Что такое ртга на вирус гриппа
Обновлено: 18.04.2024
Внутри вириона гриппа А находятся восемь сегментов вирусной РНК. Эти молекулы несут всю необходимую информацию для образования новых частиц вируса гриппа. Эти восемь РНК схематично показаны желто-зелеными линиями в верхней части рис. 2. РНК представляют собой цепи из четырех различных нуклеотидов – A, C, G и U. В случае с вирусом гриппа восемь РНК имеют длину порядка 14000 нуклеотидов. Нуклеотиды составляют генетический код, который считывается преобразующим механизмом клетки в триплеты, определяющие аминокислоту.
Необходимо рассмотреть два важных аспекта этих вирусных РНК. Во-первых, вы можете видеть, что концы вирусных РНК помечены как 3′ и 5′. Нуклеиновые кислоты обладают полярностью, так что один конец цепи имеет отличные химические свойства от другого. Эта полярность представлена как 3′ и 5′. Во-вторых, во время копирования, или удвоения, нуклеиновой кислоты ферментами, которые носят название полимераз, появляется нить с комплементарной полярностью. Вирусные РНК гриппа называются (-), или РНК с отрицательной нитью, поскольку они представляют собой отрицательную полярность РНК с трансляцией в белок. Молекулы РНК, являющиеся образцами для синтеза белков, называются (+), или положительной полярностью. После вхождения в клетку отрицательная нить (-) вирусной РНК гриппа должна скопироваться в комплементарные (+) нити, так что они могут служить образцом для белков. Вирусные РНК копируются ферментом (РНК-полимеразой), который привносится в клетку вместе с вирусом.
На рис. 2 желто-зелеными линиями обозначены обнаруженные в вирионе гриппа РНК с отрицательными нитями. Как только вирион входит в клетку, эти восемь РНК копируются в положительную нить мРНК. Наконец, мРНК может служить образцом для синтеза белков. Специфические вирусные белки, производимые каждой вирусной мРНК, показаны в нижней части рис. 2. Видно, что, например, сегмент 4 РНК несет информацию о вирусном белке HA, а сегмент 6 – о вирусном белке NA. Заметьте, что некоторые сегменты РНК несут информацию более чем об одном белке. Вирусы гриппа субтипов А и B имеют восемь сегментов РНК, тогда как субтипа C – только семь.
Вирусы гриппа называются РНК-вирусами с отрицательной нитью из-за полярности РНК, привносимой в вирион. Другие РНК-вирусы, такие как полиовирус, являются РНК-вирусами c положительной нитью, так как их геномная РНК может преобразовываться в белок сразу после вхождения в клетку.
1.3. Субтипы A, B и C вируса гриппа
рисунок). Оболочечные вирионы с шестиугольной структурой на поверхности формируют длинную (500 микрон) напоминающую шнур структуру при отпочковании от клетки (рис. 4). Как и в случае с вирусами гриппа A и B, ядро вируса гриппа C состоит из рибонуклеопротеина, созданного из вирусной РНК и 4 белков. Белок M1 расположен под мембраной, как и в вирионах гриппа A и B. Второстепенный вирусный оболочечный белок CM2 функционирует как ионный канал. Основной оболочечный гликопротеин вируса гриппа C называется HEF (слияние гемагглютинина и эстеразы – hemagglutinin-esterase-fusion), поскольку он обладает функциями и HA, и NA. Поэтому вирион гриппа содержит 7 сегментов РНК, а не 8, как вирусы гриппа субтипов A и B.
Практически все взрослые когда-либо заражались вирусом гриппа C, вызывающим мягкое течение болезни в верхних дыхательных путях. Осложнения с переходом на нижние дыхательные пути – редкость. Против вируса гриппа C не существует вакцины.
Мне достаточно хорошо знакомы вирусы гриппа B и C – я получил степень доктора наук за их изучение. В моей работе говорится, что геном вируса гриппа C состоит из 7 сегментов РНК, и показана рекомбинация среди различных штаммов вируса гриппа C.
Рисунок 4.
Рекомендуемая литература.
- Hatta, M., & Kawaoka, Y. (2003). The NB Protein of Influenza B Virus Is Not Necessary for Virus Replication In Vitro Journal of Virology, 77 (10), 6050-6054 DOI:10.1128/JVI.77.10.6050-6054.2003.
- RacanielloVR, & Palese P (1979). Isolation of influenza C virus recombinants. Journal of Virology, 32 (3), 1006-14 PMID: 513198.
1.4. РНК вируса гриппа: трансляция в белок
Рисунок 6.
Рисунок 7.
Последовательности, взятые нами для образца, принадлежат штамму 1918 H1N1 вируса гриппа. Обратите внимание на аминокислоту PB1-F2, выделенную синим цветом. Эта аминокислота играет важную роль в биологическом функционировании белка, которую мы еще рассмотрим впоследствии.
Диагностика гриппа. Лечение гриппа. Профилактика гриппа.
Материалы для исследования при гриппе — смывы и мазки из носоглотки, мазки-отпечатки из носовой полости и кровь.
Основные методы диагностики гриппа — вирусоскопические, вирусологические и серологические. К методом экспресс-диагностики гриппа относят определение Аг вируса в мазках-отпечатках из носа и смывов носоглотки в РИФ и ИФА.
Выделение возбудителя гриппа проводят заражением 10-11-суточных куриных эмбрионов или, реже, различных клеточных культур. Вирусы гриппа проявляют слабый цитопатический эффект и чаще определяют феномен гемадсорбции. Типовую принадлежность вирусов идентифицируют в РСК; подтип гемагглютинина — в РТГА (вирусы гриппа агглютинируют эритроциты человека и различных животных); подтип нейраминидазы — в реакции ингибирования активности фермента.
Лечение гриппа
Препараты выбора при лечении гриппа —- амантадин или ремантадин, ИФН и его индукторы, противогриппозный у-глобулин. Терапевтические мероприятия следует начинать как можно раньше.
Профилактика гриппа. Иммунопрофилактика гриппа.
Разработаны методы активной и пассивной иммунопрофилактики гриппа. Для пассивной иммунизации применяют противогриппозный иммуноглобулин человека, приготовленный из крови доноров, иммунизированных гриппозными вакцинами.
Для активной иммунизации против гриппа применяют живые и инактивированные вакцины. Живые аттенуироеанные вакцины проявляют большую иммуногенность. Инактивированные вакцины включают вирионные (приготовлены из высоко-очищенных культур вирусов), субвирионные или расщеплённые (получают обработкой высоко-очищенных культур вирусов детергентами), субъединичные (содержат только гемагглютинин и нейраминидазу) препараты. Вакцинацию осуществляют в периоды наибольшего риска развития эпидемий. Она в большей степени показана лицам младшего и преклонного возраста, страдающим обструктивными лёгочными и сердечно-сосудистыми заболеваниями, а также сотрудникам ЛПУ.
Применение убитых вакцин от гриппа требует ежегодной ревакцинации; их эффективность не превышает 60-70%. Поскольку антигенные вариации возбудителя наблюдают часто, то набор Аг соответствующего вируса для иммунизации может быть определён только после начала вспышки заболевания.
Выявление противовирусных антител ( AT ) в сыворотке крови. РТГА. РСК. РИФ. Иммуносорбционные методы выявления противовирусных антител.
Более простой и доступный подход — выявление противовирусных антител ( AT ) в сыворотке. Образцы крови необходимо отбирать дважды: немедленно после появления клинических признаков и через 2~3 нед. Чрезвычайно важно исследовать именно два образца сыворотки. Результаты однократного исследования нельзя считать окончательными из-за невозможности связать появление AT с настоящим случаем. Вполне возможно, что эти AT циркулируют после предшествующей инфекции. В подобной ситуации роль исследования сыворотки, полученной в период рекон-валесценции, трудно переоценить. На наличие заболевания в период отбора первой пробы указывает не менее чем четырёхкратное увеличение титра AT, выявленное при исследовании второй пробы.
Перечисленные ниже методы не позволяют дифференцировать антитела ( AT ), образующиеся во время болезни и циркулирующие после выздоровления (продолжительность этого периода вариабельна для различных инфекций). Поскольку для адекватной диагностики необходимо подтвердить достоверное увеличение титров AT в двух пробах, то первую пробу исследуют в острой фазе, а вторую — в период выздоровления (через 2-3 нед). Полученные результаты носят ретроспективный характер и более пригодны для проведения эпидемиологических обследований.
РТГА выявляет AT, синтезируемые против гемагглютининов вирусов (например, вируса гриппа). Метод позволяет легко выявлять подобные антитела ( AT ) в сыворотке больного.
РСК — основной метод серодиагностики вирусных инфекций (среди доступных). Реакция выявляет комплементсвязывающие IgM и IgG, но не дифференцирует их; для оптимизации получаемых результатов постановка реакции требует определённых навыков персонала.
РИФ. При возможности получить биоптат инфицированной ткани и доступности коммерческих наборов AT, меченных флюоресцеином, диагноз может подтвердить реакция прямой иммунофлюоресценции. Постановка реакции включает инкубацию исследуемой ткани с AT, их последующее удаление и люминесцентную микроскопию образца.
Иммуносорбционные методы выявления противовирусных антител
Иммуносорбционные методы (например, ИФА и РИА) более информативны, поскольку выявляют IgM и IgG по отдельности, что позволяет делать определённые выводы о динамике инфекционного процесса или состоянии реконвалесценции. Для выявления AT известный Аг сорбируют на твёрдом субстрате (например, на стенках пробирок, пластиковых микропланшетах, чашках Петри) и вносят различные разведения сыворотки пациента. После соответствующей инкубации несвязавшиеся AT удаляют, вносят антисыворотку к Ig человека, меченную ферментом, повторяют процедуру инкубирования и отмывания несвязанных AT и вносят какой-либо хромогенный субстрат (чувствительный к действию фермента). Поскольку изменение окраски пропорционально содержанию специфических AT, то вполне возможно определение их титра спектрофотометрическим способом. В диагностике ВИЧ-инфекции наи- большее распространение нашёл метод иммуноблотннга.
Информация на сайте подлежит консультации лечащим врачом и не заменяет очной консультации с ним.
См. подробнее в пользовательском соглашении.
Штаммы вируса гриппа. Антигены вируса гриппа. Строение вируса гриппа.
Вирулентные штаммы вируса гриппа, в отличие от невирулентных, обязательно активизируются за счет расщепления протеазами. Гемагглютинины вируса гриппа расщепляются внутриклеточно и потому способны инфицировать клетки различных тканей и вызывать системную инфекцию. Ортомиксовирусы с нерасщепленным НА имеют низкую инфекционную активность. Инфекционная форма вируса с расщепленным НА в организме млекопитающих образуется только в клетках, выстилающих дыхательный тракт. При отсутствии трипсина в культуре клеток расщепляется НА только вирулентных штаммов вируса. Для вируса гриппа птиц установлена строгая корреляция между расщепляемостью НА, способностью размножаться в культуре клеток и патогенностью для кур. Расщепление НА на субъединицы не является обязательным для сборки и выхода вирионов из клетки и проявления гемагглютинирующей активности. Полагают, что фактором, детерминирующим патогенность вируса гриппа птиц, является чувствительность НА к протеолитическому расщеплению.
В сайте расщепления НА у вирулентных штаммов вируса гриппа содержится несколько основных аминокислот, а у невирулентных — только один остаток аргинина. Таким образом, только участок из нескольких основных аминокислот у С-конца НА образует сайт узнавания для ферментов, ответственных за расщепление.
Основные функции НА: гемагглютинирующая активность вируса; прикрепление вирионов к клеткам-мишеням путем связывания с сиалосодержащими рецепторами; слияние вирусной и клеточной мембран. НА является основным специфическим антигеном вируса, определяющим (наряду с NA) подтип и вызывающим образование антител, нейтрализующих инфекционность вируса и его ГА-активность. НА играет главную роль в индукции протективного иммунитета при гриппе. В молекуле НА имеются 3-4 антигенных домена, изменения в которых определяют антигенный дрейф. NA является ферментом, катализирующим отщепление сиаловой кислоты от субстрата. Удаление сиаловой кислоты с НА облегчает его расщепление клеточными протеазами. Антитела к белку NA имеют вспомогательное значение в защите и нейтрализуют вирус лишь при высоком титре. Матриксный белок М - самый низкомолекулярный структурный белок. Он принимает участие в морфогенезе вириона и стабилизации его структуры. Нуклеопротеид (NP) - основной внутренний белок, формирующий субъединицы капсида. Белки NP и М являются типоспецифическими антигенами, общими для всех вирусов гриппа одного типа, и в этом отношении резко отличаются от высокодивергентных поверхностных белков. Они не вызывают образования протективных антител. Однако нуклеопротеин вируса гриппа — основной антиген, узнаваемый цитотоксическими Т-лимфоцитами. Аминокислотные последовательности 260—283 нуклеопротеина вируса гриппа А являются индукторами Т-клеточного ответа. Изменение антигенных свойств вируса гриппа — результат двух генетических процессов: антигенных дрейфа и шифта. Антигенный дрейф происходит в основном через накопление аминокислотных замен (точечных мутаций) в НА1. Замена одного аминокислотного остатка в эпитопе нарушает его связывание с соответствующими МАТ. Основные механизмы антигенного шифта — реассортация отдельных генов, возвращение в популяцию старых генов, прямые мутации, изменяющие специфичность к хозяину. NA может измениться независимо от НА. Вариабельность НА вируса гриппа А значительно выше вариабельности НА вируса гриппа В.
В процессе адаптации вируса гриппа к различным системам наблюдают изменение антигенной структуры НА, в основе которой лежит селекция мутантов с измененной рецепторсвязывающей специфичностью. Вирусы гриппа А и В человека, размноженные в КЭ, могут изменяться антигенно и претерпевать мутации в ГА (замена трех аминокислот в ГА). Вирус, размноженный в КЭ или в культуре клеток, защищает против культурального вируса более эффективно, чем против полевого вируса, выделенного от человека.
Один и тот же клинический изолят вируса гриппа при размножении в культуре клеток животных (МДСК) или в КЭ имеет разные антигенные свойства, что связано с заменой одной-двух аминокислот в разных участках молекулы НА. Особенно заметные изменения антигенности в молекуле НА наблюдали при замене аминокислотных остатков 187 и 189 в процессе адаптации вируса к КЭ. Изменение сайта гликозилирования может сопровождаться изменением антигенности и вирулентности вируса. Состав углеводов гемагглютинина вирусов и гриппа птиц может изменяться в различных хозяйских клетках даже в течение одного пассажа. У вирусов гриппа птиц типа А идентифицировано девять нейраминидазных N-антигенов, обозначенных 1-9, и 13 гемагглютинирующих антигенов Н, обозначенных 1-13. Состав Н- и N-антигенов полевых изолятов зависит от вида птиц, места и времени вспышек гриппа. Свиньи восприимчивы к различным подтипам вируса гриппа А и, возможно, вместе с водоплавающей птицей являются главным резервуаром вируса гриппа в природе.
В пермиссивных клетках вирусный НА активируется путем расщепления на две части НА1 и НА2, которые остаются связанными дисульфидными связями. Вирионы прикрепляются к клеткам, активированным НА, соединяются с рецепторами сиаловой кислоты плазматической мембраны и входят в клетку эндоцитозом. После сплавления оболочки вируса и эндоплазматической мембраны транскрипционный комплекс освобождается и транспортируется в ядро, где происходит транскрипция и репликация РНК.
Так же, как у всех других вирусов с негативно-полярным РНК-геномом, геном ортомиксовирусов выполняет две функции: 1) матричную для синтеза мРНК и 2) матричную для синтеза позитивно-полярной промежуточной формы РНК, которая служит матрицей для синтеза потомства геномной РНК. Из 8 первичных транскриптов, синтезированных на 8 генных сегментах вирусов гриппа А и В, 6 являются моноцисторными и транслируются прямо в белки. Два других — подвергаются сплайсингу с образованием двух мРНК, которые транслируются с различных рамок считывания с образованием двух белков. Вирусные белки синтезируются, используя клеточный механизм трансляции. Ортомиксовирусы используют несколько механизмов для увеличения кодирующей способности: сплайсинг мРНК, спаренную стоп-старт-трансляцию тандемных генов и сдвиг рамки считывания.
Репликация геномных РНК сегментов требует синтеза полноразмерных, положительной полярности РНК посредников, которые, в отличие от соответствующих мРНК транскриптов, не имеют КЭП-структуры на 5'-конце и поли (А) последовательности на З'-конце. Вновь синтезированный нуклеопротеин присоединяется к этим РНК, облегчая их использование в качестве матрицы для синтеза геномной РНК. Вирионы формируются почкованием, включая М белок и нуклеокапсид, которые встроены на плазматической мембране, в которую включены НА и NA. Механизмы копирования каждого РНК сегмента и включение их в каждый вирион неизвестны.
Хотя в результате реассортации генов теоретически могут возникать вирусы с любой комбинацией Н и N генов, однако только ограниченное число вирусов с определенной комбинацией Н и N генов оказались важными патогенами, имеющими право на существование. В том числе вызывающие респираторную патологию у людей: H1N1, H2N2, H3N2, H5N1 и, возможно, H3N8; у лошадей H7N7 и H3N8; у норок H10N4; у котиков H7N7 и H4N5; вирусы, часто выделяемые от свиней - H1N1 и H3N2. Главными возбудителями гриппа птиц являются вирусы с H5N2 и H7N1, хотя встречаются и другие варианты вируса гриппа А. Так как установлена резистентность диких видов птиц к вирусу гриппа А, им отводили роль резервуара вируса, прежде всего для домашней птицы. При экспериментальном заражении вирусом H1N5 дикие утки, как правило, не проявляли клинических признаков болезни, хотя вирус в их организме размножался и выделялся во внешнюю среду. Латентное инфицирование вирусом гриппа может иметь место у других домашних и диких животных.
Целью исследования была идентификация вируснейтрализующих эпитопов в составе тяжелой субъединицы гемагглютинина (НА1) вирусов гриппа В линии Ямагата. Для селекции эскейп-мутантов была использована панель из шести впервые полученных моноклональных антител (МКА) к НА1 вируса. Использованные МКА специфически реагировали в реакции торможения гемагглютинации и реакции нейтрализации только со штаммами Ямагатской линии при отсутствии взаимодействия с вирусами Викторианской линии. Секвенирование гена НА1 показало наличие мутаций в составе ЭМ 4Н7 с соответствующими аминокислотными заменами в позициях V75Iи D150T. У остальных ЭМ были выявлены одиночные аминокислотные замены: у ЭМ 10F4 – замена Y40H, ЭМ 8Н11 – H85Y,ЭМ D9 – R149I, ЭМ 8Н3 – N202K и у ЭМ 9А3 – S242R. Обсуждается связь выявленных аминокислотных замен с особенностями реагирования полученных ЭМ в РТГА.
1. Лобова Т.Г., Прокопец А.В., Комиссаров А.Б., Даниленко Д.М., Паянкова В.Ф., Суховецкая В.Ф. и др. Эволюционная изменчивость вирусов гриппа В, циркулировавших в Российской Федерации с 2005 по 2012 г // Вопросы вирусологии. – 2012. Т. – 54, № 6 – С. 22–26.
2. Соминина А.А., Лонская Н.И., Еропкин М.Ю., Литвинова О.М., Коновалова Н.И., Лобова Т.Г. и др. К вопросу о штаммовой композиции гриппозных вакцин на предстоящий эпидемический сезон 2005 – 2006 годов // Эпидемиология и вакцинопрофилактика. – 2005. – Т. 4, № 23, С. 3–7.
3. Kaverin N.V., Rudneva I., Govorkova E., Timofeeva T., Shilov A., Kochergin-Nikitsky K., et al. Epitope mapping of the hemagglutinin molecule of a highly pathogenic H5N1 influenza virus by using monoclonal antibodies.//J.Virol. 2007. Vol.81. pp. 12911-12917.
4. Kohler G., and Milstein C. Derivation of specific antibody-producing tissue culture and tumor lines by cell fusion // Eur. J. Immunol. 1976. Vol. 6. pp. 511–519.
5. Nakagawa N., Suzuoki J., Kubota R., Kobatake S., Okuno Y. Discovery of the neutralizing epitope common to influenza B virus Victoria group isolates in Japan // J. Clin. Microbiol. 2006. Vol. 44. № 4. pp. 1564–1566.
6. Ni F., Kondrashkina E., Wang Q. Structural basis for the divergent evolution of influenza B virus hemagglutinin // Virology. 2013. Vol. 446. pp. 112–122.
7. Shen J., Kirk B., Ma J., Wang Q. Diversifying Selective Pressure on Influenza B Virus Hemagglutinin // J. Med. Virol. 2009. Vol. 81. №1. pp. 114–124.
8. Shih S., Chen G., Yang C., Yang W., Liu D., Lin J. et al. Laboratory based surveillance and molecular epidemiology of influenza virus in Taiwan // J. Clin. Microbiol. 2005. Vol. 43. pp. 1651–1661.
9. Stray S., Pittman L. Subtype- and antigenic site-specific differences in biophysical influences on evolution of influenza virus hemagglutinin //Virol. J. 2012; 9:91. doi:10.1186/1743-422X-9-91.
10. Wang Q., Cheng F., Lu M., Tian X., Ma J. Crystal structure of unligandedinfluenza B virus hemagglutinin // J. Virol. 2008. Vol. 82. P. 3011–3020.
Вирусы гриппа типа В, впервые выделенные в 1940 году, в течение длительного времени составляли одну весьма гетерогенную группу возбудителей. В начале 1980-х гг. наметился дивергентный характер их эволюции с формированием двух эволюционных линий, родоначальниками которых были признаны референс-вирусы В/Виктория/2/87 и В/Ямагата/16/88 [8], резко различающиеся по антигенным и генетическим свойствам и периодически (в разные эпидемические сезоны) сменяющие друг друга в циркуляции, что создает серьезные трудности при выборе штаммов для включения в состав гриппозных вакцин [2]. Установлено [7], что в результате естественного иммунопрессинга в пределах линий происходит постоянный антигенный дрейф, обусловленный мутациями в тяжелой субъединице гемагглютинина. По современным представлениям, Викторианская эволюционная линия разделилась далее на две генетически независимые сублинии, а Ямагатская – на четыре сублинии [7]. Информацию о механизмах антигенного дрейфа получают путем сравнения аминокислотного состава гемагглютинина природных изолятов и эскейп-мутантов, получаемых в лабораторных условиях в результате клонирования вирусов в присутствии моноклональных антител. Наблюдаемые в ходе естественной эволюции аминокислотные замены локализованы преимущественно в определенных локусах HA1, представляющих антигенные эпитопы этого белка. Интересно, что в этих же участках обычно происходят аминокислотные замены и у полученных в лабораторных условиях ЭМ.
В задачу настоящего исследования входила разработка моноклональных антител (МКА), направленных к HA1 вирусов гриппа ВЯ магатской линии с последующим получением эскейп–мутантов вируса и идентификацией иммунодоминантных эпитопов в составе молекулы гемагглютинина.
Материалы и методы исследований
Получение генетически стабильных штаммов мышиных гибридов – продуцентов моноклональных антител к вирусам гриппа.
МКА к вирусам гриппа типа В (штаммы В/Панама/45/90 и В/Флорида/04/06)были получены в лаборатории биотехнологии диагностических препаратов НИИ гриппа по методу [4] в следующей модификации. Мышей линии BALB/c иммунизировали путем внутрибрюшинного введения 70 мкг антигена вирусов гриппа В/Панама/45/90 или В/Флорида/04/06, очищенных ультрацентрифугированием в градиенте плотности сахарозы. Двенадцать недель спустя мыши были бустированы очищенной фракцией поверхностных гликопротеинов (15 мкг/мышь) тех же вирусов. Через 3 дня после бустер-иммунизации проводили гибридизацию спленоцитов иммунных мышей с клетками мышиной миеломы линии PxAg. 653 в соотношении 10:1 в присутствии 50% раствора полиэтиленгликоля-2000 в среде Игла D-MEM. Клонирование гибридом проводили методом предельных разведений. Первичный отбор клонов проводили в ИФА с использованием для сенсибилизации планшет фракции поверхностных гликопротеинов вируса с последующим поэтапным внесением исследуемых культуральных жидкостей и затем – пероксидазных конъюгатоваффинно очищенных антител к IgG мыши, разведенных 1:10 000 (Sigma). Отобранные клоны гибридом, культивируемые на селективной среде НАТ, подвергали 5- кратному реклонированию, чередующемуся с размножением отобранных клонов в 24-луночных планшетах. Стабильные клоны – продуценты МКА – подвергали криоконсервации, а также использовали для получения асцитов путем внутрибрюшинного введения клонированных гибридом мышам линии BALB/c предварительно праймированных пристаном (Sigma).Селекция эскейп-мутантов.
В целях получения ЭМ использовали ранее описанный метод клонирования вирусов гриппа в присутствии нейтрализующих вирус МКА [3]. Для этого вирусы дикого типа (В/Панама/45/90 или В/Флорида/04/06) смешивали с равными количествами взятых в избыточной концентрации специфических МКА к указанным вирусам. Смеси инкубировали 1 ч при 37 0С, после чего вводили в куриные эмбрионы. Через 72 часа аллантоисные жидкости собирали и исследовали в РГА. Пробы, обладающие гемагглютинирующей активностью, содержащие ЭМ вируса, подвергали повторному клонированию, после чего собирали отдельные клоны и исследовали способность реагировать в РТГА с гомологичными и гетерологичными МКА.
Реакции гемагглютинации (РГА) и торможения гемагглютинации (РТГА) проводили в соответствии с рекомендациями ВОЗ. За титр гемагглютининов принимали наибольшее разведение вируса, вызвавшее полную агглютинацию эритроцитов. При постановке РТГА МКА титровали в объеме 50 мкл на 0,1М ФСБ, после чего вносили 50 мкл вирусной суспензии, содержащей 4 ГАЕ вируса. После инкубации смеси при комнатной температуре в течение часа вносили по 100 мкл 1 % суспензии куриных эритроцитов. Титром антител считали наибольшее разведение МКА, при котором наблюдалась полнаяингибиция гемагглютинации.
Результаты исследований и их обсуждение
Характеристика МКА, использованных в исследовании
В целях идентификации вируснейтрализующих эпитопов в молекуле гемагглютинина вирусов гриппа типа В Ямагатской эволюционной линии (ЭЛ) нами была разработана панель из шести МКА к вирусам гриппа, в т.ч. два – к вирусу В/Панама/45/90 (МКА 4Н7 и D9) и четыре – к штамму В/Флорида/04/06 (МКА 8Н3, 8Н11, 9А3 и 10F4). Согласно данным western-блота все МКА были направлены к тяжелой субъединице НА1. Все полученные МКА реагировали до высоких титров в ИФА (10-6) с вирусами Ямагатской ЭЛ, при полном отсутствии взаимодействия с вирусами гриппа В Викторианской ЭЛ и штаммами ранних (1954-1983 гг.) лет выделения. МКА, полученные к Ямагатским штаммам, обладали выраженной антигемагглютинирующей активностью только в отношении вирусов, принадлежащих этой ветви, начиная с эталонного штамма В/Ямагата/16/88.Интересным исключением явились МКА 10F4, которые не взаимодействовали с ранними штаммами Ямагатской линии (1988–1998 гг. выделения), но реагировали в РТГА со штаммами 2004-2012 гг. выделения, антигенно родственными штамму B/Флорида/07/04. Все разработанные МКА не проявляли антигемагглютинирующей активности в отношении вирусов 1954 – 1983 гг. выделения и Викторианских изолятов (табл. 1). Разработанные МКА обладали выраженной вируснейтрализующей активностью, что обеспечило в дальнейшем возможность получения ЭМ вирусов.
Взаимодействие моноклональных антител 4Н7, 8Н3, 8Н11, 9А3 и 10F4 (Ямагатские клоны) с различными штаммами вируса гриппа типа Вв РТГА
Читайте также: