Золотым стандартом в выявлении микобактерий туберкулеза является метод

Обновлено: 28.03.2024

Лабораторная диагностика туберкулеза. Выявление бактерий туберкулеза.

В распознавании и дифференциальной диагностике туберкулеза, а также в определении эффективности проводимого лечения важную роль играют лабораторные методы исследования. Среди них большое значение имеют прежде всего способы обнаружения микобактерии туберкулеза в различных выделениях, воспалительных экссудатах, жидкостях и тканях организма больного.

При туберкулезе легких микобактерии находят прежде всего в мокроте. Частота, массивность и постоянство бацилловыделения зависят от формы процесса. Оно часто имеет место при инфильтративном и особенно деструктивном туберкулезе легких. Реже или периодически выделяют микобактерии больные очаговыми, диссеминированными и цирротическими формами туберкулеза без явного распада легочной ткани. Существенное значение имеет при этом состояние бронхов. При их специфическом поражении, но сохраненной дренажной функции микобактерии выявляются с мокротой сравнительно чаще и с большим постоянством, чем при нормальном состоянии бронхов или при их стенозе, вызывающем блокаду каверны.

Микобактерии туберкулеза находят в большом количестве в обильно выделяющейся мокроте, а в скудном отделяемом, наоборот, они встречаются реже и в виде единичных экземпляров. У больных, не выделяющих мокроту, лучшие результаты дает применение раздражающих аэрозольных ингаля пий 10—15% раствора поваренной соли в 1% растворе питьевой соды Н. М. Рудой и соавт. (1971) применяют с этой целью смесь, состоящую из 5 мл 10% раствора хлорида натрия, 1 мл химопсина, растворенного в физиологическом растворе, и 20 капель солутана.

Второе место по эффективности выявления бацилловыделения у больных, не выделяющих мокроту, занимает исследование промывных вод трахеи и бронхов, которое предложил Я. С. Зобин (1939). В настоящее время для анестезии гортани у взрослых применяют 0,25% раствор дикаина, разведенный в 10% растворе новокаина. Этот раствор наливают во время фонации на голосовые связки в количестве 0,5—1 мл. У больных с повышенным глоточным рефлексом этим раствором смазывают заднюю стенку глотки. Затем в трахею шприцем с напаянной канюлей вводят 10—20 мл физиологического раствора комнатной температуры.

При этом в результате раздражения слизистой оболочки бронхов возникает кашель, при котором из глубоких дыхательных путей вместе с введенной жидкостью выделяются слизь и мокрота. Это отделяемое исследуют на присутствие микобактерии туберкулеза или другой микробной флоры.

диагностика туберкулеза

Исследование промывных вод бронхов редко сопровождается серьезными осложнениями. Только при сильном, длительном и приступообразном кашле иногда появляется кровохарканье, может аспирироваться инфекционный материал в здоровые участки легочной ткани, нарастает сердечная недостаточность. Такие явления отмечаются главным образом у больных с сопутствующей бронхиальной астмой, пороком сердца, гипертонией. В подобных случаях, очевидно, не следует прибегать к данному методу исследования. При отсутствии таких противопоказаний, особенно у больных с ограниченными формами процесса, у которых чаще всего и возникает необходимость в исследовании промывных вод бронхов, обычно не наблюдается каких-либо осложнений, и поэтому его можно производить не только в клинических, но и в амбулаторных условиях.

Менее эффективно производимое натощак исследование промывных вод желудка, в которых может содержаться бациллярная мокрота или бронхиальная слизь, чаще заглатываемая детьми, а иногда и взрослыми (Аrmand-Dellille, 1927). Кроме того, микобактерии могут проникать в желудок через его слизистую оболочку при гематогенном распространении инфекции в организме, а также при забрасывании бациоллосодержащей желчи (М. Д. Розанова, 1950). Пользоваться этим методом рекомендуется в тех случаях, когда не удается получить мокроту при раздражающих ингаляциях, при противопоказаниях к применению промывания бронхов или при невозможности их проведения по другим причинам.

Наименее информативно определение бацилловыделения с помощью исследований мазков слизи из гортани, а также промывания только верхних отделов дыхательных путей.

У части больных можно выделить микобактерии из крови. По наблюдениям 49 авторов, обобщенным в 1954 г. Dalencour, бациллемия отмечалась в среднем у 5,3% больных различными формами туберкулеза. П. И. Беневоленский (1945) установил ее у 3,7% больных туберкулезом легких (исключая страдающих гематогенным процессом). Чаще обнаруживают микобактерии в крови при туберкулезе кожи, обширных гематогенных диссеминациях в легких, при менингите. Однако, по сводным данным Kallos (1937). основанным на изучении гемокультур, выделенных от 14 502 больных, туберкулезная бациллемия имела место всего лишь у 1,13% из них.

Частота выявления микобактерии зависит не только от формы заболевания, метода получения материала, но и от способа его исследования (бактериоскопия, посев, заражение животных). Микобактерии туберкулеза обнаруживают при прямой бактериоскопии мазков мокроты, окрашенных по Цилю—Нельсену, при микроскопии с использованием метода обогащения — флотации и люминесцентного способа исследования. Методы обогащения повышают частоту обнаружения микобактерии туберкулеза в мокроте, промывных водах желудка и бронхов, в экссудате, спинномозговой жидкости, в каловых массах на 10—20% по сравнению с результатами прямой бактериоскопии.

Среди бактериоскопических методов выявления бацилловыделения наиболее чувствительным является люминесцентная микроскопия, повышающая возможность обнаружения в мокроте микобактерии на 15—20% по сравнению с обычной бактериоскопией, а при исследовании мазков из флотационных колец — на 8—10%. При этом облегчается изучение некоторых биологических свойств возбудителя — старения культур, аутолиза клеток и др.

Некоторые авторы утверждают, что при флюоресцентной (люминесцентной) микроскопии микобактерии туберкулеза можно выявить даже чаще, чем при посевах мокроты и других материалов на различные питательные среды. Kolbel (1955) обнаружил их при простой бактериоскопии у 39,7% больных, при бактериологическом методе — у 52,1%, а при люминесцентной микроскопии — у 73,6%. На преимущество последнего метода указывают Т. Н. Ященко и И. С. Мечева (1973), Н. С. Страхов и соавт. (1973).

Для суждения об эффективности проводимой антибактериальной терапии придают прогностическое значение уменьшению (или сохранению) в динамике массивности бацилловыделения. Поэтому целесообразно не только констатировать бацилловыделение, но и оценивать его количественный показатель. При этом при бактериоскопии бацилловыделение оценивается как обильное, если находят микобактерии в каждом поле зрения, умеренное — при наличии «единичных микробов в 40—50 полях зрения и скудное — при нахождении их единичных экземпляров в препарате.

Выявление – составная часть борьбы с туберкулезом. Для выявления и диагностики туберкулеза применяются различные методы (туберкулинодиагностика, рентгено-флюорографические, бактериологические), но наиболее информативным, быстрым и экономичным является бактериоскопия мокроты по Цилю – Нельсену у лиц с симптомами, подозрительными на туберкулез (кашель с выделением мокроты более 3 нед, кровохарканье, боли в грудной клетке, потеря массы тела) и рентгенография грудной клетки.

To detect tuberculosis is part of its control programme. For identification and diagnosis of the disease, different (tuberculin diagnostic, X-ray, fluorographic, and bacteriological) methods are used, but the most informative, rapid, and cost-effective ones are Ziehl-Neelsen’s sputum bacterioscopy in individuals with signs of suspected tuberculosis (over 3-week productive cough, hemoptysis, chest pain, weight loss) and chest X-ray.

В.В. Пунга — доктор мед. наук, руководитель отдела Центрального НИИ туберкулеза РАМН, Москва
V.V. Punga — MD, Head of Department, Central Research Institute of Tuberculosis, Russian Academy of Medical Sciences, Moscow

В ыявление – составная часть борьбы с туберкулезом, направленная на идентификацию случаев туберкулеза в обществе. Выявление больных туберкулезом осуществляется медицинским персоналом учреждений общей лечебной сети при обследовании пациентов, обратившихся за медицинской помощью, а также при плановых профилактических обследованиях определенных групп населения.
Основными методами выявления туберкулеза остаются:
– туберкулинодиагностика;
– рентгенофлюорографические обследования;
– бактериологическая диагностика.
Все эти методы, каждый в отдельности или в комбинации, применяются у разных групп населения: туберкулинодиагностика – у детей и подростков; профилактические флюорографические обследования – у лиц старше 15 лет; бактериологические, рентгенологические обследования, туберкулинодиагностика – у лиц с повышенным риском заболевания туберкулезом, находящихся на диспансерном учете, обращающихся в поликлиники и поступающих в стационар на лечение с симптомами заболевания, подозрительными на туберкулез. Туберкулез поражает различные органы и системы, поэтому для диагностики внелегочного туберкулеза применяются специальные методы обследования в зависимости от локализации заболевания.
Одним из приоритетных направлений в системе противотуберкулезных мероприятий в сложившихся социально-экономических условиях является выявление туберкулеза в учреждениях общей лечебно-профилактической сети среди лиц, обратившихся за медицинской помощью. У всех лиц с симптомами, подозрительными на туберкулез органов дыхания (кашель с мокротой более 2 – 3 нед, боли в грудной клетке, потеря массы тела, субфебрильная температура, потливость, кровохарканье), необходимо исследовать мокроту на микобактерии туберкулеза (МБТ) методом микроскопии мазка по Цилю – Нельсену и провести рентгенографию (флюорографию) грудной клетки. Как показали исследования, проводимые в ряде территорий Российской Федерации (Ивановская, Томская области, республика Марий Эл), этот подход позволяет выявить более половины впервые заболевших туберкулезом органов дыхания с бактериовыделением, наиболее опасных в эпидемиологическом отношении, сократить сроки диагностики туберкулеза и время от первого обращения больного в медицинское учреждение до начала противотуберкулезного лечения. Исследования мокроты методом микроскопии мазка по Цилю – Нельсену необходимо осуществлять во всех клинико-диагностических лабораториях общей лечебной сети. Больных, у которых выявлены МБТ, следует направлять в противотуберкулезные диспансеры для дообследования, подтверждения диагноза туберкулеза, лечения и постановки на учет.
Бактериоскопический метод прост, экономичен и позволяет при положительном результате исследования мазка мокроты установить диагноз туберкулеза органов дыхания. Бактериоскопическому обследованию подлежат обратившиеся в медицинское учреждение лица:
– с явными симптомами заболевания;
– с наличием продолжительного (более 3 нед) кашля с выделением мокроты, кровохарканьем и болями в грудной клетке;
– контактировавшие с бациллярными больными туберкулезом;
– имеющие рентгенологические изменения в легких, подозрительные на туберкулез.
Выявление больных туберкулезом легких бактериоскопическим методом должно осуществляться во всех клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений общей сети: взрослых и детских поликлиниках, республиканских, краевых, областных, городских и центральных районных больницах, клиниках научно-исследовательских институтов, участковых больницах и сельских врачебных амбулаториях, психиатрических больницах, медико-санитарных частях пенитенциарных учреждений и др. Как минимум 3 мазка мокроты необходимо исследовать в лаборатории методом микроскопии по Цилю – Нельсену на кислотоустойчивые бактерии. Первую и вторую пробы мокроты берут в присутствии медицинского работника в день обращения пациента (с промежутком 1,5 – 2 ч), затем ему выделяют посуду для сбора утренней мокроты перед вторым посещением врача. Для получения положительного результата важно правильно организовать сбор мокроты, который следует проводить в отсутствии посторонних людей в отдельной, хорошо проветриваемой комнате. Пациенту необходимо объяснить, как следует откашливать мокроту из более глубоких отделов легких. В поликлинике или больнице все медицинские сестры должны быть обучены методике сбора мокроты. Больной должен откашливать мокроту в присутствии медицинской сестры. Следует попросить больного сделать несколько глубоких вдохов и покашлять в емкость, после чего проверить наличие в емкости мокроты. Если больной не может откашлять мокроту или она отсутствует, материал для исследования можно получить с помощью раздражающих ингаляций, промывания бронхов и желудка.
В первый же день необходимо сделать рентгенографию грудной клетки. В отдельных случаях (например, когда больной живет далеко от лечебного учреждения или ему трудно добираться до него, или его состояние неудовлетворительное) пациента можно госпитализировать на 2 – 3 дня для обследования. В некоторых отдаленных населенных пунктах более целесообразно обучить фельдшеров или других медицинских работников правильному сбору мокроты, консервации и быстрой доставке ее в ближайшую клинико-диагностическую лабораторию; можно также обучить персонал приготовлению мазков мокроты, высушиванию, фиксации с последующей доставкой в ближайшую лабораторию для окрашивания и исследования. Необходимо исследовать не менее 100 микроскопических полей зрения. Если кислотоустойчивые бактерии не обнаружены в 100 полях зрения, необходимо исследовать дополнительно еще 100 полей.
У взрослых диагноз туберкулеза легких подтверждается обнаружением МБТ в мокроте. У детей до 10 лет в связи с трудностью получения мокроты исследуют промывные воды желудка или мазок из гортани. Процедуру проводят рано утром натощак, полученное содержимое собирают в стерильную посуду и направляют в лабораторию для бактериоскопического и культурального исследования.
Чтобы предупредить заражение туберкулезом при сборе мокроты, медицинский работник обязан быть в шапочке, маске, клеенчатом фартуке и резиновых перчатках. Меры предосторожности также должны применяться при хранении и доставке мокроты в лабораторию на исследование. Для хранения и перевозки используют специальные контейнеры или металлические биксы. Если первые мазки оказались положительными, а больной не пришел к врачу повторно, его следует срочно разыскать и вызвать для дообследования, установления диагноза и направления на лечение.
Кроме микроскопии мазка мокроты, окрашенного по Цилю – Нельсену, в лабораториях, оснащенных люминесцентными микроскопами, возможно исследование материала методом люминесцентной микроскопии. Необходимо обязательно проводить посев мокроты на питательные среды у всех больных, так как у части больных МБТ выявляются только культуральным методом. Посев мокроты или другого материала на выделение возбудителя туберкулеза осуществляют в специализированных лабораториях противотуберкулезных учреждений.
Посев мокроты или другого материала (крови, промывных вод желудка, бронхоальвеолярных смывов, плевральной жидкости) повышает число положительных результатов, которые становятся известными через 4 – 8 нед. В настоящее время существуют методы, которые позволяют сократить длительность выявления МБТ: применение сред для бифазного посева, системы БАКТЕК-460, сокращающие в среднем наполовину сроки роста МБТ. Использование системы БАКТЕК-460 технически просто и позволяет идентифицировать МБТ, определить их лекарственную чувствительность в течение недели.
Кроме прямых методов диагностики туберкулеза (бактериоскопия, культуральный метод), используют и непрямые, основанные на серодиагностике и определении в исследуемом материале нуклеиновых кислот МБТ (полимеразно-цепная реакция – ПЦР). Данные, касающиеся чувствительности и специфичности ПЦР, не позволяют еще в настоящее время использовать этот метод в широкой практике. Микроскопическое исследование патологического материала остается пока наиболее быстрым, чувствительным и дешевым методом, позволяющим установить диагноз туберкулеза.
Активный метод выявления туберкулеза, основанный на массовом рентгенофлюорографическом обследовании населения, для большинства территорий в настоящее время крайне затруднен вследствие его высокой стоимости, изношенности аппаратуры и недостаточной результативности. Проведенный в Ивановской области анализ соотношения стоимости – эффективности выявления случая туберкулеза показал, что на выявление больного по обращаемости затрачивается $ 1590, а при профилактическом осмотре – $ 4000. Сплошные профилактические флюорографические обследования всего населения в возрасте 15 лет и старше, проводимые в прежние годы, в настоящее время также могут быть осуществлены по эпидемиологическим показаниям и при достаточных ресурсах. Профилактические флюорографические обследования для активного выявления туберкулеза в настоящее время следует использовать среди отдельных групп населения, где наиболее часто выявляется туберкулез. Рентгенофлюорографический метод в основном позволяет выявить все случаи “абациллярного” туберкулеза легких (в настоящее время регистрируется 45 – 50% случаев).
Туберкулинодиагностика является основным методом раннего выявления инфицирования туберкулезом детей и подростков. Туберкулинодиагностика как специфический диагностический тест применяется при массовых обследованиях населения на туберкулез, а также в клинической практике для диагностики туберкулеза. Для этих целей используется единая внутрикожная туберкулиновая проба Манту с 2 туберкулиновыми единицами (ТЕ) очищенного туберкулина PPD-L. Ежегодная постановка пробы Манту с 2 ТЕ позволяет своевременно выявить лиц с гиперергическими и усиливающимися реакциями на туберкулин, у которых высок риск заболевания, возможны начальные и локальные формы туберкулеза. Проба Манту считается положительной при размере папулы более 5 мм.
Массовую туберкулинодиагностику среди детей и подростков, посещающих детские ясли, сады, школы, колледжи, проводят специальными бригадами (2 медсестры и врач), сформированными при детских поликлиниках. Детям раннего и дошкольного возраста, не посещающим детские учреждения, пробу Манту ставят в детской поликлинике, а в сельской местности ее производят медицинские работники районных сельских больниц и фельдшерско-акушерских пунктов. При правильной организации мероприятий по раннему выявлению туберкулеза ежегодно туберкулинодиагностикой должно охватываться 90 – 95% детского и подросткового населения административной территории.
Проба Манту с 2 ТЕ безвредна как для здоровых детей и подростков, так и для лиц с различными соматическими заболеваниями. Противопоказаниями для постановки туберкулиновой пробы являются кожные заболевания, аллергические состояния, эпилепсия, острые инфекционные заболевания и хронические заболевания в период обострения. В условиях массовой внутрикожной вакцинации (ревакцинации БЦЖ) проба Манту 2 ТЕ выявляет как послевакцинную, так и инфекционную аллергию. Систематическое проведение детям и подросткам внутрикожных туберкулиновых проб позволяет установить первичное инфицирование и осуществлять поиск очага туберкулезной инфекции среди взрослых.
Таким образом, в настоящее время для выявления больных туберкулезом применяются различные методы. Наиболее информативными, простыми, достоверными и экономичными являются бактериоскопическое исследование мокроты у лиц с симптомами, подозрительными на туберкулез (кашель с выделением мокроты более 3 нед, боли в грудной клетке, кровохарканье, потеря массы тела), рентгенография грудной клетки и туберкулинодиагностика у детей и подростков.

1. Джон Крофтон, Норман Хорн, Фред Миллер. // Клиника туберкулеза. – М., 1996.
2. Диагностика туберкулеза легких бактериоскопическим методом. Метод указания МСБТЛЗ. – Париж, Франция, 1995.

В соответствии с современными программами ВОЗ, основой выявления туберкулёза за рубежом считают проведение микроскопии мазков мокроты, полученной от кашляющих больных, обратившихся к врачам общей практики; мазки окрашивают по Цилю-Нильсену. Эта методика входит в отечественный поликлинический и клинический минимум обследования пациента, выделяющего мокроту. В 1995 г. Минздравмедпром России в приказе № 8 "О развитии и совершенствовании деятельности лабораторной клинической микробиологии (бактериологии) лечебно-профилактических учреждений" подтвердил эту обязанность клинико-диагностических лабораторий. Обязательное бактериологическое исследование мокроты на М. tuberculosis должно быть организовано для нетранспортабельных больных, больных хроническими заболеваниями органов дыхания и мочевыводящей системы, а также для работников неблагополучных по туберкулёзу животноводческих хозяйств. Этот старейший метод полностью сохраняет свое значение вследствие доступности для практических клинико-диагностических лабораторий, низкой стоимости и быстроты выполнения.

При бактериоскопии мазка, окрашенного по Цилю-Нильсену, микобактерии туберкулеза могут быть обнаружены при наличии не менее 100 000 - 1 000 000 бактериальных клеток в 1 мл патологического материала (мокроты). Такое большое количество микобактерий встречается у больных с далеко зашедшими прогрессирующими формами заболевания (диссеминированными и фиброзно-кавернозными). У значительно большего числа больных количество выделяемых ими микобактерий ниже предела метода бактериоскопии, что и является большим минусом этого метода. Только при идеальном выполнении всех требуемых условий, указанных в Приказе № 109 МЗ РФ,-исследование не менее трех проб диагностического материала, правильный сбор мокроты, наличие современного бинокулярного микроскопа и высококачественных реактивов, просмотр до 300 полей зрения - возможно повышение чувствительности до 10000 микробных клеток.

Микобактерии туберкулёза имеют вид тонких, слегка изогнутых палочек различной длины с утолщениями на концах или посередине, располагаются группами и поодиночке (рисунок 1,а) Окрашенные по Цилю-Нильсену мазки микроскопируют с иммерсионной системой не менее 10 мин.

Люминесцентная микроскопия

Метод основан на проникновении в микробную клетку карболового производного флюоресцентного красителя (аурамина, родамина). При окраске флюоресцентным красителем аурамином-родамином микобактерии можно видеть при неиммерсионном 100-кратном увеличении. Более точен результат при окраске по Цилю-Нильсену карболфуксином и иммерсионной микроскопии при 1000-кратном увеличении. Именно окраска мазка по Цилю-Нильсену рекомендована при применении технологий DOTS. Микобактерии в этом случае выглядят светящимися желтыми палочками (рисунок 1, б). Метод имеет неоспоримые преимущества, так как позволяет при меньшем увеличении микроскопа просмотреть фактически весь мазок, так же этот метод экономически более эффективен, так как уменьшается время, затрачиваемое на просмотр мазков.

К недостаткам метода ЛМ следует отнести значительно более высокую стоимость люминесцентного микроскопа, при процедуре окрашивания- соблюдение и коррекция pH мазка, а также освобождение микобактерий в диагностическом материале (особенно в мокроте) от окружающей их слизи, которая препятствует проникновению флуоресцентного красителя в микробную клетку. Поэтому нецелесообразно использование ЛМ для нативной мокроты, но применять этот метод рекомендуется при исследовании мазков, приготовленных после центрифугирования из осадка материала, обработанного для культурального исследования и нейтрализованного после деконтаминации. Поэтому метод ЛМ следует применять в бактериологических лабораториях, где культуральное и микроскопическое исследование может быть произведено из одной и той же порции диагностического материала.

При гистологическом или цитологическом исследовании иногда можно обнаружить характерные для туберкулёза клетки, являющиеся результатом защитной реакции организма на внедрение туберкулёзной палочки. Наличие в цитограмме гигантских клеток Лангханса с несомненностью решает диагноз туберкулёза. Эти клетки имеют очень большие размеры (80 - 90 мкм и более в диаметре). Цитоплазма окрашена в серо-голубой цвет. По её периферии расположено в ряд большое количество ядер (до 20), расположенных в форме кольца (рисунок 1, в).

Другим признаком туберкулёза является присутствие в препарате так называемых эпителиоидных клеток, из которых и развиваются клетки Лангханса. Это происходит при увеличении количества ядер без разделения цитоплазмы, которая только увеличивается в размерах (рисунок 1, г).

Микроскопия позволяет быстро получить результат, но обладает низкой чувствительностью и специфичностью, невозможностью дифференциации кислотоустойчивых микобактерий.

Рисунок 1

Микобактерии туберкулеза
а - метод окраски по Цилю-Нельсену
б - метод люминисцентной микроскопии
в - клетки Лангхаса
г - эпителиоидные клетки

Культуральный метод

Исторически сложилось, что питательные среды на яичной основе (Левенштейна-Йенсена, Финна-2, Огавы, Аникина, "Новая", Попеску) получили наибольшее распространение среди плотных питательных сред, применяемых для выделения МБТ. Посев материала на среду Левенштайна-Йенсена проводят в бактериологической лаборатории. Рост первых колоний на классических средах отмечают через 4 - 8 недель. Однако появившиеся в последние годы агаровые среды Миддлбрука (7Н10, 7Н11) позволяют быстрее обнаружить рост микобактерий (от двух до четырех недель) и обеспечивают лучшие возможности для изучения морфологии колоний, чем на яичных средах. Недостатком агаризованных питательных сред является необходимость инкубации посевного материала в термостате с углекислым газом, поэтому агаризованные среды в России практически не применяются.

Следует отметить, что в связи с высокой избирательностью различных штаммов микобактерий и потребностью в полноценных белках до сих пор нет универсальной питательной среды, способной заменить все остальные. В Приказе № 109МЗ РФ для посева диагностического материала на МБТ рекомендуется использовать по одной пробирке международной питательной среды Левенштейна-Йенсена и Финна-2. Однако практика показывает, что кроме указанных сред целесообразно использовать и какую-либо из дополнительных, а посев на три пробирки питательной среды также повышает эффективность культуральной диагностики.

Для полноценной культуральной диагностики туберкулеза необходимо иметь соответствующие помещения и оборудование. Особенно важно наличие центрифуги и антиаэрозольной защитой и способностью обеспечить ускорение 3000g. А также шкафов биологической безопасности для предотвращения внутрилабораторного инфицирования.

Основным недостатком культуральной диагностики туберкулеза является длительность исследования - от трех недель до трех месяцев. Поэтому остаются актуальными дальнейшие исследования по разработке методов ускорения роста микобактерий.

Системы BACTEC

Культуральная диагностика туберкулеза переживает в настоящее время принципиальные изменения, связанные с внедрением в практику полностью автоматизированных систем культивирования МБТ. Главное отличие этих методов - применение жидких питательных сред для культивирования с последующей радиометрической (BACTEC 460), колорометрической (Mb-Bact, Вас- tALERT) и люминесцентной детекцией роста (BACTEC MGIT 960). Рост МБТ на жидкой питательной среде в этих системах удается обнаружить уже через 1 - 2 недели в зависимости от их исходного количества в диагностическом материале. Частота выявления микобактерий так же несколько выше, чем на плотных питательных средах. Автоматизированные системы BACTEC с использованием соответствующих флаконов, содержащих различные противотуберкулезные препараты, позволяют сократить время исследования лекарственной устойчивости микобактерий до 10 - 14 суток.

Из перечисленных автоматизированных систем наиболее эффективна в настоящее время система BACTEC MGIT 960BD. Флаконы MGIT с жидкой питательной средой 7Н9 содержат в придонной части под силиконом флуоресцентный индикатор, "погашенный" высокими концентрациями кислорода. При наличии роста микобактерий в процессе поглощения кислорода индикатор начинает светиться, регистрация флуоресценции в сисиеме BACTEC MGIT производится автоматически. Использование флаконов MGIT возможно и "вручную", тогда регистрацию свечения производят с помощью трансиллюминатора на флаконах MGIT составляет 11 суток.

Основным недостатком BACTEC MGIT, как и других систем BACTEC, является высокая стоимость оборудования (до 100000 долларов США) и флаконов с питательной средой - посев одной пробы диагностического материала стоит до 400 рублей.

Посев на L -формы микобактерий

Так называемые дефектные по клеточной стенке L-формы микобактерий и других инфекционных патогенов являются результатом изменчивости и основным видом персистирования, то есть переживания в неблагоприятных условиях. Посев на L-формы особенно эффективен при внелегочном туберкулезе, поскольку вегетация МБТ в очагах ВЛТ при повышенном ацидозе и анаэробиозе приводит к снижению их жизнеспособности и ферментативной активности.

Диагноз не может быть поставлен только на основании выявления L-форм микобактерий, но их обнаружение, особенно при верификации методом ПЦР, является весомым аргументом в пользу туберкулезной природы заболевания. В очагах внелегочного туберкулеза наблюдается ранняя L-трансформация микобактерий, поэтому их обнаружение позволяет поставить диагноз на начальных стадиях заболевания.

Представлены результаты сравнения диагностических возможностей автоматизированной системы BACTEC MGIT 960 с использованием жидкой питательной среды для выделения МБТ и определения лекарственной чувствительности МБТ к противотуберкулезным препаратам с традиционными методами культуральный диагностики на плотных питательных средах Левенштейна - Йенсена. Автоматизированная система ВАСТЕС MGIT 960 сокращает сроки выделения МБТ из диагностического материала в среднем до 10-20 дней, уменьшает длительность определения лекарственной чувствительности МБТ до 6-15 дней с момента выделения культуры и имеет специальный набор реактивов для тестирования чувствительности МБТ к пиразинамиду.

These are the comparison results of diagnostic possibilities of automated system BACTEC MGIT 960 using liquid TB medium and detection of MTB susсeptibility to TB drugs and traditional methods of cultural diagnostics with solid medium . Automated system BACTEC MGIT 960 reduces the terms of MTB growth up to 10-20 days in average and the terms of detection of MTB susсeptibility to TB drugs up to 6-15 days from the date of culture detection. There is a special range of reagents for MTB susceptibility topyrazinamid.

Принципиально новый уровень бактериологической диагностики туберкулеза достигнут внедрением в практику автоматизированных систем бульонного культивирования для ускоренного выявления микобактерий BACTEC MGIT 960 ("Becton Dickinson") и MB/BacT ("Organon Teknika"), позволяющих выявлять рост культуры в диагностическом материале в течение 10 - 20 дней [7; 4].

Автоматизированная система BACTEC MGIT 960 зарекомендовала себя надежным методом микробиологической диагностики туберкулеза как в мире, так и во многих регионах России [1, 2, 4, 5, 7, 10, 11, 13]. Эталонные исследования эффективности использования автоматизированных систем культивирования на жидких питательных средах BACTEC MGIT 960 и их преимуществ по сравнению с традиционным методом посева на плотные среды проведены в Московском городском научно - практическом Центре борьбы с туберкулезом под руководством доктора медицинских наук В. И. Литвинова [4, 7].

По данным авторов, чувствительность автоматизированной системы ВАСТЕС MGIT 960 по выделению культур МБТ оказалась на 10% выше традиционного способа посева на среду ЛЙ. Система BACTEC MGIT 960 продемонстрировала также более высокую высеваемость МБТ из бактериоскопически негативного материала, примерно на 15%, по сравнению с плотными средами. Для бактериоскопически позитивного материала чувствительность жидких и плотных сред для культивирования оказалась идентичной [4].

По данным зарубежных исследователей, в автоматизированной системе ВАСТЕС MGIT 960 удалось получить примерно на 2,2 - 4% больше изолятов МБТ из образцов мокроты, чем на плотной среде ЛЙ [10, 13]. Внедрение в практику бактериологических систем типа BACTEC MGIT 960 позволило сократить сроки выделения культуры МБТ. В среднем период культивирования образца на ВАСТЕС MGIT 960 составил 11 - 15, на плотной среде - 20 - 28 дней [2, 8, 13].

Автоматизированная система BACTEC MGIT 960 позволила за относительно короткий период времени - в среднем за 2 недели − исследовать выделенные культуры микобактерий туберкулеза на чувствительность к противотуберкулезным препаратам (ПТП) первого ряда, в том числе к пиразинамиду [5, 7, 8]. Традиционным для определения лекарственной чувствительности (ЛЧ) к основным ПТП в России являлся метод абсолютных концентраций на плотной среде ЛЙ [9]. Система BACTEC MGIT-960 показывала значительное совпадение результатов тестирования чувствительности МБТ к антибактериальным препаратам с результатами, полученными методом абсолютных концентраций. Для рифампицина и изониазида совпадение данных о наличии чувствительных или резистентных форм МБТ составило 98,5 и 98,25% соответственно, для стрептомицина - 97,26, для этамбутола - 93,77%. При этом сроки получения результатов теста ЛЧ в автоматизированной системе BACTEC MGIT 960 составили от 4 до 13, тогда как по методу абсолютных концентраций - от 21 до 26 суток, что очень важно для своевременного и правильного выбора схемы противотуберкулезной терапии [4, 6].

Цель исследования: сравнить диагностические возможности автоматизированной системы BACTEC MGIT 960 по выделению МБТ и определению лекарственной чувствительности МБТ к ПТП с традиционными методами культуральный диагностики на плотных питательных средах ЛЙ, на основе данных, полученных в микробиологической лаборатории Республиканского противотуберкулезного диспансера в 2008 году и первом полугодии 2009 года.

Материалы и методы.В 2007 году микробиологическая лаборатория Республиканского противотуберкулезного диспансера в соответствии с проектом Международного банка реконструкции и развития была оснащена автоматизированной системой для экспресс - диагностики МБТ BACTEC MGIT 960 ("Becton Dickinson", США). Прибор BACTEC MGIT 960 состоит из трех секций, вмещающих 960 пробирок, это позволяет исследовать в течение года примерно 8 тыс. образцов диагностического материала. Прибор весит 351 кг и имеет небольшие габариты (92X135X85 см).

Возбудитель в автоматизированной системе BACTEC MGIT 960 выделяется на основе постоянного компьютерного мониторинга состояния бактериальной популяции. Основным компонентом системы является пробирка MGIT (Mycobacterial Growth Indicator Tube) с флюоресцентным индикатором роста, который находится под силиконом на дне пробирки и погашается высокими концентрациями кислорода, растворенного в среде. В системе используется обогащенная жидкая питательная среда Middlebrook 7H9. Размножающаяся микробная популяция активно поглощает кислород, высвобождая флюоресцентный компонент, который начинает светиться при ультрафиолетовом облучении. Технология MGIT предполагает периодическое (1 раз в час) ультрафиолетовое тестирование индикаторных пробирок с диагностическим материалом при помощи встроенного компьютера. На жидкокристаллическом дисплее в каждой секции специальные индикаторы высвечивают информацию о наличии положительных и отрицательных посевов. Прибор BACTEC MGIT 960 оценивает пробирку как позитивную, если количество живых микробов ней достигло 100 тыс. на 1 мл среды.

В системе BACTEC MGIT 960 для определения лекарственной чувствительности культур МБТ к ПТП используется набор индикаторных пробирок, содержащих препараты, которые крепятся на специальном носителе со штрих-кодом для непрерывного мониторинга скорости размножения культуры. Прибор оценивает рост микробной популяции, фиксируя его в специальных единицах роста GU (Grownth Unit), и определяет её статус: R (Resistant) - устойчивый и S (Susceptible) - чувствительный.

Лекарственная чувствительность в системе BACTEC MGIT 960 определяется как к низким, так и к высоким концентрациям основных ПТП: изониазид (INH), рифампицин (RIF), этамбутол (EMB) и стрептомицин (STR). Благодаря использованию в системе модифицированного бульона Middlebrook 7H9, который поддерживает рост МБТ при сниженной до 5,9 рН, система BACTEC MGIT 960 позволяет получить данные о чувствительности к пиразинамиду, который также является препаратом первого ряда, но не доступен для тестирования на плотных средах.

Для оценки диагностических возможностей автоматизированной системы BACTEC MGIT 960 исследовано 3310 клинических образцов на наличие МБТ, полученных из мокроты, промывных вод бронхов, плевральной жидкости больных, проходивших обследование и лечение в Республиканском противотуберкулезном диспансере в 2008 году и первом полугодии 2009 года.

Метод абсолютных концентраций на плотной среде ЛЙ для определения ЛЧ M. Тuberculosis использовали в соответствии с приказом Минздрава России №109 от 21.03.2003 [5].

Результаты и обсуждение.За указанный период из исследованных клинических образцов всеми методами получено 1313 культур МБТ, причем 94% выделены в автоматизированной системе ВАСТЕС MGIT 960, 76% показали рост на плотной среде ЛЙ (табл. 1).

Результативность системы ВАСТЕС MGIT 960 и плотных сред

Левенштейна - Йенсена по выделению культур МБТ

Система культивирования Количество изолятов с положительным результатом посева Количество изолятов с ложноотрицательным результатом посева
абс. % абс. %
Все системы 1313 100
BACTEC 960 1234 94 79 6
Плотная среда Левенштейна - Йенсена 998 76 317 24

Таким образом, ложноотрицательные результаты по выделению культуры МБТ в системе ВАСТЕС MGIT 960 имели место в 6% случаев, что в 4 раза меньше, чем классическим методом на среде ЛЙ, в которой данный показатель составил 24%. В результате сравнения данных культивирования чувствительность системы ВАСТЕС MGIT 960 оказалась в среднем на 18% достоверно выше, чем на плотной среде ЛЙ (p<0,05).

Распределение результатов детекции роста МБТ в различных системах культивирования,

в том числе среди негативных по мазку образцов

В+ - система BACTEC 960, положительный результат посева;

В- - система BACTEC 960, отрицательный результат посева;

L+ - плотная среда Левенштейна - Йенсена, положительный результат посева;

L- - плотная среда Левенштейна - Йенсена, отрицательный результат посева.

Из табл. 2 видно, что на двух средах одновременно рост МБТ дали 919 образцов (70%). Только в жидкой среде системы ВАСТЕС-960 культура МБТ была выделена в 22,2% образцов, исключительно на плотной среде ЛЙ удалось получить культуру в 5,5% случаев. Дополнительно детекция роста МБТ из негативных по мазку образцов показала, что, если на двух средах положительный результат посева удалось получить в 62,4% случаев, то использование системы ВАСТЕС MGIT 960 увеличило количество выделенных культур ещё на 26%. Однако выделенные 58 культур (8,7%) явились результатом культивирования только на плотной среде ЛЙ.

Высеваемость МБТ в системе BACTEC MGIT - 960 и на плотных средах

Левенштейна - Йенсена по результатам микроскопии мазка диагностических образцов

КУМ+ - результат микроскопии мазка положительный на наличие кислотоустойчивых микобактерий;

КУМ- - результат микроскопии мазка отрицательный на наличие кислотоустойчивых микобактерий.

Показательным стал сравнительный анализ высеваемости МБТ на двух исследуемых средах в зависимости от результата бактериоскопии мазка (табл.3). При оценке результативности культивирования образцы с положительным мазком показали рост культуры в системе ВАСТЕС MGIT 960 в 83,2, из негативных по мазку образцов высеваемость составила 23,6% случаев. На плотной среде ЛЙ рост культуры всех видов образцов был значительно ниже, чем на жидких средах: 67,1% из положительных по мазку образцов и 19,1% из бактериоскопически отрицательных образцов.

Таким образом, благодаря использованию автоматизированной системы ВАСТЕС-960 удавалось чаще выделять культуру МБТ по сравнению с плотными средами ЛЙ в среднем на 16% из положительных и на 4,5% из отрицательных по мазку образцов диагностического материала. На практике в количественном выражении эта разница в 4,5% при негативном мазке соответствовала 50 пациентам, у которых было подтверждено наличие бактериовыделения и диагностировано специфическое поражение органов дыхания, что указывало на неоспоримые преимущества автоматизированной системы ВАСТЕС MGIT 960 в диагностике туберкулеза.

При всех преимуществах бульонного культивирования в системе ВАСТЕС MGIT 960 осталась доля образцов, которые показали рост только традиционным методом посева на плотную питательную среду, в том числе в 8,7% случаев из негативных по мазку образцов. Таким образом, наиболее рациональным для практических лабораторий являлось параллельное выделение культуры в автоматизированной системе и на плотных яичных средах ЛЙ.

Сроки тестирования лекарственной чувствительности в автоматизированной системе к препаратам первого ряда составили в среднем от 6 до 15 дней, т. е. в 3 - 4 раза меньше, чем методом абсолютных концентраций, при этом через 6 дней результат был получен у 12% изолятов, через 10 дней - у 39, на 13 - 15-й день - у 49%.

Для анализа результатов определения ЛЧ было использовано 953 культуры МБТ, выделенные от больных туберкулезом на жидких средах системы ВАСТЕС MGIT 960. Полученные данные были сравнены с результатами тестирования на чувствительность этих же образцов к препаратам первого ряда методом абсолютных концентраций на среде ЛЙ (табл.4). Наибольшая согласованность данных наблюдалась для изониазида, рифампицина и стрептомицина, наименьшая - для этамбутола. Отсутствие совпадений или расхождения результатов для указанных лекарственных препаратов прослеживались только в 0,75 - 1,5% случаев. Значительное расхождение традиционно имело место в отношении этамбутола (5%) в пользу большей чувствительности системы ВАСТЕС MGIT 960, что обусловлено техническими трудностями приготовления смеси этого лекарственного препарата для плотной среды.

Результаты тестирования лекарственной чувствительности, полученные методом абсолютных концентраций на среде Левенштейна - Йенсена и в системе BACTEC-960

Препараты Всего результатов чувствительности Совпадение результатов (количество культур МБТ) Расхождение результатов (количество культур МБТ)
абс. % абс. %
INH 953 927 97,3 26 2,73
RIF 953 940 98,6 13 1,36
STR 953 925 97,1 28 2,94
EMB 953 906 95,1 47 4,93

Выводы.Сравнение эффективности использования автоматизированной системы ВАСТЕС MGIT 960 для выявления и определения ЛЧ возбудителя туберкулеза с традиционными методами на плотных питательных средах показало более высокие диагностические возможности культивирования на жидких средах, что доказывает целесообразность её внедрения в лабораторную практику.

Автоматизированная система ВАСТЕС MGIT 960 сокращает сроки выделения МБТ из диагностического материала в среднем до 10-20 дней, уменьшает длительность определения ЛЧ МБТ до 6-15 дней.

Благодаря использованию жидких питательных сред в автоматизированной системе ВАСТЕС MGIT 960 повышается высеваемость МБТ как из бактериоскопически отрицательного, так и положительного по мазку диагностического материала.

Бактериологический анализатор ВАСТЕС MGIT 960 имеет специальный набор реактивов для тестирования лекарственной устойчивости МБТ к пиразинамиду, для которого не существует способа оценки чувствительности на плотных средах.

Оба метода демонстрируют согласованность в результатах выявления чувствительных и резистентных форм МБТ к основным ПТП.

Автоматизированная система ВАСТЕС MGIT 960 позволяет унифицировать культуральные исследования микробиологии.

Оптимальным решением для бактериологических лабораторий на практике является параллельное выделение культуры в автоматизированной системе и на плотных яичных средах Левенштейна − Йенсена.

Балабанова Я.М. и др.Использование автоматизированной системы ВАСТЕС MGIT 960 в диагностике лекарственной устойчивости к резервным препаратам в г. Самара// Туберкулез и болезни легких. 2009. №9.С.63-70.

Быкдарова К.Р. и др.Автоматизированная система ускоренной культуральной диагностики туберкулеза//Материалы VII Российского съезда фтизиатров. М., 2003. С.82

Диагностика и химиотерапия туберкулеза органов дыхания: Пособие для врачей. М.: Медицина и жизнь, 2003. 48с.

Иртуганова О.А. и др.Ускоренная культуральная диагностика туберкулеза с использованием автоматизированных систем ВАСТЕС MGIT 960 и МВ/ВАСТ//Пробл. туб. 2002. № 1. С. 58 - 62.

Иртуганова О. А. и др.Определение чувствительности Mycobacterium tuberculosis к пиразинамиду на бактериальном анализаторе ВАСТЕС 960 // Пробл. туб. 2003. № 7. С. 40 - 42.

Кондратюк Н.В.и др.Порiвняльна характеристика медикаментозноi чутливостi штамiв Mycobacterium tuberculosis // Мiкробiол. ж. 2006. Vol. 68, N 4. С. 54-59

Лабораторная диагностика туберкулеза / Под ред. В. И. Литвинова, А. М. Мороза. М.: МНПЦБТ, 2001. 184с.

Малахов В.Н. и др. Качество бактериологического выявления и определения лекарственной чувствительности микобактерий туберкулеза участниками федеральной системы внешней оценки качества клинических лабораторных исследований в 2002 - 2003 гг. //Пробл. туб. 2005. № 4. С. 6 - 10.

О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в Российской Федерации: Приказ МЗ РФ №109 от 21.03.2003.

Augustynowicz-Kopeć E.,Jaworski A.,Zwolska Z.Evaluation of Bactec MGIT 960 fluorescent method in diagnosis of tuberculosis//Pneumonol Alergol Pol.2002; 70(9-10):450-7.

Laboratory Services in Tuberculosis Control. Geneva, WHO. 1998.

Читайте также: