытуемые сыворотки выдерживают в водяной бане при температуре 56 °С в течение 30 мин.

5.3. Проведение исследования

Готовят двукратные разведения испытуемых сывороток от 1:2 до 1 : 16 на питательной среде для культуры клеток с анти-

биотиками. Затем готовят необходимый объем вируса, содержащего 1000 ТЦД₅о/о,1 см з и добавляют равный объем его в каждую пробирку с последовательными разведениями сывороток. Смесь сывороток и вируса встряхивают, выдерживают при температуре 37 °С в течение 1 ч, после чего в 4 пробирки с культурой клеток вносят по 0,2 см 3 смеси сыворотки и вируса и выдерживают при температуре 37°С ! в течение 30 мин. По истечении указанного срока в пробирки с культурой клеток вносят по 1,8 см 3 поддерживающей питательной среды. Одновременно ставят следующие контролп:

контроль незараженных культур клеток в 3—4 пробирках, в которых проводят смену питательной среды;

контроль дозы вируса. Для контроля точности дозы вируса, взятой в реакцию, из рабочего разведения вируса (1000 ТЦДбо/олсм 3 ) готовят разведения до 10~ 4 . Для каждого разведения вируса используют 3—4 пробирки с культурой клеток. В пробирки с культурой клеток вносят рабочее разведение вируса и последовательные его разведения в объеме по 0,1 см 3 . После контакта при температуре 37°С в течение 30 мин в пробирки с культурой клеток добавляют 1,9 см 3 поддерживающей питательной среды;

контроль токсичности сыворотки. Для определения токсичности сыворотки в пробирочные культуры вносят по ОД см 3 разведения сыворотки и по 1,9 см 3 поддерживающей питательной среды (по 3—4 пробирки с культурой клеток на каждое разведение сыворотки);

контроль специфичности вируса. Пробирки с культурой клеток инфицируют смесью вируса в рабочей дозе с двукратным разведением специфической сыворотки до ее титра (по 3—4 пробирки с культурой клеток для смеси каждого разведения специфической сыворотки + вирус).

Все пробирки с культурами клеток, используемые в' реакции, инкубируют при температуре 37 °С.

Проводят ежедневный микроскопический контроль клеточных культур. Учет реакции проводят при появлении цитопати-ческого действия вируса в контроле дозы вируса, взятой для реакции нейтрализации.

5.4. Обработка результатов

Результат серологического исследования испытуемых сывороток считают положительным при отсутствии цитопатического действия в разведениях сыворотки 1 : 2 и выше при наличии следующих результатов в контролях:

в контроле культуры клеток не должно быть изменений монослоя клеток;

в контроле дозы вируса цитопатическое действие должно быть в рабочем разведении вируса и в разведениях 10 -1 , 10~ 2 , 10 _3 и 10~ 4 (в последнем разведении не менее двух пробирок);

в контроле токсичности сывороток в случае положительной сыворотки (переболевшее животное) отсутствует дитопатический эффект, начиная с разведения сыворотки 1:2; при отрицательной сыворотке (отсутствуют специфические антитела) должен быть дитопатический эффект, как и в культурах с контролем дозы вируса (рабочее разведение);

в контроле специфичности вируса отсутствует цитопатический эффект в культурах, инокулированных смесью специфической сыворотки и вируса.

Наличие специфических антител в испытуемых сыворотках крови свидетельствует об инфицировании данной особи, группы животных возбудителем болезни Ауески или возможной вакцинации животных против болезни Ауески.

Положительный результат серологического метода исследования сывороток крови невакцинированных животных свидетельствует о подозрении на заболевание, которое подтверждают постановкой биологической пробы.

Редактор Н. Е. Шестакова Технический редактор Н. П. Замолодчикоза.

Корректор Е. И. Евтеева

Сдано в наб. 06.05.83 Подп. в печ. 07.06.83 0,625 п. л. 0,48 уч.-изд. л. Тир. 6000 Цена 3 коп.

Диагноз на лептоспироз ставят путем проведения микроскопических, бактериологических, серологических и гистологических исследований с учетом эпизоотологических, эпидемиологических, клинических и патологоанатомических данных.

Материалом для прижизненной диагностики является кровь и моча, для посмертной — трупы мелких животных, от крупных животных ветспециалист отбирает в ветлабораторию следующий патматериал: сердце, кусочки паренхиматозных органов , почку, транссудат грудной и брюшной полостей, перикардиальную жидкость, мочевой пузырь с содержимым. Абортированный плод доставляют в лабораторию целиком или берут желудок с содержимым и паренхиматозные органы. В летнее время патологический материал должен быть взят и исследован в течение 6 часов, зимой при условии хранения его в охлажденном состоянии — в течение 10-12 часов. При обнаружении больных или подозрительных по заболеванию животных берут не менее 50 проб крови от животных каждого скотного двора, свинарника, гурта; спустя 7-10 дней у тех же животных ветспециалист берет кровь повторно. В хозяйстве рекомендуется провести микроскопию мочи не менее чем от 100 животных.

Бактериологическая диагностика состоит в обнаружении в исследуемом материале или в органах лабораторных животных, зараженных этим материалом, лептоспир путем микроскопии, а также в выделении и идентификации чистых культур.

Серологическая диагностика основана на обнаружении специфических антител в крови животных реакцией микроагглютинации (РМА) или реакцией макроагглютинации.

Диагноз на лептоспироз считается установленным и хозяйство признается неблагополучным по лептоспирозу, если при лабораторном исследовании материала обнаруживаются лептоспиры: при микроскопии; при выделении культур; выявлении возбудителя в гистологических срезах почек или печени; установлении нарастания титра антител при повторном исследовании в 5 раз и более или при обнаружении антител у ранее не реагировавших животных, если специфические антитела обнаружены в сыворотке крови при однократном исследовании по РМА в титре 1:100 и выше более чем у 25% обследованных животных или по РА 1-4креста более чем у 20% животных.

Дифференциальный диагноз. При установлении причины падежа животного специалистам необходимо учитывать, что животные –лептоспироносители, а также животные, имеющие в крови антитела к лептоспирозу, могут погибать от других инфекционных и незаразных болезней. При заболевании крупного и мелкого рогатого скота необходимо исключить гемоспоридиозные заболевания, злокачественную катаральную горячку, бруцеллез, кампилобактериоз (вибриоз), трихомоноз, листериоз, сальмонеллез, вирусные пневмоэнтериты, кормовые отравления. У свиней необходима исключить бруцеллез, сальмонеллез, чуму, рожу, дизентерию, микотоксикозы. У лошадей — инфекционную анемию, инфекционный энцефаломиелит. У собак и пушных зверей — чуму, инфекционный гепатит, сальмонеллез и вирусный энтерит.

Лечение. Заболевших лептоспирозом животных изолируют и подвергают лечению. Лечение может быть специфическим и симптоматическим. Из специфических средств хороший лечебный эффект оказывает поливалентная гипериммунная противолептоспирозная сыворотка, особенно если ее применить в самом начале болезни. Сыворотку вводят подкожно в разовых дозах: крупному рогатому скоту 50-120 мл; телятам 20-40 мл; свиньям, овцам, лисицам 5-30 мл. При тяжелом течении болезни введение сыворотки через 1-2 дня повторяют. Внутривенно сыворотка вводится в половинных дозах. Эффективно также применение антибиотиков: стрептомицин (по 10-12 тыс. ЕД на 1кг массы животного 2 раза в день 4-5дней подряд), дитетрациклин (свиньям по 30 тыс.ЕД на 1кг массы животного 2-3 раза с интервалом 2-3дня). Для симптоматического лечения используют глюкозу. При лептоспирозе в организме животных наблюдается гипогликемия. Использование глюкозы компенсирует недостачу сахара, пополняет энергетические ресурсы организма, 40% раствор глюкозы вводят внутривенно : крупному рогатому скоту и лошадям 500 мл; молодняку 50-200 мл; лисицам, песцам и собакам 5-10мл. Для устранения атонии желудочно-кишечного тракта используют слабительные (внутрь — глауберовую соль 25-500г). Для дезинфекции мочевых путей внутрь применяют уротропин с водой: крупным животным 5-10г, телятам 1-2г. Для поддержания сердечной деятельности подкожно инъекция кофеина: крупным животным 2-3г; мелкому рогатому скоту и свиньям 0,5-2г. При поражении ротовой полости ее промывают растворами марганцовокислого калия (1:1000). Некротические очаги кожи смазывают ихтиоловой мазью, борным вазелином и т.д. Больным животным создают наилучшие условия кормления и содержания. В рацион вводят рыбий жир, рыбную муку, микроэлементы, витамины. Телят и поросят облучают кварцевой лампой.

Больных животных необходимо предохранять от действия солнечных лучей, необходимо их чаще поить.

Иммунитет и иммунизация. Чрезвычайно широкое распространение лептоспир в природе дают частые возможности контакта всех видов животных с этими микроорганизмами. В то же время при вспышках лептоспироза в сельскохозяйственных предприятиях большинство животных не заболевает. Чаще болеют молодые животные, а это говорит о том, что естественная иммунизация животных против лептоспироза (иммунизирующая субинфекция) является бесспорным фактором.

В создании невосприимчивости к лептоспирозу в организме животного большую роль играют гуморальные и клеточные факторы. При попадании лептоспир в организм их обнаруживают в макрофагах различных органов, купферовских клетках печени; доказано, что фагоцитарная активность клеток крови (нейтрофилов) через несколько дней после заражения увеличивается в 4-6раз. То есть можно сказать, что в начальном периоде после заражения защитные функции выполняют клеточные факторы иммунитета, которые приобретают специфичность под влиянием появляющихся несколько позднее антител, агглютининов, лизинов, комплемент связывающих антител, преципитинов. Преципитины делают фагоцитоз не только завершенным, но и разрушают паразитов (лизис). Конечно, эффективность механизмов иммунитета зависит от состояния нервной системы организма, и в первую очередь от ее чувствительности, способной своевременно пускать в ход защитные механизмы.

Изучая иммуногенез, ученые заметили, что переболевшие лептоспирозом животные приобретают иммунитет к повторному заражению гомологичным серотипом, а кровь реконвалисцентов обладает лечебными и профилактическими свойствами. Эти факторы были учтены учеными при изыскании вакцин и сыворотки против лептоспироза.

Первая вакцина против лептоспироза в СССР была предложена С.Я. Любашенко в 1940г., а начиная с 1946 по 1958г., лептоспирозную вакцину готовили из трех серотипов (гриппотифоза, помона, иктерогеморрагия). В дальнейшем в соавторстве с А.Г. Малявиным для приготовления вакцины стали использовать еще два серотипа (каникола и тарасови).

Сейчас для активной иммунизации животных используют поливалентную депонированную вакцину ВГНКИ, выпускаемую в двух вариантах (различное сочетание серогрупп лептоспир).

Противолептоспирозные вакцины применяют как для профилактики, так и при проведении вынужденной вакцинации животным в возрасте от 1месяца и старше в неблагополучных, откормочных и угрожаемых по лептоспирозу хозяйствах, при выпасе животных в зоне природного очага болезни, при выявлении в хозяйстве животных, сыворотка крови которых реагирует на лептоспироз по РМА или РА, и в районах с отгонным животноводством. Специалисты при проведении вакцинации должны учитывать то, что крупный рогатый скот, буйволов, коз, свиней и лошадей нельзя вакцинировать в последнею неделю беременности и в первую неделю после родов, а собак, лисиц и песцов — во вторую половину беременности. Иммунитет у привитых животных наступает через 14 дней и продолжается до года. Сыворотку крови от вакцинированных животных не исследуют на лептоспироз в течение 2-3 месяцев после вакцинации.

Для пассивной иммунизации применяют поливалентную сыворотку против лептоспироза сельскохозяйственных и промысловых животных. Владельцам животных необходимо помнить, что сыворотка, как и вакцина, не освобождает организм животных от лептоспироносительства; и не может профилактировать наступление абортов у зараженных животных.

Меры борьбы. Борьба с лептоспирозом проводится согласно ветеринарных правил ВП 13.3. 1310-96 утвержденных Начальником Департамента ветеринарии Министерства сельского хозяйства и продовольствия Российской Федерации — Главным государственным ветеринарным инспектором Российской Федерации В. М. Авиловым 18июня 1996г. и Санитарных правил СП 3.1. 091-96, утвержденных первым заместителем председателя Госкомсанэпиднадзора России — заместителя Главного государственного санитарного врача Российской Федерации. С.В. Семеновым 31 мая 1996г.

При установлении диагноза лептоспироз Постановлением Губернатора области выносится решение об объявлении хозяйства (отдельной его части), населенного пункта неблагополучным по лептоспирозу, вводятся ограничения и утверждается план оздоровления хозяйства.

В плане оздоровительных мероприятий предусматриваются необходимые диагностические исследования животных, ограничительные, ветеринарные, санитарные, организационно-хозяйственные мероприятия с указанием сроков проведения и ответственных лиц.

По условиям ограничений запрещается:

выводить (ввозить) животных для целей воспроизводства, продавать животных населению;
перегруппировывать животных без ведома ветеринарного специалиста, обслуживающего хозяйство;
допускать животных к воде открытых водоемов и использовать ее для поения и купания животных;
выпасать невакцинированных животных на пастбищах, где выпасались больные лептоспирозом животные, или на территории природного очага лептоспироза;
скармливать невакцинированным животным корма, в которых обнаружены инфицированные лептоспирами грызуны.

Молоко, полученное от больных лептоспирозом животных, нагревают до кипения и используют в корм. Молоко клинически здоровых коров, сыворотка крови которых дает положительную РМА без нарастания титра, используют без ограничений.

В неблагополучном по лептоспирозу хозяйстве (ферме, отделении, стаде, свинарнике, и т.д.) проводят клинический осмотр и измерение температуры тела у подозрительных по заболеванию животных.

Больных и подозрительных по заболеванию животных изолируют, лечат гипериммунной сывороткой и антибиотиками в дозах, указанных в наставлениях по их применению.

Клинически здоровых животных всех видов и возрастных групп, восприимчивых к лептоспирозу, вакцинируют. Животных, подвергнутых лечению, вакцинируют через 5-7дней после выздоровления.

Всех животных откормочных хозяйств, неблагополучных по лептоспирозу, и малоценных животных в племенных и пользовательных хозяйствах откармливают и сдают на убой.

Маточное поголовье, производителей и ремонтный молодняк, которые необходимо сохранить для воспроизводства, после вакцинации обрабатывают лептоспироцидными препаратами и переводят в продезинфицированное помещение.

Эффективность обработки проверяют через 10-15дней путем микроскопии мочи.

Молодняк, полученный после проведения мероприятий, выращивают отдельно, вакцинируют в сроки, предусмотренные наставлением по применению вакцины против лептоспироза и, после снятия ограничений, реализуют на общих основаниях.

Вывод животных для откорма разрешается в пределах области (края, республики) через месяц после последнего случая выздоровления животного, проведения вакцинации и заключительных ветеринарно-санитарных мероприятий.

У производителей (быки, хряки, жеребцы, бараны) инфицированных лептоспирами ( положительная реакция РМА, лептоспиры в моче), прекращают получать сперму и, исходя из хозяйственной целесообразности, направляют их на убой или обрабатывают стрептомицином и проводят дезинфекцию помещения. Все поголовье вакцинируют против лептоспироза. Через 10-15 дней эффективность лечения контролируют путем микроскопии мочи. При обнаружении лептоспир в моче повторяют курс лечения и проверку его эффективности. От быков, признанных здоровыми, продолжают брать сперму. Сперму, полученную от быков — лептоспироносителей, уничтожают.

Повторное исследование сыворотки крови в РМА и микроскопию мочи всех производителей на ранее неблагополучном по лептоспирозу предприятии (станции) проводят через 3 месяца и при получении отрицательных результатов далее каждые 6месяцев.

Производителей на предприятиях (станциях, пунктах) искусственного осеменения, расположенных в неблагополучной или угрожаемой по лептоспирозу зоне, вакцинируют против лептоспироза.

Ограничения в неблагополучных по лептоспирозу хозяйствах снимают в следующем порядке:

в откормочных хозяйствах-после сдачи поголовья на убой и проведения заключительных ветеринарно-санитарных мероприятий;
в племенных и пользовательных хозяйствах — после установления их благополучия по лептоспирозу лабораторными методами исследований. Для этой цели через 1-2 месяца после проведения мероприятий исследуют в РМА не менее 50 проб сыворотки крови молодняка, предназначенного для продажи (не должно быть положительных реакций), и не менее 100 проб мочи от каждой 1000 взрослых животных или группы ремонта, среди которых не должно быть лептоспироносителей; РМА у взрослых животных может оставаться положительной;
повторные исследования на лептоспироз в ранее неблагополучных хозяйствах проводят через 6 месяцев после снятия ограничений;
хозяйство считается оздоровленным при получении отрицательных результатов исследований у всех обследованных животных.

В целях недопущения заболевания животных лептоспирозом собственники и владельцы скота, ветеринарные специалисты обязаны выполнять следующее:

Читайте также: