Антиген вируса лейкоза крс

Обновлено: 18.04.2024

3. БОЛЕЗНИ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

3.4. ИНСТРУКЦИЯ ПО ПРИМЕНЕНИЮ ТЕСТ-СИСТЕМЫ "ЛЕЙКОЗ" ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ВИРУСА ЛЕЙКОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА (КРС) МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ

УТВЕРЖДЕНА 19 мая 2009 г.

Тест-система "ЛЕЙКОЗ" для выявления ДНК провируса лейкоза крупного рогатого скота (bovine leukosis virus) в биологическом материале методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) выпускается в двух вариантах.

Вариант EPh - для выявления ДНК провируса лейкоза крупного рогатого скота (bovine leukosis virus) в биологическом материале методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с электрофоретической детекцией продуктов амплификации в агарозном геле.

Вариант FRT - для выявления ДНК провируса лейкоза крупного рогатого скота (bovine leukosis virus) в биологическом материале методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени.

I. ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ

1. Тест-система выпускается в двух вариантах.

Вариант EPh

В состав тест-системы "ЛЕЙКОЗ", рассчитанной на проведение 50 анализов, включая контроли, входят:

- "ДНК-сорб-В" вариант 50 - комплект реагентов для выделения ДНК из клинического материала;

- "ПЦР-комплект" вариант 50R - комплект реагентов для ПЦР-амплификации ДНК провируса лейкоза крупного рогатого скота;

- "ЭФ" вариант 200 - комплект реагентов для электрофоретической детекции продуктов амплификации в агарозном геле.

Вариант FRT

В состав тест-системы "ЛЕЙКОЗ", рассчитанной на проведение 50 анализов, включая контроли, входят:

- "ДНК-сорб-В" вариант 50 - комплект реагентов для выделения ДНК из клинического материала;

- "ПЦР-комплект" вариант FRT - комплект реагентов для ПЦР-амплификации ДНК провируса лейкоза крупного рогатого скота с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени.

1.1. Комплект реагентов "ДНК-сорб-В" вариант 50 состоит из следующих компонентов:

1 флакон, 15,0 см (мл)

Раствор для отмывки 1

1 флакон, 15,0 см (мл)

Раствор для отмывки 2

1 флакон, 50,0 см (мл)

1 пробирка, 1,25 см (мл)

ТЕ-буфер для элюции ДНК

1 пробирка, 5,0 см (мл)

Комплект реагентов рассчитан на выделение ДНК из 50 проб, включая контроли.

1.2. Комплект реагентов "ПЦР-комплект" вариант 50R состоит из следующих компонентов:

ПЦР-смесь-1-R BLV-пpoвирус, раскапана под воск в пробирки объемом 0,5 или 0,2 мл

55 пробирок по 0,005 см (мл)

1 пробирка, 0,6 см (мл)

Минеральное масло для ПЦР

1 пробирка, 2,0 см (мл)

ПКО ДНК BLV

1 пробирка, 0,1 см (мл)

ДНК а-актина КРС

1 пробирка, 0,1 см (мл)

1 пробирка, 0,5 см (мл)

Комплект реагентов рассчитан на постановку 55 реакций амплификации, включая контроли.

Дополнительно к комплекту реагентов прилагаются контрольные образцы этапа выделения:

1 пробирка, 1,2 см (мл)

1.3. Комплект реагентов "ПЦР-комплект" вариант FRT состоит из следующих компонентов:

BLV-провирус

2 пробирки по 0,3 см (мл)

1 пробирка, 0,42 см (мл)

2 пробирки, 0,02 см (мл)

ПКО ДНК BLV

1 пробирка, 0,1 см (мл)

1 пробирка, 0,5 см (мл)

Комплект реагентов рассчитан на постановку 55 реакций амплификации, включая контроли.

Дополнительно к комплекту реагентов прилагаются контрольные образцы этапа выделения:

1 пробирка, 1,2 см (мл)

1 пробирка, 1,0 см (мл)

Комплект реагентов "ЭФ" вариант 200 состоит из следующих компонентов:

Трис-боратный буфер (ТБЕ) концентрированный с бромидом этидия

1 флакон, 50,0 см (мл)

Агароза для электрофореза ДНК

2 флакона по 1,7 г

Комплект реагентов рассчитан на электрофоретический анализ 240 образцов (из расчета 100 мл геля - 5 рядов по 24 лунки).

2. Упаковка и маркировка

На пробирках (флаконах) с каждым компонентом должна быть наклеена этикетка с указанием краткого наименования компонента, количества препарата в пробирке (флаконе), номера серии и даты изготовления. Комплекты реагентов упаковывают в отдельные застегивающиеся пакеты из полиэтилена. На каждый пакет наклеивают (или вкладывают) этикетку с указанием наименования комплекта, перечня компонентов, входящих в комплект, количества пробирок каждого компонента, количества препарата в каждой пробирке (флаконе), номера серии комплекта, условий хранения, даты изготовления, срока годности.

Комплекты реагентов вкладывают в картонную коробку (пакет из полиэтилена). На каждую упаковку тест-системы наклеивают (или вкладывают) этикетку, на которой указывают: наименование предприятия-изготовителя, полное наименование тест-системы, перечень комплектов, входящих в тест-систему, номер серии, дату изготовления, срок годности, условия хранения, обозначение СТО и надпись "Для животных". В каждую упаковку вкладывают инструкцию по применению тест-системы.

3. Транспортирование и хранение

Тест-систему транспортировать при температуре от 2 до 8°С не более 5 сут. При получении разукомплектовать в соответствии с указанными температурами хранения. Комплект реагентов "ДНК-сорб-В" хранить при температуре от 2 до 25°С.

Вариант EPh.

Комплект реагентов "ПЦР-комплект" вариант 50R хранить при температуре от 2 до 8°С. Комплект реагентов "ЭФ" хранить при температуре от 18 до 25°С в защищенном от света месте.

Вариант FRT.

Комплект реагентов "ПЦР-комплект" вариант FRT (кроме ПЦР-смеси-1-FRT BLV-провирус и полимеразы (TaqF)) хранить при температуре от 2 до 8°С. ПЦР-смесь-1-FRT BLV-провирус и полимеразу (TaqF) хранить при температуре не выше -16°С. Следует избегать длительного нахождения ПЦР-смеси-1-FRT BLV-провирус на свету.

4. Срок годности тест-системы - 12 мес. с даты изготовления.

II. ПРИНЦИП МЕТОДА

5. Вариант EPh. В основе метода лежит амплификация специфического участка ДНК провируса лейкоза крупного рогатого скота (последовательности, интегрированной в ДНК лейкоцитов КРС) за счет многократного повторения циклов денатурации ДНК в исследуемой пробе, отжига специфических олигонуклеотидных затравок (праймеров) и синтеза комплементарных цепей ДНК с помощью фермента Taq-полимеразы. Для контроля качества проведения анализа вместе с последовательностью ДНК провируса (в одной пробирке) проводится амплификация эндогенного внутреннего контроля гена а-актина КРС.

Вариант FRT. В основе метода лежит амплификация специфического участка ДНК провируса лейкоза крупного рогатого скота (последовательности, интегрированной в ДНК лейкоцитов КРС) за счет многократного повторения циклов денатурации ДНК в исследуемой пробе, отжига специфических олигонуклеотидных затравок (праймеров) и зондов, меченных флуоресцентными красителями, и синтеза комплементарных цепей ДНК с помощью фермента Taq-полимеразы.

III. ОТБОР И ПОДГОТОВКА МАТЕРИАЛА ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ

6. Тест-система "ЛЕЙКОЗ" предназначена для выявления ДНК провируса лейкоза КРС в цельной крови КРС у животных старше 14-дневного возраста методом полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Вариант EPh. Продукты амплификации определяют путем электрофоретической детекции в агарозном геле.

Вариант FRT. Продукты амплификации определяют путем гибридизационно-флуоресцентной детекции в режиме реального времени.

6.1. При отборе образцов материала, а также при подготовке проб для исследования необходимо соблюдать меры, предупреждающие обсеменение объектов внешней среды, руководствуясь при этом действующими правилами и инструкциями.

6.2. Материал от каждого животного отбирают отдельными инструментами.

6.3. Для исследования используют цельную кровь.

7. Отбор материала для исследования

7.1. Кровь для исследования отбирают из хвостовой вены в стерильные пробирки с 3%-ным раствором ЭДТА из расчета 10:1 (или с цитратом натрия в стандартной концентрации). Желательно использовать одноразовые системы взятия крови "Моноветт". Закрытую пробирку с кровью несколько раз переворачивают. Пробы цельной крови используют для выделения ДНК без предварительной подготовки.

7.2. Материал доставляют в лабораторию не позднее чем через 3 дня от момента забора материала. Хранить материал следует при температуре от 2 до 8°С.

IV. ПОРЯДОК ПРОВЕДЕНИЯ ПЦР

Вариант EPh. ПЦР-анализ проводят в три этапа в отдельных помещениях (зонах).

Вариант FRT. ПЦР-анализ проводят в два этапа в отдельных помещениях (зонах).

Для работы требуются следующие материалы и оборудование.

8.1.* ЗОНА 1 - для выделения ДНК из исследуемого материала:

* Нумерация соответствует оригиналу. - Примечание изготовителя базы данных.

- ламинарный бокс (например, "БАВп-01-"Ламинар-С"-1,2", "Ламинарные системы", Россия, класс биологической безопасности II, тип А);

- твердотельный термостат для пробирок типа "Эппендорф" от 25 до 100°С (например, "ТЕРМО 24-15", "Биоком", Россия);

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ДИАГНОСТИКЕ ЛЕЙКОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

Руководитель Департамента ветеринарии Министерства сельского хозяйства Российской Федерации М.В.Кравчук 23 августа 2000 г. N 13-7-2/2130

1. Общие положения

1.1. Лейкоз крупного рогатого скота - хроническая инфекционная болезнь, вызываемая вирусом лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС). Лейкозом болеет крупный рогатый скот всех возрастов. Клинически болезнь проявляется чаще у животных в возрасте старше 4 лет.

Болезнь протекает вначале бессимптомно, затем проявляется персистентным лимфоцитозом и (или) образованием опухолевидных разрастаний в кроветворных и других органах и тканях.

После установления опухолевой природы лейкоза болезнь как у животных, так и у человека получила название гемобластозы, то есть опухолевые заболевания крови. По характеру и месту локализации опухолевых разрастаний, а также по морфологии и принадлежности пролиферирующих клеток к определенным росткам гемопоэза гемобластозы разделены на две группы:

лейкозы - системные поражения органов кроветворения, включающие лимфоидную, миелоидную, моноцитарную и недифференцированную формы;

гематосаркомы - сопровождающиеся опухолевым ростом. К ним относятся лимфосаркома, ретикулосаркома, лимфогрануломатоз и миеломная болезнь.

Возбудителем лейкоза крупного рогатого скота является опухолеродный РНК-содержащий вирус из семейства Retroviridae.

Источник возбудителя инфекции - животное, зараженное ВЛКРС.

Факторами передачи являются кровь, молоко и другие секреты и экскреты, содержащие лимфоидные клетки, инфицированные ВЛКРС.

Заражение может происходить при совместном содержании здоровых и инфицированных ВЛКРС животных.

1.2. Диагностические исследования на лейкоз проводят серологическими, молекулярно-биологическим, гематологическим, клиническим, патоморфологическим методами, методом биопробы.

1.3. Основу диагностики лейкоза крупного рогатого скота составляет серологический метод исследования - реакция диффузионной преципитации (РДП), иначе называемая реакцией иммунодиффузии в геле агара (РИД).

Из числа положительно реагирующих в РИД животных (инфицированных ВЛКРС) с помощью гематологического метода выявляют больных лейкозом.

2. Серологические методы диагностики лейкоза крупного рогатого скота

2.1. Реакция иммунодиффузии (РИД).

2.1.1. Сущность метода.

Метод основан на обнаружении в сыворотке крови животных специфических преципитирующих антител к антигенам вируса лейкоза крупного рогатого скота. Специфические антитела появляются в крови через 2-8 недель после заражения животного ВЛКРС и сохраняются в организме пожизненно.

2.1.2. Серологическому исследованию на лейкоз подвергают животных в возрасте 6 месяцев и старше. Пробы крови для исследований берут не ранее чем через 30 суток после введения животным вакцин и аллергенов, у стельных животных - за 30 суток до отела или через 30 суток после него.

2.1.3. Получение сыворотки. Сыворотки для исследования получают из крови испытуемого животного в количестве 2-3 мл и направляют в лабораторию с сопроводительным документом, в котором указывают название хозяйства, номер (кличку), возраст, пол, породу животного.

Кровь (для получения сыворотки) берут в бактериологические пробирки, выдерживают 1-2 ч в теплом месте (не выше 40°С). Для лучшего отделения сыворотки образовавшийся сгусток обводят в пробирке профломбированной после каждой пробы стальной спицей (проволокой). После этого пробирки выдерживают в течение 20-24 ч при 4-10°С. Полученные пробы сыворотки сливают в пробирки Флоринского (достаточно 2-3 мл) и маркируют.

При невозможности быстрого исследования подготовленные сыворотки хранят в замороженном состоянии.

2.1.4. Для постановки РИД используют набор для серологической диагностики лейкоза крупного рогатого скота (ТУ 10-19-442-87), в состав которого входят: сухой специфический антиген вируса лейкоза крупного рогатого скота, состоящий из гликопротеидного gр-51 и полипептидного р-24 антигенов, разбавитель антигена, специфическая преципитирующая сыворотка (СПС) к вирусу лейкоза, солевая смесь агара (ССА) и разбавитель ССА, контрольные сыворотки: отрицательная, положительная, слабоположительная и положительная с антителами к р-24 антигену ВЛКРС.

Оборудование и реактивы:

- чашки Петри диаметром 100 мм;

- стандартный штамп-пробойник для просечения лунок в агаре;

- пипетки пастеровские или автоматические со сменными наконечниками;

- хлорид натрия (х.ч.);

2.1.5. Постановка РИД.

Подготовку компонентов реакции к работе осуществляют в соответствии с "Наставлением по применению набора для серологической диагностики лейкоза крупного рогатого скота". Антиген растворяют в 5 см разбавителя. Растворенный антиген хранят при температуре 4°С не более двух недель.

Разбавитель ССА и солевую смесь агара переносят в колбу и приливают дистиллированную воду до объема 200 см, затем колбу помещают в водяную баню и выдерживают до полного расплавления гранул агара. Расплавленный агаровый гель, имеющий температуру 50-70°С, разливают слоем 2-3 мм (12-15 мл) в обезжиренные чашки Петри и оставляют их приоткрытыми при комнатной температуре в течение 1 ч. После застывания агара специальным штампом-пробойником делают лунки в геле, не допуская образования трещин между ними и отслоения агара от дна чашки. В каждой чашке делают по четыре фигуры, каждая из которых состоит из семи лунок: одна в центре, остальные по периферии. Диаметр каждой лунки составляет 7 мм, расстояние между центральной и периферическими лунками - 3 мм. Образовавшиеся диски геля удаляют из лунок канюлей, соединенных с вакуумным насосом.

Антиген, контрольные и испытуемые сыворотки вносят в лунки каждой фигуры пастеровскими или автоматическими пипетками со сменными наконечниками.

Антиген (А) вносят в центральную лунку, две диаметрально противоположные лунки заполняют контрольной сывороткой (КС). Оставшиеся в фигуре 4 периферические лунки (1, 2, 3, 4) заполняют испытуемыми сыворотками. Лунки заполняют доверху, не допуская переливания жидкости через край. После заполнения всех лунок чашки Петри закрывают крышками и инкубируют во влажной камере при температуре 22-27°С.

2.1.6. Учет и оценка результатов реакции.

2.1.6.1. Реакцию учитывают не ранее чем через 48 ч и не позднее чем через 96 ч. Чашки просматривают на темном фоне, направляя сфокусированный луч осветителя на дно чашки под углом 30-45°. Специфичность реакции оценивают по контрольной линии преципитата. Если она отсутствует или слабо выражена, то реакцию следует повторить.

Специфическая линия преципитации, формируемая преципитирующей контрольной сывороткой и антигеном, должна быть четкой, иметь форму прямой, располагаться на одинаковом расстоянии от лунок с антигеном и контрольной сывороткой.

Неспецифической считают линию преципитации, которая образуется между лунками с испытуемой сывороткой и антигеном, но не сливается с контрольной линией преципитации, а пересекает ее или упирается в нее, образуя угол.

2.1.6.2. Оценка результатов.

В зависимости от наличия специфических антител против антигенов ВЛКРС в испытуемой сыворотке реакцию оценивают как положительную или отрицательную.

Положительной считают реакцию, если между лунками с антигеном и испытуемой сывороткой образуется полоса преципитации, которая соединяется с полосой преципитации контрольной сыворотки, образуя непрерывную линию, то есть идентична ей (рис.1 - не приводится, поз.1):

- если линия преципитации между лунками с испытуемой сывороткой и антигеном отсутствует, но контрольная линия преципитирующей сыворотки образует вблизи лунки с испытуемой линией изгиб, направленный в сторону лунки с антигеном (рис.1, поз.2), - слабоположительная сыворотка;

- если контрольная линия значительно укорочена со стороны лунки с испытуемой сывороткой и имеет размытый изгиб к лунке с антигеном или образует линию преципитации, расположенную очень близко от лунки с антигеном (рис.1, поз.2), - резко положительная сыворотка.

Положительно реагирующая сыворотка может образовывать вторую линию преципитации, которая располагается ближе к лунке с испытуемой сывороткой. Эта линия указывает на наличие в сыворотке преципитирующих антител против второго антигена (р-24) ВЛКРС (рис.1, поз.3).

При образовании толстой, короткой, без загибов контрольной линии преципитации, не доходящей до лунки с испытуемой сывороткой, необходимо провести раститровку этой испытуемой сыворотки физраствором до получения результата, который можно будет оценить как отрицательный, положительный или неспецифический. Для этого необходимо физиологический раствор в объеме 100-500 мкл разлить в пробирки или в лунки стандартных пластиковых плат для постановки серологических реакций (количество пробирок или лунок соответствует числу необходимых разведений). В первую пробирку или лунку с физраствором внести такой же объем сыворотки, тщательно перемешать и перенести той же пипеткой в том же объеме в следующую пробирку или лунку, затем после перемешивания - в следующую и т.д. В результате в первой пробирке или лунке испытуемая сыворотка разведена в 2 раза, во второй - в 4 раза, в третьей - в 8 раз и т.д.

Реакцию считают отрицательной, если контрольная линия продолжается до лунки с испытуемой сывороткой без загиба (рис.1, поз.4).

В случаях, когда линия преципитации плохо просматривается или имеется зона опалесценции вокруг лунок, реакцию следует переставить.

Сдвиг контрольной линии преципитации в сторону лунки с антигеном или с контрольной сывороткой указывает на нарушение соотношения антигена и антител в тест-системе. В этом случае необходимо использовать другую серию диагностического набора.

2.1.7. Животных, сыворотки крови которых дали положительный результат в РИД, признают зараженными вирусом лейкоза, и их необходимо исследовать гематологическим методом.

2.2. Метод иммуноферментного анализа (ИФА).

2.2.1. Сущность метода. Иммуноферментный анализ основан на иммунохимической реакции взаимодействия антиген-антитело и использовании в качестве индикатора этой реакции маркированных ферментами антител или антигенов.

Существует две модификации иммуноферментного анализа: непрямой и конкурентный.

Метод непрямого иммуноферментного анализа основан на связывании специфических к вирусу лейкоза антител с антигеном ВЛКРС, адсорбированным на стенках лунок планшета для микротитрования. Связавшиеся антитела выявляют с помощью видоспецифических антител, меченых ферментом (пероксидазой), с последующим ферментативным превращением бесцветного субстрата пероксидазой в окрашенный продукт. Интенсивность окраски прямо пропорциональна содержанию антител к ВЛКРС в сыворотке крови.

В основе конкурентного иммуноферментного анализа лежит способность антител к ВЛКРС, содержащихся в испытуемой сыворотке, блокировать связывание антигена ВЛКРС с антителами к ВЛКРС, иммобилизованными (адсорбированными) на стенках лунок планшетов для микротитрования (МТП). Антиген ВЛКРС, связавшийся с иммобилизованными антителами, выявляют с помощью антител к ВЛКРС, меченных пероксидазой (конъюгатом антител с пероксидазой) и последующего ферментативного превращения бесцветного субстрата пероксидазы в окрашенный продукт. В том случае, если испытуемый материал не содержал антител к ВЛКРС, интенсивность окрашивания максимальна. Антитела к ВЛКРС в испытуемом материале снижают интенсивность окрашивания прямо пропорционально их содержанию.

2.2.2. Материалы и оборудование.

2.2.2.1. Материалом для исследования методом иммуноферментного анализа может служить сыворотка крови, секрет вымени сухостойных коров, молозиво и молоко.

При исследовании сывороток крови их получают, как изложено в п.2.1.3. Сыворотки пригодны для использования в течение 10 дней при температуре хранения +4°С. Срок годности сыворотки, хранящейся при температуре -20°С и ниже, не ограничен.

Бактериально загрязненные, разложившиеся или сильно гемолизированные сыворотки непригодны для исследования.

2.2.2.2. При постановке реакции используют стандартные коммерческие диагностические наборы согласно прилагаемому к ним наставлению по применению.

Для проведения исследования применяют:

- микропипетки одноканальные автоматические;

- фотометр одно- или многоканальный с автоматической регистрацией результатов. Рекомендуется использовать анализатор иммуноферментный фотоэлектрический АИФ-Ц-01С;

- микротитровальные пластмассовые (полистироловые) планшеты с 96 лунками;

- автоматическое или полуавтоматическое оборудование для промывания пластин;

- термостат, обеспечивающий температуру 37+/-0,5°С;

- пипетки градуированные вместимостью 1 и 10 см.

2.2.3. Непрямой иммуноферментный анализ для выявления антител к вирусу лейкоза.

2.2.3.1. В состав диагностического набора входят:

- антиген вируса лейкоза лиофилизированный и разбавитель антигена;

- конъюгат антител против иммуноглобулинов крупного рогатого скота с пероксидазой или другим ферментом, жидкий или лиофилизированный, и разбавитель конъюгата;

- сыворотки контрольные - отрицательная и положительная (слабоположительная), лиофилизированные или жидкие;

- разбавитель для сывороток и промывающий раствор, содержащий детергент и инертный белок;

3. БОЛЕЗНИ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

3.1. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ДИАГНОСТИКЕ ЛЕЙКОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

УТВЕРЖДЕНЫ 23 июля 2000 г., N 13-7-2/2130

1. Общие положения

После установления опухолевой природы лейкоза болезнь как у животных, так и у человека получила название гемобластозы (опухолевые заболевания крови). По характеру и месту локализации опухолевых разрастаний, а также по морфологии и принадлежности пролиферирующих клеток к определенным росткам гемопоэза гемобластозы разделены на две группы:

- лейкозы - системные поражения органов кроветворения, включающие лимфоидную, миелоидную, моноцитарную и недифференцированную формы;

- гематосаркомы - сопровождающиеся опухолевым ростом. К ним относятся лимфосаркома, ретикулосаркома, лимфогранулематоз и миеломная болезнь.

Возбудителем лейкоза крупного рогатого скота является опухолеродный РНК-содержащий вирус из семейства Retroviridae.

Источник возбудителя инфекции - животное, зараженное ВЛКРС.

Заражение может происходить при совместном содержании здоровых и инфицированных ВЛКРС животных.

1.2. Диагностические исследования на лейкоз проводят серологическим, молекулярно-биологическим, гематологическим, клиническим, патоморфологическим методами, методом биопробы.

2. Серологические методы диагностики лейкоза крупного рогатого скота

2.1. Реакция иммунодиффузии (РИД)

2.1.1. Сущность метода

Метод основан на обнаружении в сыворотке крови животных специфических преципитирующих антител к антигенам вируса лейкоза крупного рогатого скота. Специфические антитела появляются в крови через 2. 8 недель после заражения животного ВЛКРС и сохраняются в организме пожизненно.

2.1.2. Серологическому исследованию на лейкоз подвергают животных в возрасте 6 мес. и старше. Пробы крови для исследований берут не ранее чем через 30 сут после введения животным вакцин и аллергенов, у стельных животных - за 30 сут до отела или через 30 сут после него.

2.1.3. Получение сыворотки. Сыворотки для исследования получают из крови испытуемого животного в количестве 2. 3 мл и направляют в лабораторию с сопроводительным документом, в котором указывают название хозяйства, номер (кличку), возраст, пол, породу животного.

Кровь (для получения сыворотки) берут в бактериологические пробирки, выдерживают 1. 2 ч в теплом месте (не выше 40°С). Для лучшего отделения сыворотки образовавшийся сгусток обводят в пробирке профломбированной после каждой пробы стальной спицей (проволокой). После этого пробирки выдерживают в течение 20. 24 ч при 4. 10°С. Полученные пробы сыворотки сливают в пробирки Флоринского (достаточно 2. 3 мл) и маркируют.

При невозможности быстрого исследования подготовленные сыворотки хранят в замороженном состоянии.

2.1.4. Для постановки РИД используют набор для серологической диагностики лейкоза крупного рогатого скота (ТУ 10-19-442-87*), в состав которого входят сухой специфический антиген вируса лейкоза крупного рогатого скота, состоящий из гликопротеидного gp-51 и полипептидного р-24 антигенов, разбавитель антигена, специфическая преципитирующая сыворотка (СПС) к вирусу лейкоза, солевая смесь агара (ССА) и разбавитель ССА, контрольные сыворотки: отрицательная, положительная, слабоположительная и положительная с антителами к р-24 антигену ВЛКРС.

* ТУ не приводятся. За информацией о документе Вы можете обратиться в Службу поддержки пользователей. - Примечание изготовителя базы данных.

Оборудование и реактивы:

- чашки Петри диаметром 100 мм;

- стандартный штамп-пробойник для высечения лунок в агаре;

- пипетки пастеровские или автоматические со сменными наконечниками;

- хлорид натрия (х.ч.);

2.1.5. Постановка РИД

Разбавитель ССА и солевую смесь агара переносят в колбу и приливают дистиллированную воду до объема 200 см, затем колбу помещают на водяную баню и выдерживают до полного расплавления гранул агара. Расплавленный агаровый гель, имеющий температуру 50. 70°С, разливают слоем 2. 3 мм (12. 15 мл) в обезжиренные чашки Петри и оставляют их приоткрытыми при комнатной температуре в течение 1 ч. После застывания агара специальным штампом-пробойником делают лунки в геле, не допуская образования трещин между ними и отслоения агара от дна чашки. В каждой чашке делают по 4 фигуры, каждая из которых состоит из 7 лунок: одна в центре, остальные по периферии. Диаметр каждой лунки составляет 7 мм, расстояние между центральной и периферическими лунками - 3 мм. Образовавшиеся диски геля удаляют из лунок канюлей, соединенной с вакуумным насосом.

2.1.6. Учет и оценка результатов реакции

2.1.6.1. Реакцию учитывают не ранее чем через 48 ч и не позднее чем через 96 ч. Чашки просматривают на темном фоне, направляя сфокусированный луч осветителя на дно чашки под углом 30. 45°. Специфичность реакции оценивают по контрольной линии преципитата. Если она отсутствует или слабо выражена, то реакцию следует повторить.

2.1.6.2. Оценка результатов

Положительной считают реакцию, если между лунками с антигеном и испытуемой сывороткой образуется полоса преципитации, которая соединяется с полосой преципитации контрольной сыворотки, образуя непрерывную линию, т.е. идентична ей (рис.16*, поз.1):

* Нумерация рисунков сквозная по всему тексту Сборника. - Примечание изготовителя базы данных.

- если линия преципитации между лунками с испытуемой сывороткой и антигеном отсутствует, но контрольная линия преципитирующей сыворотки образует вблизи лунки с испытуемой линией изгиб, направленный в сторону лунки с антигеном (рис.16, поз.2) - слабоположительная сыворотка;

- если контрольная линия значительно укорочена со стороны лунки с испытуемой сывороткой и имеет размытый изгиб к лунке с антигеном или образует линию преципитации, расположенную очень близко от лунки с антигеном (рис.16, поз.2), - резко положительная сыворотка.

Лейкоз крупного рогатого скота — хроническая инфекционная болезнь опухолевой природы, основным признаком которой является злокачественное разрастание клеток кроветворных органов с нарушением их созревания. В результате происходит диффузная инфильтрация органов этими клетками или появляются опухоли.

Болезнь регистрируется почти во всех странах мира и наносит значительный экономический ущерб. Особую актуальность она приобрела из-за близкого родства ее возбудителя с вирусом Т-клеточного лейкоза человека.

К вирусу восприимчивы крупный рогатый скот, овцы, зебу, буйволы и, по некоторым данным, лоси.

Характеристика возбудителя. Вирус относится к семейству Retroviridae, подсемейству Oncovirinae, роду Oncovirus. Вирионы сферической формы, размером 40—90 нм и состоят из нуклеотида (сердцевины) с кубическим типом симметрии и липопротеидной оболочки, образующей на поверхности выступы. Нуклеотид содержит диплоидный геном, представленный двумя односпиральными линейными молекулами РНК.

Устойчивость к физико-химическим воздействиям. Вирус неустойчив к факторам внешней среды. Инактивируется при высоких температурах (56 °С и выше), УФ-излучении, под действием ультразвука. Повторные размораживания и оттаивания разрушают вирус. Дезинфицирующие растворы (формальдегид, едкие щелочи, хлорная известь и т. д.) в обычных концентрациях действуют на него губительно. Вирус чувствителен к жирорастворителям (эфиру, хлороформу, ацетону и т. д.).

Антигенная структура и активность. Вирионы вируса содержат наружные гликопротеидные и внутренние полипептидные антигены. Гликопротеидные антигены обладают гемагглютинирующей активностью и индуцируют образование вируснейтрализующих антител, которые защищают животных от инфицирования. Полипептидные антигены индуцируют образование преципитирующих

и комплементсвязывающих антител. Кроме того, преципитирующие антитела синтезируются и к гликопротеидному антигену и обнаруживаются у инфицированных животных в более ранние сроки в РДП.

Антигенная вариабельность и родство. В антигенном отношении штаммы вируса лейкоза крупного рогатого скота родственны, но отличаются от ретровирусов и вирусов других родов по антигенным свойствам, морфогенезу, синцитиобразованию, образованию в монослойных культурах клеток, свойством ревертазы. На основании этих различий вирус лейкоза рекомендуют отнести к особой группе, именуемой как тип Е.

Культивирование вируса. В лабораторных условиях вирус размножается в краткосрочных субкультурах лейкоцитов крови и перевиваемых культурах клеток животных различных видов (крупного рогатого скота, овец, летучих мышей, обезьян, собак и т. д.) и человека. Наиболее чувствительны — монослойные культуры клеток селезенки на ранних пассажах.

Репродукция вируса в культуре клеток не вызывает нарушения монослоя, а сопровождается образованием многоядерных клеток (синцитиев) уже в ранних пассажах. Это свойство вируса (синцитиобразование) было использовано в диагностическом методе по выявлению инфекционного вируса и вируснейтрализующих антител.

Гемагглютинирующая активность. Вирус агглютинирует эритроциты мышей при pH 6,0 и 4 °С.

Экспериментальная инфекция. Ее можно воспроизвести на новорожденных телятах и овцах, которым инокулируют разными способами (внутриперитонеально, подкожно, внутримышечно, аэрозольно) нативные лейкоциты или краткосрочные культуры клеток от больных лейкозом коров, или вируссодержащую культуральную жидкость. После длительной инкубации (от нескольких месяцев до нескольких лет) развивается характерная клиническая картина лейко — и лимфоцитоза, которая заканчиваются опухолевой стадией болезни и гибелью.

При экспериментальном заражении коз, свиней, кроликов наблюдается длительное выявление вирусспецифических антител без клинических проявлений болезни.

Клинические признаки. Различают две формы клинического течения болезни: энзоотическую и спорадическую.

Энзоотический лейкоз поражает взрослых (5—8 лет) животных и протекает с длительным латентным периодом (до нескольких лет), который характеризуется стойким лимфолейкозом без клинических признаков болезни. Терминальная стадия сопровождается снижением массы тела, молочной продуктивности, увеличением лимфоузлов и заканчивается смертью. Экономический ущерб очень высокий.

Спорадический лейкоз встречается редко и в экономическом отношении малоактуален. Поражается молодняк до трех лет. Болезнь протекает в трех формах: ювенальной, тимусной и кожной.

Патологоанатомические изменения. Они специфичны и характеризуются диффузной инфильтрацией различных тканей клетками кроветворных органов и образованием опухолевых масс во внутренних органах (костном мозге, тимусе, селезенке, лимфоузлах, сердце, сычуге, почках, матке, скелетных мышцах). Лимфоузлы и селезенка увеличены, бугристые, с очагами некроза и кровоизлияниями.

Локализация вируса. Вирус локализуется в лимфоидных клетках разных органов, хотя обнаружить его удается только в молозиве и молоке. В инфицированных клетках естественно и экспериментально зараженных животных вирус сохраняется пожизненно (персистирует). В инфицированных лимфоцитах в форме провируса (непродуктивное состояние) вирус защищен от действия вируснейтрализующих антител и может передаваться потомству во время деления клеток. Провирус может изменять экспрессию генов клетки, что приводит к ее трансформации и развитию опухолевой стадии лейкоза.

Источник инфекции — больные животные. Основной путь передачи инфекции в естественных условиях через контаминированные вирусом инъекционные иглы, хирургические инструменты и т. д. при проведении санитарно-ветеринарных мероприятий. Кроме того, вирус может передаваться трансплацентарно (хромосомная или экстрахромосомная трансмиссия) от матери к плоду, алиментарно через молоко и молозиво, а также половым путем через инфицированную сперму. Распространяться инфекция может кровососущими насекомыми.

Диагностика. Диагноз на лейкоз ставят на основании эпизоотологических, клинических, патологоанатомических данных и результатов лабораторных исследований, которые играют решающее значение.

Взятие материала. От больных и подозрительных на лейкоз животных берут кровь. Для гематологических исследований ее берут из яремной вены с антикоагулянтом. Для серологических исследований используют сыворотку крови от животных в возрасте 6 мес и старше. Транспортируют в термосе со льдом.

От трупов берут кусочки пораженных органов: селезенки, лимфоузлов, грудной кости, печени, почек, легких, сердца, сычуга, матки, скелетных мышц. Транспортируют в свежем виде или в растворе консерванта (10%-ном формалине) в термосе со льдом.

Лабораторная диагностика. Проводят гематологические, гистологические и специфические исследования.

Гематологический метод основан на подсчете лейкоцитов периферической крови и выведении лейкоцитарной формулы. Для этого используют электронный счетчик или камеру Горяева. Из проб крови, где установлен лимфолейкоз, готовят мазки и подсчитывают клетки белой крови в зависимости от их морфологии.

У больных лейкозом повышено содержание лейкоцитов за счет клеток лимфоцитарного ряда, а также слабодифференцированных ретикулярных и антигенных (опухолевых) клеток.

У подозрительных на лейкоз животных гематологические исследования повторяют через равные интервалы (2—3 мес).

Для гистологических исследований из кусочков пораженных органов готовят специальные срезы и окрашивают гематоксилин-эозином. У больных лейкозом наблюдают диффузную инфильтрацию клетками лимфоидного ряда разной степени зрелости, склеротические изменения и некрозы.

Помимо этого для подтверждения диагноза могут проводить индикацию и идентификацию вируса.

Серодиагностика и ретроспективная диагностика. Используют серологические реакции, из которых наиболее чувствительны РДП и ИФА. Они позволяют обнаружить специфические антитела у инфицированных животных, начиная с 6-месячного возраста и старше. Это объясняется тем, что телята, выпаиваемые молозивом и молоком инфицированных коров, получают материнские антитела, которые сохраняются до 6 мес.

РДП (РИД). Для постановки реакции используют диагностический набор, содержащий необходимые компоненты (специфический антиген и сыворотку к нему, отрицательную сыворотку). Реакцию ставят микро — или макро методом по общепринятой методике, используя 0,8%-ный агар на трис-буфере. Учет проводят через 48 ч. Животные, сыворотки крови которых положительно прореагировали (полоса преципитации между испытуемой сывороткой и антигеном) в РДП, считаются зараженными лейкозом.

ИФА. Применяют для обнаружения специфических антител в сыворотках крови, молоке и молозиве. Используются диагностические наборы для непрямого и конкурентного вариантов ИФА. Данный метод в 100 раз чувствительнее РДП и позволяет проводить широкомасштабные исследования по эпизоотическому лейкозу в стадах крупного рогатого скота.

Другие серологические методы уступают по чувствительности (% выявляемости) РДП и ИФА, поэтому могут рекомендоваться в качестве дополнительных. К ним относятся реакции латексагглютинации (РЛА), непрямой гемагглютинации (РНГА), непрямой иммунодиффузии (РИФ), а также встречного иммуноэлектрофореза (ВИЭФ).

Индикация и идентификация вируса. В диагностике лейкоза крупного рогатого скота они имеют скорее дополнительное значение и используются менее широко. С этой целью применяют ПЦР для обнаружения вирусного генома (провирусной ДНК), выделение вируса в культуре клеток и его индикацию в месте синцитиобразования, электронно-микроскопический метод, реакции бласттрансформации лейкоцитов (РБТЛ), а также обнаружение вирусных антигенов методом радиоиммунологического анализа (РИА).

ПЦР. Реакция позволяет обнаружить провирусную ДНК в патологическом материале через две недели после заражения. В диагностический набор входят праймеры, соответствующие участкам определенных генов некоторых структурных белков. Чувствительность данного набора достаточно высокая и позволяет выявлять до десяти копий ДНК в 1 мкг исследуемой пробы.

Тест синцитиобразования (ТСО). Основан на выделении инфекционного вируса в субкультурах и перевиваемых культурах клеток лимфоцитов, где он размножается с образованием многоядерных клеток (синцитиев), которые выявляются при окрашивании монослоя.

Электронно-микроскопический метод. Позволяет обнаруживать вирусные частицы в препаратах, полученных из краткосрочных культур клеток лейкоцитов крови, зараженных вирусом лейкоза, и из перевиваемых культурах клеток, сокультивируемых с инфицированными лимфоцитами. Вирионы обнаруживают в основном в межклеточном пространстве и на внешней мембране лимфоидных клеток. Они имеют ультраструктуру, характерную для онковирусов типа С.

Реакция бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ). Основана на способности лимфоцитов трансформироваться в переходные клеточные формы в питательной среде (в присутствии фитогемагглютинина) при определенном режиме культивирования (36 °С, 72 ч). Такие же процессы происходят in vivo у клинически здоровых животных. В препаратах, полученных в результате культивирования и окрашенных по Романовскому—Гимзе, определяют количество трансформированных лимфоцитов на 1000 учтенных клеток и выражают показателем бласттрансформации. В норме у клинически здоровых коров он составляет в среднем 60 % (40—90 %). Диагноз на лейкоз считается подтвержденным, если этот показатель не выше 35 %.

РИА. Метод конкурентного радиоиммунного анализа позволяет обнаруживать вирусные антигены в краткосрочных культурах лимфоцитов крови инфицированных животных. Основан на конкуренции вирусного антигена, выделенного из зараженных клеток, с контрольным (специфическим) антигеном, меченным изотопом, за связывание со специфическими антителами. Метод — наиболее чувствителен и специфичен.

Дифференциальный диагноз. Лейкоз крупного рогатого скота дифференцируют от актиномикоза, туберкулеза, паратуберкулеза и бруцеллеза.

Иммунитет и специфическая профилактика. Вакцины против лейкоза крупного рогатого скота нет, но исследования в этой области продолжаются. В основном, они идут по двум направлениям: созданию вакцины на основании культурального вируса и разработки рекомбинантной вирусвакцины. Достижение первого направления исследований — получение культурального вируса с использованием перевиваемых культур клеток (LK-15, FLK и др.), выбор эффективного инактиванта (формальдегида, этиленимина и его производных), который обеспечивает сохранение антигенной активности и полностью устраняет инфекционность вируса, и, наконец, проведение испытаний опытных серий полученного препарата на естественно-воприимчивых животных (телятах).

Что касается генно-инженерных разработок, то на сегодняшний день в качестве вирусного вектора используют осповакцину, содержащую рекомбинантные гены, кодирующие наружные антигены вируса лейкоза. После адаптации таких штаммов к культурам клеток (NP-2) получена живая культуральная рекомбинантная вакцина, опытные серии которой испытаны на телятах и овцах.

Лейкоз крупного рогатого скота – хроническая инфекционная болезнь опухолевой природы, основной признак которой – злокачественное разрастание клеток кроветворных органов с нарушением их созревания, в результате чего происходит диффузная инфильтрация органов этими клетками или появляются опухоли. Лейкозы животных диагностируют во всех странах земного шара. [4] Лейкоз крупного рогатого скота имеет широкое распространение и наносит значительный экономический ущерб.

В зависимости от характера распространения опухолевых клеток лейкоз классифицируют на две группы – системные и опухолевые. Первая отличается системностью поражения кроветворной и лимфоидной тканей с вовлечением в процесс костного мозга, селезенки, лимфатических узлов и включает лимфоидный, миелоидный лейкозы и злокачественный гистиоцитоз [1].

Лейкозом болеет крупный рогатый скот всех возрастов, но клинически он проявляется чаще всего у животных в четыре года и старше [1]. В естественных условиях к вирусу восприимчивы, кроме крупного рогатого скота, овцы, зебу и буйволы. Заражение происходит с молоком, молозивом и кровью, если не соблюдаются правила асептики и антисептики при ветеринарных (взятие крови, прививки и др.) и зоотехнических (нумерация и др.) манипуляциях у животных, с инфицированной спермой. Существенное значение в распространении болезни имеет гено- и фенотипическая предрасположенность животных к лейкозу, например, среди красной и черно-пестрой пород скота [2].

Инкубационный период при экспериментальном заражении длятся 60…750 сут, а при спонтанном – 2…6 лет. В течении лейкозов выделяют предлейкозную, начальную, развернутую и терминальную стадии болезни. С развитием патологического процесса указанные стадии следуют одна за другой. В начальный период болезни при лейкемическом течении отмечают увеличение числа лейкоцитов в периферической крови (лейкоцитоз), в дальнейшем – системное или регионарное увеличение лимфатических узлов, селезенки, нередко развивается геморрагический синдром. Характерны изменения картины крови (увеличение в крови незрелых кроветворных клеток, или лейкемия, лейкоцитоз и др.) [3].

Болезнь чаще протекает в латентной форме. Основным признаком лейкоза является нарушение нормального процесса пролиферации и дифференциации клеток кроветворной ткани. Чаще поражаются лейкобластические клетки, что приводит к интенсивной пролиферации различных типов лейкоцитов в кроветворных органах, костном мозге, селезенке, лимфоузлах. Размножающиеся клетки крови неконтролируемо распространяются по организму и попадают в различные органы и ткани. Образующиеся опухоли вызывают изменения структуры и функции пораженных органов вследствие атрофии специфических клеток. Появляются нарушения на молекулярном, клеточном и органном уровнях, что приводит к расстройству кроветворения, увеличению количества лимфоцитов. Заболеваемость составляет 3…20 %, а летальность – до 15% [3].

Диагностические исследования на лейкоз проводят серологическим, молекулярно-биологическим, гематологическим, клиническим, патоморфологическим методами, методом биопробы [5].

Для исследования в ветеринарную лабораторию доставляют: для серологических исследований - кровь от животных в возрасте 6 мес и старше в количестве 2. 3, для гематологического исследования - кровь из яремной вены в пробирку с антикоагулянтом (трилон В), срезы из пораженных органов – селезенки, лимфоузлов, печени, почек, легких для гистологических исследований (срезы посылают в свежем виде или в 10% растворе формалина) [2].

Инфицированных животных можно выявить путем постановки биопробы на овцах, которых заражают внутрибрюшинно цельной кровью [2].

Основу диагностики лейкоза крупного рогатого скота составляет серологический метод исследования - реакция диффузионной преципитации (РДП), иначе называемая реакцией иммунодиффузии в геле агара (РИД). Метод основан на обнаружении в сыворотке крови животных специфических преципитирующих антител к антигенам вируса лейкоза крупного рогатого скота. Специфические антитела появляются в крови через 2. 8 недель после заражения животного ВЛКРС и сохраняются в организме пожизненно [5].

Животных, сыворотки крови которых дали положительный результат в РИД, признают зараженными вирусом лейкоза, их необходимо исследовать гематологическим методом [5].

В случаях, когда линия преципитации плохо просматривается или имеется зона опалесценции вокруг лунок, реакцию следует переставить [5].

Гематологический метод исследования заключается в количественной и качественной оценке лейкоцитов в периферической крови животных, отнесенных по результатам РИД к группе инфицированных ВЛКРС.

Животных относят к категории больных по результатам однократного гематологического исследования.

Животных, подозреваемых в заболевании лейкозом, подвергают через 1 – 2 месяца дополнительному гематологическому исследованию. При повторном подтверждении диагноза их считают больными [1].

При вскрытии трупов или послеубойном осмотре туш и органов животных обращают внимание на величину органов, распространенность опухолевых разрастаний, их связь с лимфатическими узлами или другими органами и тканями. Все формы лейкоза характеризуются увеличением в различной степени лимфатических узлов. При опухолевых лейкозах, а также при злокачественном гистиоцитозе лимфатические узлы бугристые, капсула сращена с паренхимой; на разрезе часто обнаруживают кровоизлияния и некрозы. В органах брюшной, тазовой полостей, на серозных оболочках отмечают диффузные или узловые опухолевые разрастания различной величины и формы. Селезенка увеличена при всех случаях системного лейкоза и в 40 – 60 % случаев лимфогранулематоза. В более поздней стадии границы между красной и белой пульпой стерты, ткань мягкой консистенции, от буро-красного до буро-коричневого цвета. В терминальной стадии может происходить разрыв селезенки [1].

Метод биопробы основан на восприимчивости животных гетерологичных видов к ВЛКРС. Овец в возрасте старше 6 мес. или кроликов любого возраста, пола, породы перед постановкой на них биопробы исследуют в РИД дважды с интервалом 2 мес на наличие антител к гликопротеидному антигену вируса лейкоза. В опыт берут животных с двукратным отрицательным результатом серологического исследования на лейкоз. При введении овцам или кроликам лейкоцитов крупного рогатого скота, инфицированного вирусом лейкоза, у них развивается инфекция, которая сопровождается появлением в крови специфических преципитирующих антител, выявляемых с помощью реакции иммунодиффузии через 14. 30 дней после заражения. Период от момента взятия крови у испытуемого животного до постановки биопробы должен составлять не более 24 ч при температуре хранения 18. 25°C. Пробу исследуемой крови считают положительной, если у овцы или кролика после введения крови или лейкоконцентрата испытуемого животного обнаруживают в сыворотке крови антитела к вирусу лейкоза [5].

Лечение лейкоза крупного рогатого скота не разработано. Инфицированных животных подвергают вынужденному убою либо изолируют. Переболевшие лейкозом животные часто приобретают иммунитет к повторному заражению.

Библиографический список

Диагностика лейкоза крупного рогатого скота [Текст]: метод.указания / В. А. Седов. - Москва: Агропромиздат, 1989. - 29 с.

Ветеринарная вирусология [Текст]: учебное пособие для студ. вузов, обучающихся по спец. 111201 - "Ветеринария": рек. УМО по образованию / П. И. Барышников. - Москва: ФОРУМ, 2009. - 96 с.

Ветеринарная вирусология [Текст]: учебник для студ. вузов, обуч. по спец. 111201 "Ветеринария" / Р. Г. Госманов, Н. М. Колычев. - 2-е изд., перераб. и доп. - Москва: КолосС, 2006. - 304 с.

Частная ветеринарно-санитарная микробиология и вирусология [Текст]: учебное пособие для студ. вузов, обучающихся по направлению подготовки (специальности) - Ветеринария (квалификация (степень) "Специалист"): допущено УМО по образованию / Р. Г. Госманов [и др.]. - Уфа: БашГАУ, 2013. - 251 с.

Читайте также: