Электронная микроскопия в диагностике вирусных болезней

Обновлено: 23.04.2024

Почти все смертельные вирусные вспышки в последние два десятилетия были вызваны вновь появляющимися вирусами. Для изучения вирусов часто используют электронную микроскопию (ЭМ). Она позволяет получить новые данные о структуре вирусных частиц с высоким разрешением, что представляет интерес как для фундаментальной вирусологии, так и для практической фармацевтической нанобиотехнологии. Кроме того, ЭМ применяется в экологических исследованиях для определения наличия вирусов в окружающей среде, при анализе технологических процессов для производства вакцин и других биотехнологических компонентов, а также в диагностических целях. Несмотря на развитие более чувствительных методов, электронная микроскопия в диагностике остается рабочим методом. Главное преимущество ЭМ - отсутствие специфичности к какой-либо определенной группе вирусов, что способствует работе с неизвестным материалом. Однако основное ограничение метода - относительно высокий предел обнаружения (107 частиц/мл), в связи с чем необходимо концентрировать вирусный материал. Не существует какого-то одного наиболее эффективного метода. В зависимости от самого вируса и поставленной цели используются различные комбинации методов и подходов. В настоящее время концентрирование вируса включает операции осаждения, центрифугирования, фильтрации и хроматографии. В обзоре на примере разных вирусов описаны эти основные методы. Существует необходимость в разработке эффективных методик элюирования, которые могут нарушить связь между фильтрующими материалами и вирусами, чтобы повысить степень восстановления. Рассмотрены работы по созданию уникальных ловушек, магнитных шариков, композитных полианилиновых и углеродных нанотрубок и нанотрубок с изменяемым размером для концентрирования вирусных частиц. Приведен пример применения центрифужных концентраторов, в которых вирус осаждается на мембране из поли-эфирсульфона. Проанализированные данные указывают на то, что способ концентрирования вирусов или других наночастиц выбирается в каждом конкретном случае в зависимости от поставленной цели и оснащенности лаборатории.

Ключевые слова

Об авторах

Р. п. Кольцово, Новосибирская область

Список литературы

1. Abbaszadegan M., Alum A., Abbaszadegan H., Stout V Cell surface display of poliovirus receptor on Escherichia coli, a novel method for concentrating viral particles in water. Appl. Environ. Microbiol. 2011;77(15):5141-5148.

2. Ali A., Roossinck M.J. A simple technique for separation of Cow-pea chlorotic mottle virus from Cucumber mosaic virus in natural mixed infections. J. Virol. Methods. 2008;153:163-167.

3. Alonso M.C., Rodriquez J., Borrego J.J. Enumeration and isolation of viral particles from oligotrophic marine environments by tangential flow filtration. Int. Microbiol. 1999;2(4):227-232.

4. Bakhutashvili T.O., Gusev A.A., Dudnikov A.I., Mikhalishin V V, Shipilov V.I. A Method for Concentrating Viruses. Patent RF № 1834289, 2002. (in Russian)

5. Barth H.G., Jackson С., Boyes В.Е. Size exclusion chromatography. Anal. Chem. 1994;66(12):595-620.

7. Burova E., Loffe Е. Chromatographic purification of recombinant adenoviral and adeno-associated viral vectors: methods and implications. Gene Ther. 2005;12:5-17.

8. Dong H., Xiao K., Li X., Ren Y, Guo S. Preparation of PVDF/ Al2O3 hybrid membrane via the sol-gel process and characterization of the hybrid membrane. Desalin. Water Treat. 2013; 51(19-21):3685-3690.

9. Doodeji M.S., Zerafat M.M. A review on the applications of nano filtration in virus removal and pharmaceutical industries. Glob. J. Nanomed. 2018;3(5):555624. DOI 10.19080/GJN.2018.03.555624.

10. Falman J.C., Fagnant-Sperati C.S., Kossik A.L., Boyle D.S., Me-schke J.S. Evaluation of secondary concentration methods for poliovirus detection in wastewater. Food Environ. Virol. 2019; 11(1):20-31.

11. Flavigny E., Gaboyard M., Merel P., Fleury H. Magnetic particle-mediated virus concentration for clinical virology. In: 104th General Meeting of the American Society for Microbiology, New Orleans, American Society for Microbiology. May 22-27, 2004. Washington, DC, 2004.

12. Gentile M., Gelderblom H.R. Electron microscopy in rapid viral diagnosis: an update. New Microbiol. 2014;37:403-422.

15. Goldsmith C.S., Miller S.E. Modern uses of electron microscopy for detection of viruses. Clin. Microbiol. Rev. 2009;552-563.

16. Gutierrez-Aguirre I., Banjac M., Steyer A., Poljsak-Prijatelj M., Peterka M., Strancar A., Ravnikar M. Concentrating rotaviruses from water samples using monolithic chromatographic supports. J. Chromatogr. 2009;1216(13):2700-2704.

17. Havlik M., Marchetti-Deschmann M., Friedbacher G., Messner P., Winkler W., Perez-Burgos L., Tauer C., Allmaier C. Development of a bio-analytical strategy for characterization of vaccine particles combining SEC and nanoES GEMMA. Analyst. 2014; 139(6):1412-1419.

18. Hazelton P.R., Gelderblom H.R. Electron microscopy for rapid diagnosis of infectious agents in emergent situations. Emerg. Infect. Dis. 2003;9:294-303.

19. Ikner L.A., Gerba C., Bright K. Concentration and recovery of viruses from water: a comprehensive review. Food Environ. Virol. 2012;4(2):41-67.

20. Ismagambetov B.M., Koshemetov Zh.K., Bogdanova M.I., Na-khanova G.D., Nurabaev S.Sh., Seysenbaeva M.S., Sansyz-bai A.R., Kasenov M.M. Design of diagnostic products for influenza A subtypes. Mezhdunarodnyy Zhurnal Prikladnykh i Fundamental’nykh Issledovaniy. Seriya Biologicheskie Nauki = International Journal of Applied and Fundamental Research. Biological Series. 2017;10:260-264. (in Russian)

21. Ivanova V.T., Ivanova M.V., Sapurina I.Yu., Burtseva E.I., Trusha-kova S.V., Isaeva E.I., Kirillova E.S., Stepanova N.V., Oskerko T.A. A comparative study of carbon nanotubes and polymer composites containing silver nanoparticles as sorbents of influenza viruses A and B. Voprosy Virusologii = Problems of Virology. 2015;60(3):25-30. (in Russian)

22. Ko S.-M., Cho S.-Y, Oh M.-J., Vaidya B., Kim D. Application of concanavalin A-linked magnetic beads for the detection of hepatitis A virus. J. Food Prot. 2018;81(12):1997-2002.

23. Krajacic M., Ravnikar M., Strancar A., Gutierrez-Aguirre I. Application of monolithic chromatographic supports in virus research. Electrophoresis. 2017;38:22-23.

24. Kyzin A.A., Zagidullin N.V., Gelich L.V., Timerbaeva R.H., Isra-filov A.G. Purification and concentration of influenza virus by micro- and ultrafiltration. Vestnik Bashkirskogo Universiteta = Bulletin of Bashkir University. 2014;19(4):1223-1227. (in Russian)

27. Lu R., Li Q., Yin Z., Xagoraraki I., Tarabara V., Nguyen T. Effect of virus influent concentration on its removal by microfiltration: The case of human adenovirus 2. J. Membr. Sci. 2016;497: 120-127.

28. Maximous N., Nakhla G., Wan W., Wong K. Preparation, characterization and performance of Al2O3/PES membrane for wastewater filtration. J. Membr. Sci. 2009;341(1-2):67-75.

29. Mogi K., Hayashida K., Honda A., Yamamoto T. Development of virus concentration device by controlling ion depletion zone for ultra-sensitive virus sensing. Trans. Sens. Micromachines. 2016; 136(9):363-369.

30. Reid G.G., Milne E.W., Coggins L.W., Wilson N.J., Smith K.T., Shepherd A.J. Comparison of electron microscopic techniques for enumeration of endogenous retrovirus in mouse and Chinese hamster cell line used for production of biologics. J. Virol. Methods. 2003;108:91-96.

31. Roettger B.F., Myers J.A., Ladisch M.R., Regnier F.E. Аdsorption phenomena in hydrophobic interaction chromatography. Bio-technol. Prog. 1989;5(3):79-88.

32. Ruscic J., Gutierrez-Aguirre I., Znidaric M.T., Kolundzija S., Sla-na A., Barut M., Ravnikar M., Krajacic M. A new application of monolithic supports: The separation of viruses from one another. J. Chromatogr. A. 2015;1388:69-78.

33. Ryabinnikova A.I., Matraimov M.B., Shalgynbaev E.K., Rysta-eva R.A., Orynbaev M.B. Purification and concentration of horses rhinopneumonia virus. Nauka, Novye Tekhnologii i In-novatcii Kyrgyzstana = Science, New Technologies, and Innovations in Kyrgyzstan. 2015;4:129-131. (in Russian)

34. Sakudo A., Baba K., Ikuta K. Capturing and concentrating adenovirus using magnetic anionic nanobeads. Int. J. Nanomedicine. 2016;11:1847-1857.

36. Sakudo A., Baba K., Tsukamoto M., Sugimoto A., Okada T., Ko-bayashi T., Kawashita N., Takagi T., Ikuta K. Anionic polymer, poly(methyl vinyl ether-maleic anhydride)-coated beads-based capture of human influenza A and B virus. Bioorg. Med. Chem. 2009b;17(2):752-757.

37. Sakudo A., Ikuta K. Efficient capture of infectious H5 avian influenza virus utilizing magnetic beads coated with anionic polymer. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2008;377(1):85-88.

38. Sakudo A., Ikuta K. A technique for capturing broad subtypes and circulating recombinant forms of HIV-1 based on anionic polymer-coated magnetic beads. Int. J. Mol. Med. 2012;30(2): 437-442.

40. Sakudo A., Tanaka Y., Ikuta K. Capture of infectious borna disease virus using anionic polymer-coated magnetic beads. Neurosci. Lett. 2011b;494(3):237-239.

41. Sanamyan A.G., Dmitrieva R.A., Doskina T.V., Lavrova D.V, Ne-dachin A.E. Use of a membrane module MPM 0142 for the concentration of viruses in the sanitary-virological surveillance of water objects. Gigiena i Sanitariya = Hygiene and Sanitation. 2006;6:74-76. (in Russian)

42. Schagen F.H.E., Rademaker H.J., Rabelink M., van Ormondt H., Fallaux F.J., van der Eb A.J., Hoeben R.C. Ammonium sulphate precipitation of recombinant adenovirus from culture medium: an easy method to increase the fetal virus yield. Gene Ther. 2000;7(18):1570-1574.

43. Segura M.M., Garnier А., Kamen А. Purification and characterization of retrovirus vector particles by rate zonal ultracentrifugation. J. Virol. Methods. 2006;133(1):82-91.

44. Sheets R.L. Opinion on adventitious agents testing for vaccines: Why do we worry so much about adventitious agents in vaccines? Vaccine. 2013;31(26):2791-2795.

45. Soto-Beltran M., Ikner L.A., Bright K.R. Effectiveness of poliovirus concentration and recovery from treated wastewater by two electropositive filter methods. Food Environ. Virol. 2013;5: 91-96.

46. Sun G., Xiao J., Wang H., Gong C., Pan U., Yan S., Wang Y Efficient purification and concentration of viruses from a large body of high turbidity seawater. MethodsX. 2014;1:197-206. DOI 10.1016/j.mex.2014.09.001.

48. Tarasov A.V., Fedotov Yu.A., Lepeshin S.A., Panov Yu.T., Oku-lov K.V., Vdovina A.I. The use of membranes with a positive surface charge for sanitary and virological control of water. Iz-vestiya Samarskogo Nauchnogo Tsentra Rossiyskoy Akademii Nauk = Proceedings of the Samara Research Center of the Russian Academy of Sciences. 2012;14(1-9):2372-2376. (in Russian)

49. Taylakova E.T., Chervyakova O.V., Sadikalieva S.O., Sultanku-lova K.T., Zaytsev V.L., Turganbaeva A.S., Sansyzbay A.R. Optimization of conditions for purification and concentration of equine influenza virus. Vestnik Nauki KazATU imeni S. Sejful-lina = Herald of Science of the Saken Seifullin Kazakh AgroTechnical University. 2011;4(71):14-23. (in Russian)

50. Transfiguracion J., Jorio H., Meghrous J., Jacob D., Kamen A. High yield purification of functional baculovirus vectors by size exclusion chromatography. J. Virol. Methods. 2007;142(1-2):21-28.

51. Trifonova E.A., Nikitin N.A., Kirpichnikov M.P., Karpova O.V., Atabekov I.G. A method of production and characterization of spherical particles, new biogenic platforms. Vestnik Moskov-skogo Universiteta. Seriya 16. Biology = Moscow University Bulletin. Series 16. Biology. 2015;4:46-50. (in Russian)

52. Vicente T., Roldao A., Peixoto C., Carrondo M.J.T., Alves P.M. Large-scale production and purification of VLP-based vaccines. J. Invertebr. Pathol. 2011;107:42-48.

53. Wickramasinghe S.R., Kalbfuss B., Zimmermann A., Thom V, Reichl U. Tangential flow microfiltration and ultrafiltration for human influenza A virus concentration and purification. Biotech-nol. Bioeng. 2005;92(2):199-208.

54. Yeh Y.T., Tang Y, Sebastian A., Dasgupta A., Perea-Lopez N., Albert I., Lu H., Terrones M., Zeng C.-Y Tunable and label-free virus enrichment for ultrasensitive virus detection using carbon nanotube arrays. Sci. Adv. 2016;2(10):e1601026. DOI 10.1126/sciadv.1601026.

55. Yousefi M.H., Zerafat M.M., Shokri-Doodeji M.D., Sabbaghi S. Investigation of dip-coating parameters effect on the performance of Alumina-Polydimethylsiloxane nanofiltration membranes for desalination. J. Water Environ. Nanotechnol. 2017; 2(4):235-242.

56. Zajtsev B.N., Taranov O.S., Rudometova N.B., Shcherbakova N.S., Il’ichev А.А., Karpenko L.I. Optimized method for counting viral particles using electron microscopy. Vavilovskii Zhurnal Ge-netiki i Selektsii = Vavilov Journal of Genetics and Breeding. 2019;23(3):237-242. DOI 10.18699/VJ19.498. (in Russian)

57. Zajtsev VP., Zolotykh D.S., Leonova V.D., Larskaya K.S., Krat I.P., Orobinskaya V.N., Konovalov D.A. The nanoparticles: methods of preparation and analysis, activity, and toxicity. Sovremennaya Nauka i Innovatsii = Modern Science and Innovation. 2016; 3(15):197-218. (in Russian)

Лабораторная диагностика вирусных инфекций включает обнаружение возбудителя или его компонентов в клиническом материале; выделение вируса из этого материала; серодиагностику. Выбор метода лабораторной диагностики в каждом отдельном случае зависит от характера заболевания, периода болезни и возможностей лаборатории. Современная диагностика вирусных инфекций основана на экспресс-методах, позволяющих получать ответ через несколько часов после взятия клинического материала в ранние сроки после заболевания, К ним относятся электронная и иммунная электронная микроскопия, а также иммунофлюоресценция, метод молекулярной гибридизации, выявление антител класса lgM и др.

Электронная микроскопия вирусов, окрашенных методом негативного контрастирования, позволяет дифференцировать вирусы и определять их концентрацию. Применение электронной микроскопии в диагностике вирусных инфекций ограничивается теми случаями, когда концентрация вирусных частиц в клиническом материале достаточно высокая (10 5 в 1 мл и выше). Недостатком метода является невозможность отличать вирусы, принадлежащие к одной таксономической группе. Этот недостаток устраняется путем использования иммунной электронной микроскопии. Метод основан на образовании иммунных комплексов при добавлении специфической сыворотки к вирусным частицам, при этом происходит одновременная концентрация вирусных частиц, позволяющая идентифицировать их. Метод применяют также для выявления антител. В целях экспресс-диагностики проводят электронно-микроскопическое исследование экстрактов тканей, фекалий, жидкости из везикул, секретов из носоглотки. Электронную микроскопию широко используют для изучения морфогенеза вируса, ее возможности расширяются при применении меченых антител.

При вирусоскопическом методе в исследуемом материале обнаруживают с помощью электронной микроскопии вирионы или с помощью светооптической микроскопии внутриклеточные включения. Метод электронной микроскопии дает возможность обнаружить вирионы, но он недостаточно специфичен.

Гораздо более специфичным, чувствительным и надежным является метод иммунной электронной микроскопии. Он оказался особенно полезным для обнаружения тех вирусов, которые не размножаются в культуре клеток и для которых нет других тест-систем. В основе этого метода лежит взаимодействие антител с вирусами при смешивании вирусосодержащего материала со специфической сывороткой.

Сам процесс иммунной электронной микроскопии включает следующие процедуры: 1) приготовление водного экстракта исследуемого материала и смешивание его с соответствующим объемом специфической сыворотки; 2) осаждение образующихся микропреципитатов центрифугированием; 3) негативное контрастирование иммунного преципитата фосфорно-вольфрамовой кислотой; 4) нанесение материала на сеточку; 5) просмотр препарата в электронном микроскопе.

Единственный недостаток этого метода заключается в его громоздкости, поэтому он не может быть использован для массовых исследований.

Большинство вирусов обнаруживают при помощи электронной микроскопии. При помощи электронной микроскопии выявлено большое разнообразие морфологии вирусов и изучена ультраструктура вирусных частиц.

В световом микроскопе видны только крупные вирусы (200 нм и больше). Эти вирусы окрашивают по Романовскому-Гимзе и рассматривают при иммерсионной микроскопии.

Вирусы меньше, чем 200 нм окрашивают серебрением по Морозову. Они увеличиваются в размерах и под световым микроскопом вирусы имеют черный цвет и круглую форму. Вирусы оспы, окрашенные по Морозу, - тельца Пашена.

Для диагностики вирусных инфекций в пораженных клетках обнаруживают вирусные тельца или включения. Это скопления вирусных частиц или колонии вирусов в клетке. Они окрашиваются специальными методами и изучаются с помощью светового микроскопа. Образование внутриклеточных включений отмечено при многих вирусных инфекциях. Включения имеют разную величину (от 0,25 до 20-30 нм) и форму (круглая, овальная, грушевидная, веретенообразная, неправильная).

Например, при бешенстве в цитоплазме нервных клеток обнаруживаются тельца Бабеша-Негри. При натуральной оспе в цитоплазме эпителиальных клеток обнаруживаются тельца Гварниери.

Морфология бактериофагов и особенности их взаимодействия с бактериальной клеткой.

Бактериофаги ("пожиратели бактерий") – это вирусы бактерий. Размеры такие же, как у вирусов, – 20 – 200 нм. Как и вирусы, бактериофаги проходят через бактериальные фильтры и размножаются только в живых клетках. Бактериофаги в природе находятся там, где бактерии: в воде, почве, молоке, в организме людей и животных.

С помощью электронного микроскопа показано, что большинство бактериофагов имеют форму головастика или сперматозоида. Они состоят из головки и хвостового отростка. Отросток – стержень с чехлом. Стержень заканчивается шестиугольной пластинкой с короткими шипами, от которых отходят фибриллы. Чехол может сокращаться. Внутри головки находится ДНК. ДНК окружена капсидом. В отростке находятся ферменты – лизоцим и АТФаза. Они участвуют в проникновении фага в клетку.

Взаимодействие бактериофага с бактериальной клеткой называется бактериофагией. Стадии взаимодействия фага с клеткой такие же, как и у вирусов: адсорбция, проникновение в клетку, синтез нуклеиновых кислот и белков, морфогенез, выход из клетки. Но имеются особенности. Фаги обладают строгой специфичностью взаимодействия. Определенный фаг взаимодействует с определенным видом или даже подвидом бактерий. По этому название бактериофагов такие же, как видовые или родовые названия тех бактерий, с которыми они взаимодействуют. Например, стафилофаги, дизентерийные фаги и т.д.

Интересен процесс проникновения фагов с хвостовыми отростками в клетку. Эти фаги адсорбируются при помощи фибрилл, сокращается чехол (при помощи АТФазы), и стержень внедряется в клетку (при помощи фермента лизоцима). ДНК проходит через стержень в цитоплазму клетки. Капсид и отросток остаются вне клетки. Через 5 минут начинается синтез нуклеиновых кислот и белков, а через 30-40 минут бактериальная клетка разрушается (лизируется). В окружающую среду выходит около 200 новых фаговых частиц.

Явление бактериофагии можно обнаружить при выращивании бактерий на жидких и плотных питательных средах. На жидких средах при действии фагов наблюдается просветление жидкости с бактериальной культурой. . На твердых средах на фоне сплошного роста бактерий образуются стерильные пятна круглой или неправильной формы. Они образуются на месте разрушения (лизиса) бактерий. Это "негативные колонии" бактериофага.

Различают: а) поливалентные фаги – взаимодействуют с родственными видами бактерий; б) моновалентные – взаимодействуют с одним определенным видом; в) типовые фаги – взаимодействуют с отдельными вариантами (типами) данного вида бактерий.

Фаги делятся на вирулентные и умеренные. Вирулентные фаги проникают в клетку, размножаются в ней и вызывают ее лизис. Умеренные фаги проникают в клетку и встраиваются в хромосому бактерии. Лизис при этом не происходит. Встроенный в хромосому бактерии фаг называется профагом. Бактериальные клетки, содержащие профаг, называются лизогенными, а само явление – лизогения. Лизогенные бактерии имеют дополнительные свойства (образование токсинов и др). Изменение свойств называется фаговой конверсией. Под влиянием УФ лучей и химических веществ профаг может превращаться в вирулентный фаг. Это явление называется индукцией фага.

Умеренные фаги – мощный фактор изменчивости микроорганизмов и могут нанести вред микробиологическому производству

Получение и применение бактериофагов. Для получения препаратов бактериофагов используют проверенные производственные штаммы фагов и соответствующие им типичные культуры бактерий. В бактериальную культуру в жидкой питательной среде вносят маточную взвесь фага. После просветления (лизиса) культуру фильтруют через бактериальные фильтры, и фильтрат вносят в свежую культуру соответствующих бактерий и т.д. После накопления достаточного количества фага лизированную им культуру бактерий вновь фильтруют, и получают препарат фага.

Таким образом, препараты фагов получают путем многократного пассирования через чувствительную бактериальную культуру, а сами препараты фагов – фильтраты бульонных культур лизированных ими бактерий. Это прозрачные жидкости светло-желтого цвета, а также на их основе готовят другие лекарственные формы - таблетки с кислотоустойчивым покрытием, мази, аэрозоли, свечи.

Применение фагов основано на их строгой специфичности. Они используются для:

а) диагностики инфекционных заболеваний (диагностические препараты): с помощью известного фага можно определить вид или подвид бактериальной культуры;

б) лечения и профилактики заболеваний (лечебно-профилактические препараты).

В лабораторной диагностике вирусных инфекций имеются три основных подхода (табл. 1, табл. 2):

1) непосредственное исследование материала на наличие вирусного антигена или нуклеиновых кислот;

2) изоляция и идентификация вируса из клинического материала;

3) серологическая диагностика, основанная на установлении значительного прироста вирусных антител в течение болезни.

При любом выбранном подходе к вирусной диагностике одним из важнейших факторов является качество исследуемого материала. Так, например, для прямого анализа образца или для изоляции вируса исследуемый материал должен быть получен в самом начале заболевания, когда возбудитель еще экскретируется в относительно больших количествах и не связан пока антителами, а объем образца должен быть достаточен для проведения прямого исследования. Также важен выбор материала в соответствии с предполагаемым заболеванием, то есть того материала, в котором исходя из патогенеза инфекции вероятность присутствия вируса наибольшая.

Не последнюю роль в успешной диагностике играет среда, в какую берется материал, как он транспортируется и как хранится. Так, носоглоточные или ректальные мазки, содержимое везикул помещают в среду, содержащую белок, предотвращающий быструю потерю инфекционности вируса (если планируется его изоляция), или в соответствующий буфер (если планируется работа с нуклеиновыми кислотами).

Прямые методы диагностики клинического материала

Прямые методы – это методы, которые позволяют обнаружить вирус, вирусный антиген или вирусную нуклеиновую кислоту (НК) непосредственно в клиническом материале, то есть являются наиболее быстрыми (2–24 ч). Однако из-за ряда особенностей возбудителей прямые методы имеют свои ограничения (возможность получения ложноположительных и ложноотрицательных результатов). Поэтому они часто требуют подтверждения непрямыми методами.

Электронная микроскопия (ЭМ). С помощью этого метода можно обнаружить собственно вирус. Для успешного определения вируса его концентрация в пробе должна быть примерно 1·10 6 частиц в 1 мл. Но поскольку концентрация возбудителя, как правило, в материале от больных незначительна, то поиск вируса затруднен и требует предварительного его осаждения с помощью высокоскоростного центрифугирования с последующим негативным контрастированием. Кроме того, ЭМ не позволяет типировать вирусы, так как у многих из них нет морфологических различий внутри семейства. Например, вирусы простого герпеса, цитомегалии или опоясывающего герпеса морфологически практически неотличимы.

Одним из вариантов ЭМ, используемым в диагностических целях, является иммунная электронная микроскопия (ИЭМ), при которой применяются специфические антитела к вирусам. В результате взаимодействия антител с вирусами образуются комплексы, которые после негативного контрастирования легче обнаруживаются.

ИЭМ несколько более чувствительна, чем ЭМ, и используется в тех случаях, когда вирус не удается культивировать in vitro, например при поиске возбудителей вирусных гепатитов [1].

Реакция иммунофлюоресценции (РИФ). Метод основан на использовании антител, связанных с красителем, например флюоресцеинизотиоцианатом. РИФ широко применяется для выявления вирусных антигенов в материале больных и для быстрой диагностики.

В практике применяются два варианта РИФ: прямой и непрямой. В первом случае применяются меченные красителем антитела к вирусам, которые наносятся на инфицированные клетки (мазок, культура клеток). Таким образом, реакция протекает одноэтапно. Неудобством метода является необходимость иметь большой набор конъюгированных специфических сывороток ко многим вирусам.

При непрямом варианте РИФ на исследуемый материал наносится специфическая сыворотка, антитела которой связываются с вирусным антигеном, находящимся в материале, а затем наслаивается антивидовая сыворотка к гамма-глобулинам животного, в котором готовилась специфическая иммунная сыворотка, например антикроличья, антилошадиная и т. п. Преимущество непрямого варианта РИФ состоит в потребности лишь одного вида меченых антител.

Метод РИФ широко применяется для быстрой расшифровки этиологии острых респираторных вирусных инфекций при анализе мазков-отпечатков со слизистой оболочки верхних дыхательных путей [2, 3]. Успешное применение РИФ для прямой детекции вируса в клиническом материале возможно лишь в случае содержания в нем достаточно большого числа инфицированных клеток и незначительной контаминации микроорганизмами, которые могут давать неспецифическое свечение.

Иммуноферментный анализ (ИФА). Иммуноферментные методы определения вирусных антигенов в принципе сходны с РИФ, но основываются на мечении антител ферментами, а не красителями. Наиболее широко используется пероксидаза хрена и щелочная фосфатаза, применяют также -галактозидазу и -лактамазы [4]. Меченые антитела связываются с антигеном, и такой комплекс обнаруживается при добавлении субстрата для фермента, с которым конъюгированы антитела. Конечный продукт реакции может быть в виде нерастворимого осадка, и тогда учет проводится с помощью обычного светового микроскопа, или в виде растворимого продукта, который обычно окрашен (или может флюоресцировать или люминесцировать) и регистрируется инструментально.

Поскольку с помощью ИФА можно измерять растворимые антигены, то не требуется наличия интактных клеток в образце и таким образом могут использоваться различные виды клинического материала.

Другое важное преимущество метода ИФА – возможность количественного определения антигенов, что позволяет применять его для оценки клинического течения болезни и эффективности химиотерапии. ИФА, как и РИФ, может применяться как в прямом, так и в непрямом варианте.

Твердофазный ИФА, дающий растворимый окрашеный продукт реакции, нашел наибольшее распространение. ИФА может быть использован как для определения антигена (тогда на твердую фазу – дно лунки полистиролового планшета – наносятся антитела), так и для определения антител (тогда на твердую фазу наносятся антигены) [5, 6].

Радиоиммунный анализ (РИА). Метод основан на метке антител радиоизотопами, что обеспечивало высокую чувствительность в определении вирусного антигена. Широкое распространение метод получил в 80-е годы, особенно для определения маркеров HBV и других некультивируемых вирусов. К недостаткам метода относится необходимость работать с радиоактивными веществами и использования дорогостоящего оборудования (гамма-счетчиков).

Молекулярные методы. Первоначально классическим методом выявления вирусного генома считался высокоспецифичный метод гибридизации НК, но в настоящее время все шире используется выделение геномов вируса с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Молекулярная гибридизация нуклеиновых кислот. Метод основан на гибридизации комплементарных нитей ДНК или РНК с образованием двунитевых структур и на выявлении их с помощью метки. Для этой цели используются специальные ДНК- или РНК-зонды, меченные изотопом ( 32 Р) или биотином, обнаруживающие комплементарные нити ДНК или РНК. Существуют несколько вариантов метода: – точечная гибридизация – выделенную и денатурированную НК наносят на фильтры и затем добавляют меченый зонд; индикация результатов – авторадиография при использовании 32 Р или окраска – при авидин-биотине; – блот-гибридизация – метод выделения фрагментов НК, нарезанных рестрикционными эндонуклеазами из суммарной ДНК и перенесенных на нитроцеллюлозные фильтры и тестируемые мечеными зондами; используется как подтверждающий тест при ВИЧ инфекции; – гибридизация in situ – позволяет определять НК в инфицированных клетках [7].

ПЦР основана на принципе естественной репликации ДНК. Суть метода заключается в многократном повторении циклов синтеза (амплификации) вирусспецифической последовательности ДНК с помощью термостабильной Taq ДНК-полимеразы и двух специфических затравок – так называемых праймеров.

Каждый цикл состоит из трех стадий с различным температурным режимом. В каждом цикле удваивается число копий синтезируемого участка. Вновь синтезированные фрагменты ДНК служат в качестве матрицы для синтеза новых нитей в следующем цикле амплификации, что позволяет за 25–35 циклов наработать достаточное число копий выбранного участка ДНК для ее определения, как правило, с помощью электрофореза в агарозном геле.

Метод высокоспецифичен и очень чувствителен. Он позволяет обнаружить несколько копий вирусной ДНК в исследуемом материале. В последние годы ПЦР находит все более широкое применение для диагностики и мониторинга вирусных инфекций (вирусы гепатитов, герпеса, цитомегалии, папилломы и др.) [8, 9].

Разработан вариант количественной ПЦР, позволяющий определять число копий амплифицированного сайта ДНК. Методика проведения сложна, дорогостояща и пока недостаточно унифицирована для рутинного применения.

Цитологические методы в настоящее время имеют ограниченное диагностическое значение, но при ряде инфекций по-прежнему должны применяться. Исследуются материалы аутопсии, биопсии, мазки, которые после соответствующей обработки окрашиваются и анализируются под микроскопом. При цитомегаловирусной инфекции, например, в срезах ткани или в моче обнаруживаются характерные гигантские клетки– "совиный глаз", при бешенстве – включения в цитоплазме клеток (тельца Бабеша–Негри). В некоторых случаях, например при дифференциальной диагностике хронических гепатитов, имеет значение оценка состояния ткани печени.

Электронная микроскопия – методы идентификации вирусов и диагностики вирозов с использование электронного микроскопа [1] .

Одну из первых микрографий вируса в 1939 году получили Г.А. Кауше и Е. Пфанкух при просмотре очищенных препаратов вируса табачной мозаики и Х-вируса картофеля. По мере совершенствования электронно-микроскопической техники расширялось и использование электронной микроскопии. В настоящее время данный метод широко применяется в фитовирусологии не только в качестве диагностического приема, но и при изучении биологии вирусов, особенностей их взаимоотношения с растениями и переносчиками, а также при определении концентрации вирионов [2] [1] .

Принцип работы электронного микроскопа

В устройство электронного микроскопа входит вольфрамовая нить, через которую проходит ток, нагревающий ее и вызывающий эмиссию электронов. Высокое отрицательное напряжение, прилагаемое к нити, обеспечивает значительную разность величины потенциалов между вольфрамовой нитью и заземленной пластиной анода [2] .

Разность потенциалов приводит к ускорению движения электронов по направлению к аноду. При этом часть электронов проходит через отверстие в центре анода (центральную апертуру) и формирует электронный луч, направленный вниз по колонне микроскопа [2] .

Данный луч фокусируется первой (конденсорной) магнитной линзой и освещает исследуемый препарат [2] .

Основная масса электронов проходит через исследуемый объект без отклонения, но часть их подвергается рассеиванию тяжелыми атомами объекта и выбивается из общего электронного луча. Чем плотнее структура объекта, тем сильнее рассеивание лучей. В результате формируется структура выходящего луча, способная при повторной фокусировке преобразоваться в изображение исследуемого объекта [2] .

Электроны, прошедшие сквозь объект, фокусируются второй магнитной линзой (объективной). Она и создает увеличенное изображение, которое увеличивается третьей (проекционной) магнитной линзой, а затем проецируется на экран с люминофорным покрытием [2] .

Чаще всего вирусы фотографируют при увеличении в 20–50 тысяч раз. При печати фотографии есть возможность увеличить изображения ещё в несколько раз [2] .

Электронный микроскоп

Требования к изучаемым биологическим объектам

Биологические объекты, предназначенные для изучения с помощью электронной микроскопии, должны отвечать следующим требованиям:

обладать высокой электрической проводимостью;
обладать устойчивостью к вакууму;
обладать устойчивостью к нагреванию;
обладать устойчивостью к действию электронного пучка;
обладать достаточно большими значениями атомных масс элементов, входящим в его состав;
быть выделенным из свежего материала [3] .

Для четкой видимости вирионов под электронным микроскопом применяют контрастирование вирусных препаратов при их приготовлении – напыление металлом (хром, вольфрам, платина, золото) или негативное контрастирование при помощи химических соединений. Для негативного контрастирования используются фосфорно-вольфрамовая кислота, молибденовокислый аммоний, вольфрамат натрия. Негативное контрастирование обеспечивает возможность изучения внутренней структуры вирионов [3] .

Вирусные частицы (с напылением)

Методы приготовления вирусных препаратов

Вирусные препараты готовят на специализированных сетках диаметром 2–3 мм. Сверху сетки покрыты пленкой-подложкой из формвара или коллодия. Препараты для метода электронного микроскопирования готовят согласно специальным методикам.

Метод погружения – пригоден для выявления нитевидных, палочковидных вирусов в ростках, листьях, кожуре клубней. Для этого край листа обрезают и место среза погружают на пару секунд в каплю дистиллированной воды, нанесенную на сетку с пленкой-подложкой. Таким же образом срезают кожуру клубня или росток (на высоте 1/3 клубня), место среза погружают в каплю дистиллированной воды на сетке. После высыхания капли препарат контрастируют металлом [3] .

Метод разбавленной суспензии – кусочек исследуемого листа (1 см 2 или 10–30 мг) растирают в фарфоровой ступке до однородной массы и добавляют маленькими порциями 10–20 мг дистиллированной воды. Растирание продолжают до получения однородной разбавленной смеси. Каплю, полученной взвеси, наносят на сетку и после высыхания напыляют металлом. Метод применяется для исследования стабильных палочковидных и нитевидных вирусов, характеризующихся относительно высокой концентрацией вирионов в тканях растений [3] .

Препараты для лабильных вирусов (с нестойкими вирионами) готовят, используя с применением различных приемов, способствующих стабилизации вирусных частиц. Для таких вирусов, особенно с бацилловидной формой используют только негативное контрастирование [1] . Для каждого вида лабильных вирусов разрабатываются индивидуальные способы контрастирования. В частности, вирус мозаики люцерны и вируса обыкновенной мозаики огурца сохраняют путем обработки очищенных препаратов формалином перед негативным контрастированием. Стабилизация вирионов вируса штриховатой мозаики пшеницы производится с помощью вакуум-инфильтрации внутрь тканей листьев 12% раствора глютаральдегида в течение получаса, затем суспензия негативно окрашивается фосфорно-вольфрамовой кислотой [2] .

Иммуносорбентная электронная микроскопия

Иммуносорбентная электронная микроскопия является методом, сочетающий серологию с электронной микроскопией. Пленки-подложки обрабатывают специфическими антисыворотками. Это дает возможность выявить низкую концентрацию вирусов и дифференцировать вирусные частицы при смешанной инфекции [2] .

При использовании данного метода сетку, пленкой вниз, помещают в каплю антисыворотки, обладающей специфичностью к данному вирусу. Через 30–40 секунд сыворотку удаляют фильтровальной бумагой, оставляя на пленке следы влаги. Затем сетку переносят на поверхность капли сока растения, затем на каплю контрастера. Избыточную жидкость удаляют фильтровальной бумагой [2] .

При такой подготовке биологического материала под электронным микроскопом можно наблюдать вирусы, связанные и покрытые антителами диагностической сыворотки [2] .

Читайте также: