Диагностика вирусных и фитоплазменных болезней

Обновлено: 27.03.2024

Мозаика (русская) озимой пшеницы. Возбудитель — вирус русской мозаики озимой пшеницы Russian winter wheat mosaic virs. При раннем заражении больные растения отстают в росте, сильно кустятся, обесцвечиваются, часто не образуют продуктивных стеблей либо имеют бесплодные колосья. На листьях вдоль жилок мозаичность или светло-зеленые пятна, штрихи и полосы, которые к концу вегетации становятся хлоротичными.

От растения к растению передается цикадами. Возбудитель сохраняется на озимых посевах, сорняках, а также в насекомых-переносчиках (яйцо, имаго).

Почвопередающаяся мозаика пшеницы. Возбудитель — почвоперадающийся вирус мозаики пшеницы Soil-borne wheat mosaic virus. Основной симптом — прерывистое или сплошное посветление или пожелтение ткани листа в фазу всходов-кущения и последующее угнетение роста растений.

Переносчиком вируса является грибоподобный микроорганизм отдела Plasmodiophoromycota. Его зооспоры по почвенной влаге, внедряются в корни, а вместе с ними и вирусы. Он одновременно является и основным резерватором вирусов, которые длительно сохраняются в покоящихся спорах (цистах) в почве. Покоящиеся споры псевдогриба очень устойчивы как к низким температурам зимой, так и к повышенным температурам в летний период, они могут сохраняться в глубоких слоях почвы.

Полосатая мозаика пшеницы. Возбудитель — вирус полосатой мозаики пшеницы Wheat striake mosaic virs. На листьях светло-зеленые штрихи или полоски, параллельные жилкам листа. Растения отстают в росте и не дают продуктивных стеблей. Колос полностью или частично стерилен, формируется щуплая зерновка.

От растения к растению вирус передается при механических повреждениях, инокуляции соком больных растений и с галлообразующим клещом Eriophyes tulipae

Закукливание овса. Возбудитель — вирус сибирской мозаики овса Siberian oats mosaic vims. Симптомы зависят от сроков заражения растений. При заражении всходов приостанавливается развитие растений, листья приобретают мозаичность, корни развиваются очень слабыми. Такие растения, как правило, выпадают. При заражении перед кущением растения достигают высоты 10-15 см и чрезмерно кустятся, образуя 70—200 побегов. Метелки обычно не образуются, или колоски в них стерильны. Иногда появляется завязь, столбик которой видоизменяется и сильно вытягивается.

Распространяется вирус цикадкой темной, сохраняется в зимующих органах дикорастущих злаков, а также в теле зимующих личинок цикадки.

Желтая карликовость ячменя. Вызывается двумя вирусами: желтой карликовости ячменя Barley yellow dwarf virus и желтой карликовости злаков Cereal yellow dwarf virus. Поражают практически все злаковые растения. Болезнь проявляется на листьях ячменя и пшеницы интенсивной золотисто-желтой и даже оранжевой окраской, которая распространяется от верхушки вниз, чаще по краям листовой пластинки. Со временем листья становятся жесткими. Мозаичность и крапчатость отсутствуют. Подобно другим вирусным болезням, при поражении молодых растений наблюдается интенсивное кущение и карликовость. Колосья часто не образуются, или они короткие и дают незначительный урожай. Если заражение происходит после кущения, молодые листья желтеют, значительной задержки роста не происходит.

Эти вирусы передаются более 20 видами тлей и другими переносчиками, сохраняются в многолетних злаковых сорняках и в озимых.

Черный бактериоз пшеницы. Возбудители — бактерии рода Xanthomonas. Ha всходах описаны симптомы пожелтения и некротизации кончиков листьев, в более поздние фазы развития на листьях появляются небольшие водянистые пятна, сначала светло-зеленые, позднее темно-коричневые, или черные полосы. Соломина под колосом буреет, наблюдается почернение верхней части колосковых чешуек, а нередко и остей. При сильном развитии болезни весь колос буреет, зерновки в нем становятся щуплыми, иногда покрываются желтыми полосами из засохшего бактериального экссудата. Пораженные семена чаще не дают жизнеспособных всходов, или появляются всходы с осветленными и некротизированными кончиками листьев, растения впоследствии в основном погибают.

Бактерии распространяются от растения к растению с каплями дождя, насекомыми, ветром.

Источниками инфекции служат семена, неперегнившие растительные остатки, сорные растения.

Базальный бактериоз. Возбудители — бактерии Pseudomonas. На листьях появляются сначала светлые водянистые, а позже усыхающие коричневые пятна. Колосковые чешуи у основания буреют, а при слабом поражении чернеют с внутренней стороны. Зародышевая часть зерна также чернеет. При сильном развитии болезни наблюдаются побурение колеоптиля, карликовость стеблей, сухая гниль оберточного листа, сплошное почернение чешуек колосков. Зерновки чернеют у основания, остальная часть их краснеет. Растения преждевременно теряют часть листьев. Образуется щуплое зерно с низкой всхожестью.

Источники инфекции: зараженные семена, коренеотпрыски злаковых сорняков, неперегнившие остатки больных растений.

Бурый бактериоз пшеницы. Возбудители — комплекс бактерий, чаще Pseudomonas Весной у основания стебля желтые опоясывающие стебли пятна с бурым окаймлением. Пораженные участки темнеют, размочаливаются, отмирают и становятся темно-коричневыми. Нижние листья, теряя тургор, желтеют и засыхают. На слабопораженных стеблях колосья недоразвиты. Зерна в них щуплые, имеют буроватую поверхность, иногда потемневший зародыш.

Возбудитель сохраняется на поверхности семян и внутри них (до 15 месяцев), в растительных остатках (в течение 10 месяцев) даже при их запахивании на глубину 20 см, а также на падалице и сорняках.

Бурый бактериоз овса. Возбудители — бактерии Pseudomonas. На листьях, иногда на колосковых чешуях появляются овальные красно-бурые пятна со светлой каймой. Листья засыхают. Чешуйки колосков покрываются светло-красными пятнами. При сильном развитии болезни пленки зерновок разрушаются, зародыш остается недоразвитым, снижается всхожесть. Семена могут загнивать, при надавливании из них выделяется желто-белая вязкая масса.

В период вегетации бактерии распространяются ветром, с каплями дождя, насекомыми, сохраняются в растительных остатках и семенах.

Основными направлениями защиты уничтожение растений-резерваторов, их семян, корнеотпрысков, на ускоренную минерализацию растительных остатков культур и сорняков; использование устойчивых или толерантных сортов. Применение обработки семян и растений инсектицидами, препятствующие распространению насекомых-переносчиков и, соответственно, заражению растений вирусами. Среди препаратов общеукрепляющей и противовирусной направленности проходит испытание фармайод. Защитные мероприятия от бактериозов условно можно разделить на три группы. Профилактические: высокая агротехника, севообороты, агрохимикаты, удобрения. Защитно-ограничивающие: применение биопрепаратов, удаление больных растений из первично обнаруженных очагов. Поиск, создание и внедрение устойчивых сортов.


Фитоплазмозы – это заболевания растений, вызванные фитоплазмами [4] .

Первоначально к фитоплазмозам отнесли следующие заболевания: карликовость шелковицы, желтуху астр, ведьмины метлы картофеля. Затем список фитоплазмозов пополнился и к ним были причислены: филлодия клевера, столбур пасленовых, круглолистность картофеля, полиферация яблони. По признаку инфекционности все выше перечисленные заболевания ранее считали вирусными и относили к группе желтух. Уточнению этиологии данных заболеваний способствовало совершенствование методов диагностики [2] .

Содержание:

Механизм воздействия фитоплазмозов

Фитоплазмы заселяют в основном флоэму растений и распространяются системно. Проникновение данной группы патогенов в клетки происходит редко, обычно они действуют с поверхности клеток [3] .

Первая фаза фитоплазменной инфекции основана на способности фитоплазм адсорбироваться на клетках растения-хозяина. Это обусловлено родством рецепторного аппарата клеток хозяина и фитоплазм. Адсорбировавшиеся на мембранных элементах клеток фитоплазмы получают возможность извлекать из них питательные субстраты и влиять на генетический аппарат клеток растения-хозяина [3] .

Конечный эффект взаимодействия фитоплазм и клеток выражается либо в развитии острой инфекции, сопровождающейся видимыми изменениями, разрушением пораженных клеток, либо скрытой формой – изменением метаболизма и функций пораженных клеток, нарушением нормального клеточного деления, хромосомными изменениями [3] .

Основные факторы патогенности фитоплазм – токсины, перекись водорода, аммиак, ферменты. Кроме того, фактором патогенности считают конкуренцию патогена с клеткой-хозяином за субстраты энергетического и белкового обмена (аминокислоты, углеводы) [3] .

Фитоплазмозы - Фитоплазмозы картофеля и груши

Фитоплазмозы картофеля и груши

Фитоплазмозы - Фитоплазмозы картофеля и груши

1. Столбур картофеля (Potato stolbur phytoplasma) [7]

2. Фитоплазма истощения груши (Pear decline phytoplasma [5]

Симптомы фитоплазмозов

В пораженных растениях фитоплазмы часто встречаются в смешанных инфекциях с вирусами, вироидами, риккетсиеподобными организмами. В частности, в тканях томатов, пораженных столбуром, в клетках флоэмы наблюдаются частицы фитоплазмы и признаки присутствия вируса табачной мозаики. Это явление объясняется тем, что указанные заболевания имеют общие способы распространения, циркуляции и сходные приемы защиты [4] .

Характерные внешние симптомы фитоплазмозов:

Все указанные симптомы могут присутствовать на одном растении одновременно. В процессе онтогенеза растений происходит изменение концентрации фитоплазм в тканях. Это может приводить к ложному выздоровлению, свойственному данной группе заболеваний [1] .

Способы передачи инфекции

Фитоплазмы по способу распространения являются типичными трансмиссивными патогенами. Они не переносятся механически с соком пораженных растений и через семена. Механическая передача фитоплазмозов возможна только при использовании больного прививочного материала [3] .

Для распространения фитоплазменной инфекции в природе необходим вектор (переносчик). Основную роль в распространении фитоплазмозов играют насекомые семейства Цикадки (Cicadellidae). Насчитывается более 60 видов цикадок-векторов фитопатогенных микоплазм. Кроме того, переносчиками фитоплазм в естественных условиях являются насекомые – представители семейства Листоблошки (Psyllidae) и семейства Фонарницы (Fulgoridae), а также насекомые семейства Трипсы настоящие (Tripidae) и различные представители отряда Акариморфных клещей (Acariformes) – вредителей растений, в частности из семейства Клещи галловые четырехногие (Eriophyidae) [3] [4] .

Некоторые виды фитоплазм способны размножаться в организме переносчиков. В этом случае вектор становится важным резерватором, способным вызывать вспышку фитоплазмоза [1] .

Насекомое приобретает способность передавать инфекцию не сразу после питания на больном растении, а через определенное время. За это время фитоплазмы размножаются в организме вектора [1] . Это подтверждается микроскопированием переносчиков, при котором в их организмах обнаруживаются тела фитоплазм [2] .

В растениях фитоплазмы сохраняются только в живых тканях: корнях, корневищах, луковицах, клубнях, корнеплодах. В семенах фитоплазмы не обнаруживаются [1] .


Диагностика – распознавание причин патологического состояния и постановка диагноза путем тщательного и всестороннего исследования больного организма (растения) [2] . В рамках фитопатологии, как науки, диагностика сегодня является обособленным направлением, представляющим крупное научное течение, занимающееся изучением и совершенствованием методов распознавания болезни растения [4] .

Постановка диагноза – это установление типа болезни, его характера (инфекционное или неинфекционное), причины, возбудителя заболевания и выбор соответствующих мер борьбы.На данном этапе развития науки имеются несколько методов диагностики: макроскопический (патографический), микроскопический, микологический, химический, физический, молекулярный [2] . Наиболее прогрессивной является молекулярная диагностика [5] .

Содержание:

Макроскопический (патографический, визуальный) метод диагностики

Макроскопический метод диагностики – позволяет ставить диагноз по видимым невооруженным глазом внешним признакам (симптомам). При необходимости используется незначительное увеличение (лупа, бинокль) [2] .

При использовании этого метода для правильной постановки диагноза необходимо:

  • проанализировать большое количество растений, поскольку совокупность всех признаков заболевания встречается не на всех растениях или симптомы не всегда выражены ясно;
  • тщательно осмотреть и оценить состояния больных растений от корней до вершины (точки роста);
  • проанализировать условия местопроизрастания объекта;
  • установить причины, способствовавшие возникновению болезни растения (антропогенные факторы, неблагоприятные погодные условия, поражение другими болезнями, повреждения насекомыми) [5] .

Диагностика - Исследование образца растения в лаборатории

Исследование образца растения в лаборатории

Диагностика - Исследование образца растения в лаборатории

Микроскопический метод диагностики

Микроскопический метод диагностики – исследование с помощью микроскопа спороношения возбудителя заболевания или пораженных тканей растения [2] .

Этот метод применяется для установления наличия патогена в тканях больного растения, то есть определения характера заболевания, и определения вида возбудителя болезни [2] .

Метод микроскопирования дает возможность установить наличие характерных признаков спороношения, свойственных тому или иному патогену и с помощью определителя установить его систематическое положение [2] .


Выращивание Sclerotinia sclerotiorum на питательной среде.


Микологический метод диагностики

Микологический метод диагностики – выделение инокулюма патогена из пораженных частей растения, его изоляции и выращивания (культивирования) на подходящей питательной искусственной или естественной среде [3] [2] .

Культивирование патогенов включает три основных этапа:

  • подготовка образцов естественных субстратов (почвы, органов растений, растительных остатков), из которых осуществляют высев на обычные или элективные питательные среды, способные обеспечить развитие одного или группы родственных видов;
  • выделение и получение чистой культуры патогена на питательных средах;
  • пересев чистых культур на дифференциально-диагностические среды для определения их видовой принадлежности [3][2] .

Физический метод диагностики

Физический метод диагностики – основан на различных свойствах семян, тканей и органов больных и здоровых растений. Органы больных растений исследуются на резонанс, свечение в ультрафиолетовых лучах, цвет клеточного сока, электропроводность, плотность [2] .

В частности, качество семян можно определить по плотности, поскольку у больных и здоровых семян она различна. Скрытую гниль древесины первоначально устанавливают путем выстукивания, поскольку здоровые и фаутные стволы издают разные звуки [2] .

К физическим методам диагностики относится метод идентификации патогена с помощью индикаторного растения – метод индикаторных растений. Он основан на использовании растений-индикаторов, дающих специфичные симптомы, характерные для определенного вида возбудителя болезни. Метод индикаторных растений широко используется для идентификации вирусных, вироидных, фитоплазменных заболеваний [1] .

Молекулярные методы диагностики

Молекулярные методы диагностики – комплекс методов молекулярной детекции фитопатогенов, позволяющие провести точную диагностику на любой стадии развития заболевания [5] .

Различают три группы методов:

Большинство методов молекулярной диагностики характеризуются быстротой и простотой использования, позволяющей проводить исследования в условиях передвижных мини-лабораторий. На основе методов молекулярной диагностики выпускаются различные коммерческие наборы для выявления патогенов – диагностикумы [5] .

Вирусы делятся на 2 вида: вирусы мозаичного и желтушного типа. Мозаичные вирусы передаются насекомыми неперсистентно( основой переносчик тля),но могут распространяться и контактно-механическим способом при междурядных обработках, когда повреждается ботва и происходит соприкосновение больных и здоровых растений; при уходе за растениями ( при пасынковании, обрезке, прищипке, выламывании побегов и т.д.) При заражении растений вирусами желтушного типа наблюдаются более сильные повреждения, чем при заражении вирусами мозаичного типа. Вирусы желтушного типа передаются персистентно главным образом цикадками. Грибы наиболее частая причина инфекционных болезней растений. Распространение грибов от растения к растению происходит спорами, кусочками грибницы с помощью ветра, дождя, насекомых, с орудиями обработки.Сохраняются грибы в спорах, уплотненных грибницах-склероциях, а при зараженмноголетних органов плодовых растений может зимовать и мицелий.Основные источники грибной инфекции — растительные остатки, почва, посадочный материал. Возбудители этого типа заболеваний — бактерии. Это низшие, бесхлорофилльные, одноклеточные растительные организмы, размножающиеся простым делением клетки. Их размеры в среднем 0,3—0,6X0,5—4,5 мкм.Бактериальные болезни проявляются в виде ожогов, некрозов, пятнистостей, гнилей. В случае поражения бактериями сосудистой системы растения увядают.Пути проникновения бактерий в растения многообразны: заражение происходит через устьица, водные поры, чечевички в кожуре, механические повреждения.Сохраняются фитопатогенные бактерии главным образом с растительными остатками в почве. Кроме того, бактерии могут оставаться на поверхности семян, заражая сеянцы и саженцы.Бактерии вызывают свыше 200 болезней растений.

ВИРОИДЫ (от вирусы и греч. eidos — форма, вид), инфекционные агенты, представляющие собой низкомолекулярную одноцепочечную кольцевую РНК (молекулярная масса 150 000-170 000), не кодирующую собственные белки. Вызывают болезни растений. Механизм репликации вироидов окончательно не выяснен. Предполагается, что вироиды в клетках растений, индуцируют синтез вироидных РНК, используя ферменты растений-хозяев. Возможно, что некоторые болезни человека и животных (куру, скрейпи овец и др.) вызываются агентами, сходными с вироидами Известно еще несколько молекулярных патогенов, подобных вирусам. Особое значение среди них имеют вироиды, которые несмотря на свое название резко отличаются от вирусов. Они много меньше самых малых вирусных частиц и лишены белковой оболочки. Вироиды состоят из однонитевой молекулы РНК, которая автономно реплицируется в зараженных клетках. Они являются возбудителями болезней многих растений (пальм, хризантем, картофеля и др.). Впервые вироиды обнаружены в 1971 г. в ядрах инфицированных клеток, при репликации они используют ферментные системы клетки-хозяина.

Фитоплазмы — специфическая группа фитопатогенных организмов, занимающих промежуточное положение между бактериями и вирусами. Они представляют собой полиморфные организмы. Клетки их, как правило, округлы, но некоторые имеют удлиненную или гантелеобразную форму. Один и тот же фитоплазменный организм может иметь клетки неодинаковых размеров и форм. Так, в клетках флоэмы столбурных растений табака присутствуют фитоплазмы сферической, овальной, вытянутой и другой формы. Диаметр клеток 0,1—1 мкм.

По существующей классификации фитоплазмы объединены в класс Mollicutes, хотя и составляют гетерогенную группу организмов. На основании пищевых потребностей выделены 2 порядка: Mycoplasmatales, представители которого нуждаются в холестерине, иAcholeplasmatales, для которых он не является необходимым. К семейству Mycoplasmataceae относятся стеринзависимые факультативные анаэробы. Представители семейства Spiroplasmataceae обладают большой подвижностью, благодаря наличию в цикле развития специфических спиралевидных форм. Им также свойственна зависимость от стеринов. Наиболее известными заболеваниями, вызываемыми возбудителями этой группы, являются стабборы цитрусовых (Citrus stubborn), карликовость кукурузы (Corn stunt) и кокосовой пальмы (Cocos ctunt). Среди наиболее вредоносных заболеваний, вызываемых фитоплазмами из семейства Acholeplasmataceae, можно отметить столбур томатов, курчавую мелколистность щелковицы, филлодию клевера. Эти микроорганизмы способны проникать в ткани растений непосредственно через корневую систему и вызывать специфические изменения морфогенеза.

Длительность сохранения инфекционного начала должна учитываться при составлении севооборота, определении перерыва в возделывании на зараженном поле культур, которые могут поражаться этой же болезнью.

Перезимовавшее инфекционное начало (бактерии, споры гриба и др.) обусловливает в следующем году первичное заражение и начало развития болезни.

Первичное заражение, или первичная инфекция, — это заражение, которое впервые происходит и впервые обнаруживается в сезоне (обычно на единичных растениях).

Первичное заражение происходит обычно за счет зимующего инфекционного начала (с растительными остатками, семенами и т. д.), но оно может попадать на растение и извне, с далекого расстояния.

Источником инфекции (точнее, источником возбудителя инфекции) служит инфекционное начало, находящееся на любых объектах окружающей среды. В большинстве случаев источник инфекции – это зараженные возбудителями сельскохозяйственные культуры, реже сорняки и представители дикой флоры.

Виды передачи возбудителя

Существует шесть основных видов механизмов передачи возбудителя инфекции:

 вертикальный (в том числе, трансплацентарный)

Воздушно-капельный механизм передачи инфекции — механизм передачи инфекции, при котором возбудители локализуются в слизистой оболочке дыхательных путей, откуда поступают в воздушную среду (при кашле, чихании и т. п.), пребывают в ней в форме аэрозоля и внедряются в организм человека при вдыхании зараженного воздуха.[1]

Контактный механизм передачи инфекции — механизм передачи инфекции, при котором возбудители локализуются на коже и ее придатках, на слизистой оболочке глаз, полости рта, половых органов, на поверхности ран, поступают с них на поверхность различных предметов и при контакте с ними восприимчивого человека (иногда при непосредственном контакте с источником инфекции) внедряются в его организм.[2]

Фекально-оральный механизм передачи инфекции — механизм передачи инфекции, при котором локализация возбудителя инфекции преимущественно в кишечникеопределяет его выведение из зараженного организма с испражнениями (фекалиями, мочой) или рвотными массами. Проникновение в восприимчивый организм происходит через рот, главным образом при заглатывании загрязненной воды или пищи, после чего он вновь локализуется в пищеварительном тракте нового организма.[2]

Трансплацентарный путь передачи инфекции — при котором возбудитель инфекции передается от матери к плоду во время беременности.[2]

Гемоконтактный механизм передачи инфекции — механизм передачи инфекции обусловленный медицинскими манипуляциями, инъекциями наркотиков, половым сношением.[2]

В основе диагностики вирусного заболевания лежат в первую очередь внешние симптомы. Но диагноз заболевания только по внешним признакам не всегда точен. Внешними признаками при определении вирусного заболевания можно ограничиться в тех случаях, когда они очень четки и характерны только для данного вида заболевания.

Применяют следующие методы диагностики вирусных заболеваний и вызывающих их вирусов: 1) установление инфекционности заболевания; 2) серологический метод; 3) метод растений-индикаторов; 4) электронная микроскопия; 5) метод внутриклеточных включений; 6) метод люминесцентного анализа; 7) анатомический метод; 8) химический метод. Основными из них являются первые четыре метода.

Бактерии. Особенности патогенеза. Сохранение инфекционного начала, пути передачи инфекции, методы диагностики.

Бактерии (из тетради по фитопатологии)

Граммположительные ( р. Bacillus, p. Clavibacter)

Граммотрицательные (р. Enterobacteraeae, Erwinia,Agrobacterium,Pectobacter,, Pseudomonas, Xantonomas, Rhizobium)

Размножение бактерий: делением на 2 части ил пчкованием

Распространение бактерий: 1) период вегетации от раст к раст (воздух, вода,начекомое, человек) 2) На большие расстояния семенами, посадочным материалом, птицами.

1) Визуальный анализ симптомов. Точно определить заболевание на основе симптомов можно только в редких случаях, когда симптомы носят специфический характер. На бактериальную природу некрозов часто указывает наличие экссудата.

2. Микроскопический анализ с использованием окрашивания. Готовят микроскопический препарат из поражённой ткани растения, для чего используют пограничные участки между поражённой и здоровой тканью. Проведение окрашивания (например, по Граму) облегчает распознавание бактериальных клеток в ткани растения-хозяина.

3. Микробиологический заключается в выделении возбудителя из поражённых тканей на искусственные питательные среды. При этом необходимо установить патогенность изолятов бактерий, т.е. их способность вызывать на искусственно инфицированных растениях те же симптомы, какие были на исследуемом растении при естественном поражении, т.е. действуют в соответствии с правилом Роберта Коха, названным триадой Коха. Метод включает три основных этапа: выделение возбудителя, заражение растения и выделение из него возбудителя.

4. Серологический. Сущность метода такая же, как при диагностике вирусов. Отличия серологической диагностики бактерий от диагностики вирусов и сложность анализа состоит в том, что у бактериальной клетки имеются не только белки, специфичные для вида, но и белки, общие для рода и семейства бактерий. Поэтому для получения специфичной антисыворотки используют лишь видоспецифичные белки (антигены). Наиболее часто применяются такие серологические методы как иммуноферментный анализ и реакция

иммунофлуоресценции. В настоящее время доступны коммерческие диагностические наборы для обнаружения заражённости семян томата бактериальным раком.

5. Молекулярный. Среди нескольких диагностических методов, использующих полиморфизм молекулы ДНК бактерий, наиболее распространенным является амплификация

(умножение) видоспецифичных последовательностей ДНК в ходе полимеразной цепной реакции (ПЦР). В ходе этой реакции отдельные фрагменты ДНК, характерные только для одного вида бактерии, избирательно синтезируются ферментом полимеразой до количества, в тысячи и миллионы раз превышающего исходное число копий выбранного фрагмента ДНК. Далее фрагмент обнаруживается с помощью электрофореза в агарозном геле или по флуоресценции исходного раствора. Метод отличается высокой чувствительностью (достаточно КГ" г бактериальной ДНК), быстротой (до 2—3 часов), высокой надежностью. К числу недостатков относится высокая стоимость оборудования и реактивов для проведения ПЦР, а также необходимость предварительного изучения разнообразия ДНК ФПБ.

Бактерии В настоящее время известно около 400 видов разнообразных бактерий, поражающих растения из самых различных семейств. Бактерии представляют собой мельчайшие одноклеточные растительные организмы. Большинство бактерий, так же как и грибы, относится к гетеротрофным организмам, лишенным хло¬рофилла и питающимся готовыми органическими веществами.

По форме бактерии делятся на три группы: шаровидные, п а л очко в ид н ы е, или цилиндрические, и извитые.

Все бактерии, вызывающие болезни сельскохозяйственных растений, имеют палочковидную форму. Движение у бактерий происходит при помощи жгутиков, которые представляют со¬бой длинные протоплазматические нити. Связь жгутиков с клет¬кой непрочная, при малейшем встряхивании бактерии теряют жгутики.

Длина жгутиков у разных бактерий колеблется в довольно широких пределах. У многих форм бактерий она не превышает размеров тела. Однако встречаются формы бактерий, у которых длина жгутиков в десятки раз превышает длину самой бакте¬риальной клетки. Размножаются бактерии главным образом простым делением клетки на две части. При благоприятных условиях деление каждой клетки может повторяться через каждые 20-30 минут. Питаются бактерии осмотически, непосредственно через обо¬лочку клеток путем диффузии или адсорбции. Способность к па-разитизму обусловлена наличием у них ряда ферментов, с по¬мощью которых бактерии переводят необходимые для них ве¬щества в усвояемые формы. Выделение продуктов жизнедея¬тельности у бактерий происходит через всю поверхность тела. Необходимые для роста питательные вещества бактерии полу¬чают из субстрата, на котором они поселяются. Из него они синтезируют новые составные части клетки и выделяют в окру¬жающую среду конечные продукты жизнедеятельности.

Из всего разнообразия бактерий лишь немногие из них способны вызывать болезни растений. Такие бактерии называются ф и т о п а т о г е н н ы м и, а вызы¬ваемые ими болезни - бактериозами.

Почти все фитопатогенные бактерии имеют палочковидную форму, в большинстве случаев палочки прямые, с закруглен¬ными концами. Они бывают одиночные или соединенные по¬парно. Значительно реже образуются короткие цепочки, и лишь у немногих видов можно наблюдать длинные цепочки (напри¬мер, у Pseudomonas coronofaciens). Среди фитопатогенных бак¬терий имеются формы, представляющие собой изогнутые, иногда ветвящиеся палочки и без жгутиков (Corynebacterium).Размеры фитопатогенных бактерий мало отличаются от дру¬гих палочковидных форм (ширина 0,3-0,6 мк, длина 0,5- 4,5 мк). Почти все фитопатогенные бактерии подвижны, непод-вижных видов, поражающих в той или иной степени растения, насчитывается не более 10 видов. Движение большинства из них совершается при помощи полярных жгутиков. Перитрихиальное расположение жгутиков встречается значительно реже.

Известны фитопатогенные бактерии, которые имеют кап¬сулу.

Большинство фитопатогенных бактерий является аэробами, они хорошо растут на искусственных питательных средах, обра¬зуя на них блестящие, слизистые колонии с ровными краями, в отдельных случаях края колоний могут быть неровными, как бы разорванными. Цвет колоний фитопатогенных бактерий чаще всего бывает белым или желтоватым, редко оранжевым. Цвет колоний обусловливается наличием у бактерий пигментов.

Фитопатогенные свойства бактерий тесно связаны с нали¬чием или отсутствием у них тех или иных ферментов. При внеш¬нем сходстве бактерии сильно отличаются друг от друга в био-химическом отношении. Они содержат протеазу, расщепляю¬щую белок, пектиназу и протопектиназу, расщепляющие пекти¬новые вещества и оболочки клеток, амилазу, гидролизующую крахмал, хлорофиллазу, расщепляющую хлорофильные зерна, в результате чего теряется зеленая окраска пораженной ткани и появляются светлые маслянистые пятна.

Из всех ферментов фитопатогенных бактерий наиболее рас¬пространена протопектиназа, с ее помощью бактерии разъеди¬няют и разрушают растительные клетки. Впоследствии бактерии используют не только пектиновые вещества, но и содержимое клеток, отмирающих в результате их разъединения и иногда интоксикации.

Появление желтого ореола вокруг некротических пятен свя¬зано с хлорофиллазой.

Окислительные ферменты (тирозиназы) вызывают почерне¬ние или побурение растительных тканей. Почернение колосьев при поражении пшеницы бактерией Xanthomonas translucens объясняется наличием у нее тирозиназы. Возбудитель черной ножки картофеля Pectobacterium phytophthorum также содер¬жит тирозиназу, чем отличается от других возбудителей гни¬лей растений.

Некоторые фитопатогенные бактерии образуют токсины, ко¬торые влияют на обмен веществ растений-хозяев; одни из них вызывают локальные поражения, например образование округ¬лых некротических пятен при бактериальной рябухе табака, другие токсины принимают участие в процессах увядания растений - Ps. solanacearum, третьи способствуют ненормальному делению и разрастанию клеток растения-хозяина, например воз¬будитель бактериального рака Ps. tumefaciens.

Среди бактерий есть высокоопециализированные, которые приурочены к одному роду или даже виду растений (например, Xanthomonas malvacearum Sm (Dows) поражает только неко¬торые виды рода Gossypiuin).

Известны бактерии, поражающие многие растения разных видов и даже родов, но в пределах одного семейства (например, Xanthomonas campestris приурочена к семейству крестоцвет¬ных).

Кроме того, есть группа фитопатогенных бактерий, характе¬ризующаяся широкой избирательной способностью. Отдельные виды бактерий этой группы поражают растения из самых раз¬нообразных семейств (например, Pseudomonas tumefaciens встречаются на растениях из 39 семейств).

Бактериальные болезни. Патогенез.

Бактериозы, болезни растений, вызываемые бактериями (См. Бактерии). Причиняют большой вред многим с.-х. культурам, особенно хлопчатнику, табаку, томатам, картофелю, капусте, огурцам и некоторым др. Поражения могут быть общими, вызывающими гибель всего растения или отдельных его частей, проявляться на корнях (корневые гнили), в сосудистой системе (сосудистые болезни); местными, ограничивающимися заболеванием отдельных частей или органов растения, а также проявляться на паренхимных тканях (паренхиматозные болезни — гнили, пятнистости, ожоги); могут носить смешанный характер. Особое место занимают Б. б. р., связанные с появлением новообразований (онухолей).

Возбудители Б. б. р. — главным образом неспороносные бактерии из семейства Mycobacteriaceae, Pseudomonadaceae, Bacteriaceae. Среди них существуют многоядные бактерии, поражающие многие виды растений, и специализированные, поражающие близкородственные растения одного вида или рода. Многоядные бактерии вызывают следующие наиболее распространённые бактериозы: мокрые гнили, от которых сильно страдают картофель, капуста, лук, реже морковь, махорка, томаты, и корневой рак различных плодовых деревьев, винограда. Специализированные бактерии вызывают бактериальную пятнистость фасоли, бактериоз огурцов, чёрную бактериальную пятнистость и бактериальный рак томатов, сосудистый бактериоз капусты, рябуху табака, чёрный и базальный бактериоз пшеницы, бактериальный ожог косточковых, груш, шелковицы, цитрусовых, кольцевую гниль и чёрную ножку картофеля, гоммоз хлопчатника, полосатый бактериоз проса и ячменя и другие болезни. Возникновение и развитие Б. б. р. зависит от наличия инфекционного начала и восприимчивого растения, а также от факторов внешней среды, изменяя которые можно управлять течением инфекционного процесса. Например, бактериоз огурцов в теплицах развивается только при наличии капельножидкой влаги и температуры воздуха 19—24°C. Проветривая теплицы и повышая в них температуру, удаётся приостановить развитие болезни. Бактерии проникают в растения через различные повреждения и естественные ходы; например, возбудители различных пятнистостей — через устьица листьев, ожога плодовых деревьев — через нектарники цветков, сосудистых бактериозов крестоцветных — через водяные поры в листьях. Передача возбудителей бактериозов возможна с семенами (гоммоз хлопчатника и др.), с неперегнившими остатками больных растений, при уходе за растениями, прививках, с воздушными токами, брызгами дождя, насекомыми, моллюсками, нематодами.

Меры борьбы: протравливание семян, дезинфекция саженцев и черенков, почвы в парниках и теплицах; обработка вегетирующих растений бактерицидами или антибиотиками; уничтожение остатков больных растений; обрезка больных побегов и дезинфекция поврежденных ветвей; уничтожение заболевших растений; правильное чередование культур в полях севооборота; правильный режим питания и водоснабжения растений; выведение устойчивых сортов.


Обзор

Автор
Редакторы


Спонсор конкурса — дальновидная компания Thermo Fisher Scientific. Спонсор приза зрительских симпатий — фирма Helicon.

Чем болеют растения?

Для начала несколько слов о том, от чего, собственно, специалистам приходится защищать сельскохозяйственные растения. Причинами заболевания растений могут быть как факторы среды (летняя засуха или зимние морозы, недостаток питательных веществ в почве или их избыток и т.п.), так и различные паразитические организмы (бактерии, вирусы, грибы, круглые черви (нематоды) и даже другие растения).

Грибы, бесспорно, являются основными патогенами культурных растений. Известно, например, что из 162 серьёзных заболеваний в Центральной Европе 135 (83%) вызываются грибами [2]. Фитопатогенные грибы — многочисленная группа; их описано свыше 10 000 видов, различных по систематическому положению, степени паразитизма, специализации и т.д. [3]. Они широко распространены в природе и при благоприятных для их развития условиях наносят значительный урон урожаю и сельскохозяйственным продуктам при хранении. Даже самые осторожные оценки говорят об уничтожении болезнями 10–20% потенциального урожая; без контрмер масштабы этих потерь резко возросли бы [2].

Именно о проблемах диагностики болезней растений, вызываемых фитопатогенными грибами, пойдёт речь в данной статье.

Врага надо знать в лицо

Зачем же нужно, с одной стороны — обнаружение, а с другой — быстрое и точное (желательно — до вида, или даже расы) определение фитопатогенных грибов?

На данный момент самым распространённым методом борьбы с фитопатогенными грибами является обработка растений фунгицидами. Понятно, что невозможно защитить культуры от всех возможных потенциальных угроз: это и сложно, и экономически невыгодно, да и для окружающей среды далеко не полезно. Именно поэтому важно знать, желательно — своевременно, с чем именно придётся бороться. Чем раньше обнаружена болезнь, тем больше шансов, что, приняв соответствующие меры, удастся её победить. Это верно для заболеваний как человека, так и растений. Кстати, точное определение вида грибов важно ещё и в довольно неожиданной области — реставрации деревянных строений — поскольку используемые там антисептические меры также очень сильно зависят от типа поражения [4].

Кроме этого, идентификация фитопатогенных грибов необходима для изучения их таксономии и эволюции, их взаимоотношений с растениями-хозяевами, генетических основ восприимчивости и устойчивости растений, что, в конечном счете, должно помочь в разработке способов борьбы с патогенами и в селекции растений, невосприимчивых к болезням [5].

И, наконец, крайне важна сертификация зерна и посадочного материала в рамках карантинных программ. Известно, что фитопатогенные грибы могут распространяться многими путями — как естественными (с током воздуха, водой, насекомыми, животными), так и при помощи человека, перевозящего заражённые растения или их части не только между различными странами, но и между континентами. Зачастую такое перемещение приводит к неожиданному и масштабному распространению заболеваний.

Например, пузырчатая ржавчина (Cronartium ribicola) была эндемична для Альп и востока России. Этот паразит, в цикле развития предполагающий обязательную смену хозяев, обитает круглый год на пятихвойных соснах, а летом поражает листья смородины; ни в одном из исходных ареалов он не причинял серьёзного ущерба. Однако веймутова сосна, завезённая в начале XVIII века из Америки в ряд областей Европы, оказалась крайне восприимчивым хозяином для данного гриба. За счёт этого распространившаяся инфекция причинила большой вред культурам смородины и высаженным веймутовым соснам, а в 1909 году была завезена с их рассадой в Америку, где встретила многочисленных хозяев для обеих фаз развития. Здесь стали страдать, прежде всего, лесообразующие пятихвойные сосны. Поэтому, чтобы разорвать инфекционную цепь паразита с обязательной сменой хозяев, пытаются уничтожать дикорастущие виды смородины [2].

Ещё один показательный пример: возбудитель голландской болезни вяза (Ophiostoma ulmi) уже в XX столетии был занесён из континентальной Европы в Северную Америку. Начиная примерно с 1970 г., после того, как он был завезён в Великобританию, он успел уничтожить половину английских вязовых насаждений [2]. Теперь этот вид встречается и в России.

Для того чтобы избежать подобного впредь, созданы списки карантинных организмов, и при перемещении растений или их семян между странами (или даже частями одной страны) обязательно проводится их обследование.

Как только что было показано, идентификация фитопатогенных грибов крайне важна, возник вопрос — каким образом она производится?

Наиболее простой способ — это идентификация патогена по внешним признакам заболевания (симптомам), то есть по тому воздействию, которое он оказывает на поражённое растение [6]. Но здесь проблема в том, что к одним и тем же повреждениям растения-хозяина могут приводить совершенно разные микроорганизмы, отличающиеся разной устойчивостью к фунгицидам, вредоносностью и другими характеристиками. Как пример, здесь можно привести три листовые пятнистости пшеницы (рис. 1).

Листовые пятнистости пшеницы

Рисунок 1. Листовые пятнистости пшеницы. Слева — септориоз листьев пшеницы (возбудитель — Mycosphaerella graminicola). По центру — септориоз листьев и колоса пшеницы, проявление на листьях (возбудитель — Phaeosphaeria nodorum). Справа — жёлтая пятнистость пшеницы (возбудитель — Pyrenophora triticirepentis). Обратите внимание: несмотря на то, что это разные заболевания, поражения листьев очень похожи.

Ещё одна проблема заключается в том, что далеко не все заболевания проявляются сразу же после заражения растения. Например, возбудитель пыльной головни ячменя (Ustilago nuda) обычно проникает во время цветения пшеницы в формирующуюся зерновку. Гриб не препятствует формированию зародыша, само зерно развивается нормально, ничем внешне не отличаясь от здорового. Мицелий зимует в зерновке. Весной одновременно с прорастанием семян происходит и рост мицелия, который по мере роста растения распространяется по различным его органам. Проявляется заболевание только в период колошения. При этом разрушаются все части колоса, превращаясь в чёрную споровую массу, после распыления которой остаются лишь ости и стержень колоса (рис. 2) [8].

Пыльная головня ячменя

Рисунок 2. Пыльная головня ячменя: поражённое соцветие со спорами

Стандартный для фитопатологов подход при определении фитопатогенных грибов — это выделение их в чистую культуру на какой-либо питательной среде, получение характерных образований (чаще всего это, конечно, спороношения) и затем идентификация гриба под микроскопом.

Но здесь возникают определённые трудности. Основная из них заключается в том, что далеко не все паразитические грибы возможно культивировать на искусственных питательных средах: многим требуется наличие живых тканей растения-хозяина, либо присутствие других представителей сложного сообщества [10]. Но даже если гриб удаётся выделить в культуру, следующий вопрос — это то, сколько времени понадобится, чтобы добиться от него появления спороношения. Например, возбудитель белосоломенной болезни пшеницы и ржи (Gibellina cerealis), хотя и хорошо культивируется, даёт спороношение только после четырёх–пяти недель роста. Естественно, что меры по борьбе с патогеном необходимо принимать сразу после его обнаружения, а не через месяц, когда может оказаться, что спасать уже нечего.

Сравнение конидий типовых образцов

Рисунок 3. Сравнение конидий типовых образцов Alternaria longipes (вверху), Alternaria tenuissima (в центре), Alternaria alternata (внизу). Видно, что на основе сравнения только формы конидий этих трёх видов однозначно различить их крайне сложно. При идентификации видов в данном случае специалист использует не только форму конидий, но и другие признаки (например, способ образования конидий, их взаимное расположение и т.п.).

И даже с определением тех фитопатогенных грибов, спороношения которых получить сравнительно просто, могут возникать сложности. К примеру, идентификация многих микромицетов сопряжена с рядом трудностей, таких как сходство морфологических характеристик разных видов и одновременно внутривидовая вариабельность признаков. Несмотря на внешнее сходство, возбудители могут значительно отличаться по патогенности, токсигенности, степени специализации, генетике взаимоотношений с растением-хозяином, вредоносности, чувствительности к фунгицидам и т.д. То есть разные виды обладают совершенно разными экологическими особенностями и хозяйственной значимостью [12]. Хорошим примером здесь является определение различных видов рода Alternaria (рис. 3). Очевидно, что для идентификации до вида нужны достаточно широкие познания в данной области и немалый опыт работы с исследуемым фитопатогеном.

Ещё один способ, пригодный для обнаружения некоторых фитопатогенных грибов, заключается в смыве с субстрата, фильтрации и микроскопическом определении (и даже подсчёте, что даёт количественные данные) их спор. Чаще всего, таким способом оценивается количество грибных спор в зерне или в почве. Несмотря на то, что идентификация до вида на основании одних только спор чаще всего затруднена, этот способ широко применяется, а для анализа получаемых при помощи микроскопа изображений разрабатываются специальные компьютерные программы [14]. Например, таким образом определяют заражённость зерна возбудителем твёрдой головни (Tilletia caries) (рис. 4) [15]. Несмотря на использование компьютерных технологий, этот метод весьма трудоёмок и не подходит для исследования большого количества образцов.

Зерновки, поражённые твёрдой головнёй пшеницы

Рисунок 4. Зерновки, поражённые твёрдой головнёй пшеницы

Молекулярная биология на службе фитопатолога

Во всех описанных случаях на помощь исследователям могут прийти широко развивающиеся в последнее время молекулярные методы анализа. Сейчас в основе большинства из них лежит применение ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay, иммуноферментный анализ) [11], либо ПЦР (полимеразная цепная реакция, polymerase chain reaction) [17].

Иммуноферментный анализ состоит из двух основных этапов: иммунной и ферментативной реакций. Иммунная реакция заключается в специфическом связывании характерного для данного микроорганизма антигена с диагностическим антителом. Ферментативная реакция необходима для обнаружения этого связывания. Как правило, она сопровождается изменением цвета, причём степень этого изменения может быть использована для определения количества присутствующего антигена.

Прибор CSL Pocket Diagnostic

Рисунок 5. Прибор CSL Pocket Diagnostic TM lateral flow immunodiagnostic kit. Растительный экстракт помещается на площадку (a), которая содержит латексные шарики, покрытые специфическими антителами; смесь мигрирует вдоль мембраны (b) к абсорбирующей поверхности (c). При этом имеющиеся в растворе целевые антигены связываются со специфичными антителами на латексных шариках. Мембрана содержит полосу антител, отличающихся необходимой специфичностью (измерительную полосу) (d) и полосу других антител, которые связываются с первыми антителами (контрольную полосу) (e). Латексные шарики, содержащие связанный антиген, задерживаются в тестовой зоне, давая видимую линию, тогда как излишние латексные шарики, которые не содержат антигена, задерживаются в контрольной зоне, показывая, что анализ работает. Наличие двух линий соответствует положительному результату (positive), наличие только одной линии (контрольной) говорит о негативном результате (negative).

Основанные на иммуноферментном анализе методы широко применяются для обнаружения вирусов (в том числе поражающих растения) и значительно реже — для идентификации грибов и бактерий. Основной причиной этого является трудность получения антител с необходимой специфичностью: строение клеточных стенок грибов и бактерий гораздо сложнее, чем вирусного капсида, к тому же может изменяться в ходе их жизненного цикла. В результате получаемые антитела могут оказаться специфичны как сразу к большой группе видов, так и исключительно к отдельным жизненным формам данных микроорганизмов. Тем не менее, основанные на ELISA методы идентификации фитопатогенных грибов всё же разрабатываются: например, существует метод идентификации спор уже упоминавшейся в данной статье твёрдой головни [19].

ПЦР — это ферментативная реакция, в результате которой происходит накопление большого количества копий какого-либо не слишком большого (чаще всего, 200–1500 пар нуклеотидов) фрагмента ДНК. Так как ДНК любого организма содержит как вариабельные (отличающиеся даже у близкородственных организмов), так и консервативные (сходные у эволюционно далёких видов) участки, возможно на основе выбора диагностического участка варьировать специфичность протекающей реакции.

Таким образом, данный метод позволяет обнаруживать последовательности нуклеиновой кислоты, специфичные для конкретного организма или группы сходных организмов и, тем самым, выявлять его (их) присутствие в анализируемой пробе. Методы, основанные на ПЦР, позволяют идентифицировать патогенные виды как в чистой культуре, так и непосредственно в растительном материале, минуя этап изоляции грибов [20]. Как пример, здесь приведены результаты ПЦР, разработанной для идентификации грибов рода Pyrenophora (рис. 6), представители которого являются возбудителями жёлтой пятнистости злаков, в частности — пшеницы (рис. 1).

Идентификация грибов рода Pyrenophora

Рисунок 6. Разделённые при помощи электрофореза продукты ПЦР, разработанной для идентификации грибов рода Pyrenophora. М — маркер, представляющий собой набор фрагментов ДНК известного размера, 1–10 — ДНК, выделенная из различных образцов листьев пшеницы, поражённых листовыми пятнистостями. Здесь продукт реакции (фрагмент ДНК известного размера) должен наблюдаться только в том случае, если в образце присутствует ДНК целевого организма, а именно — гриба рода Pyrenophora. В итоге видно, что растения под номерами 3–6, 8 и 9 больны жёлтой пятнистостью, а остальные — каким-либо другим внешне схожим заболеванием.

Существует достаточно много модификаций метода ПЦР, большинство из которых применяется в изучении возбудителей болезней растений. Например, RAPD и RFLP анализы используются для уточнения родственных связей между различными грибами; ПЦР, специфичная для ДНК представителей отдельных родов или видов — для идентификации фитопатогенов (в том числе — в форматах nested и multiplex); ПЦР с регистрацией в режиме реального времени (real-time PCR) — для определения количества присутствующей целевой ДНК.

Рассмотрим подробнее один из самых перспективных методов на основе ПЦР — ПЦР с регистрацией в режиме реального времени (рис. 7). В отличие от большинства других форматов ПЦР, он позволяет не только констатировать факт присутствия ДНК целевого патогена, но и измерить её количество. В качестве примера здесь приведено определение в двух образцах количества ДНК ещё одного возбудителя листовой пятнистости.

ПЦР с регистрацией в режиме реального времени

Интересно применение данного метода для анализа заражённости зерна твёрдой головнёй (рис. 4): при наличии соответствующих калибровочных графиков возможно получение результатов в виде числа спор, имеющихся в образце [7].

Ложка дёгтя в бочке мёда

Хотя преимущества и перспективы применения молекулярных методов идентификации сложно переоценить, на пути их практического использования имеется целый ряд трудностей. Несмотря на универсальность методов при конечном анализе, для их разработки и проверки требуется достаточно много времени и немалая экспериментальная база. Основной проблемой здесь является отсутствие возможности чисто теоретически оценить специфичность разрабатываемых методов.

Ну и самая большая проблема всех описанных в данной статье методов — это цена, ограничивающая их широкое применение в условиях небогатых российских хозяйств.

Несколько слов о будущем

Несмотря на все имеющиеся проблемы, молекулярные методы анализа интенсивно развиваются (о чём можно судить хотя бы по числу публикаций на соответствующие темы, которое с каждым годом становится всё больше). Старые методы постоянно совершенствуются, в то же время разрабатываются новые (например, метод биочипов [21] и секвенирование следующего поколения [22]), а цена одного анализа становится всё ниже. Поэтому можно надеяться, что не за горами то время, когда все упоминавшиеся в данной статье методики и их более совершенные аналоги действительно найдут широкое применение и облегчат жизнь фитопатологов и агрономов.

Читайте также: