Что значит выделить вирус

Обновлено: 18.04.2024

Главная задача биологии — это развитие представлений у человека о живых организмах, о многообразии видов, обо всех закономерностях развития живых существ, а также об их взаимодействии с окружающей природой. Предмет основы безопасности жизнедеятельности (ОБЖ) позволяет получить знания и умения, которые помогут сохранить жизнь и здоровье в опасных ситуациях. Эти ситуации всегда возникают неожиданно, но, тем не менее, большинство из них предсказуемы и к ним можно подготовиться заранее. ОБЖ учит нас предвидеть возможные опасности и минимизировать потери от той или иной ситуации. Сегодня мы сталкиваемся с новым видом вирусной опасности COVID-19,о котором поговорим с точки зрения биологии и ОБЖ.

Что такое вирус?

Вирус — это неклеточный инфекционный агент. Сегодня нам известно около 6 тысяч различных вирусов, но их существует несколько миллионов. Вирусы не похожи друг на друга и могут иметь как форму сферы, спирали, так и форму сложного асимметричного сплетения. Размеры вирусов варьируются от 20 нм до 300 нм.

Как устроен вирус?

В центре агента находится генетический материал РНК или ДНК, вокруг которого располагается белковая структура — капсид.
Капсид служит для защиты вируса и помогает при захвате клетки. Некоторые вирусы дополнительно покрыты липидной оболочкой, т.е. жировой структурой, которая защищает их от изменений окружающей среды.

Вирусолог Дэвид Балтимор объединил все вирусы в 8 групп, из которых некоторые группы вирусов содержат 1-2 цепочки ДНК. Другие же содержат 1 цепочку РНК, которая может удваиваться или достраивать на своей матрице ДНК. При этом каждая группа вирусов производит себя в различных органеллах зараженной клетки.

Вирусы имеют определенный диапазон хозяев, т.е. он может быть опасен для одних видов и абсолютно безвреден для других. Например, оспой болеет только человек, а чумкой только некоторые виды плотоядных. Вирус не способен выжить сам по себе, поэтому активируется только в хозяйской клетке, используя ее ресурсы и питательные вещества. Цель вируса — создание множества копий себя, чтобы инфицировать другие клетки!

Как вирус попадает в организм?

через физические повреждения (например, порезы на коже)
путём направленного впрыскивания (к примеру, укус комара)
направленного поражения отдельной поверхности (например, при вдыхании вируса через трахею)

к эпителию слизистых оболочек (это например вирус гриппа)
к нервной ткани (вирус простого герпеса)
к иммунным клеткам (вирус иммунодефицита человека)

Геном вируса встраивается в одну из органелл или цитоплазму и превращает клетку в настоящий вирусный завод. Естественные процессы в клетке нарушаются, и она начинает заниматься производством и сбором белка вируса. Этот процесс называется репликацией. И его основная цель — это захват территории. Во время репликации генетический материал вируса смешивается с генами клетки хозяина — это приводит к активной мутации самого вируса, а также повышает его выживаемость. Когда процесс репликации налажен, вирусная частица отпочковывается и заражает уже новые клетки, в то время как инфицированная ранее клетка продолжает производство.

Выход вируса

Вирус создал множество собственных копий, клетка оказывается изнуренной из-за использования ее ресурсов. Больше вирусу клетка не нужна, поэтому клетка часто погибает и новорожденным вирусам приходится искать нового хозяина. Это и есть заключительная стадию жизненного цикла вируса.

Скорость распространения вирусной инфекции

Размножение вирусов протекает с исключительно высокой скоростью: при попадании в верхние дыхательные пути одной вирусной частицы уже через 8 часов количество инфекционного потомства достигает 10³, а концу первых суток − 10²³.

Вирусная латентность

Как вирус распространяется?

воздушно-капельный (кашель, чихание)
с кожи на кожу (при прикосновениях и рукопожатиях)
с кожи на продукты (при прикосновениях к пище грязными руками вирусы могут попасть в пищеварительную и дыхательную системы)
через жидкие среды организма (кровь, слюну и другие)

Почему с вирусами так тяжело бороться?

Сегодня людям уже удалось победить некоторые вирусы, а некоторые взять под жесткий контроль. Например, Оспа (она же черная оспа). Болезнь вызывается вирусом натуральной оспы, передается от человека к человеку воздушно-капельным путем. Больные покрываются сыпью, переходящей в язвы, как на коже, так и на слизистых внутренних органов. Смертность, в зависимости от штамма вируса, составляет от 10 до 40 (иногда даже 70%), На сегодняшний день вирус полностью истреблен человечеством.

Кроме того, взяты под контроль такие заболевания, как бешенство, корь и полиомиелит. Но помимо этих вирусов существует масса других, которые требуют разработок или открытия новых вакцин.

Коронавирус

Виновником эпидемии, распространяющейся сегодня по миру, стал коронавирус, вирусная частица в 0,1 микрона. Свое название он получил благодаря наростам на своей структуре, своеобразным шипам. Внутри вируса спрятан яд, с помощью которого он подчиняет себе зараженный организм. Этот вирус воздействует не только на человека, но и на птиц, свиней, собак и летучих мышей. В настоящий момент выделяют от 30 до 39 разновидностей коронавирусной инфекции. Но для человека патогенно всего 6. И как любой другой вирус COVID-19 мутирует.

К наиболее распространенным симптомам COVID-19 относятся повышение температуры тела, сухой кашель и утомляемость. К более редким симптомам относятся боли в суставах и мышцах, заложенность носа, головная боль, конъюнктивит, боль в горле, диарея, потеря вкусовых ощущений или обоняния, сыпь и изменение цвета кожи на пальцах рук и ног. Как правило, эти симптомы развиваются постепенно и носят слабо выраженный характер. У некоторых инфицированных лиц болезнь сопровождается очень легкими симптомами.

Сколько же может жить этот вирус вне организма? Все зависит от типа вируса и от той поверхности, на которую вирусы попали. В качестве примера было рассмотрено 3 вируса, по которым велись исследования. Изучали время, на которое может задерживаться вирус на различных поверхностях. Данные приведены в таблице.

Поскольку пока не изобретено вакцины от COVID-19, в целях защиты от инфекции самым важным для нас является соблюдение гигиены.

Гигиена — раздел медицины, изучающий влияние жизни и труда на здоровье человека и разрабатывающая меры (санитарные нормы и правила), направленные на предупреждение заболеваний, обеспечение оптимальных условий существования, укрепление здоровья и продление жизни.

Сегодня следует соблюдать определенные правила гигиены:

Соблюдение режима труда и отдыха, не допускающего развития утомления и переутомления.
Выполнение условий, обеспечивающих здоровый и полноценный сон (свежий воздух, отсутствие шума, удобная постель, оптимальная продолжительность).
Правильное здоровое питание в соответствии с потребностями организма.
Комфортный микроклимат в жилище (температура, влажность и подвижность воздуха, естественная и искусственная освещенность помещений).
Содержание в чистоте тела и тщательный уход за зубами.
Спокойное и корректное поведение в конфликтных ситуациях.

Вся следующая информация и доказательства, приведенные ниже, основаны на том факте, что так называемые эксперты никогда не выделяли и не очищали вирус в соответствии с золотым стандартом постулатов Коха (Постула́ты Ко́ха— утверждения, которые можно сделать относительно микроорганизма, доказывающие, что он является возбудителем некоторой болезни: Микроорганизм постоянно встречается в организме больных людей (или животных) и отсутствует у здоровых), или даже модифицированных постулатов Ривера. Постулаты Коха:

1. Микроорганизм должен быть идентифицирован у всех людей, пораженных заболеванием, но не у здоровых людей.

2. Микроорганизм можно выделить от больного человека и выращивать в культуре.

3. При попадании в организм здорового человека культивируемый микроорганизм должен вызывать заболевание.

4. Затем микроорганизм должен быть повторно изолирован от экспериментального хозяина и признан идентичным исходному микроорганизму.

Постулаты Ривера были предложены Томасом М. Ривером в 1973 году для установления роли определенного вируса как причины определенного заболевания. Это модификации постулатов Коха. Вот они:

1. Вирусный агент должен находиться либо в жидкостях организма хозяина (животного или растительного) во время заболевания, либо в клетках, демонстрирующих поражения, характерные для этого заболевания.

2. Материал-хозяин с вирусным агентом, используемый для инокуляции здорового хозяина (тест-организм), не должен содержать каких-либо других микроорганизмов.

3. Вирусный агент, полученный от инфицированного хозяина, должен вызывать конкретное заболевание у подходящего здорового хозяина и / или обеспечивать свидетельство инфекции, индуцируя образование антител, специфичных к этому агенту.

4. Подобный материал (вирусная частица) от вновь инфицированного хозяина (тестируемого организма) должен быть изолирован и способен передавать конкретное заболевание другим здоровым хозяевам.

Какой бы набор постулатов ни использовался, SARS-CoV-2 не проходит проверку.

Процесс использования сертифицированных стандартных образцов (CRM) для проверки методов анализа и последовательностей калибровки приборов в лаборатории выглядит следующим образом:

3) Проводят через прибор неизвестные образцы (сыворотки крови, мочи, слюны, воды, экстрактов образцов пищи и т. д.). Смотрят, содержит ли неизвестный образец что-либо из того, что вы искали (аналит). Поскольку вы построили количественную кривую, вы также можете определить концентрацию аналита в исходной пробе. Обычно это выражается как отношение массы к объему, например нг / мл (нанограмм на миллилитр). Нанограмм - это одна миллиардная грамма. Когда мы тестируем продукты на глифосат, мы можем обнаружить всего 1 нанограмм на миллилитр, что кое-что говорит вам о чрезвычайной чувствительности высококлассных инструментов.

Федеральное агентство министерства здравоохранения США, Центр по контролю и профилактике заболеваний США (CDC) - в 2020г сообщил, что вирус Sars-cov-2 (COVID-19) никогда и никем не был выделен, а это значит что его существование, как и болезнь COVID-19 не доказаны.

CDC огласил миру этот факт в своём многостраничном документе, под названием "CDC 2019-Novel Coronavirus (2019-nCoV) Real-Time RT-PCR Diagnostic Panel" (CDC 2019-Новый Короновирус (2019-nCoV) Диагностическая панель ПЦР в реальном времени) датированном 01 декабря 2020г. Информация запрятана глубоко в документе в разделе Performance Characteristics (Рабочие характеристики) на странице 40.

CDC сообщает: "Since no quantified virus isolates of the 2019-nCoV were available for CDC use at the time the test was developed and this study conducted, assays designed for detection of the 2019-nCoV RNA were tested with characterized stocks of in vitro transcribed full length RNA (N gene; GenBank accession: MN908947.2) of known titer. "

"Поскольку на момент разработки теста и проведения настоящего исследования количественные изоляты вируса 2019-nCoV не были доступны для использования CDC, анализы, предназначенные для обнаружения РНК 2019-nCoV, были протестированы с охарактеризованными запасами полноразмерной РНК, транскрибированной in vitro (N ген; номер в GenBank: MN908947.2) с использованием известного титра. "

Что это всё значит? Каждый объект можно определить количественно, значит измерить его. Использование слова "количественные" в этой фразе означает, что у них нет измеримого количества вируса потому, что он не доступен. Получается измерять нечего, нет вируса.

Использование слова "изоляты" в данной фразе означает, что у них нет изолированного (выделенного) вируса. Выделенного измеримого количества вируса у них нет. Вирус они не выделили, а раз вирус не выделен, то его существование не доказано!

Фраза: ". были протестированы с охарактеризованными запасами полноразмерной РНК, транскрибированной in vitro (N ген; номер в GenBank: MN908947.2) с использованием известного титра. " означает, что т.к. вирус не был выделен, то никто не знает какая нуклеотидная последовательность ему принадлежит. Поэтому они создали искусственную нуклеотидную/генетическую последовательность с помощью образцов взятых из банка генов без участия какого-либо вируса. Эта нуклеотидная последовательность, которую они создали - всего лишь предположение о том как по их мнению должна выглядеть нуклеотидная последовательность вируса Sars-cov-2.

То же самое, что и CDC, заявляет и Высший орган исполнительной власти Европейского союза - Европейская комиссия. Такой же многостраничный документ под названием: "Текущая эффективность методов и устройств тестирования COVID-19 и предлагаемые критерии эффективности", опубликованный 16 апреля 2020 года, интересующая информация размещена на странице 19, в разделе Analytical performance (аналитическая производительность).

"Since no virus isolates with a quantified amount of the SARS-CoV-2 arecurrently available, assays designed for detection of the SARS-CoV-2 RNA couldbe tested with characterised stocks of invitrotranscribed RNA containing the target of interest of a calculated titer (RNA copies/μL) spiked into a diluent consisting of a suspension of human cells in viral transport medium (VTM) to mimic a clinical specimen."

"Поскольку в настоящее время отсутствуют изоляты вируса с определенным количеством SARS-CoV-2, анализы, предназначенные для обнаружения РНК SARS-CoV-2, могут быть протестированы с охарактеризованными запасами приглашенной транскрибированной РНК, содержащей интересующую мишень с рассчитанным титром (копии РНК). / мкл) добавлен в разбавитель, состоящий из суспензии человеческих клеток в вирусной транспортной среде (VTM), чтобы имитировать клинический образец."

То же самое, что и в документе CDC, отсутствуют изоляты вируса, заимствованная РНК. Всё предельно прозрачно, ничего не скрывается.

Кроме того группа авторитетных ученых из США, в числе которых признанные светила медицины, такие как Эндрю Кауфман (судебный психиатр с опытом работы в области молекулярной биологии), Томас Коуэн (доктор медицинских наук, имеет практику семейной медицины в Сан-Франциско, где он специализируется на питании, гомеопатии и фитотерапии), Салли Фаллон Морелл (является автором нескольких книг о питании - в том числе Nourishing Traditions® - и соучредителем и президентом организации Уэстон А. Фонд цен) и другие, объявили награду 1 миллион долларов за доказательство существовании COVID-19. По некоторым данным, более года никто так и не смог доказать существование этого вируса, и в настоящий момент награда возросла до 1,5 миллиона евро. Условия получения премии описаны на сайте.

Мнения, высказываемые в данной рубрике могут не совпадать с позицией редакции

Автор: Доктор Стефано Скольо, Ph.D, номинант на Нобелевскую премию в области медицины в 2018 г.

Ещё в марте 2020 года я начал говорить о том, что так называемое выделение SARS-CoV-2, проведенное командой Китайского центра по контролю заболеваний (CCDC) Zhu N. et al., (*прим. переводчика: публикация Zhu N. et al – самая первая и основополагающая публикация о выделении вируса SARS-CoV-2) вовсе не являлась процедурой по выделению, поскольку не было проведено никакой очистки вируса, а только культивирование бронхоальвеолярной жидкости некоторых пациентов с пневмонией на клетках почек обезьяны. Как я сказал тогда, эта бронхоальвеолярная жидкость, более или менее отфильтрованная, содержала около 30 миллиардов вирусоподобных частиц, большинство из которых были человеческого происхождения (экзосомы, внеклеточные везикулы и т.д.), которые затем были помещены в культуру клеток почек обезьяны Vero E6.

Кто-то может возразить: ну кого это волнует, был ли вирус выделен, вирус все равно есть и люди болеют. Но проблема именно в этом: чтобы можно было сказать, что причиной заболевания является вирус, а не многие другие возможные факторы, такие как пищевые, экологические и ятрогенные (вызванные самими лекарствами и терапиями), сначала необходимо обнаружить и идентифицировать вирус, что означает провести его изоляцию/ очистку путем выделения из огромной массы миллиардов вирусоподобных частиц, присутствующих в жидкости пациента; а затем, получив выделенный вирус, убедиться, что он патогенный, что он может вызвать заболевание, что возможно только в том случае, если вы протестируете образец, состоящий почти исключительно из вируса, на морской свинке. Потому что даже если патогенный эффект будет иметь место, но материал который вы тестируете, очень неоднороден, то есть состоит из большого количества других элементов, которые могут быть возможными болезнетворными факторами, нельзя будет узнать, является ли ваш предполагаемый вирус действительной причиной заболевания (в данном случае Covid). Таким образом, это суть тех фундаментальных принципов микробиологии, которые называются постулатами Коха.

В своих работах (и еще более подробно в книге, которую я собираюсь опубликовать) я показал, что постулаты Коха не были ни в малейшей степени удовлетворены исследователями, и поэтому нет возможности утверждать, что двусторонние интерстициальные пневмонии и легочные тромбоэмболии, которые составляют суть болезни Covid (и которые всегда существовали, и до 2020 года эти состояния называли не Covid, а их собственными названиями), вызваны каким-либо вирусом, не говоря уже о конкретном вирусе SARS-CoV-2.

Меня жестко критиковали за мою позицию, обвиняли в отрицании, но настоящие отрицатели – это те, кто отрицают истинную науку, желая выдать за достоверное и доказанное только то, что является простой гипотезой. Сегодня мою позицию окончательно подтверждает один из важнейших мировых органов здравоохранения – Американский центр по контролю заболеваний (CDC).

Даже если мы захотим адаптироваться к модификации постулатов Коха, сделанной Риверсом в 1937 году, то нам продолжает быть очевидно, что для проверки на патогенность используется не выделенный вирус, а культуры клеток, в которых вирус якобы размножается. Но для уверенности в том, что это культуры определенного вируса, сначала необходимо знать этот вирус, а для этого, следовательно, вирус должен быть предварительно выделен/очищен.

В общем, без предварительного выделения/изоляции и очистки вируса все, что из него следует, не имеет смысла. Вот почему утверждение о получении неколичественного изолята не имеет смысла, это противоречие в терминах. Противоречие, которое взрывается во всей своей серьезности в недавнем официальном документе того же CDC.

Центр контроля заболеваний США ответил на два запроса о выделении вируса в соответствии с Законом о свободе информации (FOIA). Это ответ на первый:

Это подтверждает то, что мы подозревали, и то, что я повторял в последние месяцы: настоящее выделение – это процесс вычитания, то есть вы вычитаете то, что хотите выделить из комплекса, к которому оно принадлежит. Здесь же изоляция идентифицируется как мультипликативная процедура, культивирование, которое является полной противоположностью изоляции.

Таким образом, этот запрос не позволяет уйти от ответа. Вот ответ CDC (полный документ прилагается в приложении):

Например, это ответ китайских ученых из группы, которые впервые в мире заявили, что изолировали SARS-CoV-2 [3], на запрос о разъяснении, сделанный моим другом и немецким журналистом Торстеном Энгельбрехтом:

Это подтверждает то, что я сказал выше: процесс, обычно используемый в вирусологии, ничего не очищает, то есть он не выделяет, а обогащает, то есть умножает и без того сверхсложную секрецию пациента в столь же сложной культуре клеток, учитывая, что клетки почек обезьяны имеют ту же генетическую и молекулярную сложность, что и человеческие клетки пациента.

Удивительно то, что экзосомы, которые неотличимы от вирусов и имеют тот же размер и структуру, что и предполагаемые вирусы [4], напротив, всегда правильно выделены [5]. Так почему же вирусологи не поступают так же? Может быть, потому что им придется признать, что попытка выделить потенциально супертоксичные вирусы на самом деле приведет к выделению безвредных экзосом? Таким образом дальнейшие тесты на патогенность показали бы, что токсичность и патогенный эффект полностью отсутствует, и это поставило бы самые основы вирусологии в фатальный кризис.

Итак, вирусологи настаивают на создании нечетких культур без каких-либо предварительных знаний о вирусе, который они хотят протестировать, с полностью манипулированными и сфальсифицированными доказательствами его патогенности.

Клетки почек обезьян подвергаются тесту на цитопатогенность не в нейтральном состоянии, а с добавлением антибиотиков, гормонов и других синтетических веществ. И поскольку эти ингредиенты тоже являются токсичными, то чтобы утверждать, что клеточная токсичность вызвана вирусом и ничем другим, необходимо параллельно удостовериться, что смесь клеток Vero не разлагается и токсические эффекты не происходят без вмешательства каких-либо секретов пациента. Однако такой проверки никогда не проводят.

Совсем недавно, это сделала команда д-ра Штефана Ланки, который еще не завершил исследование, так как еще не закончены этапы электронной микроскопии и секвенирования, но он предоставил первые результаты, которые и без того чрезвычайно значительны.

Выше вы можете увидеть слайды культур клеток, предоставленные командой Ланки. Доктор Ланка не добавлял каких-либо выделений от пациентов, предположительно пораженных вирусным заболеванием, но следовал процедуре, обычно используемой самими вирусологами для выделения вируса (культивирования в клетках). Например, это процедура, описанная американской группой исследователей CDC для изоляции SARS-CoV-2:

Это показывает, что цитотоксический эффект не связан с каким-либо патогенным вирусом, якобы присутствующим в секрете пациента, а возникает спонтанно из-за способа, которым структурирована культура клеток. Поэтому ясно, почему вирусологи никогда не проводят такой контроль. Потому что им придется признать, что секреция, полная так называемых вирусов, не вызывает никакой большей токсичности и патогенного эффекта, чем те, которые и так происходят в клетках без какого либо секрета.

Но, не выделив и не проанализировав вирус, откуда они знают, что те частицы, что видны под электронным микроскопом, относятся именно к вирусу, который они ищут, а не к какому-то другому организму, включая организм человека, поскольку известно, что все секреты человека содержат частицы генов человека (внеклеточные везикулы, экзосомы и т. д.) и составляют до 95% от всех частиц, найденных в этих секретах [8]? На самом деле, они ничего не знают, это просто гипотеза, превратившаяся в достоверность, и вирусологи полностью скрывают тот факт, что есть электронные микроскопические фотографии экзосом, которые выглядят полностью идентичными тем, которые приписываются коронавирусам:

Приложение: Официальный ответ американского CDC с
фирменной подписью.

Источники:

1. European Commission, Working Document of Commission Services, Current performance of COVID-19 test methods and devices and proposed performance criteria, April 16 2020, p.19.
2. Center for Disease Control and Prevention, Division of Viral Diseases, CDC 2019-Novel Coronavirus (2019-nCoV) Real-Time RT-PCR Diagnostic Panel, 13/07/2020, p.39).
3. Zhu N et al, A Novel Coronavirus from Patients with Pneumonia in China, 2019, N Engl J Med. 2020 Feb 20; 382(8): 727–733.
4. Giannessi F et al., The Role of Extracellular Vesicles as Allies of HIV, HCV and SARS Viruses, Viruses 2020, 12, 571; pp. 572-4.
5. Li P. et al., Progress in Exosome Isolation Techniques, Theranostics. 2017; 7(3): 789–804.
6. Zhu N et al, A Novel Coronavirus from Patients with Pneumonia in China, 2019, N Engl J Med. 2020 Feb 20; 382(8): 727–733.
7. Harcourt J et al., Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 from Patient with Coronavirus Disease, United
States, Emerg. Infect. Dis., Volume 26, Number 6, June 2020.
8. Takeuchi S. et al., Metagenomic analysis using next-generation sequencing of pathogens in bronchoalveolar with respiratory failure, in Nature, SCIENTIFIC REPORTS (2019) 9:12909.

Обзор

Автор

Редакторы

Обратите внимание!

Спонсоры конкурса: Лаборатория биотехнологических исследований 3D Bioprinting Solutions и Студия научной графики, анимации и моделирования Visual Science.

Эволюция и происхождение вирусов

В 2007 году сотрудники биологического факультета МГУ Л. Нефедова и А. Ким описали, как мог появиться один из видов вирусов — ретровирусы. Они провели сравнительный анализ геномов дрозофилы D. melanogaster и ее эндосимбионта (микроорганизма, живущего внутри дрозофилы) — бактерии Wolbachia pipientis. Полученные данные показали, что эндогенные ретровирусы группы gypsy могли произойти от мобильных элементов генома — ретротранспозонов. Причиной этому стало появление у ретротранспозонов одного нового гена — env, — который и превратил их в вирусы. Этот ген позволяет вирусам передаваться горизонтально, от клетки к клетке и от носителя к носителю, чего ретротранспозоны делать не могли. Именно так, как показал анализ, ретровирус gypsy передался из генома дрозофилы ее симбионту — вольбахии [7]. Это открытие упомянуто здесь не случайно. Оно нам понадобится для того, чтобы понять, чем вызваны трудности борьбы с вирусами.

Из давних письменных источников, оставленных историком Фукидидом и знахарем Галеном, нам известно о первых вирусных эпидемиях, возникших в Древней Греции в 430 году до н.э. и в Риме в 166 году. Часть вирусологов предполагает, что в Риме могла произойти первая зафиксированная в источниках эпидемия оспы. Тогда от неизвестного смертоносного вируса по всей Римской империи погибло несколько миллионов человек [8]. И с того времени европейский континент уже регулярно подвергался опустошающим нашествиям всевозможных эпидемий — в первую очередь, чумы, холеры и натуральной оспы. Эпидемии внезапно приходили одна за другой вместе с перемещавшимися на дальние расстояния людьми и опустошали целые города. И так же внезапно прекращались, ничем не проявляя себя сотни лет.

Вирус натуральной оспы стал первым инфекционным носителем, который представлял действительную угрозу для человечества и от которого погибало большое количество людей. Свирепствовавшая в средние века оспа буквально выкашивала целые города, оставляя после себя огромные кладбища погибших. В 2007 году в журнале Национальной академии наук США (PNAS) вышла работа группы американских ученых — И. Дэймона и его коллег, — которым на основе геномного анализа удалось установить предположительное время возникновения вируса натуральной оспы: более 16 тысяч лет назад. Интересно, что в этой же статье ученые недоумевают по поводу своего открытия: как так случилось, что, несмотря на древний возраст вируса, эпидемии оспы не упоминаются в Библии, а также в книгах древних римлян и греков [9]?

Строение вирусов и иммунный ответ организма

Рисунок 1. Первооткрыватель вирусов Д.И. Ивановский (1864–1920) (слева) и английский врач Эдвард Дженнер (справа).

Почти все известные науке вирусы имеют свою специфическую мишень в живом организме — определенный рецептор на поверхности клетки, к которому и прикрепляется вирус. Этот вирусный механизм и предопределяет, какие именно клетки пострадают от инфекции. К примеру, вирус полиомиелита может прикрепляться лишь к нейронам и потому поражает именно их, в то время как вирусы гепатита поражают только клетки печени. Некоторые вирусы — например, вирус гриппа А-типа и риновирус — прикрепляются к рецепторам гликофорин А и ICAM-1, которые характерны для нескольких видов клеток. Вирус иммунодефицита избирает в качестве мишеней целый ряд клеток: в первую очередь, клетки иммунной системы (Т-хелперы, макрофаги), а также эозинофилы, тимоциты, дендритные клетки, астроциты и другие, несущие на своей мембране специфический рецептор СD-4 и CXCR4-корецептор [13–15].

Одновременно с этим в организме реализуется еще один, молекулярный, защитный механизм: пораженные вирусом клетки начинают производить специальные белки — интерфероны, — о которых многие слышали в связи с гриппозной инфекцией. Существует три основных вида интерферонов. Синтез интерферона-альфа (ИФ-α) стимулируют лейкоциты. Он участвует в борьбе с вирусами и обладает противоопухолевым действием. Интерферон-бета (ИФ-β) производят клетки соединительной ткани, фибробласты. Он обладает таким же действием, как и ИФ-α, только с уклоном в противоопухолевый эффект. Интерферон-гамма (ИФ-γ) синтезируют Т-клетки (Т-хелперы и (СD8+) Т-лимфоциты), что придает ему свойства иммуномодулятора, усиливающего или ослабляющего иммунитет. Как именно интерфероны борются с вирусами? Они могут, в частности, блокировать работу чужеродных нуклеиновых кислот, не давая вирусу возможности реплицироваться (размножаться).

Причины поражений в борьбе с ВИЧ

Тем не менее нельзя сказать, что ничего не делается в борьбе с ВИЧ и нет никаких подвижек в этом вопросе. Сегодня уже определены перспективные направления в исследованиях, главные из которых: использование антисмысловых молекул (антисмысловых РНК), РНК-интерференция, аптамерная и химерная технологии [12]. Но пока эти антивирусные методы — дело научных институтов, а не широкой клинической практики*. И потому более миллиона человек, по официальным данным ВОЗ, погибают ежегодно от причин, связанных с ВИЧ и СПИДом.

Подобный вирусный механизм характерен не только для ВИЧ. Он описан и при инфицировании некоторыми другими опасными вирусами: такими, как вирусы Денге и Эбола. Но при ВИЧ антителозависимое усиление инфекции сопровождается еще несколькими факторами, делая его опасным и почти неуязвимым. Так, в 1991 году американские клеточные биологи из Мэриленда (Дж. Гудсмит с коллегами), изучая иммунный ответ на ВИЧ-вакцину, обнаружили так называемый феномен антигенного импринтинга [23]. Он был описан еще в далеком 1953 году при изучении вируса гриппа. Оказалось, что иммунная система запоминает самый первый вариант вируса ВИЧ и вырабатывает к нему специфические антитела. Когда вирус видоизменяется в результате точечных мутаций, а это происходит часто и быстро, иммунная система почему-то не реагирует на эти изменения, продолжая производить антитела к самому первому варианту вируса. Именно этот феномен, как считает ряд ученых, стоит препятствием перед созданием эффективной вакцины против ВИЧ.

Открытие биологов из МГУ — Нефёдовой и Кима, — о котором упоминалось в самом начале, также говорит в пользу этой, эволюционной, версии.

Сегодня не только ВИЧ представляет опасность для человечества, хотя он, конечно, самый главный наш вирусный враг. Так сложилось, что СМИ уделяют внимание, в основном, молниеносным инфекциям, вроде атипичной пневмонии или МЕRS, которыми быстро заражается сравнительно большое количество людей (и немало гибнет). Из-за этого в тени остаются медленно текущие инфекции, которые сегодня гораздо опаснее и коварнее коронавирусов* и даже вируса Эбола. К примеру, мало кто знает о мировой эпидемии гепатита С, вирус которого был открыт в 1989 году**. А ведь по всему миру сейчас насчитывается 150 млн человек — носителей вируса гепатита С! И, по данным ВОЗ, каждый год от этой инфекции умирает 350-500 тысяч человек [33]. Для сравнения — от лихорадки Эбола в 2014-2015 гг. (на состояние по июнь 2015 г.) погибли 11 184 человека [34].

* — Коронавирусы — РНК-содержащие вирусы, поверхность которых покрыта булавовидными отростками, придающими им форму короны. Коронавирусы поражают альвеолярный эпителий (выстилку легочных альвеол), повышая проницаемость клеток, что приводит к нарушению водно-электролитного баланса и развитию пневмонии.

Рисунок 8. Электронная микрофотография воссозданного вируса H1N1, вызвавшего эпидемию в 1918 г. Рисунок с сайта phil.cdc.gov.

Почему же вдруг сложилась такая ситуация, что буквально каждый год появляются новые, всё более опасные формы вирусов? По мнению ученых, главные причины — это сомкнутость популяции, когда происходит тесный контакт людей при их большом количестве, и снижение иммунитета вследствие загрязнения среды обитания и стрессов. Научный и технический прогресс создал такие возможности и средства передвижения, что носитель опасной инфекции уже через несколько суток может добраться с одного континента на другой, преодолев тысячи километров.

Физико-химическое изучение любого вируса, как правило, начинается с разработки метода его выделения и очистки. Обычно исходный материал представляет собой культуральную жидкость, тканевый экстракт и т.д. Во всех этих случаях вирус находится в смеси с большим количеством разнообразных балластных веществ – белков, пигментов, структурных компонентов клеток и т.п. Без удаления этих примесей невозможно проводить биохимические исследования вирусов.

Для очистки большинства вирусов с успехом применяют дифференциальное ультрацентрифугирование. Центрифугирование в градиенте плотности сахарозы делает возможным более тонкое разделение частиц, седимен- тационные свойства которых незначительно отличаются друг от друга. Методом равновесной седиментации в градиентах плотности цезиевых солей можно разделить частицы, обладающие различной плотностью.

В случае, если вирусы приходится выделять из больших объемов биологических жидкостей, прибегают к высаливанию сернокислым аммонием, осаждению органическими растворителями, осаждению в изоэлектрической точке. Наряду с этим используется ионообменная хроматография, гельфильтрация и т.д. Короче говоря, большинство методов, используемых для очистки белков, применимо и к вирусам. Однако существует и ряд специфических методов, применяемых для очистки только вполне определенных вирусов.

Например, миксовирусы можно очистить, используя их способность адсорбироваться на эритроцитах.

Общей схемы, пригодной для очистки любого вируса, в настоящее время не существует. Поскольку свойства вируса, так же как и химические свойства примесей, могут значительно варьировать у различных вируссодержащих материалов, то и выбор приемов очистки будет зависеть от каждого конкретного случая.

Высокоочищенные вирусы можно получить только благодаря применению целого ряда методов.

Идеальным методом выделения вирусов был бы тот, который обеспечил бы сохранение их биологической активности при полном разрушении клеточных компонентов и мембран. Однако такого метода нет. В зависимости от характера исходного материала и природы вируса приемы извлечения вирусов различны.

Выделение вирусов из зараженных клеток

Размалывание. Этот способ широко применяется в тех случаях, когда приходится работать с большим количеством вируссодержащего материала. Наиболее простым и почти универсальным приспособлением для размельчения нативной животной ткани является обычная или электрическая мясорубка.

Обработка ультразвуком. Очень широко используется также дезинтеграция клеток, зараженных вирусами, при помощи ультразвука. Если обрабатывать жидкость ультразвуком, то при определенной интенсивности звука (около 20 кГц/с) в среде возникает явление кавитации. Благодаря очень быстрому чередованию давления и разрежения возникает большое число крошечных воздушных пузырьков, которые, разрываясь, образуют вокруг себя область с интенсивной ударной волной. При этом возникает мгновенный жесткий локальный градиент давления, который и разрушает клетки.

На практике часто обработка ультразвуком сочетается с другими способами дезинтеграции, такими, как осмотический шок в дистиллированной воде (протопласты бактерий и грибов), многократное замораживание и оттаивание (ткани животных), гомогенизация, что значительно уменьшает время обработки ультразвуком. Последнее благоприятно сказывается на выходе инфекционных вирусных частиц, поскольку ультразвуковая обработка приводит к значительному разогреву озвучиваемой суспензий.

Концентрирование и очистка вирусов

Осаждение солями. Вирусы, подобно белкам, осаждаются из водных растворов при определенных концентрациях солей, которые разрушают взаимодействие между молекулами воды и полярными группировками оболочки вируса. Вирус агрегирует и выпадает в осадок. Наиболее часто для этого применяют сульфат аммония.

Несмотря на простоту и дешевизну, метод высаливания сульфатом аммония обладает двумя недостатками. Во-первых, он неспецифичен для вирусов, поскольку вместе с ними высаливаются и белки клетки-хозяина, во-вторых, при этой процедуре происходит деструкция некоторых вирусов.

Осаждение в изоэлектрической точке. Большинство вирусов преципитирует в кислой зоне pH, поскольку их изоэлектрические точки лежат в пределах 3,5-6,5.

Осаждение в изоэлектрической точке – наиболее простая и доступная операция из всех применяемых методов концентрирования и очистки вирусов. Однако при pH ниже 5,0 также выпадают в осадок многие белки клетки-хозяина, что ограничивает возможность применения этого метода. К тому же подобная процедура не всегда желательна при очистке некоторых лабильных вирусов.

Осаждение спиртами. При добавлении к вируссодержащей суспензии охлажденного метанола или этанола вирус преципитирует вследствие уменьшения (как и в рассмотренном выше случае обработки сульфатом аммония) степени гидратации его белковой оболочки. Оптимальная концентрация спирта для каждого вируса подбирается эмпирически. Эта величина колеблется от 15 до 35% . Процедура проводится при максимально возможных низких температурах для избежания денатурации вирусных частиц. Метанол более выгодно использовать, чем этанол, так как, применяя его, можно работать при более низких температурах.

Однако этот метод так же, как и метод высаливания сульфатом аммония, имеет недостатки. Он неспецифичен для вирусов (осаждается значительное количество балластных белков) и не может быть использован для некоторых вирусов животных, которые не устойчивы к спиртам (сложные вирусы, содержащие липопротеидные оболочки).

Обработка ферментами. Благодаря особой структурной организации вирионов, большинство вирусов, несмотря на их нуклеопротеидную природу, устойчиво к действию протеолитических ферментов и нуклеаз, в то время как клеточные нуклеиновые кислоты и белки легко разрушаются этими ферментами. Используя эту различную чувствительность вируса и клеточных примесей к ферментам, можно при помощи ферментов провести частичную очистку вирусов.

Ультрафильтрация. Метод концентрирования и очистки вирусов с помощью мембранных ультрафильтров имеет преимущества перед другими методами, как один из наиболее мягких и щадящих. Мембранные фильтры изготавливают из этерифицированной целлюлозы. Размер пор у фильтров разных типов варьирует от 0,01 до 8 мк. Фильтры устойчивы к температуре (до 125°С), к воздействию разбавленных кислот и щелочей и неполярных растворителей. В идеале, используя последовательную ультрафильтрацию через две мембраны с убывающим размером пор (одна задерживает частицы более крупные, чем вирус, а вторая – только вирус), можно получить в чистом виде любой вирус. Недостатком метода является то, что часто происходит засорение фильтра или адсорбция вируса на фильтре.

Скорость осаждения частиц, приведенная к единице центробежного ускорения (коэффициент седиментации, S), является специфической характеристикой макромолекул и выражается формулой

где х – расстояние от оси вращения, см; t – время, с; ω – угловая скорость, рад/с.

Коэффициент седиментации имеет размерность времени, так как со имеет размерность, обратную времени (радиан – величина безразмерная). Значения коэффициента седиментации для различных макромолекул имеют величины порядка 10 -14 -10 -13 с. Для удобства величина 10 -13 принята за единицу коэффициента седиментации. Эту величину обозначают S (единица Сведберга).

Коэффициент седиментации обычно зависит от концентрации изучаемого вещества. На практике бывает необходимым знать седиментационные характеристики веществ при оседании в сравнимых и идеальных условиях, т.е. условиях, когда взаимодействие между частицами отсутствует. Для этого величина коэффициента седиментации, измеренная в воде при 20°С, рассчитывается для бесконечного разведения раствора и обозначается как S°₂₀,_w – константа седиментации.

В современных ультрацентрифугах достигается скорость вращения ротора 60 000 об/мин и выше. Для частиц, находящихся на расстоянии 5-6 см от оси вращения, эта скорость соответствует центробежной силе, превышающей силу тяжести в 250 тыс. раз.

Ядра клетки оседают при 800 g, митохондрии – при 10 000 g₉ а большинство вирусов – при 30 000-100 000 g за 0,5-3 ч. При низкоскоростном центрифугировании из вируссодержащей суспензии удаляются обломки клеток и их компоненты. Затем при центрифугировании над осадка при 100 000 g осаждают вирусные частицы, а основная часть белков и других низкомолекулярных соединений остается в надосадочной жидкости. Таким образом, с помощью цикла дифференциального центрифугирования удается разделить вирусную суспензию на ряд фракций, содержащих однородные по скорости седиментации частицы.

Следует отметить, что для большинства вирусов использование только одного метода дифференциального центрифугирования недостаточно, чтобы получить высо- коочищенную вирусную суспензию. Как правило, конечный препарат содержит некоторые нормальные компоненты клеток, имеющие очень близкие с вирусами седиментационные характеристики. К сожалению, многие вирусы, особенно палочкообразные, могут образовывать после центрифугирования осадки, которые затем очень трудно вновь суспензировать.

Ультрацентрифугирование в градиенте плотности. Это понятие относится к скоростному центрифугированию частиц в столбе жидкости с плотностью, увеличивающейся по направлению от оси ротора. Такой градиент плотности может быть образован с помощью, например, сахарозы, глицерина, фиколла или солей тяжелых металлов (цезия, рубидия).

Существуют две наиболее важные разновидности метода:

метод зонального ультрацентрифугирования;
метод изопикнического (или равновесного) ультрацентрифугирования.

Метод зонального ультрацентрифугирования для разделения частиц в зависимости от коэффициента седиментации применяется с 1953 г. При этом исследуемую суспензию наслаивают на преформированный градиент. Градиент обычно готовят пологим, и если центрифугирование продолжать длительно, то все частицы могут осесть. Поэтому центрифугирование надо прекращать до момента оседания частиц. Но вместе с тем времени должно быть достаточно для того, чтобы частицы могли мигрировать через градиент. В результате указанной процедуры в центрифужной пробирке формируются зоны, каждая из которых состоит из частиц с близкими седиментационными свойствами.

Для извлечения вируса из центрифужной пробирки содержимое ее фракционируют. Обычно это осуществляется путем прокалывания дна пробирки и последовательного сбора фракций.

Рассмотрим принцип работы самоустанавливающегося изоплотностного градиента (рис. 2.1).

Рис. 2.1. Схематическое изображение разделения двух вирусов с различной плавучей плотностью путем равновесного ультрацентрифугирования в градиенте плотности CsCl

Левую центрифужную пробирку наполняют водным раствором CsCl (р = 1,28 г/мл), в котором суспензируется некоторое количество вируса осповакцины и вируса гриппа. После центрифугирования в течение 20 ч при 41 000 об/мин молекулы CsCl концентрируются на дне пробирки, образуя градиент плотности. При этом вирионы из нижней части градиента всплывают (так как они легче, чем находящийся здесь раствор CsCl), а вирионы из верхней части градиента, наоборот, осаждаются – до зоны, которая имеет ту же плотность, что и частицы вируса. В данном случае это зоны с плотностью 1,28 г/мл (вирус осповакцины) и 1,25 г/мл (вирус гриппа).

Разрешение, достигаемое при ультрацентрифугировании в градиентах плотности CsCl и Cs₂SО4, очень велико. Например, при помощи этого метода удается легко разделить частицы бактериофагов, отличающиеся друг от друга по плотности всего на 0,05 г/мл. Этому различию в плотности соответствует относительное различие в содержании ДНК порядка 1%.

Адсорбционная хроматография. Метод основан на различной степени адсорбции вирусов и примесей при фильтровании через слой твердого адсорбента. Решающее значение имеют поверхностные свойства вирусной частицы и адсорбента, а также состав буфера, в котором суспензирован вирус. При элюировании соответствующим буфером вирусные частицы могут быть отделены от примесей. В качестве адсорбентов в вирусологической практике обычно используются фосфат кальция, гидроксилапатит, фосфат алюминия, цеолит.

Хроматография на молекулярных ситах (гельфильтрация). Метод основан на способности пористых материалов разделять смесь веществ по размеру и молекулярной массе компонентов. Молекулярные сита не обладают сорбционным сродством к фракционируемым веществам. Обычно в качестве таких пористых материалов применяют гранулированные гели полисахаридов (сефадексы, агароза), полиакриламид (биогели) и пористое порошковое стекло.

Схематически процесс гельфильтрации можно представить следующим образом (рис. 2.2). Молекулы более крупные, чем размер пор в гранулах, не проникают внутрь них и поэтому движутся по колонке с жидкой фазой вне гранул. Мелкие молекулы проникают внутрь гранул и движутся относительно медленнее. Степень проникновения зависит от размера и формы молекул. Вследствие этого элюирование молекул из слоя гранул геля происходит в порядке уменьшения размера молекул. Когда из колонки элюируются все молекулы, она вновь готова к следующему эксперименту. Эта автоматическая регенерация – одно из преимуществ гельфильтрации.

Рис. 2.2. Схема фракционирования вируса и примеси на колонке с молекулярным ситом

Метод гельфильтрации нашел широкое применение в вирусологической практике, так как он наиболее безвреден для лабильных вирусов. Кроме того, он очень удобен при использовании на последней стадии очистки многих вирусов, поскольку при этом можно удалить из препаратов сульфат аммония и другие низкомолекулярные вещества (например, использующиеся для формирования градиентов плотности).

Ионообменная хроматография. Ионообменниками называют такие соединения, которые содержат фиксированные заряженные функциональные группы и подвижные противоионы. Последние могут обратимо обмениваться с другими ионами того же заряда, не изменяя физических свойств нерастворимой матрицы. Ионообменниками могут быть органические и неорганические соединения – алюмосиликаты, синтетические смолы, полисахариды, целлюлоза и т.д.

Тип ионообменника определяется активностью групп в матрице. Введение фенольных, карбоксильных или сульфогрупп придает матрице катионообменные свойства, а введение алифатических или ароматических аминогрупп – анионообменные свойства (табл. 2.1).

Разделение компонентов при этом виде хроматографии осуществляется не за счет разницы в их размерах, а за счет различий в их зарядах. Фракционирование вируссодержащих смесей, нанесенных на колонки, осуществляется пропусканием через колонку буферных растворов с возрастающей ионной силой или же растворов с возрастающей (или убывающей) величиной pH.

Применяя ионообменники, удается сравнительно легко и быстро проводить препаративную очистку и концентрирование различных вирусов. В то же время имеются сообщения и о неудачах при использовании метода ионообменной хроматографии для очистки вирусов. Некоторые вирусы при элюции с ионообменников теряют до 90% активности.

Таблица 2.1. Основные типы целлюлозных ионообменников

Критерии чистоты вирусных препаратов

Вирусный препарат можно считать чистым, если в нем не обнаруживаются какие-либо посторонние примеси. Определение степени загрязненности зависит от чувствительности применяемых методов исследования. Следует помнить, что применяя какой-либо один метод, нельзя доказать гомогенность препарата.

Важным критерием чистоты считается кристаллизация. Часто как доказательство чистоты вирусного препарата используется наличие спектра поглощения в ультрафиолете, характерного для нуклеопротеидов.

Важнейшим методом оценки гомогенности вирусной суспензии является наблюдение за скоростью седиментации частиц при ультрацентрифугировании в градиенте плотности сахарозы. Требованием для гомогенного препарата является симметричность соответствующего ему пика на седиментационной диаграмме.

Еще более чувствительным критерием гомогенности служит наличие одного пика при равновесном ультрацентрифугировании в градиенте плотности CsCl или Cs₂SC>4.

Применение метода электронной микроскопии для выявления примесей целесообразно, если этот материал имеет достаточный размер и по внешнему виду отличается от вируса.

Примесь клеточных веществ, которые способны диффундировать и обладают антигенными свойствами, можно выявить с помощью очень чувствительных серологических методов, таких, как иммунодиффузия и иммуноэлектрофорез.

Для вирусов с хорошо установленным элементарным составом (например, ВТМ) такие методы, как определение отношения фосфора к азоту, позволяют обнаружить примеси, содержащие азот или фосфор, если они присутствуют в значительном количестве. При определенных обстоятельствах могут быть применены также более сложные химические методы, например анализ концевых групп белков, позволяющих обнаружить всего-навсего одну аминокислоту.

Из вышеизложенного следует, что для вирусных препаратов нет одного вполне удовлетворительного метода определения чистоты. Поэтому в практической работе используют и критически сопоставляют результаты, полученные при помощи как можно большего числа разнообразных методов.

Читайте также: