Диагностика классической чумы свиней госты

Обновлено: 23.04.2024

5.2. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКЕ КЛАССИЧЕСКОЙ ЧУМЫ СВИНЕЙ

УТВЕРЖДЕНЫ 8 июня 1978 г., б/н

1. Общие положения

1.1. Лабораторная диагностика классической чумы свиней заключается в обнаружении в патологическом материале специфического антигена методом иммунофлуореоценции, реакции связывания комплемента (РСК), а также в постановке биологической пробы.

1.2. Лабораторный диагноз на классическую чуму свиней ставят на основании получения положительных результатов ИФ и РСК.

Окончательный диагноз устанавливается на основании эпизоотологических, клинических и патологоанатомических данных с учетом результатов лабораторного исследования.

1.3. Для лабораторной диагностики КЧС в лабораторию направляют патологический материал (кусочки печени, селезенки, подчелюстных, мезентеральных лимфоузлов), взятый от вынужденно убитых в агональном состоянии животных, у которых в течение 4. 5 дней отмечалось повышение температуры тела. Патологический материал в свежем или замороженном состоянии доставляют в лабораторию. Его можно хранить в замороженном состоянии в течение 8. 10 дней, материал от павших животных к исследованию не пригоден.

1.4. Метод иммунофлуоресценции и реакцию связывания комплемента для обнаружения специфического антигена в патологическом материале применяют при исследовании материала от невакцинированных свиней или от свиней, привитых вирус-вакциной против чумы за 30 и более дней до вынужденного убоя. В связи с этим в сопроводительной описи к патологическому материалу указывают дату последней вакцинации свиней.

2. Индикация антигена вируса классической чумы свиней в патологическом материале

2.1. Индикация антигена проводится с помощью реакции ИФ (прямой вариант и с применением контрастирующего красителя). Из патологического материала готовят мазки-отпечатки или гистологические срезы. Препараты подсушивают на воздухе и фиксируют метиловым спиртом в течение 3. 4 мин при комнатной температуре или смесью (1:1) метилового спирта и ацетона, предварительно охлажденной до -10. -20°С.

2.2.1. Оценка результатов. ИФ считается положительной при наличии в препаратах округлых клеток с ярко-зеленым свечением цитоплазмы или цитоплазмы и ядра. Специфическое свечение должно быть обнаружено в препарате не менее чем в трех полях зрения при наличии в каждом из них 3. 5 и более светящихся клеток.

Не учитывают свечения дегенеративно измененных клеток и лейкоцитов, которые отличают по структуре ядра и выраженной гранулярной флуоресценции цитоплазмы.

2.2.2. Для контроля специфичности свечения наносят на препараты специфическую к вирусу сыворотку с последующей окраской флуоресцирующей сывороткой, а также окрашивают препараты нормальной меченой сывороткой. В контрольных препаратах свечение не отмечается.

2.3. Реакция ИФ с применением контрастирующего красителя. На препараты наносят смесь флуоресцирующей сыворотки и раствора Эванса голубого (3 части сыворотки и 1 часть 0,25%-ного раствора синьки Эванса) и выдерживают при комнатной температуре во влажной камере в течение 10. 12 ч. Затем препарат погружают в подогретый до 60. 70°С 20%-ный раствор триэтиленгликоля на 30. 90 с до появления нежно-голубого оттенка, промывают, подсушивают, заключают в забуференный глицерин под покровное стекло и просматривают под люминесцентным микроскопом.

2.3.1. Оценка результатов. Реакция ИФ считается положительной, если на оранжево-красном фоне препарата наблюдается светло-зеленое свечение цитоплазмы. Контрольные препараты дают красное свечение. Некротические участки ткани, клеточный детрит светятся зеленовато-желтым цветом, но они отличаются от специфического свечения отсутствием у них клеточной структуры.

2.4. Реакция связывания комплемента. Для обнаружения в патологическом материале КС-антигена готовят из растертых в ступке органов 20%-ную суспензию на забуференном физиологическом растворе с рН 7. Суспензию экстрагируют при комнатной температуре в течение 2 ч, затем трехкратно замораживают при температуре -20°С, центрифугируют при 5000 об/мин в течение 20 мин. Надосадочную жидкость вновь центрифугируют при 10000. 15000 об/мин в течение 30 мин. Полученную надосадочную жидкость используют в РСК как испытуемый антиген.

2.4.1. Титрование гемолизина. Для титрования готовят основное разведение гемолизина 1:100 (0,2 мл гемолизина и 9,8 мл физиологического раствора), а затем готовят все последующие разведения по схеме 1.

Текст ГОСТ 25754-83 Животные сельскохозяйственные. Методы лабораторной диагностики классической чумы свиней

ЖИВОТНЫЕ

СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫЕ

МЕТОДЫ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ КЛАССИЧЕСКОЙ ЧУМЫ СВИНЕЙ

ГОСТ 25754—83 (СТ СЭВ 3453-81)

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР ПО СТАНДАРТАМ

РАЗРАБОТАН Министерством сельского хозяйства СССР ИСПОЛНИТЕЛИ

Э. В. Ивановский, Н. К. Мищенко, Н. Д. Насокина

ВНЕСЕН Министерством сельского хозяйства СССР

Член Коллегии А. Д. Третьяков

УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Постановлением Государственного комитета СССР по стандартам от 22 апреля 1983 г. № 2017

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ СОЮЗА ССР

Методы лабораторной диагностики классической чумы свиней

Agricultural animals. Methods* of laboratory diagnostics of classical pig-plague

Постановлением Государственного комитета СССР по стандартам от 22 апреля 1983 г. № 2017 срок действия установлен

с 01.07.84 до 01.07,89

Несоблюдение стандарта преследуется по закону

Настоящий стандарт устанавливает методы лабораторной диагностики классической чумы свиней.

Стандарт применяют при диагностике заболеваний животных в лабораториях ветеринарных научно-исследовательских учреждений.

Стандарт полностью соответствует СТ СЭВ 3453—81.

1. ГИСТОЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД

Сущность метода заключается в обнаружении специфических патолого-гистологических изменений нервных тканей в специально подготовленных срезах.

1.1. Метод отбора проб

1.1.1. Для проведения исследования от павших или убитых свиней берут полушария большого мозга с частями коры, мозжечок, аммоновые рога, спинной мозг в различных участках ствола.

1.2. Аппаратура, материалы и реактивы

1.2.1. Для проведения исследования применяют:

термостат с температурой нагрева 58 °С;

микротом для приготовления срезов в парафине;

микроскоп биологический по ГОСТ 8284—78;

пластинку нагревающую на 40°С;

парафин с точкой плавления от 56 до 58 °С по ГОСТ 23683—79; book пчелиный по ГОСТ 21179—75; формалин по ГОСТ 1625—75; кальций хлористый по ГОСТ 4460—77; кадмий хлористый по ГОСТ 4330—76; спирт этиловый абсолютный; спирт этиловый 96 %-ный по ГОСТ 5962—67; бензол по ГОСТ 5955—75 или ксилол, или толуол по ГОСТ 5789—78;

гематоксилин кристаллический; эозин;

кислоту фосформолибденовую; бальзам канадский;

воду дистиллированную по ГОСТ 6709—72.

1.3. Подготовка к исследованию

1.3.1. Отобранные пробы фиксируют по Бейкеру. Для этого готовят раствор следующего состава:

хлористый кальций — 1 г; хлористый кадмий — 1 г;

10 %-ный формальдегид или формалин— 10 см 2 3 ; дистиллированная вода— 100 см 3 .

1.3.2. Фиксированные пробы обрабатывают путем подготовки срезов, включенных в парафин (см. обязательное приложение 1) или путем подготовки срезов при помощи гистокриотома.

1.3.3. Для окрашивания гистологических препаратов используют метод окрашивания гематоксилином (см. обязательное прило-* жение 2).

1.4. Проведение исследования

1.4.1. Подготовленные и окрашенные срезы просматривают под микроскопом.

1.5. Обработка результатов

1.5.1. Гистологические изменения, выражающиеся в наличии воспаления, диапедизиальных кровоизлияний, васкулярного эндо-телита, мукоидного фирбиозного и гиалинового перерождения стенок сосудов, а также лимфогистиоцитарного энцефаломиэлита в первичной ткани, характерны при заболевании чумой.

2. МЕТОД ПРЯМОЙ ИММУНОФЛЮОРЕСЦЕНЦИИ

2.1. Метод отбора проб

2.1.1. Для проведения исследования берут миндалины, селезенку, почки, легкие, лимфатические узлы (мезентариальные и подчелюстные), красный костный мозг и кровь.

Пробы органов и тканей берут от павших животных не позднее 8 ч после гибели, от больных и подозреваемых в заболевании животных— сразу после убоя. Кровь берут от больных и подозревае-вых в заболевании животных.

2.2. Аппаратура и реактивы

2.2.1. Для проведения исследования применяют: микроскоп люминисцентный;

центрифугу с частотой вращения 5000 об/мин; шприцы;

рефрижератор на минус 20 °С; нож термоэлектрический; стекла предметные по ГОСТ 9284—75; стекла покровные по ГОСТ 6672—75; ацетон по ГОСТ 2603—79; глицерин по ГОСТ 6824—76;

раствор фосфатный буферный с pH 7,2; готовят следующим образом:

раствор А — в 1 дм 3 дистиллированной воды разводят 11,871 г двузамещенного фосфата натрия;

раствор Б — в 1 дм 3 дистиллированной воды растворяют 9,076 г однозамещенного фосфата калия. Смешивают 800 см 3 раствора А и 250 см 3 раствора Б;

раствор фосфатный буферный с pH 8,0; готовят следующим образом:

смешивают приготовленные растворы А — 930 см 3 и Б — 70 см 3 . При приготовлении буферных растворов в каждом случае pH растворов проверяют потенциометром;

коньюгат флюоресцентный специфический; коньюгат флюоресцентный нормальный;

краситель Эванса, 0,25 %-ный раствор в буферном растворе.

2.3. Подготовка к исследованию

2.3.1. Из проб органов при помощи криотома, микротома или термоэлектрического ножа (при сильном замораживании) готовят срезы толщиной 5 мк, которые помещают на обезжиренные предметные стекла и высушивают в течение 30 мин при 4°С.

Из проб костного мозга и лейкоцитарного концентрата готовят мазки (см. обязательное приложение 3).

2.3.2. Препараты (срезы и мазки) фиксируют ацетоном в течение 10 мин при минус 20 °С или в течение 5—10 мин при комнат

ной температуре. После фиксации препараты высушивают на воздухе при комнатной температуре до полного испарения ацетона.

Фиксированные препараты допускается хранить в морозильнике при температуре не менее минус 20 °С в течение 6 мес.

2.3.3. Фиксированные препараты двукратно промывают фосфатным буферным раствором (pH 7,2), после чего оставляют их в растворе на 10 мин.

Увлажненные препараты допускается хранить до использования во влажной камере при 4°С в течение 3 дней.

2.3.4. Подготовленные препараты окрашивают методом контрастной иммунофлюоресценции.

Для этого приготовляют на фосфатном буферном растворе (pH 7,2) рабочие разведения специфического и нормального флюоресцентного конъюгата в соответствии с указаниями, нанесенными на этикетках препаратов. К полученным разведениям конъюгатов добавляют краситель Эванса в соотношении: 3 части коньюгата и 1 часть красителя.

Окрашивают следующие препараты:

три препарата, приготовленных из исследуемых проб; из них два препарата покрывают специфическим коньюгатом с красителем Эванса, а третий—(нормальным коньюгатом с красителем Эванса (контроль);

два препарата, приготовленных из органов свиней, не инфицированных вирусом чумы, покрывают специфическим коньюгатом с красителем Эванса (контроль).

Окрашенные препараты выдерживают в термостате в течение 30 мин при 37°С или в течение 12—18 ч при комнатной температуре.

Препараты двукратно промывают в фосфатном буферном растворе, после чего оставляют на 10 мин в свежей дистиллированной воде.

После частичного высушивания на воздухе препараты покрывают буферным глицерином (9 частей нефлюоресцирующего глицерина и 1 часть фосфатного буферного раствора с pH 8,0) и закрывают покровными стеклами.

При необходимости покровные стекла фиксируют парафином. Окрашенные препараты хранят при 4°С в течение 3—4 недель без потери специфической флюоресценции.

2.4. Проведение исследования

2.4.1. Препараты просматривают под люминисцентным микроскопом.

2.5. Обработка результатов

2.5.1. Специфическая флюоресценция характеризуется желтовато-зеленоватым и зеленоватым оттенками свечения цитоплазмы разных клеток (в зависимости от оптики и системы освещения).

Ядра клеток выглядят темными и не флюоресцируют. Фон препаратов имеет флюоресценцию красно-оранжевого цвета.

В срезах из селезенки и лимфатических узлов флюоресцирующие клетки рассеяны или сконцентрированы вокруг сосудов и синуса.

В препаратах из миндалин флюоресценция более ясная и выявляется в базальных клетках поверхностного эпителия и эпителия крипт.

В срезах почек специфическая флюоресценция устанавливается главным образом в различных клетках почечных и интерасциаль-ных поперечных срезов канальцев.

В мазках из красного костного мозга специфическая флюоресценция отличается большей яркостью, размером и количеством флюоресцирующих клеток.

Аналогичная флюоресценция выявляется в мазках из лейкоцитарного концентрата.

Специфическая флюоресценция в цитоплазме даже в отдельных клетках препаратов, полученных от животных, подозреваемых в заболевании, указывает на наличие вируса классической чумы свиней.

Все контрольные срезы и мазки не должны иметь желтоватозеленоватой флюоресценции цитоплазмы. 3

3. МЕТОД ПОСТАНОВКИ БИОПРОБЫ

Сущность метода заключается в выявлении наличия вируса чумы свиней путем введения восприимчивому животному (свинье) суспензии, полученной из органов, взятых от больных или подозреваемых в заболевании животных.

3.1. Метод отбора проб

3.1.1. Для постановки биопробы от больных, павших или убитых животных берут кровь, селезенку, лимфатические узлы, трубчатую длинную кость.

Кровь от животных для проведения биопробы берут с соблюдением правил асептики.

Если органы начали портиться, то проводят сечение трубчатой длинной кости и извлекают мозг, который используют для проведения исследования.

3.2. Аппаратура, материалы и реактивы

3.2.1. Для проведения исследования применяют:

центрифугу с частотой вращения 5000 об/мин;

ступку или измельчитель ткани;

антибиотики (пенициллин, стрептомицин или другие антибиотики с широким спектром действия);

мертиолат натрия (тиомерсал),

3.3. Подготовка к исследованию

3.3.1. Кусочки селезенки и лимфатические узлы измельчают при помощи ножниц. Измельченные пробы селезенки и лимфатических узлов или костного мозга растирают в ступке с малым количеством физиологического раствора, добавляют физиологический раствор до получения 10%-ной суспензии. К полученной суспензии добавляют пенициллин и стрептомицин по 300—1000 ЕД/см 3 , тиомерсал в конечной концентрации 1:5000 — 1 : 10000 и выдерживают не менее 4 ч при 4°С.

суспензию центрифугируют в течение 10 мин с частотой вращения 4000—5000 об/мин. “

Надосадочную жидкость используют для проведения биолробы. Перед использованием из надосадочьзй жидкости делают посевы на питательные среды.

3.4. Проведение исследования

3.4.1. Берут пять поросят в возрасте 2—3 мес, массой 20—30 кг, восприимчивых к чуме свиней. Трем животным вводят подкожно по 1 см 3 крови или по 2 см 3 суспензии органов. Двух поросят, не инокулированных исследуемым материалом, содержат отдельно для контроля.

Двум поросятам, иммунным к чуме свиней, вводят исследуемый материал в тех же дозах с целью дифференциальной диагностики в отношении африканской чумы свиней.

За подопытными животными ведут клиническое наблюдение в течение 21 сут с ежедневным измерением температуры тела.

3.5. Обработка результатов

3.5.1. Диагноз на классическую чуму свиней считают положительным:

если два из трех неиммунных поросят, которым был введен исследуемый материал, заболевают, проявляя клинические признаки болезни, и погибают;

если два иммунных поросенка, которым введен исследуемый материал, в период наблюдения остаются здоровыми или проявляют незначительные и кратковременные (1—4 дня) клинические признаки болезни слабой интенсивности (повышение температуры тела не выше 41 °С).

3.5.2. Заболевание иммунных животных указывает на то, что исследуемый материал содержит возбудителя другой инфекции.

ПРИЛОЖЕНИЕ 1 Обязательное

ПРИГОТОВЛЕНИЕ БЛОКОВ И ГИСТОЛОГИЧЕСКИХ СРЕЗОВ, ВКЛЮЧЕННЫХ В ПАРАФИН

Фиксированные и обработанные пробы выдерживают в 96%-ном этиловом спирте (три ванны), абсолютном спирте (три ванны) « амиловом спирте (три ванны). В каждой ванне кусочки выдерживают в течение 2 ч. Затем пробы выдерживают в трех парафино-восковых банях при 58°С по 2 ч в каждой.

Пробы вынимают из последней бани и включают в парафин в виде блоков специальной формы.

Сечение микротомом делают в виде ленты толщиной 5—7 мк.

При помощи игл фиксируют срезы в центре предметного стекла, предварительно смазанного слоем альбумина по Мейеру на нагревающей пластинке при 40°С. Альбумин по Мейеру готовят следующим образом: смешивают яичный белок и глицерин в соотношекпи 1:1.

Предметные стекла со срезами выдерживают в термостате при 37°С в течение 6—42 ч, после чего удаляют парафин, выдерживая в трех ваннах с растворителем в течение 10 мин в каждой.

ПРИЛОЖЕНИЕ 2 Обязательное

ОКРАШИВАНИЕ ГИСТОЛОГИЧЕСКИХ СРЕЗОВ

Стекла со срезами проводят через следующие ванны:

три ванны с 96%-ным этиловым спиртом — 5 мин;

две ванны с дистиллированной водой—1—2 мин;

одна ванна с гематоксилином — 5—10 мин;

две ванны с водопроводной водой—1—2 мин;

одна ванна с эцином — 3—5 мин;

две ванны с дистиллированной водой — 1—2 мин;

одна ванна с 1%-ной формолмолибденовой кислотой — 3—5 мин;

одна-две ванны с дистиллированной водой для промывания;

две ванны с 96%-ным этиловым спиртом (дифференциация);

две ванны с растворителем (прояснение—10—30 мин).

Стекло со срезами накрывают покровным стеклом, которое фиксируют канадским бальзамом.

ПРИЛОЖЕНИЕ 3 Обязательное

[.Приготовление мазков из красного костного мозга

Берут грудную кость, делают продольный разрез и вынимают красный костный мозг, из которого делают несколько мазков.

2. Приготовление мазков лейкоцитарного концентрата

От больных или подозреваемых в заболевании свиней собирают 15 см 3 крови в пробирку, содержащую антикоагулят. Кровь в пробирке энергично встряхивают для отделения плазмы и выдерживают пробирку в течение 1 ч при комнатной температуре.

Пастеровской пипеткой отбирают плазму с лейкоцитами и переносят в центрифужную пробирку. Плазму центрифугируют в течение 10 мин с частотой вращения 1000 об/мин, сливают надрсадочную жидкость, а из осадка беломолочного цвета делают 2—3 мазка.

Редактор Н Е. Шестакова Технический редактор О Н. Никитина Корректор В. Я. Варенцова

Сдано в наб 13 05 83 Подп к печ 15 06 83 0,625 п л 0,51 уч-изд л Тир 6000 Цена 3 коп.

Превью ГОСТ 25754-83 Животные сельскохозяйственные. Методы лабораторной диагностики классической чумы свиней

5. БОЛЕЗНИ СВИНЕЙ

5.1. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКЕ КЛАССИЧЕСКОЙ ЧУМЫ СВИНЕЙ

УТВЕРЖДЕНЫ 30 декабря 1996 г., N 13-4-2/809

1. Общие положения

1.1. Лабораторная диагностика классической чумы свиней (КЧС) основана на:

- обнаружении антигена вируса КЧС реакцией прямой иммунофлуоресценции в клетках мазков-отпечатков проб органов;

- выделении эпизоотического вируса КЧС из патологического материала инокуляцией перевиваемой культуры клеток почки поросенка (РК-15) и его идентификации реакцией прямой иммунофлуоресценции;

- обнаружении специфических антител в сыворотках крови переболевших классической чумой свиней реакцией нейтрализации флуоресцирующих микробляшек или реакцией непрямой иммунофлуоресценции;

- выделении и идентификации вируса КЧС биопробой на животных.

Для постановки иммунофлуоресцентных реакций используют "Набор препаратов для иммунофлуоресцентной диагностики классической чумы свиней".

1.2. При проведении лабораторной диагностики руководствуются "Правилами работы и охраны труда в ветеринарных лабораториях", утвержденными Министерством сельского хозяйства СССР 14 января 1975 г.

2. Схема проведения лабораторных исследований

2.1. Отбор проб органов и подготовка патологического материала для исследования.

2.2. Приготовление мазков-отпечатков для постановки реакции прямой иммунофлуоресценции и экстрактов проб исследуемых органов для инокуляции культуры клеток (проводится одновременно).

2.3. Постановка реакции прямой иммунофлуоресценции (РПИФ) с целью обнаружения специфического антигена вируса КЧС в мазках-отпечатках из проб органов. По положительным или отрицательным результатам реакции ставят предварительный диагноз.

2.4. Инокуляция культуры клеток РК-15 экстрактами суспензий проб исследуемых органов с последующей постановкой РПИФ для обнаружения и идентификации эпизоотического вируса КЧС.

2.5. Исследование сывороток крови свиней в реакции нейтрализации флуоресцирующих микробляшек (РНФМ) или реакции непрямой иммунофлуоресценции (РНИФ). Серологические исследования проводят в тех случаях, когда пробы крови получены от свиней, подозреваемых в переболевании классической чумой (ретроспективные исследования из хозяйств, не применяющих вакцинацию против КЧС в течение последних 2 лет.

2.6. Постановку биопробы проводят только по указанию Департамента ветеринарии, когда при подозрении на КЧС на основании эпизоотологического обследования получены отрицательные результаты лабораторных исследований.

3. Отбор и подготовка проб к исследованию

3.1. Для исследования берут лимфатические узлы (подчелюстные и мезентериальные), части миндалин, селезенки, легкого, почки, кровь и костный мозг (из грудной или трубчатой кости) от 3. 5 животных, убитых в стадии агонии, или не позже чем через 2. 3 ч после гибели.

3.2. Пробы отбирают в стерильные флаконы массой 5. 10 г каждый, герметически укупоривают резиновыми пробками.

Флаконы снаружи обрабатывают 5%-ным раствором едкого натра или осветленным 20%-ным раствором хлорной извести, обертывают марлей, смоченной тем же раствором, укладывают в полиэтиленовый пакет и помещают в термос со льдом. В случае длительной транспортировки (более 2 сут) пробы органов замораживают. Термос помещают в металлический контейнер, опечатывают и доставляют с нарочным в лабораторию с сопроводительным документом.

3.3. При ретроспективной диагностике направляют 5. 10 проб крови (по 5. 8 см) от свиней, подозреваемых в переболевании классической чумой. Кровь берут не ранее чем через 15. 20 сут после установления признаков болезни.

3.4. В лаборатории пробы селезенки, лимфатических узлов, легкого, почки каждого животного очищают от жировой и соединительной тканей и готовят по 2 мазка-отпечатка каждого органа для РПИФ. Для этого обезжиренные спирт-эфиром (1:1) покровные стекла укрепляют в расщепах деревянных палочек с условными номерами и делают мазок-отпечаток, прикладывая стекло к поверхности среза исследуемого органа (каждый отпечаток делается новым срезом органа). Мазки-отпечатки высушивают на воздухе при комнатной температуре (30. 60 мин) и помещают в химический стакан с холодным (2. 4°С) ацетоном. Фиксацию проводят в камере бытового холодильника при (4±2)°С в течение 10. 15 мин. Затем мазки-отпечатки извлекают из ацетона, высушивают и используют для постановки РПИФ. Хранят мазки-отпечатки при (4±2)°С не более 3 сут.

Контрольные отрицательные мазки-отпечатки готовят заранее, используя пробы органов от здоровых животных.

3.5. Навески каждого органа (примерно по 2 г) отдельно растирают в ступке со стерильным порошком из стекла или песком и готовят 20%-ную суспензию на стерильном 0,85%-ном растворе хлористого натрия. Приготовленные суспензии дважды замораживают при -10. -12°С, оттаивают при 30. 37°С и центрифугируют в рефрижераторной центрифуге при 2500. 3000 об/мин в течение 10. 15 мин. Надосадочную жидкость (экстракт) отсасывают, вносят 100 ЕД/см пенициллина и 100 мг/см стрептомицина (конечная концентрация), выдерживают 1 ч при (37±0,5)°С и готовят разведения 1:5 и 1:10 на стерильном 0,85%-ном растворе хлористого натрия. Для инокуляции культуры клеток используют как исходные (неразведенные) экстракты, так и разведенные.

3.6. Для получения сыворотки пробы крови выдерживают 1 ч в термостате при (37±0,5)°С или при комнатной температуре до образования сгустка. Сгусток обводят и пробы переносят в камеру бытового холодильника на 10. 14 ч. Сыворотку отсасывают и используют для исследования.

4. Обнаружение антигена вируса КЧС реакцией прямой иммунофлуоресценции в мазках-отпечатках.

4.1. Содержимое ампулы ФИТЦ-иммуноглобулинов КЧС растворяют 0,5 см дистиллированной воды и готовят рабочее разведение препарата на 0,01 М фосфатно-солевом буферном растворе - ФСБ (приготовление буферного раствора в Приложении, п.1), указанное на ампуле.

4.2. Препараты мазков-отпечатков, приготовленные по п.3.4, помещают на капли ФИТЦ-иммуноглобулинов КЧС, нанесенные в рабочем разведении на края предметных стекол, находящихся во влажной камере, и выдерживают при (37±0,5)°С в течение 30 мин.

4.3. Препараты снимают с предметных стекол, ополаскивают ФСБ и свободными концами спичек укрепляют в гнездах отмывочного штатива. Штатив помешают в цилиндрическую банку с раствором ФСБ, установленную на магнитную мешалку. Отмывание мазков-отпечатков от несвязавшихся или неспецифически связавшихся ФИТЦ-иммуноглобулинов ведут в течение 20 мин в темном месте, сменяя буферный раствор через 10 мин.

4.4. После отмывания препараты ополаскивают дистиллированной водой, подсушивают на воздухе и помещают на капли нефлуоресцирующего глицерина, разведенного раствором ФСБ в соотношении 9:1, нанесенные на прозрачные обезжиренные предметные стекла. Края препаратов заливают расплавленным парафином.

4.5. Люминесцентную микроскопию препаратов проводят в сине-фиолетовом свете при освещении их сверху, через объектив на микроскопах типа "ЛЮМАМ". Возбуждающий светофильтр ФС-1-2 или СС-15-2; запирающий ЖС-18+ЖЗС-19. Препараты последовательно просматривают при увеличении 7x10, 7x40 ("сухая" микроскопия), затем при необходимости в иммерсионной системе при увеличении 7x90, используя неразведанный нефлуоресцирующий глицерин.

4.6. Специфическую флуоресценцию учитывают в лимфоидных клетках паренхимы селезенки, лимфатических узлов, легкого, расположенных группами, а также в эпителиальных клетках миндалин и клетках эпителия почечных канальцев, расположенных группами. Флуоресценцию обнаруживают в виде яркого, зеленого, диффузного свечения цитоплазмы антигенсодержащих клеток.

4.7. Учет и оценка результатов.

Проводят по условной четырехкрестовой шкале при увеличении 5x40: (++++, +++, ++, +) обнаружение во всех полях зрения множества групп клеток с яркой зеленой цитоплазматической флуоресценцией - результат положительный; (±) обнаружение в 5. 10 полях зрения единичных групп, состоящих из 3. 5 клеток с зеленой цитоплазматической флуоресценцией - результат сомнительный; отсутствие в мазках-отпечатках клеток с цитоплазматической флуоресценцией. Свечение клеток тускло-зеленое - результат отрицательный.

Отдельно расположенные клетки с флуоресценцией цитоплазмы или ядра не учитывают.

5.2. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКЕ КЛАССИЧЕСКОЙ ЧУМЫ СВИНЕЙ

УТВЕРЖДЕНЫ 8 июня 1978 г., б/н

1. Общие положения

2. Индикация антигена вируса классической чумы свиней в патологическом материале

Текст ГОСТ 25754-83 Животные сельскохозяйственные. Методы лабораторной диагностики классической чумы свиней

ЖИВОТНЫЕ

СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫЕ

МЕТОДЫ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ КЛАССИЧЕСКОЙ ЧУМЫ СВИНЕЙ

ГОСТ 25754—83 (СТ СЭВ 3453-81)

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР ПО СТАНДАРТАМ

РАЗРАБОТАН Министерством сельского хозяйства СССР ИСПОЛНИТЕЛИ

Э. В. Ивановский, Н. К. Мищенко, Н. Д. Насокина

ВНЕСЕН Министерством сельского хозяйства СССР

Член Коллегии А. Д. Третьяков

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ СОЮЗА ССР

Методы лабораторной диагностики классической чумы свиней

Agricultural animals. Methods* of laboratory diagnostics of classical pig-plague

Постановлением Государственного комитета СССР по стандартам от 22 апреля 1983 г. № 2017 срок действия установлен

с 01.07.84 до 01.07,89

Несоблюдение стандарта преследуется по закону

Настоящий стандарт устанавливает методы лабораторной диагностики классической чумы свиней.

Стандарт полностью соответствует СТ СЭВ 3453—81.

1. ГИСТОЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД

1.1. Метод отбора проб

1.2. Аппаратура, материалы и реактивы

1.2.1. Для проведения исследования применяют:

термостат с температурой нагрева 58 °С;

микротом для приготовления срезов в парафине;

микроскоп биологический по ГОСТ 8284—78;

пластинку нагревающую на 40°С;

гематоксилин кристаллический; эозин;

кислоту фосформолибденовую; бальзам канадский;

воду дистиллированную по ГОСТ 6709—72.

1.3. Подготовка к исследованию

1.3.1. Отобранные пробы фиксируют по Бейкеру. Для этого готовят раствор следующего состава:

хлористый кальций — 1 г; хлористый кадмий — 1 г;

10 %-ный формальдегид или формалин— 10 см 2 3 ; дистиллированная вода— 100 см 3 .

1.4. Проведение исследования

1.4.1. Подготовленные и окрашенные срезы просматривают под микроскопом.

1.5. Обработка результатов

2. МЕТОД ПРЯМОЙ ИММУНОФЛЮОРЕСЦЕНЦИИ

2.1. Метод отбора проб

2.2. Аппаратура и реактивы

2.2.1. Для проведения исследования применяют: микроскоп люминисцентный;

центрифугу с частотой вращения 5000 об/мин; шприцы;

раствор фосфатный буферный с pH 7,2; готовят следующим образом:

раствор А — в 1 дм 3 дистиллированной воды разводят 11,871 г двузамещенного фосфата натрия;

раствор фосфатный буферный с pH 8,0; готовят следующим образом:

коньюгат флюоресцентный специфический; коньюгат флюоресцентный нормальный;

краситель Эванса, 0,25 %-ный раствор в буферном растворе.

2.3. Подготовка к исследованию

Из проб костного мозга и лейкоцитарного концентрата готовят мазки (см. обязательное приложение 3).

Увлажненные препараты допускается хранить до использования во влажной камере при 4°С в течение 3 дней.

2.3.4. Подготовленные препараты окрашивают методом контрастной иммунофлюоресценции.

Окрашивают следующие препараты:

2.4. Проведение исследования

2.4.1. Препараты просматривают под люминисцентным микроскопом.

2.5. Обработка результатов

Аналогичная флюоресценция выявляется в мазках из лейкоцитарного концентрата.

Все контрольные срезы и мазки не должны иметь желтоватозеленоватой флюоресценции цитоплазмы. 3

3. МЕТОД ПОСТАНОВКИ БИОПРОБЫ

3.1. Метод отбора проб

Кровь от животных для проведения биопробы берут с соблюдением правил асептики.

3.2. Аппаратура, материалы и реактивы

3.2.1. Для проведения исследования применяют:

центрифугу с частотой вращения 5000 об/мин;

ступку или измельчитель ткани;

антибиотики (пенициллин, стрептомицин или другие антибиотики с широким спектром действия);

мертиолат натрия (тиомерсал),

3.3. Подготовка к исследованию

суспензию центрифугируют в течение 10 мин с частотой вращения 4000—5000 об/мин. “

3.4. Проведение исследования

3.5. Обработка результатов

3.5.1. Диагноз на классическую чуму свиней считают положительным:

ПРИЛОЖЕНИЕ 1 Обязательное

ПРИГОТОВЛЕНИЕ БЛОКОВ И ГИСТОЛОГИЧЕСКИХ СРЕЗОВ, ВКЛЮЧЕННЫХ В ПАРАФИН

Пробы вынимают из последней бани и включают в парафин в виде блоков специальной формы.

Сечение микротомом делают в виде ленты толщиной 5—7 мк.

ПРИЛОЖЕНИЕ 2 Обязательное

ОКРАШИВАНИЕ ГИСТОЛОГИЧЕСКИХ СРЕЗОВ

Стекла со срезами проводят через следующие ванны:

три ванны с 96%-ным этиловым спиртом — 5 мин;

две ванны с дистиллированной водой—1—2 мин;

одна ванна с гематоксилином — 5—10 мин;

две ванны с водопроводной водой—1—2 мин;

одна ванна с эцином — 3—5 мин;

две ванны с дистиллированной водой — 1—2 мин;

одна ванна с 1%-ной формолмолибденовой кислотой — 3—5 мин;

одна-две ванны с дистиллированной водой для промывания;

две ванны с 96%-ным этиловым спиртом (дифференциация);

две ванны с растворителем (прояснение—10—30 мин).

Стекло со срезами накрывают покровным стеклом, которое фиксируют канадским бальзамом.

ПРИЛОЖЕНИЕ 3 Обязательное

[.Приготовление мазков из красного костного мозга

2. Приготовление мазков лейкоцитарного концентрата

Редактор Н Е. Шестакова Технический редактор О Н. Никитина Корректор В. Я. Варенцова

Сдано в наб 13 05 83 Подп к печ 15 06 83 0,625 п л 0,51 уч-изд л Тир 6000 Цена 3 коп.

Превью ГОСТ 25754-83 Животные сельскохозяйственные. Методы лабораторной диагностики классической чумы свиней

Читайте также: