Активность вируса вычисляют методом спирмена кербера

Обновлено: 28.03.2024

Противовирусную активность интерферона определяют путем сравнения защитного действия испытуемого препарата (ИП) с аналогичным действием стандартного образца активности интерферона (СО).

Проведение испытания

Определение специфической активности препаратов интерферона проводят на монослое культур клеток, полученном при температуре (37±1) 0 Св атмосфере с (5,0±0,5) % СО2 в лунках 96-луночных плоскодонных культуральных планшетов.

Количество клеток, вносимых в каждую лунку планшета, должно быть достаточным для дальнейшего экспоненциального роста клеточной культуры и образования полноценного монослоя при вышеуказанных условиях культивирования в течение 24-48 ч.

Готовят серию разведений испытуемого препарата в среде для разведений интерферона с содержанием 2 – 5 % сыворотки (на 4 разведения выше и ниже предполагаемого титра активности). Параллельно готовят такие же разведения СО в среде для разведения интерферона. Рабочие разведения ИП и СО должны быть указаны в нормативной документации.

Из лунок планшетов с клеточным монослоем удаляют ростовую среду и вносят приготовленные разведения ИП и соответствующего СО, используя на каждое разведение не менее 4-х лунок с культурой клеток.

Возможно внесение ИП и СО в лунки планшета до внесения культуры клеток. В этом случае клеточный монослой будет формироваться с внесённым интерфероном.

Для контроля дозы индикаторного вируса оставляют 16 лунок с культурой клеток, а для контроля состояния монослоя клеток – 4 лунки. В эти 20 лунок вносят поддерживающую среду.

96-луночные планшеты с культурой клеток, разведениями ИП и СО инкубируют в течение 24-48 ч при температуре (37±1) 0 С в атмосфере с (5,0±0,5) % СО2. Затем в каждую лунку с ИП и соответствующим СО вносят вирусную суспензию, содержащую рассчитанную заранее дозу индикаторного вируса100 ТЦД50. В лунки контроля клеток вносят такой же объем поддерживающей среды.

Определение дозы вируса-индикатора

Определение дозы индикаторного вируса начинают с установления его активности.

Для определения активности вируса-индикатора готовят десятикратные разведения вируса в поддерживающей среде (от 10 -1 до 10 -8 ). Из лунок 96-луночного планшета с клеточным монослоем удаляют ростовую среду. После этого вносят в лунки планшета, используемые для определения дозы вируса, поддерживающую среду в объеме, равном объему испытуемого образца. Затем вносят приготовленные разведения индикаторного вируса (не менее, чем по 4 лунки на каждое разведение) в объеме, равном объему внесенной до этого поддерживающей среды. 96-луночный планшет с разведениями вируса инкубируют в течение 24-48 ч при температуре (37±1) 0 С в атмосфере с (5,0±0,5) % СО2. За титр (активность) вируса принимают величину, обратную разведению вируса, при котором клеточный монослой в 50 % лунок оказался полностью пораженным цитопатическим действием. Титр вируса выражают в тканевых цитопатических дозах – ТЦД50/мл.

Активность вируса вычисляют методом Спирмена-Кербера по формуле:


,

где: LgED50– десятичный логарифм титра вируса;

Dmax – десятичный логарифм разведения, ниже которого произошла 100 % гибель клеток (+);

dдесятичный логарифм интервала между разведениями (=1,0);

nчисло лунок, приходящееся на каждое разведение вируса (=4);

р число лунок, давших гибель (+) в разведении, ниже которого произошла 100 % гибель клеток, и последующих разведениях.

После установления активности вируса производят подсчёт дозы для последующего внесения в лунки с испытуемым препаратом (100 ТЦД50).

Одновременно с внесением вируса-индикатора осуществляют контроль взятой дозы вируса на 16-ти лунках с культурой клеток (по 4 лунки на каждое разведение вируса).

Вносят вирус, начиная с разведения, соответствующего 100 ТЦД50, и до разведения, соответствующего 0,1 ТЦД50 с коэффициентом разведения равным 10.

Лунки с культурой клеток для оценки состояния монослоя клеток остаются интактными.

После внесения индикаторного вируса в дозе 100 ТЦД50 96-луночный планшет инкубируют в течение 24-48 ч при температуре (37±1) 0 Св атмосфере с (5,0±0,5) % СО2 до появления первых признаков цитопатических изменений в клеточном монослое с индикаторным вирусом в дозе 1 ТЦД50. Монослой в лунках с 0,1 ТЦД50 индикаторного вируса должен соответствовать состоянию клеток в контрольных лунках.

Учёт активности интерферона осуществляют через 24-48 ч при выполнении следующих условий:

доза внесённого вируса соответствует 100 ТЦД50;

в лунках с клетками и минимальными концентрациями ИП и СО, зараженными индикаторным вирусом, наблюдается практически полный цитопатический эффект (80 100 %);

в лунках с контролем клеток отсутствуют признаки дегенерации.

Учёт активности интерферона осуществляют визуально или инструментально.

Визуальный учет активности интерферона производится микроскопически при 100-кратном увеличении через 24-48 ч после внесения индикаторного вируса. За титр интерферона принимают величину, обратную разведению препарата, при котором клеточная культура в 50 % лунок полностью защищена от цитопатического действия вируса.


Титр интерферона вычисляют методом Спирмена-Кербера по формуле: ,

где: Dmax – двоичный логарифм разведения, ниже которого произошла 100 % защита ();

dдвоичный логарифм интервала между разведениями (=1,0);

nчисло лунок на каждую дозу (=4);

р число лунок, давших защиту () в разведении, ниже которого произошла 100 % защита, и последующих разведениях.

Противовирусную активность интерферона (Ах) в исследуемом образце в МЕ вычисляют по формуле:


,

где: Асо противовирусная активность СО интерферона в МЕ;

Инструментальный учет активности интерферонапредполагает селективное окрашивание живых клеток, защищенных интерфероном от действия вируса, элюирование красителя, фотометрирование оптической плотности элюата и статистическую обработку результатов с помощью метода параллельных линий.

Как правило, результаты исследования снижения цитопатического эффекта соответствуют сигмоидальному графику доза-ответ: зависимость значений оптической плотности элюата ИП и СО от логарифма их разведения.

При расчете активности интерферона по сигмоидальным кривым ИП и СО должны быть соблюдены следующие условия:

Измеренные оптические плотности для ИП и СО должны находиться в одном диапазоне оптических единиц, ограниченном значениями оптической плотности, измеренными в лунках контроля клеток и вируса;

Полученные данные должны отвечать требованиям к параллельности, линейности и величине угла наклона кривых доза-ответ для СО и ИП, указанным в нормативной документации.

Используя линейный участок графика, рассчитывают титр ИП и СО, а затем рассчитывают активность интерферона по формуле:


,

где: Асо противовирусная активность СО интерферона в МЕ;

ах титр ИП, то есть разведение ИП, в котором наблюдается 50 %-е поражение клеточного монослоя индикаторным вирусом;

асо титр СО, то есть разведение СО, в котором наблюдается 50 %-е поражение клеточного монослоя индикаторным вирусом.

Препараты, предназначенные для фармацевтического применения и включающие фармакологические активные компоненты, испытывают на животных, растениях и микроорганизмах. Первый шаг состоит в том, что устанавливают вид кривой " доза-эффект ". Под этим понимают геометрическое представление измеренных реакций в зависимости от дозы медикамента в системе координат, по оси абсцисс которой откладывается доза, а по оси ординат — реакция ( чаще всего интенсивность или частота).

Различают альтернативные и количественные кривые " доза-эффект ", в зависимости от того, альтернативную или количественную оценку реакции получают на их основе.

Пример альтернативного соотношения " доза-эффект ": в опытах на токсичность выборкам мышей вводят различные концентрации яда (токсина); по прошествии определенного времени подсчитывают, сколько мышей выжило, сколько умерло. Результатом опыта является "Да" или "Нет", "Все" или "Никто", следовательно, альтернатива .

Пример количественного соотношения " доза-эффект ": несколько групп каплунов получают каждая определенную дозу различно замешанных производных тестостерона; эффект измеряется увеличением длины и высоты гребешка. Результат опыта имеет, следовательно, количественное выражение .

В фармакологии и токсикологии важно понятие средней эффективности дозы )" />
, под которой понимается доза, вызывающая эффект у половины лечащихся индивидов. Ее оценка осуществляется по альтернативным зависимостям " доза-эффект ". По кривой накопленных процессов или накопленной функции распределения, для которой в большинстве случаев используют логарифмический масштаб по оси абсцисс, можно установить, у какого процента животных при этой и больших дозах обнаружен эффект и у какого процента при этой и меньших дозах не обнаружена реакция . Симптом может быть смерть или выживание (для ядов 50% — летальная доза, " />
— доза, при которой погибает 50% подопытных животных).

ED_<100></p>
<p>Можно также контролировать другой симптом, как, например, неспособность к управлению автомобилем при алкогольных дозах (содержание алкоголя в крови в долях процента) или наступление наркоза при дозировании наркотизирующих веществ.
— наименьшая доза, при которой следует ожидать 100% -ного действия наркоза.

Определение " />
(соответственно " />
) в большинстве случаев происходит с помощью пробит-анализа. Поскольку этот метод требует значительного объема вычислений, разработан ряд более простых, более пригодных для обычных исследований способов, которые позволяют получить математическое ожидание и дисперсии по зависимости " доза-эффект ". При трех нижеследующих условиях значение " />
получают приближенно:

  1. дозы симметрично сгруппированы относительно среднего значения (значения накопленных процентов определены от 0 до 100%);
  2. отличие фаз друг от друга, или логарифм отношения для каждой из двух последовательных доз, должны поддерживаться постоянными;
  3. отдельные дозы должны быть распределены по одинаковому числу индивидов.

Рекомендуется выбирать для каждой отдельной дозы максимум 6 индивидов, и если в распоряжении имеется больше индивидов — уменьшать разницу между дозами.

Оценка средней эффективности или летальной дозы по методу Спирмена-Кербера

Метод Спирмэна – Кербера (Bross, 1950, Cornfield, Mantel, 1950, Brown, 1961) представляет собой приближенный непараметрический метод, который позволяет быстро получить очень хорошие оценки математического ожидания и стандартного отклонения. Если распределение симметрично, то оценивают значение медианы – медианную эффективную дозу или медианную летальную дозу, равные дозам, при которых у 50% подопытных животных обнаруживается реакция или наступает смерть. При упомянутых выше условиях и дополнительной гипотезе, что данный тип распределения скорее нормальный, чем логарифмически нормальный, справедливо

LD_\text< или >ED_=m=x_k-d(S_1-1/2)
( 13.4)

При этом означает наименьшую дозу, начиная с которой всегда наблюдается 100%-ная реакция ; — отличие доз друг от друга; — сумарная доля реагирующих индивидов (при положительной реакции, см. табл. 13.1).

Стандартное отклонение , соответствующее " />
, оценивают по формуле

S_<LD_<50>>\text< или >S_>=s_m=d\sqrt
( 13.5)

S_2

в которой — сумма непрерывно суммируемых накопленных долей реагирующих индивидов.

Препараты, предназначенные для фармацевтического применения и включающие фармакологические активные компоненты, испытывают на животных, растениях и микроорганизмах. Первый шаг состоит в том, что устанавливают вид кривой " доза-эффект ". Под этим понимают геометрическое представление измеренных реакций в зависимости от дозы медикамента в системе координат, по оси абсцисс которой откладывается доза, а по оси ординат — реакция ( чаще всего интенсивность или частота).

Различают альтернативные и количественные кривые " доза-эффект ", в зависимости от того, альтернативную или количественную оценку реакции получают на их основе.

Пример альтернативного соотношения " доза-эффект ": в опытах на токсичность выборкам мышей вводят различные концентрации яда (токсина); по прошествии определенного времени подсчитывают, сколько мышей выжило, сколько умерло. Результатом опыта является "Да" или "Нет", "Все" или "Никто", следовательно, альтернатива .

Пример количественного соотношения " доза-эффект ": несколько групп каплунов получают каждая определенную дозу различно замешанных производных тестостерона; эффект измеряется увеличением длины и высоты гребешка. Результат опыта имеет, следовательно, количественное выражение .

В фармакологии и токсикологии важно понятие средней эффективности дозы )" />
, под которой понимается доза, вызывающая эффект у половины лечащихся индивидов. Ее оценка осуществляется по альтернативным зависимостям " доза-эффект ". По кривой накопленных процессов или накопленной функции распределения, для которой в большинстве случаев используют логарифмический масштаб по оси абсцисс, можно установить, у какого процента животных при этой и больших дозах обнаружен эффект и у какого процента при этой и меньших дозах не обнаружена реакция . Симптом может быть смерть или выживание (для ядов 50% — летальная доза, " />
— доза, при которой погибает 50% подопытных животных).

ED_<100></p>
<p>Можно также контролировать другой симптом, как, например, неспособность к управлению автомобилем при алкогольных дозах (содержание алкоголя в крови в долях процента) или наступление наркоза при дозировании наркотизирующих веществ.
— наименьшая доза, при которой следует ожидать 100% -ного действия наркоза.

Определение " />
(соответственно " />
) в большинстве случаев происходит с помощью пробит-анализа. Поскольку этот метод требует значительного объема вычислений, разработан ряд более простых, более пригодных для обычных исследований способов, которые позволяют получить математическое ожидание и дисперсии по зависимости " доза-эффект ". При трех нижеследующих условиях значение " />
получают приближенно:

  1. дозы симметрично сгруппированы относительно среднего значения (значения накопленных процентов определены от 0 до 100%);
  2. отличие фаз друг от друга, или логарифм отношения для каждой из двух последовательных доз, должны поддерживаться постоянными;
  3. отдельные дозы должны быть распределены по одинаковому числу индивидов.

Рекомендуется выбирать для каждой отдельной дозы максимум 6 индивидов, и если в распоряжении имеется больше индивидов — уменьшать разницу между дозами.

Оценка средней эффективности или летальной дозы по методу Спирмена-Кербера

Метод Спирмэна – Кербера (Bross, 1950, Cornfield, Mantel, 1950, Brown, 1961) представляет собой приближенный непараметрический метод, который позволяет быстро получить очень хорошие оценки математического ожидания и стандартного отклонения. Если распределение симметрично, то оценивают значение медианы – медианную эффективную дозу или медианную летальную дозу, равные дозам, при которых у 50% подопытных животных обнаруживается реакция или наступает смерть. При упомянутых выше условиях и дополнительной гипотезе, что данный тип распределения скорее нормальный, чем логарифмически нормальный, справедливо

LD_\text< или >ED_=m=x_k-d(S_1-1/2)
( 13.4)

При этом означает наименьшую дозу, начиная с которой всегда наблюдается 100%-ная реакция ; — отличие доз друг от друга; — сумарная доля реагирующих индивидов (при положительной реакции, см. табл. 13.1).

Стандартное отклонение , соответствующее " />
, оценивают по формуле

S_<LD_<50>>\text< или >S_>=s_m=d\sqrt
( 13.5)

S_2

в которой — сумма непрерывно суммируемых накопленных долей реагирующих индивидов.

Ключевые слова: респираторно-синтициальный вирус; РСВ-инфекции; противовирусные препараты.

Введение

Вирусные инфекции нижних отделов респираторного тракта являются одной из основных причин заболеваемости и смертности среди детей, людей пожилого возраста и лиц с иммунодефицитными состояниями. Респираторно-синцитиальный вирус (РСВ) – это РНК-содержащий вирус из семейства Paramyxoviridae , вызывающий заболевания нижних дыхательных путей. Ежегодно РСВ, наравне с вирусом гриппа, ответственен за значительную долю случаев инфекционных респираторных заболеваний по всему миру. Наибольшая частота встречаемости заболеваний, вызываемых РСВ, имеет место среди детей младшего возраста, в том числе новорожденных. РСВ является наиболее частой причиной бронхитов, бронхиолитов и пневмоний у новорожденных детей, что обусловливает высокий риск для жизни ребенка и приводит к необходимости госпитализации [1]. Эпидемии РСВ, приходящиеся преимущественно на осенне-зимний период, по данным ВОЗ (Всемирной организации здравоохранения), охватывает более 60% детей, из которых 80% – дети 1-го года жизни. До 70% случаев бронхиолитов у детей преимущественно в тяжелой форме развиваются в результате осложнения инфекции, вызванной РСВ. Ежегодно в мире регистрируется до 1 млн смертельных исходов от РСВ-инфекции [2].

Материал и методы

Клеточная линия, питательные среды, штамм вируса

Исследование проводилось на культуре клеток эмбриональной почки макаки МА-104, которая является чувствительной к РСВ [5]. Для культивирования клеток использовалась полная среда DMEM, содержащая 600 мг/л L-глутамина, 80 мг/л гентамицина, 20 mM буфера Hepes, 10% фетальной бычьей сыворотки. Для заражения клеток использовался респираторно-синцитиальный вирус штамм A2(источник: Airway Disease Infection Section and MRc & Asthma UK centre in Allergic Mechanisms of Asthma national Heart and Lung Institute, Imperial college London, UK). Исходный титр вируса 1–3×10 6 TCID50/мл. После заражения клетки культивировали в поддерживающей бессывороточной среде DMEM (1200 мг/л L-глутамина, 80 мг/л гентамицина, 20 mM буфера Hepes).

Оценка цитотоксического действия растворителя.

В связи с тем, что в исследовании тестировался водный раствор Эргоферона, для исключения цитотоксического действия растворителя (воды) на клетки (осмотическая гибель клеток) на первом этапе исследования проводился подбор оптимального разведения растворителя средой для культивирования.
Подобранный объем растворителя при добавлении к клеткам не должен вызывать их не специфическую гибель и влиять на их жизнеспособность. Это позволяет исключить влияние растворителя на клетки при изучении противовирусного действия препарата в основном эксперименте. Осмотическая цитотоксичность воды оценивалась колориметрическим методом, основанным на митохондри-альном метаболизме клеток - МТТ-тест (соль метилтетразолия, Sigma). Для проведения МТТ-теста клетки засеивали цв 96-луночный планшет в количестве 2×10 4 кл./лун. в объеме 100 мкл полной питательной среды DMEM. Подсчет концентрации клеток осуществляли с использованием камеры Горяева и инвертированного микроскопа. Инкубировали 1 сутки в 5% атмосфере СО2 при 37°С до образования монослоя. Затем к клеткам добавляли препарат без разведения, в разведениях 1/2, 1/4, 1/8, 1/16 и 1/32 (от общего объема пробы). В качестве положительного контроля использовали стерильную дистиллированную воду, которая вызывает осмотическую гибель клеток. В качестве отрицательного контроля использовали неразведенную питательную среду DMEM без добавления каких-либо препаратов. Инкубировали 1 сутки в 5% атмосфере СО2 при 37°С. Затем в лунки планшета, не удаляя среду, добавляли 25 мкл MTT в концентрации 4 мг/ мл в фосфатно-солевом буфере. Инкубировали 4 часа в 5% атмосфере СО2 при 37°С. Затем добавляли 50 мкл раствора додецилсульфата натрия (20% SDS на воде с 0,02 H2SO4). Инкубировали 18 часов в 5% атмосфере СО при 37°С. Измеряли оптическую плотность при 570 и 650 нм. По результатам данного эксперимента определяли разведение, в котором не наблюдали осмос-опосредованной неспецифической гибели или ингибирования роста клеток.
Соответствующий объем растворителя использовали в качестве максимального объема препаратов, добавляемых к клеткам, в последующих экспериментах по определению противовирусной активности.

Оценка противовирусной активности Эргоферона.

Тестирование образцов проводилось на культуре клеток эмбриональной почки макаки МА-104. В качестве контроля использовалась вода очищенная, прошедшая технологическую обработку аналогичную Эргоферону (Контроль 1), и вода очищенная без какой-либо технологической обработки (Контроль 2). Клетки засеивали в 96-луночный планшет в количестве 20 тыс. кл. на лунку в объеме 100 мкл полной среды DMEM. На второй день эксперимента готовили смесь исследуемых образцов и вируса РСВ-A2 в объемном соотношении 1:3 (125 мкл препарата и 375 мкл вируса с титром 1-3 х 10 6 TCID50/мл) и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа. Перед внесением смеси образцов и вируса в культуру клеток планшеты с клетками отмывали стерильным физиологическим раствором 100 мкл/лунку, после чего вносили по 100 мкл/лунку бессывороточной среды.

Затем в культуру клеток вносили смесь вируса и исследуемых образцов и титровали, разводя смесь в десять раз. Использовали следующие разведения смеси: без разведения, 1/10, 1/100, 1/1тыс, 1/10 тыс., 1/100 тыс., 1/1 млн. Каждая точка разведения ставилась в четырех повторах. После внесения смеси вируса и препаратов в лунки, клетки инкубировали в течение 3-5 суток в СО2-инкубаторе при 37°С до появления цитопатического действия. После чего проводили оценку противовирусной активности препарата визуально с помощью световой микроскопии, а именно подсчитывали количество бляшек (синцитиев), образовавшихся на монослое в результате репродукции вируса. Эксперимент был поставлен в 10 независимых повторах.

Статистическая обработка результатов.

Для оценки показателей цитотоксичности вируса РСВ в отношении культуры клеток МА-104 использовался метод пробит-анализа, являющийся разновидностью регрессионного анализа для бинарных показателей. Пробит-модель позволяет оценить вероятность гибели/выживания клеток при заданном значении факторов, в нашем случае - разведении вируса. Использованный метод является более сложным по сравнению с часто применяющимся методом Кербера-Спирмена, но вместе с этим и более точным. По полученным данным строились кривые доза-эффект, по которым определялись разведения вируса, оказывающие цитопатический эффект на 10%, 50% и 90% клеток соответственно.

Результаты отражают показатели TCID10, TCID50 и TCID90, представляемые в виде прогнозируемого значения степени разведения (титра) вируса в экспериментальной культуре клеток с 95% доверительными интервалами. Таким образом, протективное действие препарата должно проявляться в снижении титра вируса на уровне TCID10, TCID50 или TCID90, т.е. возникновение цитопатогенного эффекта на указанных уровнях должно происходить в культуре с бóльшей концентрацией вируса по сравнению с Контролями 1 и 2.

Полученные кривые и рассчитанные показатели цито-токсичности в группах Эргоферона, Контроля 1 и Контроля 2 сравнивались между собой методом нелинейных смешанных моделей. Полученные отличия считались статистически значимыми при p Pезультаты и обсуждение

Рис. 1. Изменение оптической плотности в зависимости от разведения растворителя
питательной средой в МТТ-тесте.
Для контролей линиями указаны показатели оптической плотности для раствора контроля без разведения (неразведенная питательная среда DMEM и стерильная дистиллированная вода соответственно).

Противовирусная активность исследуемых образцов при разведении 1/4.
Титр вируса на уровне TCID10, TCID50 и TCID90 по данным пробит-анализа

Методом нелинейных смешанных моделей было показано статистически достоверное (p 10и TCID50в группе Эргоферона по сравнению с Контролями. Значения TCID10 составили 99,3 [64,6–194,6](×10 3 ) /мл против 261,5 [160,7– 571,7] (×10 3 )/мл и 264,5 [153,6-614,99] (×10 3 ) /мл для Эргоферона, Контроля 1 и Контроля 2 соответственно. Значения TCID50 составили 28,03 [19,5–40,4](×10 3 ) /мл и 58,8 [39,7– 87,5](×10 3 ) /мл, для Эргоферона, Контроля 1 и Контроля 2 соответственно. Полученные данные свидетельствуют о наличии у Эргоферона противовирусного эффекта в отношении вируса РСВ штамма A2.

Рис. 2. Противовирусная активность Эргоферона: показатели гибели клеток MA-104,
зараженных разными дозами респираторно-синцитиального вируса.

Представлены расчетные значения титра вируса на уровнях TCID10, TCID50 и TCID90, полученные методом пробит-анализа на основании выживаемости клеток при заражении вирусом РСВ штамма А2 после его инкубации с образцами (в разведении 1/4) в течение 1 ч.
* – титр вируса на уровне TCID50 в группе Эргоферона статистически значимо ниже такового в группах Контроля 1 и 2 (p 10 в группе Эргоферона статистически значимо ниже такового в группах Контроля 1 и 2 (p

Предыдущие исследования показали способность Эргоферона оказывать протективное действие на клетки in vitro , при их заражении различными инфекционными дозами РСВ: препарат ингибировал репликацию РСВ, снижая вирусную нагрузку на экспериментальные клетки [4]. Дизайн данного исследования предполагал изучение прямого воздействия Эргоферона на вирус путем их совместной инкубации в течение 1 часа и последующего заражения этой смесью чувствительной культуры клеток (МА-104). Более того, после внесения смеси вируса и Эргоферона в культуру клеток, проводилось ее десятичное титрование, поэтому можно говорить о том, что эффект препарата непосредственно на экспериментальную культуру клеток был незначительным в виду высокого его разведения. Это позволяет предположить, что в условиях проведенного эксперимента эффект препарата реализуется через воздействие на вирусные частицы и их инфицирующую способность.

Механизм инфицирующего действия РСВ опосредован белком вируса RSv-G, обеспечивающего адгезию к клетке [6], и RSv-F, обеспечивающего слияние оболочки вируса с мембраной клетки [7]. Показано, что с переводом в релиз-активную форму характер действия антител меняется и релиз-активные формы антител приобретают особое свойство оказывать модифицирующее действие на структуру исходного вещества, или же структурно сходные белки, вызывая конформационные изменения этих молекул, что сопровождается изменением физико-химических и биологических свойств [8]. Это позволяет предположить, что Эргоферон, содержащий антитела в релиз-активной форме, способен выполнять роль аллостерического модулятора, воздействующего на вирусные белки RSv-G и RSv-F, что снижает способность вирусных частиц связываться с клетками и проникать в них.

Заключение

Таким образом, подводя итог проведенного исследования, выявленное в данной работе прямое противовирусное действие Эргоферона в отношении РСВ позволяет утверждать, что препараты на основе релиз-активных разведений антител способны восполнить недостаток действенных противовирусных средств, т.к. они могут проявлять активность широкого спектра, как в плане целевых вирусных агентов, так и в плане реализуемых механизмов фармакологической активности.

Литература


Из локальных повреждений, вызываемых вирусами, наиболее известны бляшки (островки мертвых, не окрашенных клеток в слое окрашенных живых) в зараженных культурах клеток, залитых агаровой средой с красителем нейтральрот и оспины (некротические узелки) на ХАО куриных эмбрионов, зараженных оспенными и некоторыми другими вирусами.

Количество вируса при этом может быть измерено, соответственно, в бляшкообразуюших единицах (БОЕ) и оспообразующих единицах (ООЕ): 1 БОЕ = доза вируса, вызвавшая образование одной бляшки; 1 ООЕ = доза вируса, вызвавшая образование одной оспины. Методика определения титра вируса в БОЕ (ООЕ) заключается в следующем:

1.. Точно отмеренными и строго одинаковыми объемами исследуемого вируссодержащего материала заражают несколько культур клеток в матрасах или куриных эмбрионов на ХАО.

2. Подсчитывают количество образовавшихся в каждом матрасе бляшек или в каждом курином эмбрионе оспин.

3. Рассчитывают среднее арифметическое этого количества, которое равно количеству БОЕ или ООЕ вируса в заражающей дозе вируссодержащего материала.

4. Титр вируса (Т) рассчитывают по формуле:

Т = среднее арифметическое количество бляшек (оспин) / объем заражающей дозы х разведение вируссодержащего материала.

Считается, что счету поддаются бляшки и оспины, если их количество не превышает 50 на матрас или ХАО. Иногда, в случае высокой концентрации вируса в материале, бляшки в культуре клеток или оспины на ХАО могут сливаться, и их невозможно будет сосчитать. В таких случаях готовят несколько десятикратных разведений испытуемого материала и каждым разведением в одинаковых дозах заражают равные группы культур клеток или куриных эмбрионов, затем рассчитывают среднее арифметическое количество бляшек или оспин для каждого разведения. Титр вируса в этом случае рассчитывается по более сложной формуле:

Т = сумма средних арифметических количества бляшек (оспин) в каждом разведении / объем заражающей дозы х сумму разведений вируссодержащего материала

Метод титрования вирусов в БОЕ дает наиболее достоверные данные о концентрации вирусов, но он встречает технические трудности с подсчетом бляшек. Что касается оспин, то их использование ограничивается довольно немногочисленными вирусами, способными образовывать узелки на ХАО куриных эмбрионов.

Читайте также: