658 мутация в гене pa вируса гриппа

Обновлено: 17.04.2024

Эндокринологический научный центр, Москва

Первое в России описание случая редкой формы изолированной глюкокортикоидной недостаточности вследствие мутации в гене NNT

Журнал: Проблемы эндокринологии. 2018;64(5): 312‑314

Семейная глюкокортикоидная недостаточность (СГН) (FGD, MIM*202200) — редкая форма первичной хронической надпочечниковой недостаточности, характеризующаяся резистентностью коры надпочечников к АКТГ, снижением секреции глюкокортикоидов и надпочечниковых андрогенов и повышением уровня АКТГ в плазме. В настоящее время описано как минимум 7 генов, мутации в которых приводят к развитию СГН: MC2R, MRAP, STAR, CYP11A1, NNT, TXNRD2, AAAS. Впервые мутацию в гене NNT описали E. Meimaridou и J. Kowalczyk в 2012 г. у 1 пациента при молекулярно-генетическом обследовании и 9 пациентов с клинической картиной семейной глюкокортикоидной недостаточности. Установление точной причины первичной хронической надпочечниковой недостаточности позволяет модифицировать проводимое лечение, прогнозировать развитие возможных осложнений и сопутствующих нарушений функции других органов, а также необходимость медико-генетического консультирования семьи.

Эндокринологический научный центр, Москва

Семейная глюкокортикоидная недостаточность (СГН) (FGD, MIM*202200) — редкое аутосомно-рецессивное заболевание, характеризующееся резистентностью коры надпочечников к адренокортикотропному гормону (АКТГ), что приводит к снижению секреции глюкокортикоидов и надпочечниковых андрогенов и повышению уровня АКТГ в плазме. Секреция альдостерона, как правило, не страдает. Первые симптомы заболевания обычно проявляются в раннем возрасте, однако имеют достаточно неспецифический характер. Ведущее проявление — гиперпигментация кожных покровов — нередко остается длительно незамеченным, так как общее состояние ребенка может сохраняться нормальным. Однако на фоне интеркуррентного заболевания проявляются слабость, сонливость, вялость, синкопальные состояния; возможно развитие криза надпочечниковой недостаточности и гипогликемии, что и является поводом к обращению за медицинской помощью. Из-за практической независимости продукции альдостерона от АКТГ [1] признаки минералокортикоидной недостаточности в большинстве случаев отсутствуют, что нередко заставляет сомневаться в диагнозе первичной хронической надпочечниковой недостаточности.

СГН — генетически гетерогенная группа заболеваний. В настоящее время описано как минимум 7 генов, мутации в которых приводят к развитию СГН: MC2R, MRAP, STAR, CYP11A1 [2, 3] (для мутаций последних 2 генов, чаще характерна классическая клиника первичной надпочечниковой недостаточности с сольтеряющим компонентом), NNT, TXNRD2 и AAAS при синдроме Оллгрова, для которого помимо резистентности к АКТГ, характерны алакримия и ахалазия.

Установление связи между мутациями в генах NNT и TXNRD2 и развитием резистентности пучковой зоны к АКТГ значительно изменило наше понимание причин развития СГН [4].

Описание случая

Через 8 мес после установления у пробанда диагноза в семье рождается сестра, у которой также с 6 мес появилась гиперпигментация кожных покровов, которая постепенно прогрессировала без нарушения общего состояния. Физическое развитие девочки соответствует средним значениям для пола и возраста (рост 69 см, масса тела 7,3 кг, SDS роста 0,8). Половое развитие — Таннер 1. При обследовании в 8 мес выявлены снижение уровня кортизола до 3 нмоль/л (норма 110—560 нмоль/л) и гипогликемия (2,68 ммоль/л). Направлена на консультацию к эндокринологу в ДДЦ; при обследовании: нормальные показатели калия, натрия и глюкозы при уровне кортизола 0 мкг/дл и повышенной концентрации АКТГ (>1250 пг/мл). Уровень ТТГ — 3,177 мМЕ/мл (норма 0,7—6,4 нмоль/л). ЭКГ — без патологии.

Впервые мутацию в гене NNT описали E. Meimaridou и J. Kowalczyk в 2012 г., обнаружив ее у 1 пациента при молекулярно-генетическом обследовании и у 9 пациентов с клинической картиной СГН, но без мутаций в известных на тот моментах генах, приводящих к развитию СГН (MC2R, MRAP и STAR). У 1 из пациентов была выявлена гомозиготная мутация (c.1598C>T;p.Ala533Val) в гене фермента никотинамиднуклеотидтрансгидрогеназы (NNT), тогда как его родители оказались гетерозиготными носителями. Последующий анализ гена NNT среди 100 пациентов с неизвестной этиологией СГН позволил выявить еще 18 мутаций в 12 семьях.

Фермент никотинамиднуклеотидтрансгидрогеназа (НАДФН:НАД оксидоредуктаза, НАДФ-трансгидрогеназа), кодируемый геном NNT, относится к классу оксидоредуктаз и катализирует обратимый перенос гидрид-иона между двумя формами никотинамидных ферментов на внутренней мембране митохондрии, что необходимо для ее детоксикации. Мутации в гене NNT приводят к дезорганизации пучковой зоны коры надпочечников у 3-месячных мышей. Несмотря на отсутствие разницы в экспрессии ферментов CYP11A1 и CYP11B1 между мутантными и контрольными мышами, при дефекте NNT отмечалось снижение как базального, так и стимулированного уровня кортикостерона. E. Meimaridou и J. Kowalczyk показали, что NNT широко экспрессируется в тканях с наибольшей активностью в надпочечниках, сердце, почках, щитовидной желез и жировой ткани.

Заключение

Несмотря на общую главную составляющую заболевания — дефицит глюкокортикоидов (и нередко минералокортикоидов), установление точной причины первичной хронической надпочечниковой недостаточности крайне важно, так как позволяет модифицировать терапию, прогнозировать развитие возможных осложнений и сопутствующих нарушений функции других органов (например, нарушение полового созревания, неврологической симптоматики), а также необходимость медико-генетического консультирования семьи.

Дополнительная информация

Источники финансирования. Молекулярно-генетическое исследование было проведено при содействии Фонда поддержки и развития филантропии КАФ.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Согласие пациента. Законные представители пациента дали письменное информированное согласие на публикацию медицинских данных в рамках настоящей статьи.

Участие авторов:

Предоставление материалов исследования – А.И. Тлиф, И.Ю. Черняк; написание текста — Н.Ю. Калинченко, А.И. Тлиф; проведение молекулярно-генетического исследования и анализ полученных данных — А.Н. Тюльпаков, Е.В. Васильев, М.В. Петров; редакция текста, внесение ценных замечаний — Н.Ю. Калинченко, Е.И. Клещенко. Все авторы внесли существенный вклад в подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией.

Георгий Александрович Базыкин — кандидат биологических наук, заведующий сектором молекулярной эволюции в Институте проблем передачи информации им. А. А. Харкевича РАН, ведущий научный сотрудник лаборатории эволюционной геномики факультета биоинженерии и биоинформатики МГУ им. М. В. Ломоносова. Занимается изучением различных вопросов биологической эволюции с использованием методов геномики и биоинформатики.

Юрий Эдуардович Стефанов — кандидат биологических наук, научный сотрудник Института молекулярной биологии РАН им. В. А. Энгельгарта и научный консультант студии научного дизайна Visual Science. Область научных интересов — эволюция мобильных генетических элементов, трехмерное компьютерное моделирование вирусных частиц.

В общественном сознании закрепилось довольно легкомысленное отношение к гриппу. Действительно, зачастую его симптомы не тяжелее простудных, да и беспокоит он нас не дольше недели, причем проходит обычно без всякого лечения. Однако история взаимодействий человека и вируса гриппа требует более серьезного подхода к этому патогену. Достаточно вспомнить, что одни из самых страшных пандемий прошлого века были вызваны этим вирусом * . Да и обычный сезонный грипп далеко не безвреден: по оценкам Всемирной организации здравоохранения, ежегодно от него и связанных с ним осложнений умирают сотни тысяч человек (в первую очередь, пожилые люди, младенцы и страдающие хроническими заболеваниями), а в годы тяжелых пандемий — миллионы. По числу унесенных жизней среди инфекционных заболеваний грипп уступает, пожалуй, только ВИЧ. Основная проблема профилактики и лечения гриппа связана с тем, что вирус очень быстро меняется, и каждый год мы имеем дело с его новыми формами, поведение которых далеко не всегда можно предсказать. Очередным шагом на пути к пониманию изменчивости вируса гриппа стал компьютерный анализ последовательностей аминокислот в белках вируса и нуклеотидов в его геноме.

Первая в мире полная достоверная модель вируса гриппа A/H1N1 с атомным разрешением, созданная в рамках проекта Viral Park компании Visual Science при участии Национального центра биотехнологии в Мадриде. Цель проекта — построение научно достоверных 3D-моделей распространенных вирусов человека с максимальной детализацией. Специалисты Visual Science собирают воедино данные огромного количества работ по молекулярной биологии, вирусологии и кристаллографии вирусов, мнения экспертов ведущих научных центров мира и результаты молекулярного моделирования, полученные научным отделом компании. Модель в значительной степени построена на основе данных, опубликованных исследовательскими коллективами под руководством: Хуана Ортина (Испанский национальный центр биотехнологий, Мадрид, Испания), Такеши Нода (Университет Токио, Япония), Роба Ригро (Отдел взаимодействий вируса и клетки, Гренобль, Франция) и Питера Розенталя (Национальный институт медицинских исследований, Лондон, Великобритания). Точное строение генома вируса гриппа удалось смоделировать благодаря сотрудничеству с Хайме Мартин-Бенито (Испанский национальный центр биотехнологий, Мадрид, Испания), группа которого добилась уникальных результатов в описании упаковки вирусного генетического материала. Создатели модели: Иван Константинов (руководитель проекта), Юрий Стефанов (научный консультант), Анастасия Бакулина (ведущий молекулярный моделлер), Дмитрий Щербинин (молекулярный моделлер), Александр Ковалевский (3D-моделлер)

Сегментированный геном

Общая длина генома вируса гриппа составляет приблизительно 13 500 нуклеотидов [2]. Три самых крупных (примерно по 2300 нуклеотидов) его сегмента (PA, PB1 и PB2) кодируют вирусную полимеразу — белок, копирующий РНК и состоящий из трех крупных субъединиц. Четвертый по длине (около 1750 нуклеотидов) сегмент (HA) отвечает за синтез гемагглютинина. Этот белок заякорен в липидной оболочке вируса и отвечает за его проникновение в клетку, связываясь с рецептором на поверхности клеточной мембраны [3]. В зависимости от того, какой именно вариант гемагглютинина несет вирус, связывание может быть более или менее крепким. После этого клетка поглощает вирус, помещая его в мембранный пузырек внутри цитоплазмы. Большинство макромолекулярных комплексов, поглощаемых таким образом, перевариваются клеткой. Однако вирус избегает этой участи: его мембрана сливается с мембраной пузырька, в результате чего ее содержимое оказывается в цитоплазме. В этом процессе гемагглютинин также играет важную роль. Затем геном вируса проникает в ядро, где с него может начать считываться информация.

Сегмент размером около 1550 нуклеотидов (NP) кодирует нуклеопротеин — белок, необходимый вирусу для упаковки РНК. Множество копий такого белка распределяется по каждому из геномных сегментов, связываясь с молекулой нуклеиновой кислоты. В результате фрагменты генома образуют нуклеопротеидные тяжи, сложенные пополам и закрученные в спираль, к каждому из которых прикрепляется своя копия полимеразного комплекса [4].

Сегмент M1/M2 длиной 1000 нуклеотидов, в соответствии со своим названием, кодирует сразу два белка — М1 и М2. Из молекул первого из них образован слой (матрикс), подстилающий вирусную липидную оболочку. Обычно М1 играет ключевую роль в формировании вирусных частиц, поскольку он взаимодействует одновременно с поверхностными белками вируса и внутренними компонентами вирусной частицы. Задача матриксного белка — собрать все составляющие воедино [6]. Белок М2 выполняет роль ионного канала. Он расположен в липидной оболочке вируса и способствует его распаковке в цитоплазме клетки [7].

Последний, самый короткий (из 865 нуклеотидов) сегмент РНК вируса гриппа отвечает за синтез двух белков, которые не попадают в зрелую вирусную частицу. Эти белки называются NS1 и NEP. Первый необходим вирусу, в частности, для того, чтобы блокировать считывание информации с клеточных молекул РНК [8]. Благодаря ему клетке приходится синтезировать преимущественно вирусные белки, оставляя свои собственные нужды. Второй белок, NEP, обеспечивает транспорт новообразованных геномных комплексов вируса из ядра к клеточной мембране, где происходит сборка вирионов [9].

Новые штаммы и поиск реассортаций

Классификация штаммов вируса гриппа основана прежде всего на том, какие именно варианты гемагглютинина и нейраминидазы входят в его состав. Широко известные комбинации букв H и N в сочетании с порядковыми номерами (например, H3N2) как раз и обозначают подтип вируса: гемагглютинин 3, нейраминидаза 2. Таких подтипов десятки, однако человека заражают лишь немногие — обычно те, у которых не слишком большие номера N и H. Наиболее давние хозяева вируса гриппа — птицы, от которых новые штаммы время от времени передаются домашнему скоту и, прямо или опосредованно, людям [10]. Чем более долгий период коэволюции провели вместе патоген и хозяин, тем менее болезненным становится их совместное существование. Птичьи штаммы вируса зачастую оказываются очень опасными после передачи новым хозяевам [11].

Известно, что именно реассортации сегментов РНК привели к возникновению штаммов, которые вызвали пандемии азиатского и гонконгского гриппа в 1957 и 1968 гг., унесшие около 2,5 млн жизней [12]. Возможно, что и испанский грипп начала прошлого века, число жертв которого шло на десятки миллионов, тоже появился в результате такой эволюционной схемы [13].

Подобное исследование можно провести с использованием геномов вируса гриппа, опубликованных в свободном доступе. Избрав в качестве объекта штаммы H3N2, можно составить выборку из 1376 сегментированных геномов, а затем сравнить между собой филогенетические деревья для этих вирусов, построенные в отдельности по каждому из геномных сегментов [15].

В результате такого сравнения оказалось, что число реассортаций примерно сопоставимо для разных сегментов: в ходе эволюции гриппа в популяции человека каждая пара сегментов в недавнем прошлом реассортировала около 50 раз.

Последствия реассортаций

После того как ветви, в которых произошли реассортации, были обнаружены, стало возможным оценить их влияние на накопление в сегментах вирусного генома точечных замен. Для этого можно сравнить время, прошедшее между каждой такой заменой и ближайшей предшествующей ей реассортацией, с тем, которое бы ожидалось из компьютерной модели, если бы реассортации не влияли на замены. Проведенный анализ показал, что по крайней мере в пяти из восьми сегментов генома мутации ускоренно накапливаются после реассортации. Наиболее ярко эффект проявился для нейраминидазы и белка PB1. Ускорение аминокислотных замен после реассортаций вирусных геномов указывает на то, что в такие периоды эволюции вируса гриппа прежде всего происходит адаптация белков к новому генетическому окружению. Из-за того, что вирусные белки взаимодействуют между собой, молекулы из разошедшихся штаммов вынуждены какое-то время изменяться, приспосабливаясь друг к другу.

Интересно, что у нейраминидаз наблюдалось 30 замен, расстояние от которых до ветви, несущей реассортацию, меньше того эволюционного расстояния, на котором мы бы ожидали встретить одну случайную синонимичную замену в гене данного белка. Такой результат свидетельствует о том, что все эти 30 мутаций произошли и закрепились необычайно быстро, и что необходимость быстрой адаптации возникла именно благодаря тому, что соответствующий сегмент генома попал в новое генетическое окружение.

Реассортация — это резкое эволюционное изменение, которое поначалу может снижать общую приспособленность вируса к условиям окружающей среды и к организму-хозяину. Однако иногда оказывается, что из-за такой перетасовки белков из разных штаммов новая форма патогена оказывается более приспособленной, чем штаммы-предшественники, получая возможность эффективнее распространиться [18]. Похоже, что за коррекцию первичного вредного эффекта от реассортации как раз и отвечают быстро закрепляющиеся адаптивные мутации.

Предсказания, полученные только статистическими методами, — путем анализа последовательностей белков и кодирующих их генов, — конечно, не могут иметь стопроцентную точность. Действительно ли взаимодействуют две определенные аминокислоты, можно проверить экспериментально. Однако каждый белок вируса состоит из сотен аминокислот, так что возможны десятки тысяч разных взаимодействий. Постановка такого числа экспериментов практически неосуществимы. Биоинформатический анализ позволяет расставлять приоритеты: выбирать и анализировать только те аминокислоты, которые участвуют во взаимодействиях, экономя время и силы экспериментаторов. Кроме того, такой подход позволяет понять, насколько взаимодействия, приводящие к вредности реассортаций, распространены на уровне всего генома.

Работа выполнена при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (проект 13-04-02098) и Министерства образования и науки Российской Федерации (проект 11.G34.31.0008).

Литература
1. Steinhauer D. A., Domingo E., Holland J. J. Lack of evidence for proofreading mechanisms associated with an RNA virus polymerase // Gene. 1992. V. 22. № 2. P. 281–288.
2. Teng Q., Hu T., Li X. et al. Complete genome sequence of an H3N2 avian influenza virus isolated from a live poultry market in Eastern China // J. Virol. 2012. V. 86. № 21. P. 11944. DOI: 10.1128/JVI.02082-12.
3. Carr C. M., Kim P. S. A spring-loaded mechanism for the conformational change of influenza hemagglutinin // Cell. 1993. V. 73. № 4. P. 823–832.
4. Arranz R., Coloma R., Chichуn F. J. et al. The structure of native influenza virion ribonucleoproteins // Science. 2012. V. 338. № 6114. P. 1634–1637. DOI: 10.1126/science.1228172.
5. Kamali A., Holodniy M. Influenza treatment and prophylaxis with neuraminidase inhibitors: a review // Infection and Drug Resistance. 2013. № 6. P. 187–198. DOI: 10.2147/IDR.S36601.
6. Nayak D. P., Hui E. K., Barman S. Assembly and budding of influenza virus // Virus Res. 2004. V. 106. № 2. P. 147–165.
7. Lear J. D. Proton conduction through the M2 protein of the influenza A virus; a quantitative, mechanistic analysis of experimental data // FEBS Lett. 2003. V. 552. № 1. P. 17–22.
8. Hale B. G., Randall R. E., Ortнn J. et al. The multifunctional NS1 protein of influenza A viruses // J. Gen. Virol. 2008. V. 89. № 10. P. 2359–2376. DOI: 10.1099/vir.0.2008/004606-0.
9. Robb N. C, Smith M., Vreede F. T. et al. NS2/NEP protein regulates transcription and replication of the influenza virus RNA genome // J. Gen. Virol. 2009. V. 90. № 6. P. 1398–1407. DOI: 10.1099/vir.0.009639-0.
10. El Zowalaty M. E., Bustin S. A., Husseiny M. I. et al. Avian influenza: virology, diagnosis and surveillance // Future Microbiol. 2013. V. 8. № 9. P. 1209–1227. DOI: 10.2217/fmb.13.81.
11. Kaplan B. S., Webby R. J. The avian and mammalian host range of highly pathogenic avian H5N1 influenza // Virus Res. 2013. V. 178. № 1. P. 3–11. DOI: 10.1016/j.virusres.2013.09.004.
12. Kilbourne E. D. Influenza pandemics of the 20th century // Emerg. Infect. Dis. 2006. V. 12. № 1. P. 9–14.
13. Suzuki Y. A phylogenetic approach to detecting reassortments in viruses with segmented genomes // Gene. 2010. V. 464. № 1–2. P. 11–16. DOI: 10.1016/j.gene.2010.05.002.
14. Nagarajan N., Kingsford C. GiRaF: robust, computational identification of influenza reassortments via graph mining // Nucleic Acids Research. 2011. V. 39. № 6. e34. DOI: 10.1093/nar/gkq1232.
15. Neverov A. D., Lezhnina K. V., Kondrashov A. S., Bazykin G. A. Intrasubtype Reassortments Cause Adaptive Amino Acid Replacements in H3N2 Influenza Genes // PLoS Genet. 2014. V. 10. № 1. e1004037. DOI: 10.1371/journal.pgen.1004037
16. Wolf Y. I., Viboud C., Holmes E. C. et al. Long intervals of stasis punctuated by bursts of positive selection in the seasonal evolution of influenza A virus // Biol. Direct. 2006. V. 1. P. 34.
17. Kryazhimskiy S., Dushoff J., Bazykin G. A. et al. Prevalence of epistasis in the evolution of influenza A surface proteins // PLoS Genet. 2011. V. 7. № 2. e1001301. DOI: 10.1371/journal.pgen.1001301.
18. Li K. S., Guan Y., Wang J. et al. Genesis of a highly pathogenic and potentially pandemic H5N1 influenza virus in eastern Asia // Nature. 2004. V. 430. № 6996. P. 209–213.
19. Ferguson N. M., Fraser C., Donnelly C. A. et al. Public health. Public health risk from the avian H5N1 influenza epidemic // Science. 2004. V. 304. № 5673. P. 968–969.
20. Yong E. Influenza: Five questions on H5N1 // Nature. 2012. V. 486. № 7404. P. 456–458. DOI: 10.1038/486456a.
21. Herfst S., Schrauwen E. J., Linster M. et al. Airborne transmission of influenza A/H5N1 virus between ferrets // Science. 2012. V. 336. № 6088. P. 1534–1541. DOI: 10.1126/science.1213362.
22. Imai M., Watanabe T., Hatta M. et al. Experimental adaptation of an influenza H5 HA confers respiratory droplet transmission to a reassortant H5 HA/H1N1 virus in ferrets // Nature. 2012. V. 486. № 7403. P. 420–428. DOI: 10.1038/nature10831.
23. Russell C. A., Fonville J. M., Brown A. E. et al. The potential for respiratory droplet-transmissible A/H5N1 influenza virus to evolve in a mammalian host // Science. 2012. V. 336. № 6088. P. 1541–1547. DOI: 10.1126/science.1222526.

Для просмотра информации о патентах вам необходимо зарегистрироваться и оплатить 30-ти дневный доступ. Разовый платеж составит 149 рублей (НДС не облагается).

Штаммы вида streptococcus pneumoniae (варианты) и способ получения из них протективной белоксодержащей фракции, обладающей внутривидовой иммуногенной активностью

Способ определения совокупной активности антимикробных пептидов как маркера состояния местного иммунитета различных эпителиальных тканей

Изобретение относится к медицинской иммунологии и микробиологии, а именно к лабораторной диагностике и предназначено для определения совокупной активности антимикробных пептидов (АМП) в клинических образцах слюны, мочи, вагинального и кожного секретов. Для этого образцы термостатируют в.

Способ получения амфифильных блок-сополимеров n,n-диметиламиноэтилметакрилата для доставки нуклеиновых кислот в живые клетки

Группа изобретений относится к области химии высокомолекулярных соединений и медицины, а именно к вариантам способа получения псевдоживой радикальной полимеризации амфифильных блок-сополимеров для трансфекции эукариотических клеток, включающих катионный блок –.

Способ получения пневмококковых гипериммунных сывороток

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использовано для получения пневмококковых гипериммунных сывороток. Для этого проводят гипериммунизацию кроликов антигеном, представляющим собой инактивированный формалином антиген плазмидосодержащего штамма пневмококка.

Способ получения живой культуральной аттенуированной вакцины для профилактики ветряной оспы

Способ получения специфических антигенных препаратов из клинически значимых дрожжевых грибов

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использовано для получения специфического белоксодержащего антигенного препарата из клинически значимых дрожжевых грибов. Для этого осуществляют культивирование дрожжей Candida albicans, либо Geotrichum candidum, либо.

Способ доставки наночастиц, предназначенных для транспортировки лекарственных веществ, в головной мозг млекопитающих через гематоэнцефалический барьер

Изобретение относится к области экспериментальной медицины, а именно к способу неинвазивной доставки наночастиц в головной мозг млекопитающих, включающему следующие этапы: приготовление порошка монокарбида вольфрама или монокарбида ванадия в виде наночастиц с размером от 15 до 60 нм.

Рекомбинантная плазмидная днк ppa-oprf-atox-opri, кодирующая синтез гибридного рекомбинантного белка, включающего аминокислотные последовательности белков f и i наружной мембраны и атоксического варианта экзотоксина a pseudomonas aeruginosa, штамм escherichia coli pa-oprf-atox-opri - продуцент гибридного рекомбинантного белка и способ получения указанного белка

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой рекомбинантную плазмидную ДНК pPA-OPRF-ATOX-OPRI, которая содержит слитые гены, кодирующие белки F и I наружной мембраны Pseudomonas aeruginosa, а также атоксический вариант экзотоксина A Pseudomonas aeruginosa. Их экспрессия находится.

Способ определения противомикробной активности цельной сыворотки и фракции её антимикробных пептидов

Изобретение относится к области лабораторной диагностики, медицинской иммунологии и микробиологии и предназначено для определения общей антимикробной активности и совокупной активности антимикробных пептидов (АМП) в клинических образцах сыворотки крови. Способ определения общей противомикробной.

Свежевыделенный штамм бактерий bordetella pertussis - продуцент комплекса протективных антигенов для производства бесклеточной коклюшной вакцины

Холодоадаптированный штамм вируса гриппа в-в/виктория/2/63/87, предназначенный в качестве штамма-донора аттенуации для получения реассортантов холодоадаптированных штаммов для живой гриппозной вакцины

Изобретение относится к медицинской вирусологии и может быть использовано при производстве живой холодоадаптированной аттенуированной вакцины против гриппа. Холодоадаптированный штамм вируса гриппа В/Виктория/2/63/87 обладает уникальными мутациями в генах, кодирующих белки PB2, PB1, PA, NP, M1.

Производные олигохитозана в качестве адъювантов для вакцин

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использовано для применения производного олигохитозана в качестве адъюванта для вакцин. Производное олигохитозана состоит из звеньев глюкозамина 91-98% и (N-ацил)глюкозамина 2-9% с молекулярной массой от 5 до 15 кДа.

Способ получения живой культуральной вакцины против вируса гриппа

Изобретение относится к области биотехнологии. Способ включает культивирование перевиваемых клеток MDCK в питательной среде, получение вируссодержащей субстанции путем культивирования вакцинных штаммов вируса гриппа в культуре клеток MDCK на этой же питательной среде, очистку вирусной.

Аттенуированный холодоадаптированный штамм вируса гриппа а/краснодар/101/59/35 (h2n2) для получения штаммов живой интраназальной гриппозной вакцины

Изобретение относится к медицинской вирусологии. Предложен холодоадаптированный штамм вируса гриппа А/Краснодар/101/59/35 (H2N2) для получения реассортантных штаммов живой гриппозной вакцины. Изобретение может быть использовано при производстве живой холодоадаптированной аттенуированной вакцины.

Способ определения наличия β-казеина аллелей а1 и/или а2 группы в молоке крс

Изобретение относится к биотехнологии, аналитической химии и касается способа определения содержания β-казеина А1 и/или А2 групп в молоке, молочных продуктах, молочных составных продуктах, молокосодержащих продуктах. Способ включает концентрирование β-казеина в исследуемой пробе до достижения.

Возможности последовательной таргетной терапии EGFR-позитивного НМРЛ. Клинический случай

Рак легкого сохраняет лидирующие позиции в смертности больных с ЗНО как в мире, так и в России. Ингибиторы тирозинкиназы (TKI) заняли ведущую роль в терапии пациентов с немелкоклеточным раком легкого (НМРЛ) с активирующими мутациями EGFR. В настоящее время в клинической практике доступны три поколения ингибиторов (TKI) как обратимого (I поколение), так и необратимого действия (II и III поколений). В связи с этим вопрос рационального подбора последовательности терапии все более насущно встает перед врачами. В публикации представлен клинический случай последовательного использования ингибиторов (TKI) различных поколений у пациента с EGFR позитивным НМРЛ. В результате персонализированного подхода и последовательного использования ингибиторов TKI в реальном клиническом случае удалось достичь общей выживаемости 32 месяца, что превышает показатели общей выживаемости, представленные в клинических исследованиях.

Рак легкого на сегодняшний день остается ведущей причиной смерти в структуре ЗНО как в мире [1], так и в России [2]. В Новосибирской области в 2015 г. рак легкого занимал 1-е место в структуре смертности от злокачественных новообразований, показатель одногодичной летальности с момента установки диагноза составил 46,6%. В большинстве случаев рак легкого диагностируется уже в поздних стадиях: на долю 3 и 4 стадий приходилось почти 65% диагностированных случаев [3]. Такие статистические данные позволяют предполагать, что большая часть пациентов с РЛ (рак легкого) будут подвергаться системной лекарственной терапии.

Немелкоклеточный рак легкого (НМРЛ) — наиболее распространенный тип рака легкого (что соответствует примерно 85% случаев), который включает три гистологических подтипа: аденокарциному, плоскоклеточный рак и крупноклеточный рак. Одним из пусковых факторов развития НМРЛ является активация RAS-RAF-MEK-сигнального каскада, а EGFR играет одну из ключевых ролей в патогенезе опухолей. Этот рецептор влияет на рост, пролиферацию и выживаемость клеток злокачественных опухолей, тем самым являясь важной мишенью для таргетной терапии [4].

Наличие мутации в гене EGFR (Del 19 и L858R) у больных раком легкого связано с хорошим ответом на терапию ингибиторами тирозинкиназы (TKI) [5]. Еще в ранних исследованиях было показано, что эти мутации чаще встречаются при аденокарциномах легкого, у женщин азиатской расы и у никогда не куривших пациентов. Использование в лечении этих больных ингибиторов TKI первого (гефитиниб, элротиниб) и второго поколений (афатиниб) позволило улучшить показатели медианы ВБП (выживаемость без прогрессирования) в 2 раза. Кроме того, в исследованиях LUX-Lung 3 показано, что афатиниб увеличивает общую выживаемость (ОВ) у пациентов с мутацией Del19: медиана ОВ в исследовании LUX-Lung 3 составила 33,3 мес против 21,2 мес в группе химиотерапии (р=0,015) [6—9].

С учетом этого в рутинной практике утвержден стандарт тестирования больных с местно-распространенным или метастатическим раком легкого на наличие мутации EGFR, что позволяет выбрать больных для терапии ингибиторами TKI. Однако, справедливости ради, необходимо отметить, что, если удельный вес таких мутаций в азиатской популяции населения достигает 40%, то в европейской популяции варьирует от 10 до 20% [10, 11].

Особенностью злокачественных опухолей является формирование резистентности к проводимой лекарственной терапии, что приводит к прогрессированию заболевания. Основной причиной прогрессирования EGFR положительного рака легкого и устойчивости к терапии ингибиторами тирозинкиназы первого и второго поколения в 50—60% случаев является мутация Т790М. Для подавления этой мутации в клинической практике появился ингибитор TKI третьего поколения (осимертиниб). Надо отметить, что осимертиниб обладает активностью не только в отношении мутации резистентности Т790М, но и в отношении частых мутаций (Del 19 и L858R). При этом использование осимертиниба в первой линии терапии EGFR положительного рака легкого дает максимальную медиану ВБП в 19 мес [12].

Адъювантная ПХТ закончена в июне 2016 г., тогда же у пациента появились жалобы на боли в позвоночнике. При выполнении КТ органов грудной клетки и остеосцинтиграфия (ОСГ) обнаружено метастатическое поражение грудных позвонков (рис. 1, 2). Рис. 1. КТ органов грудной клетки. Бластический метастатический очаг в грудном позвонке. Рис. 2. Остеосцинтиграфия. Накопление радиофармпрепарата в грудном позвонке. С учетом гистологической формы рака легкого и выявленного прогрессирования заболевания произведено молекулярно-генетическое тестирование гистологического материала на наличие драйверных мутаций. Была выявлена частая мутация в гене EGFR в 21 экзоне (L858R). По результатам исследований назначен гефотиниб (250 мг/сут) в качестве таргетной терапии и золедроновая кислота как симптоматическое лечение.

Спустя 2 мес (август 2016 г.) при контрольной КТ органов грудной клетки на фоне применения гефитиниба выявлено прогрессирование заболевания за счет увеличения количества и размеров метастазов в кости: обнаружено поражение всех грудных позвонков и грудины (рис. 3). Рис. 3. КТ органов грудной клетки. Множественные метастатические очаги в грудных позвонках и грудине. В связи с прогрессированием заболевания было решено назначить ПХТ.

С августа 2016 г. по февраль 2017 г. пациент получил 6 курсов ПХТ (пеметрексед 500 мг/м 2 + цисплатин 75 мг/м 2 ) и золедроновую кислоту в постоянном режиме. На фоне терапии состояние пациента было удовлетворительным (ECOG 0−1), сохранялся умеренный болевой синдром в костях. При КТ-контроле в февраль 2017 г. отмечена стабилизация заболевания (нарастали склеротические изменения в грудных позвонках), с учетом этого было продолжено введение пеметрекседа в прежней дозе в монорежиме как поддерживающая терапия.

Спустя 3 мес (май 2017 г.) у пациента отмечено ухудшение общего состояние, слабость, появился выраженный болевой синдром в позвоночнике и костях таза, требующий назначения наркотических анальгетиков. По результатам КТ органов грудной клетки, брюшной полости и ОСГ у пациента отмечено прогрессирование заболевания за счет метастатического поражения печени и тотального метастатического поражения скелета (рис. 4, 5). Рис. 4. КТ органов брюшной полости. Метастатический очаг в правой доле печени. Рис. 5. Остеосцинтиграфия. Тотальное метастатическое поражение скелета. Принято решение продолжить терапию афатинибом в дозе 50 мг/сут согласно инструкции. Пациент хорошо переносил терапию: из нежелательных явлений у больного наблюдалась сыпь на волосистой части головы и диарея 1—2 раза в сутки, нежелательных явлений 3—4 степени тяжести не выявлено. Данные нежелательные явления не требовали медикаментозной коррекции и не снижали качество жизни пациента.

После смены терапии отмечался выраженный клинический эффект: быстрое и полное купирование болевого синдрома и улучшение общего состояния в течение 1-й недели терапии. Спустя 1,5 мес терапии афатинибом при контрольной КТ органов грудной клетки и брюшной полости отмечена полная регрессия метастатического очага в печени (рис. 6, 7). Рис. 7. КТ органов брюшной полости. Исчезновение метастатического очага в печени. Рис. 6. КТ органов брюшной полости. Метастатический очаг в правой доле печени.

Спустя 10 мес терапии афатинибом (март 2018 г.) вновь появились боли в костях, нарастала слабость, тяжесть в правом подреберье. По данным КТ органов брюшной полости выявлены множественные метастазы в печени (рис. 8). Рис. 8. КТ органов брюшной полости. Метастатическое поражение печени.

С учетом того, что основной механизм формирования резистентности при приеме афатиниба является развитие мутации Т790М, пациенту была выполнена жидкостная биопсия для определения мутации резистентности. По результатам анализа в плазме больного выявлены две мутации: исходная L858R и новая мутация T790M. Исходя из этого, назначен ингибитор TKI третьего поколения с активностью в отношении мутации Т790М — осимертиниб 80 мг/сут. Клинический ответ также был быстрым и выраженным с купированием болевого синдрома и улучшением общего состояния.

Назначение осимертиниба позволило продлить жизнь пациента еще на 10 мес. В январе 2019 г. состояние больного резко ухудшилось, появилась мозговая симптоматика, развилась кома. Несмотря на полноценную терапию, пациент погиб.

Заключение

Приведенный клинический случай последовательного использования разных поколений ингибиторов TKI в реальной практике лечения метастатического EGFR позитивного НМРЛ показал возможности современной таргетной терапии. Последовательное применение ингибиторов TKI с учетом выявленных мутаций привело к общей выживаемости в 32 мес с сохранением высокого уровня качества жизни и социальной адаптированности пациента.

Продемонстрированные результаты согласуются с ранее опубликованными данными, в которых последовательное применение осимертиниба после афатиниба при выявлении мутации Т790М позволило увеличить общую выживаемость до 45,7 мес в определенных группах пациентов [13].

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflict of interest.

Сведения об авторах

Вирусология занимает важное место среди биологических дисциплин. Современный медицинский или ветеринарный специалист должен знать не только клинико–патологическую сторону заболевания, но и иметь четкое представление о вирусах, их свойствах, методах лабораторной диагностики и свойствах постинфекционного и поствакцинального иммунитета.

Вирус (от лат. virus — яд) является простейшей неклеточной формой жизни в виде микроскопической биологической частицы, представляющей собой молекулы нуклеиновых кислот (ДНК или РНК), заключённых в защитную белковую оболочку (капсид) и способные инфицировать живые организма.

мутации, то есть изменении последовательности нуклеотидов в определенной области генома вируса, что приводит к фенотипически выраженному изменению свойства;
рекомбинации, то есть обменом генетическим материалом между двумя вирусами, близкими, но различными по наследственным свойствам.

Мутации у вирусов

спонтанные;
индуцированные (вызванные).

Но точечные мутации не всегда приводят к изменению фенотипа. Существует целый ряд причин, по которым такие мутации не могут проявляться. Одна из них - вырождение генетического кода. Код синтеза белка вырождается, что означает, что некоторые аминокислоты могут быть закодированы несколькими триплетами (кодонами). Например, аминокислота лейцин может быть закодирована шестью триплетами. Поэтому, если молекула РНК заменяет триплет ЦУУ на ЦУЦ, ЦУА на ЦУГ, то синтезированная молекула белка все еще будет содержать аминокислоту лейцин.

Поэтому ни структура белка, ни его биологические свойства не нарушаются. Природа использует своего рода синонимичный язык и, заменяя один кодон другим, закладывает в них одно и то же понятие (аминокислоту), тем самым сохраняя естественную структуру и функцию синтезируемого белка.

Другое дело, если аминокислота кодируется только одним триплетом, например, синтез триптофана кодируется и заменяется только триплетом УГГ, то есть синонимом, который отсутствует. В этом случае в белок включается еще одна какаялибо аминокислота, которая может привести к появлению мутантного признака.

Аберрация в фагах вызвана делециями (потерями) различного числа нуклеотидов, от одной пары до последовательности, вызывающей одну или несколько функций вируса. Как спонтанные, так и индуцированные мутации также делятся на прямые и обратные мутации. Мутации могут иметь разные последствия. В некоторых случаях они приводят к изменению фенотипических проявлений в нормальных условиях.

Например, увеличивается или уменьшается размер бляшек под агарным покрытием; увеличивается или ослабевает вирулентность для определенного вида животных; вирус становится более чувствительным к действию химиотерапевтического агента и т. д.

В других случаях мутация является фатальной, поскольку она нарушает синтез или функцию жизненно важного вирусного белка, например, такого как вирусная полимераза. В некоторых случаях мутации являются условно летальными, так как вирусспецифический белок сохраняет свои функции при определенных условиях и теряет эту способность в неразрешающих (непермиссивных) условиях.

Типичным примером таких мутаций являются термочувствительные – ТS-мутации, при которых вирус теряет способность к размножению при повышенных температурах (+39-42°С), сохраняя эту способность при нормальных температурах роста (+36-37°С). Морфологические или структурные мутации могут влиять на размер вириона, первичную структуру вирусных белков и изменения в генах, определяющих ранние и поздние вирусные ферменты, обеспечивающие размножение вируса. Мутации также могут быть различными по своему механизму.

В одних случаях происходит делеция, то есть потеря одного или нескольких нуклеотидов, в других - встраивание одного или нескольких нуклеотидов, а в некоторых случаях один нуклеотид заменяется другим. Мутации могут быть прямыми или обратными. Прямые мутации меняют фенотип, а обратные мутации – реверсии) - восстанавливаются. Реальная реверсия возможна, когда обратная мутация происходит вместе с первичным повреждением, и псевдореверсия, когда мутация происходит в другой области дефектного гена (интрагенное торможение мутации) или в другом гене (экстрагенное подавление мутации).

Реверсия - не редкое явление, потому что ревертанты обычно лучше приспособлены к данной клеточной системе. Поэтому при создании мутантов с определенными свой ствами, например, вакцинных штаммов, следует ожидать возможного превращения их в дикий тип. Вирусы отличаются не только своими небольшими размерами, селективной способностью к размножению в живых клетках, особенностями строения наследственного вещества, но и значительной изменчивостью от других представителей живого мира.

Изменения могут влиять на размер, форму, патогенность, антигенную структуру, тканевую тропность, устойчивость к физико-химическим воздействиям и на другие свойства вирусов. Значение причин, механизмов и характера изменений имеет большое значение при получении необходимых вакцин для вирусных штаммов, а также для разработки эффективных мер борьбы с вирусными эпизодами, в ходе которых, как известно, свойства вирусов могут существенно изменяться.

Мутация вирусов может происходить в результате химических изменений цистронов или нарушения последовательности их расположения в структуре молекулы вирусной нуклеиновой кислоты. В зависимости от условий различают естественную изменчивость вирусов, наблюдаемую в нормальных условиях размножения, и искусственную изменчивость, получаемую в результате многочисленных специальных пассажей или воздействия на вирусы определенных физических или химических факторов (мутагенов). В обычных природных условиях изменчивость проявляется не во всех вирусах одинаково.

Этот признак наиболее заметен у вируса гриппа и вирус ящера. Значительная изменчивость отмечается у вируса гриппа. Об этом свидетельствует большое количество вариантов у разных типов этих вирусов, а также значительные изменения его антигенных свойств в конце почти каждой эпизоотии.

Частота мутаций и механизмы их возникновения

Мутации бактериофагов изучались очень интенсивно не только с целью генетического анализа, но и с целью получения информации о свойствах самих фагов. Частота появления мутантов в потомстве фагов варьируется очень сильно: например, одни мутанты образуются с частотой не более 10, а другие-с частотой 10 и выше. Неблагоприятное воздействие высокочастотных мутаций обычно компенсируется эффектом отбора. Например, мутантный фаг может быть заменен диким типом, что дает более высокий выход фага. Высокая частота вспышек обычно характерна для таких мутаций, которые могут происходить как во многих локусах, так в одном и том же локусе.

В тех случаях, когда нормальный признак соответствует функциональной форме гена, а мутант появляется в результате изменения в любой точке локуса, частота прямых мутаций окажется выше, чем частота обратных мутаций, так как обратные мутации должны приводить к восстановлению нормального состояния. Иногда ревертанты на самом деле являются псевдоревертантами: это происходит либо из-за изменений в другом гене (мутации-супрессоры), либо из-за изменений в том же гене, которые вызывают другую, но также активную форму продукта.

У зрелых фагов частота спонтанных мутаций очень мала, но они могут быть индуцированы под влиянием таких мутагенных факторов, как рентгеновские или ультрафиолетовые лучи, азотистая кислота, гидроксиламин или алкилирующие агенты. Азотистая кислота дезаминирует основания нуклеотидов, а этилметилсульфат их этилирует. Гидроксиламин превращает шитозин в урацил. В результате ошибок, допущенных при репликации химически модифицированной нуклеиновой кислоты, происходят мутации, и потомство фагов, полученное из бактерии, содержит как нормальные, так и мутантные частицы. Однако, как и при обработке мутагенного фага, содержащего одноцепочную ДНК, образуется чистый мутантный клон.

Изучение мутационного процесса, происходящего при размножении фагов, непосредственно связано с анализом развития фагов. Давайте рассмотрим процесс спонтанной мутации. В бактериальной клетке, в которой произошла мутация фага, 6 образуются как нормальный, так и мутировавший фаги. Количество мутантных фаговых частиц, содержащихся в популяции фагов, происходящих из этой отдельной бактериальной клетки, очевидно, определяется характером размножения фагов, поскольку новые гены могут быть сформированы только путем репликации уже существующих. Если вероятность мутации одинакова для каждой репликации, то число мутантов зависит от механизма репликации.

Например, если каждая новая копия гена формируется независимо от других, то распределение мутантных копий в потомках фагов от разных инфицированных бактерий будет случайным. Если же, наоборот, каждая из полученных копий воспроизводится, то в свою очередь мутантные копии будут разделены на группы или клоны, состоящие из мутантных "сибсов".

Индуцированные хозяином модификации бактериофагов

Помимо мутаций, бактериофаги подвержены негенетическим изменениям, в которых главная роль принадлежит клетке-хозяину. Это явление было названо модификациями, вызванными хозяином. Значение этих модификаций для молекулярной биологии состоит в том, что они показали способность внутриклеточной среды вызывать такие изменения в химической структуре генетического материала, которые могут быть использованы для идентификации клеточных линий, синтезирующих ДНК.

Подобные явления были впервые обнаружены на фаговой ДНК, но они также справедливы и для каждой бактериальной клеточной ДНК. Есть также наблюдения, при которых это явление относится и к эукариотическим клеткам. В особых случаях могут возникнуть более сложные ситуации. Двустороннее ограничение фага двумя хозяевами иногда наблюдается, но оно не обязательно. Фаги, отторгнутые клетками, способны адсорбироваться на них и проникать в их ДНК добавляя часть собственной ДНК. Однако последняя часть быстро разрушается, и репликация не происходит.

Деградация ДНК вызывается специфическими эндонуклеазами (рестриктазами или R-нуклеазами), которые могут обнаруживать и расщеплять определенные участки ДНК, если они не были модифицированы под влиянием М-ферментов. После этого ДНК расщепляется экзонуклеазами на отдельные нуклеотиды. Бактериальный штамм может иметь одну или несколько R-нуклеаз и в то же время M-ферменты, которые защищают собственную ДНК клетки. Предложена удобная номенклатура этих ферментов. Согласно ряду данных, области детекции R-нуклеазы не всегда совпадают с областями расщепления ДНК; возможно, что фермент может мигрировать по цепочке до того, как найдет область, где происходит расщепление ДНК. Функциональная роль индуцированных хозяином модификаций неясна.

Как видим, мутирование вирусов проходит достаточно сложный и тернистый путь в приобретении новых вирулентных свойств. Эти свойства могут быть как ослабляющими для развития инфекционного процесса, так и крайне агрессивными в своём новом виде.

Читайте также: