Эмбрион вакцина против оспы птиц из штамма кэм

Обновлено: 19.04.2024

вакцины ВГНКИ против оспы птиц. Ветеринария, 1991, №6, с.22-24. US 3419965 А, 25.02.1969.

Формула изобретения

Описание изобретения к патенту

Для профилактики инфекционных болезней птиц нарабатывается большое количество как живых, так и инактивированных вакцин, в т.ч. против НБ и ОП, которые применяются в виде монопрепаратов, что увеличивает трудозатраты. В связи с этим, для сокращения числа прививок и трудозатрат, а также снижения стрессов в процессе вакцинации, отрицательно влияющих на здоровье и продуктивность птицы, актуален вопрос о целесообразности применения ассоциированных вакцин.

Эффективность комплексной иммунизации эмбрион-вакцинами против ньюкаслской болезни и оспы птиц показана рядом исследователей как в экспериментальных, так и полевых условиях при внутрикожной аппликации [2, 3, 5, 6].

Известны комбинированные генно-инженерные вакцины против гриппа А птиц и оспы, НБ и оспы, созданные на основе вектора вируса оспы птиц (США). Живых ассоциированных культуральных вакцин против оспы птиц и ньюкаслской болезни до настоящего времени не создано.

Ассоциированный метод вакцинации, например, против НБ и ларинготрахеита [1], болезни Марека и Гамборо заключается в одновременном введении препаратов в организм птиц [4]. Однако положительных результатов одновременного накопления (репродукции) вирусов НБ и ларинготрахеита при совместном культивировании в одной биосистеме и даже в куриных эмбрионах (КЭ) не получено.

Профилактику ньюкаслской болезни птиц в основном проводят путем вакцинации препаратами, изготовленными на КЭ из лентогенных штаммов - Ла Сота, Бор-74 ВГНКИ и мезогенных штаммов парамиксовируса 1 - "Н", ГАМ-61. Эти штаммы при различных способах введения вызывают образование вирусспецифических антител (более 3 log 2 ) и защищают от заболевания более 80% птицы.

Вакцины из лентогенных штаммов обладают хорошей иммуногенностью, не реактогенны, вакцинацию можно проводить различными методами, но иммунитет формируется через 14-21 сутки после иммунизации.

Отличительной особенностью вакцин из мезогенных штаммов является то, что они защищают птицу на 3-8 сутки, но при этом обладают остаточной реактогенностью.

Вирусным сырьем для изготовления вакцин из лентогенных и мезогенных штаммов является экстраэмбриональная жидкость зараженных вирусом развивающихся КЭ, причем для получения вакцин необходимо использовать только СПФ эмбрионы, стоимость которых в несколько раз дороже обычных, а их производство в России не налажено.

Способ изготовления этой вакцины заключается в следующем: суспензию трипсинизированных клеток кожи эмбрионов кур (КЭК) заражают вирусом оспы кур (штамм "К") и культивируют в течение 72-96 ч, после чего подвергают замораживанию - оттаиванию. Полученный вируссодержащий материал смешивают со стабилизатором, расфасовывают в ампулы и лиофилизируют.

Однако совместное культивирование вирусов ОП и НБ не получено, а соответственно и не разработана ассоциированная вакцина.

Целью настоящего изобретения является получение ассоциированной культуральной вирусвакцины против ньюкаслской болезни и оспы птиц, обладающей высокой иммуногенностью против этих заболеваний.

Используемый штамм "М-ВНИИВВиМ" вируса НБ не патогенен для цыплят. Инокуляция 20%-ной суспензии селезенки от павших цыплят в разведении 1·10 -3 вызывала гибель куриных эмбрионов через 60-84 часа. Штамм был идентифицирован как мезогенный. Инфекционный титр его составляет 8,5-9,0 lg ЭЛД 50/ см 3 , а гемагглютинирующий титр - 1:256-1:512 (8,0-9,0 log 2 ).

После первых 6 пассажей вируса в клетках КФ наблюдается четко выраженное цитопатическое действие, вирус накапливается в титрах 6,5-7,0 lg ТЦД 50/ см 3 , а гемагглютинирующий титр увеличился с 1:4 в первом пассаже до 1:32 в шестом пассаже. Начиная с пятого пассажа, накопление вируса в клетках стабилизируется и составляет 6,5-7,0 lg ТЦД 50/ см 3 , при гемагглютинирующем титре 1:16-1:32.

Вируссодержащий материал смешивают с защитной средой в соотношении 1/1, разливают в ампулы по 1,0 см 3 и проводят сушку на сублимационном аппарате, предварительно заморозив смесь до температуры минус 50°С. Камеру сублиматора предварительно обрабатывают 70%-ным этиловым спиртом и готовят сублиматор по следующим параметрам:

- температура полок не выше минус 40°С;

- температура конденсатора не выше минус 70°С.

После загрузки камеры подключают датчик контроля температуры материала, камеру герметизируют и вакуумируют до остаточного давления 80-100 мм рт. столба. Затем включают циркуляционный насос, и в течение первых 10-14 часов сушки нагрев полок проводится за счет естественного нагрева до минус 20°С. Температура материала в течение первых 9-12 часов не должна превышать минус 30°С. Далее нагрев полок ступенчато (по 2-3 часа) повышают до минус 15, 10, 5 и плюс 5, 10 и 30°С. Конечная температура полок (+30°С) поддерживается в течение 3 часов, при этом температура материала не должна превышать 20°С.

Досушивание вакцины проводят при температуре материала плюс 15-20°С в течение 5 часов. Продолжительность сушки составляла 32 часа, при влажности готового продукта 2-3%.

Лиофилизированный препарат оценивают визуально, определяют влажность, стерильность, безвредность и иммуногенность для цыплят.

Контроль стерильности культуральной вакцины проводят на бактериальных средах: МПА, МПБ при 37°С и средах Сабуро при комнатной температуре в течение 10 суток. Материал считают стерильным и пригодным для дальнейшего применения, если видимых изменений в средах не выявлено

Контроль вакцины на безвредность проводят на 10 интактных цыплятах 60-суточного возраста. Для испытания используют 3 ампулы вакцины, из которых в стерильных условиях стерильным шприцем отбирают по 0,5 см препарата и объединяют их в одну пробу. Инъекцию проводят внутрикожно (в перепонку крыла) по 0,015 см 3 двухигольным инъектором троекратно. За привитой птицей наблюдают в течение 10 суток.

Вакцина признана безвредной, т.к. все 10 цыплят в течение указанного времени остались живы, без клинических признаков переболевания и на месте введения вакцины выявлены оспины.

Для проверки иммуногенной активности вакцины используют 10 цыплят 60-суточного возраста, свободных от антител к вирусам НБ и ОП (после проверки их сывороток крови в РЗГА и РДП соответственно). Иммунизацию цыплят ассоциированной вакциной проводят внутрикожно (в перепонку крыла) по 0,015 см 3 стерильным двухигольным инъектором, место введения вакцины дезинфицируют 70%-ным этиловым спиртом.

Эффективность антигена вируса НБ в ассоциированной вакцине определяют по титру антигемагглютинирующих антител к вирусу НБ в реакции задержки гемагглютинации (РЗГА). Титр антител у 90% вакцинированных цыплят через 21 сутки после вакцинации был выше, чем 1:16, а эффективность вируса определяли по наличию местной реакции на введение вакцины, которая была выявлена в месте введения вакцины на 5-7 сутки после вакцинации у 80% птицы.

Для проверки напряженности иммунитета против НБ провели контрольное заражение цыплят на 21 сутки после вакцинации вирулентным штаммом Т-53 вируса НБ. Всех цыплят, включая контрольную группу, заражали внутримышечно по 0,5 см 3 в дозе 10 5 ЭЛД 50. Наблюдение за птицей проводили в течение 10 дней. Цыплята контрольной группы погибли, а выживаемость среди вакцинированных составила 90%.

1. Дутко Ю.С. Аэрозольная вакцинация птиц одновременно против инфекционного ларинготрахеита, болезни Ньюкасла и оспы // Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук Покров, ВНИИВиМ, 1977.

4. Сирии В.Н. Псевдочума птиц (ньюкаслская болезнь). - М.: 304 с.

5. Saini S.S., Sodhi S.S., Maiti N.K. and Sharma. Jmmume pesponse of chicks to oral vaccination against Neucastle disease and Foul pox. Comp. Jmmun. Microbiol. Infect. Dis. Vol.13, 1 1, рр.1-6, 1990.

6. Tripathy D.W., Cunningam C.H. /Avian Pox/ B кн. Diseaes of Poultry, 1984, p.524-534.

7. Гуненков В.В., Чистова З.Я., Кузнецова Г.Д., Яременко Л.И. Опыт создания противооспенных вакцин для овец кроликов и домашних птиц. Мат.международной н-п конференции поев. 40-летию ВНИИВВиМ, 1998, с.297-299.

8. Гуненков В.В., Чистова З.Я., Кузнецова Г.Д., Ходосевич Н.Ф. // Свойства сухой культуральной вакцины ВГНКИ против оспы птиц. // Ветеринария, №6, 1991, с.22-24.

Фармакологическая группа:

Иммунотропные средства. Вакцины живые.

Торговое наименование ВАКСИПОКС (VACCIPOX). Международное непатентованное наименование: эмбрион-вакцина против оспы птиц из штамма "КЭМ-7" с разбавителем.

Лекарственная форма: эмбрион-вакцина (сухой компонент) - лиофилизат для приготовления суспензии для внутрикожного введения, разбавитель (жидкий компонент) - раствор.

Фармакологические свойства: эмбрион-вакцина ВАКСИПОКС относится к профилактической группе иммунобиологических лекарственных препаратов для ветеринарного применения.

Эмбрион-вакцина ВАКСИПОКС предназначена для специфической профилатики оспы птиц в неблагополучных и угрожаемых по данному заболеванию птицеводческих хозяйствах.

Эмбрион-вакцина ВАКСИПОКС по внешнему виду представляет собой сухую пористую однородную массу бежевого цвета, разбавитель - прозрачный раствор красного цвета.

Срок годности эмбрион-вакцины и разбавителя составляет 18 месяцев с даты выпуска при соблюдении условий хранения и транспортирования.

Эмбрион-вакцина ВАКСИПОКС расфасована по 50,100 или 500 прививных доз (2см3) в стеклянные флаконы, герметично укупоренные резиновыми пробками, укрепленными алюминиевыми колпачками. Разбавитель расфасован в стеклянные флаконы по 2,5 см3 (для фасовки эмбрион-вакцины по 50 и 100 доз) или 6 см3 (для фасовки эмбрион-вакцины по 500 доз), которые герметично укупорены резиновыми пробками и обкатаны алюминиевыми колпачками.

Для получения более подробной информации о препарате, позвоните по одному из телефонов:

Весь перечень и инструкции ветпрепаратов можно посмотреть в каталоге продукции на нашем сайте. В отношении цены, а также о возможности покупки Вас с удовольствием проинформируют наши менеджеры.

Окулярная форма вакцины должна содержать одну прививную дозу в 0,05 см 3 суспензии, что соответствует объему одной капли при истечении из носика стандартной глазной пипетки. Объем рабочего разведения разбавителя (см 3 ), необходимый для суспендирования одного флакона вакцины определяют по формуле (число прививных доз во флаконе)/20.

Требуемый «объем суспендированной вакцины (см 3 ) рассчитывают по формуле: (численность поголовья)/20.

Пример. Окулярным способом необходимо вакцинировать 8720 голов птицы. Один флакон вакцины данной серии содержит 2000 окулярных доз. На основании этих условий определяют:

объем рабочего разведения разбавителя для суспендирования одного флакона вакцины, 2000/20=100(см 3 );
требуемый объем суспендированной вакцины, 8720/20=436(см 3 ).

Окулярную прививку проводят следующим образом: одну каплю суспензии наносят на конъюнктиву под нижнее веко глаза и ожидают ее равномерного распределения. В случае истечения из-под века большей части дозы допускается однократное повторение операции в другой глаз.

Вакцина в виде суспензии должна быть использована в течение 2 часов.

Оральный способ. До вакцинации, соответственно породе и возрасту птицы, определяют величину прививного объема — среднего объема жидкости (см 3 ) выпиваемого одной птицей в течение 30 мин. Вакцину применяют в виде суспензии, приготовленной на каком-либо из следующих разбавителей: пастеризованное обезжиренное молоко (10%); сухое обезжиренное молоко (1%); пептон (0,5%). Основой перечисленных разбавителей служит чистая кипяченая вода.

Оральная форма вакцины в прививном объеме должна содержать 4 окулярные дозы. Объем разбавителя (см 3 ), необходимый для суспендирования одного флакона вакцины рассчитывают по формуле: (число прививных доз во флаконе х прививной объем)/4 .Требуемый объем суспендированной вакцины (см 3 ) рассчитывают по формуле: численность поголовья х прививной объем.

Пример. Оральным способом необходимо вакцинировать 8720 голов птицы. Один флакон вакцины данной серии содержит 2000 окулярных доз. Прививной объем составил 6,7 см 3 . На основании этих условий определяют:

объем разбавителя для суспендирования одного флакона вакцины, 2000х6,7/4 = 3350 (см 3 );
требуемый объем суспендированной вакцины 8720х6,7=58424(см 3 ).

Вакцину выпаивают один раз в сутки. 11еред вакцинацией птицу мясных пород выдерживают без воды в течение 2-3 часов, птицу яичных пород — в течение 4-8 часов. Вакцину распределяют через поилки, которые должны быть промыты и не содержать на внутренней поверхности дезсредств. Продолжительность присутствия вакцины в системе поилок не более 2 час.

Вакцинации подлежит клинически здоровая птица в возрасте старше 15 сут. Птица в возрасте до 60 сут. вакцинируется дважды с интервалом 14 сут. Птица в возрасте старше 60 сут. возраста вакцинируется однократно.
Мясо и яйца вакцинированных птиц могут быть использованы без ограничений.

Формула изобретения

2. Штамм по п.1, характеризующийся тем, что он адаптирован к организму развивающихся эмбрионов кур, где способен накапливаться в ткани ХАО в среднем титре (6,3±0,18) Ig ЭИД 50 /см 3 .

3. Штамм по п.1, характеризующийся тем, что он является умеренно реактогенным и безвредным для птицы при интрадермальной инъекции в дозах до 3,7 IgИД 50 /0,004 см 3 .

4. Штамм по п.1, характеризующийся тем, что он является иммуногенным с иммунизирующей дозой 3 Ig ЭИД 50 /0,004 см 3 , обеспечивающей защиту 95% привитых птиц при контрольном заражении вирулентным вирусом оспы кур.

5. Штамм по п.4, характеризующийся тем, что он индуцирует поствакцинальный иммунитет (не менее 80% защищенности поголовья) продолжительностью 360 суток после прививки.

6. Штамм по п.1, характеризующийся тем, что он сохраняет аттенуированный фенотип при пассажах как в системе культивирования, так и на естественно восприимчивой птице.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии, в частности, к получению нового штамма вируса оспы кур, который пригоден для изготовления средств диагностики и специфической профилактики оспы птиц.

Оспа птиц - контагиозная, медленно распространяющаяся вирусная болезнь птиц, которая характеризуется образованием локализованных пролиферативно-некротических поражений на коже и дифтеритического воспаления слизистой оболочки ротовой полости, верхних дыхательных путей и конъюнктивы глаз [1, 2]. Болезнь распространена по всему миру, в том числе и в РФ, и наносит существенный экономический ущерб птицеводческим хозяйствам в связи со снижением яйценоскости, замедлением роста птиц, повышением смертности и вынужденным убоем [3, 4, 5, 6, 7, 8].

В соответствии с классификацией, установленной Международной комиссией по таксономии вирусов (International Committee on Taxonomy of Viruses - ICTV), вирус оспы птиц относится к роду Avipoxvirus, семейства Poxviridae.

Основным способом борьбы с этим заболеванием является специфическая профилактика. С этой целью применяют живые вакцины на основе аттенуированных штаммов вируса.

Недостатком штамма-прототипа также является необходимость использования для его культивирования клеточных культур [12, 13], что в свою очередь существенно усложняет технологический процесс изготовления на его основе вирус-вакцин.

В задачу создания настоящего изобретения входило получение нового штамма вируса оспы кур, обладающего аттенуированным фенотипом и высокой иммуногенной активностью, способного к культивированию на эмбрионах кур как на более технологически простой системе и обеспечивающего изготовление высокоиммуногенных и безвредных биопрепаратов для профилактики и диагностики оспы птиц.

Технический результат от использования предлагаемого изобретения заключается в расширении арсенала вакцинных штаммов вируса оспы кур, генетически аутентичных, безвредных, обладающих аттенуированным фенотипом и высокой иммуногенностью, способных к культивированию на эмбрионах кур как на более технологически простой системе, и пригодных для изготовления биопрепаратов специфической профилактики оспы птиц, тем самым, усиливая в данном аспекте биологическую безопасность государства.

Генетическая аутентичность штамма.

Условия проведения ПЦР. В пробирку емкостью 0,5 мл вносили следующие компоненты: деионизованная вода (9 мкл), растворы праймеров (по 1,0 мкл), дНТФ (0,5 мкл), 25 мМ р-р хлорида магния (3,5 мкл), 5х буфер для ПЦР (5,0 мкл), Taq ДНК-полимераза (1-2 ед.), ДНК (исследуемый образец, 5 мкл).

Смесь переносили в амплификатор и проводили ПЦР при следующих режимах: 95°С - 5 мин, 30 циклов с параметрами: 95°С - 20 с, 58°С - 30 с, 72°С - 120 с, финальный прогрев 72°С - 5 мин. Далее проводили электрофорез ПЦР-фрагментов в геле 2% агарозы с последующей очисткой для определения нуклеотидной последовательности. Секвенирование очищенной кДНК осуществляли на автоматическом секвенаторе ABI Prism 3100 (Applied Biosystems, США).

Культуральные свойства штамма.

Использовали развивающиеся эмбрионы кур международной категории SPF (Specific Pathogen Free). Эмбрионы заражали осветленной фильтрованием вируссодержащей суспензией ткани хориоаллантоисной оболочки (ХАО) в дозе 3 Ig ЭИД 50 /0,2 см 3 . Определяли параметры культивирования: возраст эмбрионов, способ заражения, место локализации вируса. Критерием оценки являлась величина инфекционного титра в экстраэмбриональной жидкости (ЭЭЖ), в суспензии ткани тела эмбриона и ткани ХАО. Результаты представлены в таблице 1.

Характеристика вирусного материала.

В таблице 2 приведена характеристика необходимой дисперсности тканевой взвеси, получаемой после осветления гомогената ткани вируссодержащих ХАО.

Сущность предлагаемого изобретения поясняется следующими графическими материалами:

Фиг.2 - Диаграмма значений долей защищенных птиц (с) соответственно испытанным прививным дозам вируса (IgD) через 21÷28 суток после вакцинации; пунктиром показан график зависимости исследуемых параметров, построенный по регрессионному уравнению вида "c=f["y=1,21(IgD)-0,25];

Фиг.3 - Диаграмма распределения долей защищенных птиц (с) в подопытных группах соответственно времени после вакцинации.

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его использования, которые не ограничивают объем изобретения.

В параллельных экспериментах определяли соотношение инфекционных титров вируса, установленных для 25-45-суточных цыплят методом интрадермальной прививки в перепонку крыла (Ig ИД 50 /см 3 ) и для СПФ-эмбрионов путем введения инфицирующей жидкости на ХАО (Ig ЭИД 50 /см 3 ). В экспериментах были использованы вируссодержащие материалы различной биологической активности. Соответствующие результаты приведены в таблице 3.

Безвредность вируса для птиц.

Проводили оценку воздействия различных доз вируса на физиологическое состояние птиц. Цыплятам в возрасте старше 25 суток инъецировали интрадермально вирусный материал в дозах 0÷3,7 Ig ИД 50 . Результаты клинических наблюдений представлены в таблице 4.

Иммунизирующая доза вируса, обеспечивающая защиту 95% привитых птиц (ИмД 95 ).

Для заданных прививных доз (D) определяли долю защищенных птиц в группе (с). Полученные величины с преобразовывали в табличные пробит-эквиваленты (y=f(c)) для построения линейной модели вида "y=y 0 +k(IgD), где "y - прогнозируемый пробит-эквивалент с для заданной величины IgD. На основании построенной модели определяли прогнозируемую величину прививной дозы, гарантирующую защиту 95% иммунизированных птиц. Далее по таблице производили обратное преобразование по типу "c=f("y). Полученные результаты в графическом виде представлены виде диаграммы (Фиг.2).

Динамика напряженности иммунитета у цыплят, вакцинированных штаммом.

Устойчивость аттенуированного фенотипа вируса при пассажах в системе культивирования.

Устойчивость аттенуированного фенотипа штамма при пассажах на птице.

Препарат применяли однократно методом внутрикожной инъекции в перепонку крыла с помощью двухигольного инъектора в соответствии с прилагаемой инструкцией. На протяжении 21 суток после прививки за птицей вели клиническое наблюдение.

Препарат оценивали по следующим показателям:

1. Оценка эффективности вакцинации. Показателем результативности прививки (приживления вируса) являлась воспалительная реакция на месте инъекции. Определяли представительство (процент) птицы с поствакцинальной реакцией. Соответствующие результаты представлены в таблице 8. Критерием эффективности вакцинации (наличие поствакцинального иммунитета) считали отсутствие местной воспалительной реакции у птиц после вторичной прививки препарата, проведенной в противоположное крыло через 21-67 суток после первой вакцинации. С этой целью в каждом цехе выделяли группу вакцинированных птиц в количестве 40-70 голов, которым производили повторную прививку и в течение 10 суток вели клиническое наблюдение. Определяли процент иммунных птиц. Полученные результаты по оценке эффективности вакцинации представлены в таблице 8.

В вакцинированном поголовье иммунная птица составила 100%. Эмбрион-вакцина является иммуногенной.

2. Оценка сохранности и продуктивности птицепоголовья. Сопоставили показатели продуктивности птиц и сохранности (яйценоскость и среднесуточный падеж за 7 суток) до и после проведения вакцинации. Полученные результаты представлены в таблице 9.

Данные, представленные в таблице 9, демонстрируют, что применение эмбрион-вакцины не оказывает выраженного влияния на показатели сохранности и продуктивности иммунизированного птицепоголовья.

Читайте также: