Биофизические и биохимические свойства вирусов

Обновлено: 28.03.2024

Изучение строения вирионов привело к заключению, что их формирование подчиняется строгим математическим законам построения пространственных структур — от кристаллов до архитектурных сооружений — законам, основанным на образовании структур с наименьшим уровнем свободной энергии.

Обязательным структурным элементом вирусов является капсид — белковая оболочка, окружающая вирусную нуклеиновую кислоту. Просто устроенные вирусы, такие как пикорнавирусы и парвовирусы, состоят из капсида, окружающего одну молекулу нуклеиновой кислоты. Сложно устроенные вирусы имеют еще дополнительную внешнюю оболочку — суперкапсид. Эта терминология введена Д. Каспаром и А. Клагом в 1962 г.

Морфологическими субъединицами капсида, видимыми в электронный микроскоп, являются капсомеры. Этот термин обычно применяют для изометрических капсидов с кубическим типом симметрии. Структурными единицами капсида являются белковые субъединицы, состоящие из ОДНОЙ или нескольких молекул белка (рис. 3). Структурная единица вируса табачной мо- аЯиігИСОСТОИТ ИЗ ОДНОЙ МОЛЄ-

Рис. 3. Кубическая (а) и спиральная (б) симметрия капсидов сложно устроен

кулы белка, вируса полиомиелита — из четырех молекул белка.

Существуют два типа строения капсидов вирионов, которые обеспечивают образование структуры с минимумом свободной энергии. В одном случае кйпсомеры ассоциируются с геномом и образуют спиралевидную, винтообразную структуру.

Такой тип укладки называется сакральным типом симметрии, а сама структура — нуклеокап- сидом.

Такой тип симметрии нук- леокапсида характерен для ви-рионов табачной мозаики, ор- Ных вирусов (схема),

томиксовирусов, парамиксови- І—структурная единица капси-

• ккпсиды могут быть ригидны- сид; 4— нуклеиновая кислота; ми, как, например, у парамик- 5— с^^ашсял 1Д' Каспар исовирусов, или гибкими, если

межмолекулярные силы не слишком жестко связывают структурные единицы капсида, как, например, у вируса вВзіпсулярного стоматита (рис. 4).

' В другом случае капсомеры образуют полое изомет- рическое тело, в центре которого находится геном. Такая ¦ укладка называется кубическим типом симметрии. Последнее означает, что тело является симметрическим в трех взаимно перпендикулярных направлениях (осях симметрии). Изометрические вирусные частицы с кубическим тйпом симметрии имеют форму геометрической фигуры (Икосаэдра — многогранника, состоящего обычно из 60 'ЩЯЯ кратных 60 геометрически идентичных элементов, щих 12 вершин, 20 граней, 20 ребер (рис. 5). смотреть перпендикулярно плоскости рисунка, то

Рис. 4. Типы вирусных нуклеокапсидов (электронно-микроскопическое изображение).

а — вирион парамиксовируса (вирус Сендай) с частично высвобожденным нуклеокапсидом; б — нуклеокапсид вируса везикулярного стоматита.

ось симметрии будет окружена 5 субъединицами, в другом направлении она будет окружена тремя, а в третьем — двумя субъединицами, поэтому симметрию икосаэдра обозначают символом (5, 3, 2). По типу икосаэдра построены многие мелкие вирусы и нуклеокапсиды сложно устроенных вирусов. Например, вирион полиомиелита представляет икосаэдр, состоящих из 60 капсомеров; вирион парвовируса представляет икосаэдр, состоящий из 32 капсомеров. В зараженной клетке икосаэдры изометрических вирусов образуют кристаллоподобные скопления (рис. 6). Многие сложно устроенные вирусы имеют внешнюю липопротеидную оболочку — суперкап- Строение икосаэдра по и А. Клаїу (1962) и вирусных капсо-

етрии показаны стрелками: - оси симметрии икосаэдра: них (5) проходит перпенди- плос кости рисунка через окруженную пятью капсо- б — характеристика ико- еской структуры: А — ико- со стороны оси второго по- ^ 'Б — третьего порядка; В — ^порядка; Г, Д, Е — разные уппировки структурных еди- ^усных капсидов: Г — капсид полиомиелита (20 триме- Д — капсид парвовируса звентамеров и 20 гексамеров); псид калицивирусов (димеры “угольных гранях и на их ).

, представляющую собой липидный бислой со встроен- и в него суперкапсидными белками. Форма таких ионов приближается к сферической. Суперкапсидные ки являются типичными интрамембранными белками чаще веего представлены гликопротеидами. Гликопро- иды формируют морфологические субъединицы, которые электронном микроскопе выглядят в виде шипов ис. 7,а). У ряда тогавирусов шипы имеют палочко-

Рис. б. Кристаллообразные скопления вирионов в зараженных клетках (электронно-микроскопическое изображение).

Рис. 7. Электронно-микроскопическое изображение ряда патогенных для человека вирусов.

а — вирионы гриппа; б — вирионы везикулярного стоматита; в — вирионы ротавируса; г — вирионы реовируса; д — вирион осповакцины; е — вирионы герпеса.

видную форму; у респираторно-синцитиального вируса (семейство парамиксовирусов) — форму бутылки; у коро- вавирусов — форму солнечной короны; у вируса гриппа шипы, образованные гемагглютинином, имеют палочковидную форму, а шипы, образованные нейраминидазой,— форму барабанной палочки.

Некоторые вирионы, содержащие спиральный нуклео-

ywrni.имеют своеобразную форму. Так, вирусы вези- кулярного стоматита, бешенства и некоторых болезней растений имеют форму винтовочной пули (рис. 7,6). Наружный и внутренний капсиды реовирусов построены ро кубическому типу симметрии; оба они образуют как бы два футляра, один из которого вложен во второй (рис. 7, в, г). Капсомеры внутреннего капсида достигают наружного капсида, благодаря чему структура вириона Запоминает обод колеса. Особенно четко такая форма выражена у представителей рода ротавирусов.

При недостатке генетического материала и при избы-точной продукции белков могут образоваться пустые вирусные частицы, лишенные нуклеиновой кислоты (рис, 7, в, г).

Весьма сложное строение имеют вирионы осповакцины (рис. 7, д). Сердцевина их, содержащая вирусную ДНК В составе нуклеопротеида, имеет форму двояковогнутого кольца и окружена двумя линзообразными латеральными дельцами.

Ш разные клеточные структуры — мембраны, микро- ки, осмиофильные волокна и т. п. (рис. 8). При атриксы проделывают определенный цикл развития, шачале в них превалируют полисомы, то позже ются субвирусные компоненты, которые можно

выявить при использовании серологических методов исследования типа ИФ (рис. 8, в) или ИЭМ, а нередко и при обычной ЭМ. При ряде инфекций матриксы связаны с мембранами эндоплаз- матической сети, аппа-ратом Гольджи и други-ми клеточными структу-рами, куда транспорти-руются все вирусные компоненты.

Образования, сходные с цитоплазматическими матриксами, обнаружены также в ядрах, где происходит репродукция большинства ДНК-содержащих вирусов.

При окрашивании клеток они имеют вид внутриядерных включе-ний. На поздних стадиях инфекции в матриксах или по соседству с ними накапливается большое число вирионов, часто образующих кристаллоподобные формирования. Внут-риядерные кристал-лоподобные включения . Скопление нуклеокапсидов SV5 в цитоплазме (электронно- копическое изображение).

обнаружены, например, у реовирусов, аденовирусов, паповавирусов, парвовирусов. Процесс формирования вирионов у вирусов, имеющих липопротеидные оболочки, значительно более сложен, чем у просто устроенных вирусов, и протекает многоступенчато. Так, например, изометрические нуклеокапсиды вируса герпеса формируются в ядрах и в дальнейшем транспортируются в цитоплазму путем почко-вания через ядерную мембрану. После этого вирионы транспортируются к аппарату Гольджи, проходя через мем-брану эндоплазматической сети и захватывая ее, как это было при прохождении через ядерную мембрану. Поэтому внеклеточный вирус имеет две оболочки, одна из которых формируется из ядерной, вторая — из цитоплазматической мембраны (см. рис. 7, е).

Формирование РНП вирионов парамиксовирусов происходит в цитоплазме, где они накапливаются в виде тяжей (рис. 9) и затем транспортируются к плазматической мембране. В это время плазматическая мембрана клетки уже модифицирована, так как в нее встроены с наружной стороны вирусные гликопротеида, а с внутренней стороны — матрикс ный белок. При приближении к таким модифицированным участкам плазматической мембраны рибонуклеопротеидные тяжи свертываются в плотно упакованные клубки и, проходя через плазматическую мембрану, покрываются ею, приобретая таким путем внешнюю оболочку (рис. 10, а). Этот тип формирования вирионов называется почкованием. Почкование может происходить и во внутриклеточные вакуоли (рис. 10, б).

Морфогенез вируса оспы еще более сложен. В цитоплазме образуются сложные матриксы, в которых происходит синтез многочисленных вирусспецифических структур. Здесь же происходит и формирование вирионов, которые вначале представляют пузырчатые образования (рис.

11), и лишь позже из этих предшественников формируются зрелые вирионы. Выход вирусных частиц из клетки осуществляется либо путем почкования через мембраны во внутриклеточные вакуоли, либо при разрушении клетки.

БИОФИЗИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ВИРУСОВ

Биофизические свойства вирусов характеризуются многими показателями — седиментацией, плотностью, вязкостью вирусных суспензий, диффузионными свойст- 10. Выход вирусов из клетки путем почкования ¦ческое изображение).

чкование SV5 через плазматическую мембрану; б во внутриклеточную вакуоль.

(электронно-микро- — почкование флави-

Рис. 11. Незрелые вирионы оспы, формирующиеся в цитоплазме клеток почек зеленых мартышек (электронно-микроскопическое изображение).

вами. Все эти характеристики относятся также к суб- вирусным компонентам. Наиболее важными биофизическими характеристиками вирусов являются седимента- ционные и плотностные свойства. Они чаще всего измеряются при исследовании вирусов.

Седиментационные свойства вирусов и субвирусных компонентов измеряют с помощью центрифугирования в аналитических и препаративных ультрацентрифугах. Коэффициент седиментации выражают в единицах Свед- берга в переводе на стандартные условия — при температуре 20° С в воде и обозначают как S2ow

Коэффициенты седиментации вирионов зависят от многих факторов: от их размера и массы, плотности, формы. Для определения плотности вирионов и субвирусных структур применяют равновесное центрифугирование в градиентах плотности. Для вирионов и вирусных нуклеопротеидов обычно используют градиенты плотности сахарозы и хлорида цезия.

Плотность вирионов и субвирусных структур зависит прежде всего от их состава. Она увеличивается с увеличением процента содержания нуклеиновых кислот и уменьшается при повышении содержания белков и липидов (табл. 6).

Таблица б. Коэффициенты седиментации (S) и плавучая плотность (р) ряда вирусов Вирусы Коэффициент

S20W Плавучая плотность (р) (г/см3) в хлориде цезия в сахарозе Вирусы герпеса 500—600 1,26—1,29 Аденовирусы 560 1,33—1,34 Паповавирусы 240—300 1,32. Парвовирусы 110—122 1,39—1,40 Реовирусы 550 1,36—1,39 Тогавирусы 150—300 1,25 1,23—1,24 Парамиксовирусы 800—1000 1,21—1,22 1,19 Ортомиксовирусы 700—800 1,21—1,22 1,19 Рабдовирусы 550—1000 1,19— 1,21 1,19 Буньявирусы 350—470 1,20 1,19 Аренавирусы 325—500 1,19—1,20 1,17—1,18 Ретровирусы 300—400 1,16—1,18 Пикорнавирусы 140—165 1,33—1,45 УСТОЙЧИВОСТЬ ВИРУСОВ В ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЕ

Разные группы вирусов обладают неодинаковой устойчивостью во внешней среде. Наименее устойчивыми являются вирусы, имеющие липопротеидные оболочки, на-иболее устойчивыми — изометрические вирусы. Так, на-пример, ортомиксовирусы и парамиксовирусы инактиви-руются на поверхностях в течение нескольких часов, тогда как вирусы полиомиелита, аденовирусы, реовирусы сохраняют инфекционную активность в течение нескольких дней.

Однако из этого общего правила имеются и исключения. Так, вирус оспы устойчив к высыханию и

сохраняется в экскретах в течение многих недель и месяцев. Вирус гепатита В устойчив к действию неблагоприятных внешних факторов и сохраняет свою активность в сыворотке даже при кратковременном кипячении.

Чувствительность вирусов к ультрафиолетовому и рентгеновскому облучению зависит преимущественно от размеров их генома. Поэтому, например, вирус оспо- вакцины (молекулярная масса генома около 2 • 108) инактивируется при рентгеновском облучении около 5 • 104 рад, в то время как мелкий вирус папилломы (молекулярная масса генома 3* 106) для инактивации требует облучения 4 • 10® рад.

Чувствительность вирусов к инактивации формальдегидом и другими химическими веществами, инактивирующими генетический материал, зависит от многих условий, среда которых следует назвать плотность упаковки нуклеиновой кислоты в белковый футляр, размеры генома, наличие или отсутствие внешних оболочек и т. п. Вирусы, имеющие липопротеидные оболочки, чувствительны к эфиру, хлороформу и детергентам, в то время как просто устроенные изометрические и палочковидные вирусы устойчивы к их действию.

Наконец, важной особенностью вирусов является чувствительность к pH. Есть вирусы, устойчивые к кислым значениям pH (2,2—3,0), например вирусы, вызывающие кишечные инфекции и проникающие в организм алиментарным путем. Однако большинство вирусов инактивируется при кислых и щелочных значениях pH.


Оглавление

  • Введение
  • Обозначения и сокращения
  • 1 История вирусологии, природа и происхождение вирусов
  • 2 Химический состав вирусов
  • 3 Морфология, морфогенез, биофизические свойства и генетика вирусов

Приведённый ознакомительный фрагмент книги Общая вирусология с основами таксономии вирусов позвоночных предоставлен нашим книжным партнёром — компанией ЛитРес.

2 Химический состав вирусов

Основными химическими соединениями, которые входят в состав всех вирусов, являются белки и нуклеиновые кислоты. В состав ряда вирусов входят липиды и углеводы.

Белки. Локализация вирусных белков. Белки, связанные с жизненным циклом вируса, разделяют на белки, детерминируемые геномом вируса и белки, имеющие клеточное происхождение. В качестве примера клеточных белков, которые обнаружены в составе некоторых вирионов, могут быть приведены белок цитоскелета — актин, и ядерные белки — гистоны. Белки клеточного происхождения, участвующие в процессе репликации вируса, будут рассмотрены в разделе взаимодействия вируса с клеткой.

По месту локализации белки, детерминируемые вирусным геномом, разделяют на две группы: 1) структурные белки — это белки, входящие в состав ВЧ, их обозначают как VP; 2) неструктурные белки — это предшественники структурных белков, регуляторные белки и ферменты, обслуживающие процесс внутриклеточной репродукции вируса и не входящие в состав ВЧ. Их обозначают как NS-белки.

Свойства вирусных белков. В состав вирионов входят белки с различной молекулярной массой (от 4 до 100 кД), состоящие из одной или нескольких полипептидных цепей. Количество этих белков также различно у разных вирусов. В состав нуклеокапсида ВТМ входит один белок. У других вирусов в состав вириона может входить несколько десятков белков, имеющих различные физико-химические свойства. Белки, формирующие капсид, нуклеокапсид и коровую оболочку, обладают одним общим свойством — способностью к самосборке.

В состав ВЧ могут входить низкомолекулярные белки, не участвующие в формировании капсида. Например, геномные белки пикорнавирусов и аденовирусов. Геномный белок ковалентно связан с нуклеиновой кислотой и участвует в ее репликации.

Сложные белки представлены гликопротеинами (обозначают как gp) и липопротеинами. Наличие гликопротеина определяет присутствие в вирионе углеводного компонента, который может быть представлен олигосахаридами маннозного типа, галактозой, N-ацетилглюкозамином или нейраминовой кислотой. Вирусные гликопротеины, как правило, экспонированы на наружной поверхности ВЧ и выполняют три основные функции: обеспечивают связывание вириона с клеточным рецептором (функция прикрепительного белка), обладают фузионной активностью (обеспечивают слияние мембран) и определяют антигенные свойства вирусов. В то же время, вирусные гликопротеины могут быть и неструктурными белками и, оставаясь в интегральной форме в мембране шероховатого эндоплазматического ретикулюма (ШЭР), выполнять функции транслоказ, обеспечивая транспорт вирусных компонентов в его просвет.

Вирусные липопротеины представлены белками, ацилированными, как правило, миристиновой (C14) кислотой. Остатки жирных кислот, соединенные с молекулой белка, выполняют функцию липофильного якоря.

Вирусные белки-ферменты могут входить в состав вирусной частицы или являться неструктурными белками и появляться в клетке после экспрессии вирусного генома. Наиболее оснащенным ферментами является вирион вируса оспы, который имеет практически полный набор энзимов, необходимых для независимой внутриклеточной репликации вируса. В то же время, мелкие просто организованные изометрические вирусы с позитивным РНК-геномом могут не иметь никаких ферментов в составе вириона.

Функционально активные белки вирусов представлены, в первую очередь, ферментами нуклеинового обмена, обеспечивающими сложные механизмы репликации/транскрипции вирусного генома; ферментами, осуществляющими посттрансляционный процессинг и модификацию белков, и ферментами, участвующими в проникновении вирионов в клетку хозяина.

Первая группа ферментов наиболее многочисленна и включает как аналоги клеточных ферментов, так и вирус-специфические ферменты.

ДНК-зависимая ДНК-полимераза — осуществляет синтез ДНК на матрице ДНК (вирус оспы).

ДНК-зависимая РНК-полимераза — осуществляет синтез мРНК на матрице ДНК (вирус оспы).

Обратная транскриптаза или ревертаза или РНК-зависимая ДНК-полимераза осуществляет синтез ДНК на матрице РНК. Впервые открыта в 1970 г. у ретровирусов Темином и Мизутани.

Хеликаза — осуществляет расплетете двухнитевой структуры ДНК. Кроме этого хеликазы обладают нуклеотидтрифосфат-зависимой РНК-хеликазной активностью, которая включает три процесса: связывание дезоксинуклеотидтрифосфата, его гидролиз и за счет этой энергии расплетение двухнитевой РНК.

мРНК-модифицирующие ферменты : поли-А-полимераза — аденилирует 3'конец РНК за счет энергии АТФ; Кэп-энзим и метилтрансферазный комплекс — катализирует образование на 5'-конце кэп-структуры.

АТФ-аза, ГТФ-аза — осуществляют гидролиз соответствующих энергетических субстратов.

Рибонуклеаза Н — разрушает РНК, находящуюся в дуплексе с ДНК. Вторая группа вирусных ферментов — ферменты белкового обмена.

Здесь мы приведем лишь некоторые из них:

Протеиназы — ферменты, участвующие в посттрансляционном процессинге полипротеинов. Являются NS-белками РНК-содержащих вирусов;

Протеинкиназы — ферменты, фосфорилирующие структурные белки вирионов. Обнаружены в составе вируса везикулярного стоматита, вируса бешенства, альфавирусов и ретровирусов. Примерами ферментов, участвующих в проникновении вирусов в клетку, являются лизоцим бактериофагов и нейраминидаза вируса гриппа.

Липиды. Все оболочечные РНК-содержащие почкующиеся вирусы имеют липиды клеточного происхождения, входящие в состав суперкапсида (от 15 % до 30 % от сухого веса). От 50 % до 60 % липидов представлены фосфолипидами, от 20 % до 30 % составляет холестерин.

У ДНК-геномных вирусов липиды содержат вирусы оспы, герпеса, гепатита B. Это непочкующиеся вирусы. У вируса оспы липиды не образуют дифференцированной оболочки, которая формируется в цитоплазме в процессе морфогенеза поксвириона. Липиды вируса гепатита B образуются путем инвагинации мембран эндоплазматического ретикулюма (ЭПР). Липидсодержащая оболочка вируса герпеса формируется при прохождении внутреннего компонента вириона через ядерную мембрану. Следовательно, в состав вирусной оболочки герпесвирусов входят липиды ядерной мембраны.

Нуклеиновые кислоты. Клетки всех живых организмов содержат два вида нуклеиновой кислоты — ДНК (двухнитевая ДНК клеточного генома) и РНК (мРНК, тРНК, рРНК). В отличие от клеток, вирионы содержат только один вид нуклеиновой кислоты — ДНК или РНК. И та и другая являются хранителями наследственной информации и выполняют функции генома. Однако следует учитывать, что наличие одного вида нуклеиновой кислоты является характеристикой вириона, но не вируса. В жизненном цикле вируса его геномная нуклеиновая кислота транскрибируется, то есть ДНК-содержащие вирусы образуют РНК. Ряд РНК-содержащих вирусов имеют в цикле репродукции стадию обратной транскрипции и синтезируют ДНК на матрице РНК. Примерно 20 % всех вирусов имеют ДНК-геном, 80 % — РНК-геном. Способность РНК хранить наследственную информацию — уникальное свойство вирусов. Размеры вирусных геномов (длина нуклеотидных последовательностей, выраженная в нуклеотидах) варьируют в широких пределах — от 1,7 тысяч нуклеотидов (т.н.) у цирковируса свиней до 300 т.н. у фикоднавирусов архибактерий.

Кроме того, что геном вирусов может быть представлен или ДНК или РНК, он может находиться в разных видах — в виде двухнитевой (дн) или однонитевой (он) формы, в виде линейной или кольцевой, в виде непрерывной или сегментированной формы.

Многообразие видов РНК геномов расширяется за счет существования последовательностей, отличающихся направлением связей сахаро-фосфатного остова.

Однонитевые РНК могут иметь позитивную полярность — (+) РНК, негативную полярность — (-) РНК или могут быть представлены обоюдозначащей цепью — (+, — ) РНК (амбисенс стратегия кодирования). В свою очередь, РНК позитивной полярности могут иметь разную структурную организацию: могут, являясь матричной РНК, иметь на 5'-конце кэп (7-метилгуанозин, Сар), а на 3'-конце — поли-А (poly-A) последовательность; могут не иметь кэпа или поли-А; могут иметь на 5'-конце геномный белок; могут иметь на 3'-конце тРНК-подобную или шпильковую структуру.

Виды геномов вирусов легли в основу их классификации. Однако следует учитывать, что вид генома в настоящее время не является формальным таксоном и используется для удобства ориентации в многообразии вирусов.

Углеводы. Углеводный компонент вирусов находится в составе гликопротеидов. Количество сахаров в составе гликопротеидов может быть достаточно большим, достигая от 10 % до 13 % от массы вириона. Химическая специфичность их полностью определяется клеточными ферментами, обеспечивающими перенос и присоединение соответствующих сахарных остатков. Обычными сахарными остатками, обнаруживаемыми в вирусных белках, являются фруктоза, сахароза, манноза, галактоза, нейраминовая кислота, глюкозамин. Таким образом, подобно липидам, углеводный компонент определяется клеткой-хозяином, благодаря чему один и тот же вирус, выращенный в клетках разных видов, может значительно отличаться по составу сахаров в зависимости от специфичности клеточных гликозилтрансфераз.

Углеводный компонент гликопротеидов играет существенную роль в структуре и функции белка. Он является каркасом для локальных участков гликопротеида, обеспечивая сохранение конформации белковой молекулы, и обусловливает защиту молекулы от протеаз. Возможны и другие функции углеводов, пока достоверно не установленные.

Компоненты клетки-хозяина. В составе вирионов могут находиться компоненты клетки-хозяина. К таким компонентам могут относиться белки, и даже целые клеточные структуры. Так, например, в составе ряда оболочечных вирусов может находиться белок цитоскелета актин, в составе паповавирусов содержатся клеточные гистоны. Ряд вирусов содержит клеточные ферменты, например, протеинкиназы. В составе аренавирусов обнаружены рибосомы.

Клеточные компоненты могут включаться в вирион случайно или закономерно, В некоторых случаях они играют существенную роль в репродукции вируса, как, например, гистоны в репродукции паповавирусов.

Процесс экстракции вирусов из растений, методы их очистки и концентрирования. Методы изучения биофизических свойств вирусов, определения типа, содержания и размера нуклеиновой кислоты вирусных частиц, числа и молекулярной массы индивидуальных белков.

Рубрика Биология и естествознание
Вид курсовая работа
Язык русский
Дата добавления 30.08.2009
Размер файла 437,0 K

Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.

Очистка, биофизическая и биохимическая характеристика вирусов

Для характеристики вирусов в первую очередь важны их биохимические и биофизические свойства. Чтобы исследовать эти свойства, вирусы необходимо очистить. Разные вирусы требуют специфических методов очистки. В этой работе рассмотрены методы изучения только простейших вирусов, состоящих из белковой оболочки и геномной нуклеиновой кислоты.

1. Очистка вирусов растений

1.1 Растения-хозяева

В идеале для наращивания вируса следует использовать растение, в котором вирус дает системную инфекцию, а для определения инфекционное™ на разных стадиях очистки -- растение, на котором образуются локальные поражения. При выборе системного хозяина необходимо принимать во внимание выход вируса, легкость его экстракции, легкость культивирования растения и возможность контаминации другими вирусами. Растение, на котором образуются локальные поражения, следует использовать для определения периода максимального накопления вируса в основном хозяине и для контроля количества вируса на разных стадиях очистки.

В большинстве случаев, однако, невозможно выполнить многие из этих требований. Часто не удается найти подходящее растение, на котором образуются локальные поражения. В этих случаях для контроля количества вируса можно использовать метод дот-блот гибридизации.

1.2 Экстракция вирусов из растений

Чтобы экстрагировать вирусные частицы из растения, необходимо разрушить клеточные стенки и высвободить содержимое клеток. Обычно экстракцию проводят в буферном растворе и в присутствии соединений, предотвращающих повреждение вирусных частиц высвобождающимися ферментами. Кроме того, действие ферментов замедляется, если экстракцию проводят на холоду. Если отсутствуют специальные указания, все стадии очистки следует проводить при 0--5°С.

Наиболее распространенное приспособление для разрушения растительных клеток -- это гомогенизатор с вращающимися ножами, которые приводятся в движение сверху или снизу. В продаже имеются различные типы гомогенизаторов, и выбор конкретной модели должен определяться эффективностью разрушения растительных тканей, которая зависит от скорости вращения ножей, размера лезвий, угла между ними и формы сосуда. Эффективность разрушения растительных клеток можно повысить путем их предварительного замораживания, хотя в некоторых случаях это приводит к снижению выхода вируса.

Использование гомогенизаторов неудобно, если ткани растения-хозяина очень богаты волокнами или частицы выделяемого вируса длинные и гибкие; в последнем случае при гомотенизации они могут разрушаться \3]. Этих трудностей легко избежать, используя соковыжималку или ступку с пестиком. При очистке вирусов, размножающихся только в сосудистых тканях, например лютео-вирусов, обнаруживаемых во флоэме, ткань листьев необходимо сначала разрушить целлюлазами и пектиназами.

Выбор экстрагирующего буферного раствора может оказать решающее влияние на эффективность очистки вируса. Вирусы с удлиненными частицами, склонные к агрегации или к адсорбции на клеточном дебрисе, лучше всего экстрагировать щелочными буферами с умеренной лонной силой; однако частицы некоторых палочковидных вирусов в щелочной среде повреждаются. Для экстракции многих изометрических вирусов удобны кислые буферные растворы с рН около 5; дополнительное преимущество подобных растворов -- осаждение многих клеточных белков при кислой реакции среды. Некоторые изометрические вирусы, например вирус мозаики огурцов и вирус кольцевой пятнистости табака, при рН около 5 выпадают в осадок, и поэтому для их выделения следует использовать растворы с рН, близким к нейтральному. С другой стороны, некоторые вирусы, например бромовирусы, при рН 7 набухают, и РНК становится доступной для нуклеаз; в этом случае лучше использовать кислые растворы.

1.3 Осветление экстрактов

Для очистки вирусных частиц их следует отделить от других компонентов цитоплазмы. В число последних входят органеллы, мембраны, рибосомы и белки, в первую очередь рибулозобис-фосфаткарбоксилаза и фитоферритин. В табл. 1.1 приведены способы обработки, позволяющие эффективно удалять различные контаминанты. При разработке новой методики очистки какого-либо вируса анализируется возможность применения каждого способа грубой очистки путем определения вируса методом локальных поражений или дот-блот гибридизации. Для удаления выпавших в осадок контаминантов или разделения фаз при экстракции органическими растворителями обычно применяют низкоскоростное центрифугирование при 10 000 g в течение 10 мин.

Таблица 1.1. Удаление основных контаминантов при очистке вирусов растений

Фитоферритин Мембраны и органеллы

10 мМ Na2 ЭДТА, 0,5М NaCl, 8%-ный бутанол, хлороформ, нагревание, бентонит 8%-ный бутанол, бутанол/хлороформ, рН 4,9, нагревание, бентонит

10 мМ Na2 ЭДТА, рН 4,9, 8%-иый бутанол, бутанол/хлороформ, нагревание, бентонит Органические растворители, неионные детергенты

1.4 Концентрирование вирусов

Концентрирование обычно осуществляют с помощью поли-этиленгликоля или путем высокоскоростного центрифугирования. Типичные условия осаждения ПЭГ следующие: для палочковидных вирусов используют 2,5% ПЭГ и 0,1 М NaCl, а для изометрических вирусов-- 10% ПЭГ в присутствии 0,1 М NaCl; для эффективного осаждения необходимо поддерживать достаточно высокую концентрацию соли. Обычно ПЭГ и соль добавляют к раствору, содержащему вирус, растворяют их в течение часа при постоянном перемешивании и затем собирают осадок вируса центрифугированием при 10 000 g в течение 10 мин. Высокоскоростное центрифугирование большинства типичных изометрических вирусов проводят при 70000 g в течение 3 ч, а большинства палочковидных вирусов --при 50000 g в течение 2 ч.

1.5 Дальнейшая очистка

Осветленный и концентрированный вирус еще недостаточно чист для большинства биохимических и биофизических исследований. Дополнительной очистки достигают зональным или равновесным центрифугированием. Теоретические и практические аспекты центрифугирования детально изложены в другом руководстве. Для вирусов растений можно использовать следующие методы дополнительной очистки.

1.5.1. Зональное вирусов применяют 10--40%-ные сахарозные градиенты. Их можно приготовить одним из следующих способов:

1. С помощью устройства для приготовления градиентов, в котором соответствующим образом смешиваются исходные 10%-ный и 40%-ный растворы сахарозы.

2. Путем наслаивания друг на друга 10, 20, 30 и 40%-ного растворов сахарозы в количествах, приведенных в табл. 1.2, с последующей диффузией при 4 °С в течение ночи.

3. Путем замораживания 25%-ного раствора сахарозы в центрифужных пробирках и медленного оттаивания. Раствор, содержащий вирус, осторожно наслаивают на поверхность градиента. В большие пробирки не следует вносить больше 5 мг вируса, а в маленькие пробирки -- больше 1 мг. Центрифугирование проводят в роторах со свободно подвешенными стаканами; рекомендуемые режимы центрифугирования указаны в табл. 1.2.

Зоны вируса можно увидеть при освещении сверху и отобрать через верх пробирки шприцем с иглой, изогнутой под прямым углом недалеко от конца, прокалывая пробирку сбоку или фракционированием через дно пробирки. В последнем случае для контроля скорости вытекания раствора рекомендуется простое приспособление, показанное на рис. 1.1. Возможно использование и более сложных приспособлений, например прибора для фракционирования градиентов фирмы Isco, в котором раствор вытесняется снизу вверх и проходит через спектрофотометрическую кювету для регистрации оптической плотности. Простейшее правило, которым следует пользоваться при извлечении зоны вируса из градиента, состоит в том, что вирус не должен проходить через те участки пробирки, в которых концентрируются примеси, т.е. если, например, РБФК находится выше зоны вируса, не следует вытеснять градиент снизу вверх или отбирать зону вируса шприцем через верх пробирки. Сахарозу можно удалить диализом против подходящего буферного раствора или осаждением вируса ПЭГ.

Таблица 1.2. Зональное центрифугирование в градиентах концентрации сахарозы

А. Для получения близких к линейным градиентов методом диффузии при1-веденные объемы растворов сахарозы наслаивают один на другой и оставляют на ночь при 4 С для диффузии.

Процесс экстракции вирусов из растений, методы их очистки и концентрирования. Методы изучения биофизических свойств вирусов, определения типа, содержания и размера нуклеиновой кислоты вирусных частиц, числа и молекулярной массы индивидуальных белков.

Рубрика Биология и естествознание
Вид курсовая работа
Язык русский
Дата добавления 30.08.2009
Размер файла 437,0 K

Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.

1. Приготовление диссоциирующего буфера: 10-кратный буфер для электрофореза -- 5 мл 10%-ный ДДС-Na -- 10 мл 10 М мочевина -- 7,5 мл 2-меркаптоэтанол -- 0,5 мл сахароза --4,5 г Раствор делят на порции и хранят в замороженном виде.

2. К суспензии вируса добавляют равный объем диссоциирующего буфера. Для выделения нуклеиновой кислоты раствор прогревают 10 мин при 50--60°С, для выделения белка раствор прогревают 2 мин при 100 °С. К раствору добавляют 1/5 объема 0,06%-ного бромфенолового синего, наносят на гель и проводят электрофорез.

3. В результате получают нуклеиновую кислоту в нативном состоянии. Если необходима денатурация, следует воспользоваться одним из описанных выше методов.

3.6 Гель-электрофорез вирусных частиц

Электрофорез в геле можно использовать для определения изоэлектрической точки и разделения по размерам и поверхностному заряду мелких изометрических и некоторых палочковидных вирусов. Разделение лучше всего проводить в поли-акриламидных гелях, хотя для некоторых вирусов можно использовать и агарозные гели. Так, например, для разделения изометрических вирусных частиц диаметром около 30 нм подходит 3%-ный полиакриламидный гель. рН такого геля доводят буферным раствором, содержащим трис и лактат кальция. При этом необходимо приготовить два исходных раствора:

1. 0,6 М трис, рН которого доведен молочной кислотой до 4,0--6,0 или какодиловой кислотой до 6,0--7,5. Для получения рН 7,5--8,5 нужно использовать 0,6 М молочную кислоту, рН которой доводят трисом.

2. 60 мМ лактат кальция, который получают, доводя рН Саг до необходимого значения молочной или какодиловой кислотой. При смешивании этих растворов в отношении 1: 1 получают 20-кратный буфер для приготовления геля и проведения электрофореза.

Подобные документы

История открытия вирусов, их детальное исследование после изобретения микроскопа. Характеристика вирусов: свойства, формы существования, строение, химический состав и процесс размножения. Гипотеза о происхождении вирусов из "беглой" нуклеиновой кислоты.

презентация [553,5 K], добавлен 18.01.2014

Открытие вирусов, их размеры, особенности строения и жизненный цикл. Синтез компонентов вирусной частицы - нуклеиновой кислоты и белков капсида. Вирусы растений, животных и человека как возбудители различных заболеваний. Эволюционное развитие вирусов.

контрольная работа [433,8 K], добавлен 15.03.2014

Микроорганизмы, имеющие более простое строение по сравнению с клетками животных и растений. Размеры, внутренние и поверхностные структуры бактерий и вирусов. Соединения белка и нуклеиновой кислоты, способные размножаться только в пораженной клетке.

презентация [2,0 M], добавлен 26.09.2011

Понятие мутации вирусов и мутагенов. Частота мутаций вирусов и механизмы их возникновения. Модификации, вызываемые хозяином. Изменчивость вирусов при пассажах. Изменчивость вирусов, возникающая в процессе пассажей при пониженных и повышенных температурах.

реферат [32,0 K], добавлен 10.11.2010

Понятие, история открытия, происхождение, культивация, формы существования и свойства вирусов. Общая характеристика и сравнение вирусов животных, растений и бактерий. Механизмы инфицирующего и летального воздействия ВИЧ на клетки организма человека.

реферат [25,5 K], добавлен 23.01.2010

Характеристика вирусов как очень маленьких живых организмов, вызывающих болезни у растений и животных. Особенности строения вирусных ДНК, РНК, их внешний вид, размеры компонентов, вызываемые заболевания. Размножение и основные стадии репродукции вирусов.

презентация [1,6 M], добавлен 20.01.2012

Эволюционное происхождение. Свойства вирусов. Природа вирусов. Строение и классификация вирусов. Взаимодействие вируса с клеткой. Значение вирусов. Вирусные заболевания. Особенности эволюции вирусо на соременном этапе.


Оглавление

  • Введение
  • Обозначения и сокращения
  • 1 История вирусологии, природа и происхождение вирусов
  • 2 Химический состав вирусов
  • 3 Морфология, морфогенез, биофизические свойства и генетика вирусов

Приведённый ознакомительный фрагмент книги Общая вирусология с основами таксономии вирусов позвоночных предоставлен нашим книжным партнёром — компанией ЛитРес.

2 Химический состав вирусов

Основными химическими соединениями, которые входят в состав всех вирусов, являются белки и нуклеиновые кислоты. В состав ряда вирусов входят липиды и углеводы.

Белки. Локализация вирусных белков. Белки, связанные с жизненным циклом вируса, разделяют на белки, детерминируемые геномом вируса и белки, имеющие клеточное происхождение. В качестве примера клеточных белков, которые обнаружены в составе некоторых вирионов, могут быть приведены белок цитоскелета — актин, и ядерные белки — гистоны. Белки клеточного происхождения, участвующие в процессе репликации вируса, будут рассмотрены в разделе взаимодействия вируса с клеткой.

По месту локализации белки, детерминируемые вирусным геномом, разделяют на две группы: 1) структурные белки — это белки, входящие в состав ВЧ, их обозначают как VP; 2) неструктурные белки — это предшественники структурных белков, регуляторные белки и ферменты, обслуживающие процесс внутриклеточной репродукции вируса и не входящие в состав ВЧ. Их обозначают как NS-белки.

Свойства вирусных белков. В состав вирионов входят белки с различной молекулярной массой (от 4 до 100 кД), состоящие из одной или нескольких полипептидных цепей. Количество этих белков также различно у разных вирусов. В состав нуклеокапсида ВТМ входит один белок. У других вирусов в состав вириона может входить несколько десятков белков, имеющих различные физико-химические свойства. Белки, формирующие капсид, нуклеокапсид и коровую оболочку, обладают одним общим свойством — способностью к самосборке.

В состав ВЧ могут входить низкомолекулярные белки, не участвующие в формировании капсида. Например, геномные белки пикорнавирусов и аденовирусов. Геномный белок ковалентно связан с нуклеиновой кислотой и участвует в ее репликации.

Сложные белки представлены гликопротеинами (обозначают как gp) и липопротеинами. Наличие гликопротеина определяет присутствие в вирионе углеводного компонента, который может быть представлен олигосахаридами маннозного типа, галактозой, N-ацетилглюкозамином или нейраминовой кислотой. Вирусные гликопротеины, как правило, экспонированы на наружной поверхности ВЧ и выполняют три основные функции: обеспечивают связывание вириона с клеточным рецептором (функция прикрепительного белка), обладают фузионной активностью (обеспечивают слияние мембран) и определяют антигенные свойства вирусов. В то же время, вирусные гликопротеины могут быть и неструктурными белками и, оставаясь в интегральной форме в мембране шероховатого эндоплазматического ретикулюма (ШЭР), выполнять функции транслоказ, обеспечивая транспорт вирусных компонентов в его просвет.

Вирусные липопротеины представлены белками, ацилированными, как правило, миристиновой (C14) кислотой. Остатки жирных кислот, соединенные с молекулой белка, выполняют функцию липофильного якоря.

Вирусные белки-ферменты могут входить в состав вирусной частицы или являться неструктурными белками и появляться в клетке после экспрессии вирусного генома. Наиболее оснащенным ферментами является вирион вируса оспы, который имеет практически полный набор энзимов, необходимых для независимой внутриклеточной репликации вируса. В то же время, мелкие просто организованные изометрические вирусы с позитивным РНК-геномом могут не иметь никаких ферментов в составе вириона.

Функционально активные белки вирусов представлены, в первую очередь, ферментами нуклеинового обмена, обеспечивающими сложные механизмы репликации/транскрипции вирусного генома; ферментами, осуществляющими посттрансляционный процессинг и модификацию белков, и ферментами, участвующими в проникновении вирионов в клетку хозяина.

Первая группа ферментов наиболее многочисленна и включает как аналоги клеточных ферментов, так и вирус-специфические ферменты.

ДНК-зависимая ДНК-полимераза — осуществляет синтез ДНК на матрице ДНК (вирус оспы).

ДНК-зависимая РНК-полимераза — осуществляет синтез мРНК на матрице ДНК (вирус оспы).

Обратная транскриптаза или ревертаза или РНК-зависимая ДНК-полимераза осуществляет синтез ДНК на матрице РНК. Впервые открыта в 1970 г. у ретровирусов Темином и Мизутани.

Хеликаза — осуществляет расплетете двухнитевой структуры ДНК. Кроме этого хеликазы обладают нуклеотидтрифосфат-зависимой РНК-хеликазной активностью, которая включает три процесса: связывание дезоксинуклеотидтрифосфата, его гидролиз и за счет этой энергии расплетение двухнитевой РНК.

мРНК-модифицирующие ферменты : поли-А-полимераза — аденилирует 3'конец РНК за счет энергии АТФ; Кэп-энзим и метилтрансферазный комплекс — катализирует образование на 5'-конце кэп-структуры.

АТФ-аза, ГТФ-аза — осуществляют гидролиз соответствующих энергетических субстратов.

Рибонуклеаза Н — разрушает РНК, находящуюся в дуплексе с ДНК. Вторая группа вирусных ферментов — ферменты белкового обмена.

Здесь мы приведем лишь некоторые из них:

Протеиназы — ферменты, участвующие в посттрансляционном процессинге полипротеинов. Являются NS-белками РНК-содержащих вирусов;

Протеинкиназы — ферменты, фосфорилирующие структурные белки вирионов. Обнаружены в составе вируса везикулярного стоматита, вируса бешенства, альфавирусов и ретровирусов. Примерами ферментов, участвующих в проникновении вирусов в клетку, являются лизоцим бактериофагов и нейраминидаза вируса гриппа.

Липиды. Все оболочечные РНК-содержащие почкующиеся вирусы имеют липиды клеточного происхождения, входящие в состав суперкапсида (от 15 % до 30 % от сухого веса). От 50 % до 60 % липидов представлены фосфолипидами, от 20 % до 30 % составляет холестерин.

У ДНК-геномных вирусов липиды содержат вирусы оспы, герпеса, гепатита B. Это непочкующиеся вирусы. У вируса оспы липиды не образуют дифференцированной оболочки, которая формируется в цитоплазме в процессе морфогенеза поксвириона. Липиды вируса гепатита B образуются путем инвагинации мембран эндоплазматического ретикулюма (ЭПР). Липидсодержащая оболочка вируса герпеса формируется при прохождении внутреннего компонента вириона через ядерную мембрану. Следовательно, в состав вирусной оболочки герпесвирусов входят липиды ядерной мембраны.

Нуклеиновые кислоты. Клетки всех живых организмов содержат два вида нуклеиновой кислоты — ДНК (двухнитевая ДНК клеточного генома) и РНК (мРНК, тРНК, рРНК). В отличие от клеток, вирионы содержат только один вид нуклеиновой кислоты — ДНК или РНК. И та и другая являются хранителями наследственной информации и выполняют функции генома. Однако следует учитывать, что наличие одного вида нуклеиновой кислоты является характеристикой вириона, но не вируса. В жизненном цикле вируса его геномная нуклеиновая кислота транскрибируется, то есть ДНК-содержащие вирусы образуют РНК. Ряд РНК-содержащих вирусов имеют в цикле репродукции стадию обратной транскрипции и синтезируют ДНК на матрице РНК. Примерно 20 % всех вирусов имеют ДНК-геном, 80 % — РНК-геном. Способность РНК хранить наследственную информацию — уникальное свойство вирусов. Размеры вирусных геномов (длина нуклеотидных последовательностей, выраженная в нуклеотидах) варьируют в широких пределах — от 1,7 тысяч нуклеотидов (т.н.) у цирковируса свиней до 300 т.н. у фикоднавирусов архибактерий.

Кроме того, что геном вирусов может быть представлен или ДНК или РНК, он может находиться в разных видах — в виде двухнитевой (дн) или однонитевой (он) формы, в виде линейной или кольцевой, в виде непрерывной или сегментированной формы.

Многообразие видов РНК геномов расширяется за счет существования последовательностей, отличающихся направлением связей сахаро-фосфатного остова.

Однонитевые РНК могут иметь позитивную полярность — (+) РНК, негативную полярность — (-) РНК или могут быть представлены обоюдозначащей цепью — (+, — ) РНК (амбисенс стратегия кодирования). В свою очередь, РНК позитивной полярности могут иметь разную структурную организацию: могут, являясь матричной РНК, иметь на 5'-конце кэп (7-метилгуанозин, Сар), а на 3'-конце — поли-А (poly-A) последовательность; могут не иметь кэпа или поли-А; могут иметь на 5'-конце геномный белок; могут иметь на 3'-конце тРНК-подобную или шпильковую структуру.

Виды геномов вирусов легли в основу их классификации. Однако следует учитывать, что вид генома в настоящее время не является формальным таксоном и используется для удобства ориентации в многообразии вирусов.

Углеводы. Углеводный компонент вирусов находится в составе гликопротеидов. Количество сахаров в составе гликопротеидов может быть достаточно большим, достигая от 10 % до 13 % от массы вириона. Химическая специфичность их полностью определяется клеточными ферментами, обеспечивающими перенос и присоединение соответствующих сахарных остатков. Обычными сахарными остатками, обнаруживаемыми в вирусных белках, являются фруктоза, сахароза, манноза, галактоза, нейраминовая кислота, глюкозамин. Таким образом, подобно липидам, углеводный компонент определяется клеткой-хозяином, благодаря чему один и тот же вирус, выращенный в клетках разных видов, может значительно отличаться по составу сахаров в зависимости от специфичности клеточных гликозилтрансфераз.

Углеводный компонент гликопротеидов играет существенную роль в структуре и функции белка. Он является каркасом для локальных участков гликопротеида, обеспечивая сохранение конформации белковой молекулы, и обусловливает защиту молекулы от протеаз. Возможны и другие функции углеводов, пока достоверно не установленные.

Компоненты клетки-хозяина. В составе вирионов могут находиться компоненты клетки-хозяина. К таким компонентам могут относиться белки, и даже целые клеточные структуры. Так, например, в составе ряда оболочечных вирусов может находиться белок цитоскелета актин, в составе паповавирусов содержатся клеточные гистоны. Ряд вирусов содержит клеточные ферменты, например, протеинкиназы. В составе аренавирусов обнаружены рибосомы.

Клеточные компоненты могут включаться в вирион случайно или закономерно, В некоторых случаях они играют существенную роль в репродукции вируса, как, например, гистоны в репродукции паповавирусов.

Читайте также: