Генная инженерия и герпес

Обновлено: 18.04.2024

Трансфекция клеток

Методы генной терапии

Существует два основных подхода, различающиеся природой клеток-мишеней: 1. Фетальная, при которой чужеродную ДНК вводят в зиготу (оплодотворённую яйцеклетку) или эмбрион на ранней стадии развития; при этом ожидается, что введённый материал попадёт во все клетки реципиента (и даже в половые клетки, обеспечив тем самым передачу следующему поколению). В нашей стране она фактически запрещена ; 2. Соматическая, при которой генетический материал вводят уже родившемуся в неполовые клетки и он не передаётся половым клеткам. Генная терапия in vivo основана на прямом введении клонированных (размноженных) и определенным образом упакованных последовательностей ДНК в определённые ткани больного. Особенно перспективным для лечения генных болезней in vivo представляется введение генов с помощью аэрозольных или инъецируемых вакцин. Аэрозольная генотерапия разрабатывается, как правило, для лечения лёгочных заболеваний (муковисцидоз, рак лёгких). Разработке программы генной терапии предшествует много этапов. Это и тщательный анализ тканеспецифической экспрессии соответствующего гена (т. е., синтеза на матрице гена какого-то белка в определённой ткани), и идентификация первичного биохимического дефекта, и исследование структуры, функции и внутриклеточного распределения его белкового продукта, а также биохимический анализ патологического процесса. Все эти данные учитываются при составлении соответствующего медицинского протокола.

Прямая доставка и клеточные носители терапевтических генов

Судьба гена после его попадания в клетку

Заключение

Обзор данных позволяет прийти к заключению, что, несмотря на усилия многих лабораторий мира, все уже известные и испытанные in vivoи in vitro векторные системы далеки от совершенства . Если проблема доставки чужеродной ДНК in vitro практически решена, а ее доставка в клетки-мишени разных тканей in vivo успешно решается (главным образом путем создания конструкций, несущих рецепторные белки, в том числе и антигены, специфичные для тех или иных тканей), то другие характеристики существующих векторных систем – стабильность интеграции, регулируемая экспрессия, безопасность – все еще нуждаются в серьезных доработках. Прежде всего, это касается стабильности интеграции. До настоящего времени интеграция в геном достигалась только при использовании ретровирусных либо аденоассоциированных векторов. Повысить эффективность стабильной интеграции можно путем совершенствования генных конструкций типа рецептор-опосредованных систем либо путем создания достаточно стабильных эписомных векторов (то есть ДНК-структур, способных к длительному пребыванию внутри ядер). В последнее время особое внимание уделяется созданию векторов на базе искусственных хромосом млекопитающих. Благодаря наличию основных структурных элементов обычных хромосом такие мини-хромосомы длительно удерживаются в клетках и способны нести полноразмерные (геномные) гены и их естественные регуляторные элементы, которые необходимы для правильной работы гена, в нужной ткани и в должное время. Генная и клеточная терапия открывает блестящие перспективы для восстановления утраченных клеток и тканей и генно-инженерного конструирования органов, что, несомненно, существенно расширит арсенал методов для медико-биологических исследований и создаст новые возможности для сохранения и продления жизни человека .

Обзор

иллюстрация автора статьи

Автор

Редакторы

Смертельные клешни

Человечество столкнулось с этой загадочной болезнью еще до нашей эры. Ее пытались понять и лечить ученые мужи в самых различных уголках мира: в Древнем Египте — Еберс, в Индии — Сушрута, Греции — Гиппократ. Все они и многие другие медики вели борьбу с опасным и серьезным противником — раком. И хоть эта битва продолжается до сих пор, сложно определить, есть ли шансы на полную и окончательную победу. Ведь чем больше мы изучаем болезнь, тем чаще возникают вопросы — можно ли полностью излечить рак? Как избежать болезни? Можно ли сделать лечение быстрым, доступным и недорогим?

Мутации: погибнуть или жить вечно?

Рисунок 1. Генетическая модель рака: рак толстой кишки. Первый шаг — потеря или инактивация двух аллелей гена АРS на пятой хромосоме. В случае семейного рака (familiar adenomatous polyposis, FAP) одна мутация гена АРС наследуется. Потеря обоих аллелей ведет к образованию доброкачественных аденом. Последующие мутации генов на 12, 17, 18 хромосомах доброкачественной аденомы могут привести к трансформации в злокачественную опухоль.

Очевидно, что развитие определенных видов рака включают в себя изменение большинства или даже всех этих генов и может проходить различными путями. Из этого следует, что каждую опухоль следует рассматривать как биологически уникальный объект. На сегодняшний день существуют специальные генетические информационные базы по раку, содержащих данные о 1,2 млн. мутаций из 8207 образцов тканей, относящихся к 20 видам опухолей: атлас Ракового Генома (Cancer Genome Atlas) и каталог соматических мутаций при раке (Catalogue of Somatic Mutations in Cancer, COSMIC) [2].

Рисунок 2. Распространение метастазов

Однако клетки вооружены специальными механизмами, защищающими от развития опухолей:

программируемая клеточная смерть — апоптоз и связанные регуляторные гены имеют огромное влияние на возникновение злокачественного фенотипа. Некоторые онкогенные мутации нарушают апоптоз, что приводит к инициации канцерогенеза и метастазирования [6];
иммунная система — активация естественных киллеров (NK — natural killer cells), макрофагов, нейтрофилов, эозинофилов и специфических Т-цитотоксических клеток; синтез цитокинов и специфических антител [7].

Традиционные методы и их недостатки

хирургическая (полное удаление опухоли). Используется, когда опухоль имеет небольшие размеры и хорошо локализована. Также удаляют часть тканей, которые контактируют со злокачественным новообразованием. Метод не применяется при наличии метастазов;
лучевая — облучение опухоли радиоактивными частицами для остановки и предотвращения деления раковых клеток. Здоровые клетки тоже чувствительны к этому излучению и часто погибают;
химиотерапия — используются лекарства, тормозящие рост быстро делящихся клеток. Лекарства оказывают негативное воздействие и на нормальные клетки.

Вышеописанные подходы не всегда могут избавить больного от рака. Часто при хирургическом лечении остаются единичные раковые клетки, и опухоль может дать рецидив, а при химиотерапии и лучевой терапии возникают побочные эффекты (снижение иммунитета, анемия, выпадение волос и др.), которые приводят к серьезным последствиям, а часто и к смерти пациента. Тем не менее, с каждым годом улучшаются традиционные и появляются новые методы лечения, которые могут победить рак, такие как биологическая терапия, гормональная терапия, использование стволовых клеток, трансплантация костного мозга, а также различные поддерживающие терапии. Наиболее перспективной считается генная терапия, так как она направлена на первопричину рака — компенсацию неправильной работы определенных генов.

Генная терапия как перспектива

По данным PubMed, интерес к генной терапии (ГТ) раковых заболеваний стремительно растет, и на сегодняшний день ГТ объединяет ряд методик, которые оперируют с раковыми клетками и в организме (in vivo) и вне его (ex vivo) (рис. 3).

Рисунок 3. Две основные стратегии генной терапии. ex vivo — генетический материал с помощью векторов переносится в клетки, выращиваемые в культуре (трансдукция), а затем трансгенные клетки вводят реципиенту; in vivo — введение вектора с нужным геном в определенную ткань или орган.

Вирусные векторы

В качестве вирусных векторов используют ретровирусы, аденовирусы, аденоассоциированные вирусы, лентивирусы, вирусы герпеса и другие. Эти вирусы отличаются по эффективности трансдукции, по взаимодействию с клетками (распознавание и заражение) и ДНК. Главным критерием является безопасность и отсутствие риска неконтролируемого распространения вирусной ДНК: если гены вставляются в неправильном месте генома человека, они могут создать вредные мутации и инициировать развитие опухоли. Также важно учитывать уровень экспрессии перенесенных генов, чтобы предотвратить воспалительные или иммунные реакции организма при гиперсинтезе целевых белков (табл. 1).

Таблица 1. Вирусные векторы. Источник: [10].

Вектор	Краткое описание
Вирус кори (measles virus)	содержит отрицательную последовательность РНК, которая не вызывает защитного ответа в раковых клетках
Вирус простого герпеса (HSV-1)	может переносить длинные последовательности трансгенов
Лентивирус	производный от ВИЧ, может интегрировать гены в неделящиеся клетки
Ретровирус (RCR)	не способный к самостоятельной репликации, обеспечивает эффективное встраивание чужеродной ДНК в геном и постоянство генетических изменений
Обезьяний пенистый вирус (SFV)	новый РНК-вектор, который передает трансген в опухоль и стимулирует его экспрессию
Рекомбинантный аденовирус (rAdv)	обеспечивает эффективную трансфекцию, но возможна сильная иммунная реакция
Рекомбинантный аденоассоциированный вирус (rAAV)	способен к трансфекции многих типов клеток

Невирусные векторы

Синтетические катионные липосомы в настоящее время признаны перспективным способом доставки функциональных генов. Положительный заряд на поверхности частиц обеспечивает слияние с отрицательно заряженными клеточными мембранами. Катионные липосомы нейтрализуют отрицательный заряд цепи ДНК, делают более компактной ее пространственную структуру и способствуют эффективной конденсации. Плазмидно-липосомный комплекс имеет ряд важных достоинств: могут вмещать генетические конструкции практически неограниченных размеров, отсутствует риск репликации или рекомбинации, практически не вызывает иммунного ответа в организме хозяина. Недостаток этой системы состоит в низкой продолжительности терапевтического эффекта, а при повторном введении могут появляться побочные эффекты [12].

Электропорация является популярным методом невирусной доставки ДНК, довольно простым и не вызывающим иммунного ответа. С помощью индуцированных электрических импульсов на поверхности клеток образуются поры, и плазмидные ДНК легко проникают во внутриклеточное пространство [13]. Генная терапия іn vivo с использованием электропорации доказала свою эффективность в ряде экспериментов на мышиных опухолях. При этом можно переносить любые гены, например, гены цитокинов (IL-12) и цитотоксические гены (TRAIL), что способствует развитию широкого спектра терапевтических стратегий. Кроме того, этот подход может быть эффективным для лечения и метастатических, и первичных опухолей [14].

Выбор техники

В зависимости от типа опухоли и ее прогрессии, для пациента подбирается наиболее эффективная методика лечения. На сегодняшний день разработаны новые перспективные техники генной терапии против рака, среди которых онколитическая вирусная ГТ, пролекарственная ГТ (prodrug therapy), иммунотерапия, ГТ с использованием стволовых клеток.

Онколитическая вирусная генная терапия

Для этой методики используются вирусы, которые с помощью специальных генетических манипуляций становятся онколитическими — перестают размножаться в здоровых клетках и воздействуют только на опухолевые. Хорошим примером такой терапии является ONYX-015 — модифицированный аденовирус, который не экспрессирует белок Е1В. При отсутствии этого белка вирус не может реплицироваться в клетках с нормальным геном p53 [15]. Два вектора, сконструированных на базе вируса простого герпеса (HSV-1) — G207 и NV1020 — также несут в себе мутации нескольких генов, чтобы реплицироваться только в раковых клетках [16]. Большим преимуществом техники является то, что при проведении внутривенных инъекций онколитические вирусы разносятся с кровью по всему организму и могут бороться с метастазами. Основные проблемы, которые возникают при работе с вирусами — это возможный риск возникновения иммунного ответа в организме реципиента, а также неконтролируемое встраивание генетических конструкций в геном здоровых клеток, и, как следствие, возникновение раковой опухоли.

Геноопосредованная ферментативная пролекарственная терапия

Минус терапии состоит в том, что в опухолях присутствуют все защитные механизмы, свойственные здоровым клеткам, и они постепенно адаптируются к повреждающим факторам и пролекарству. Процессу адаптации способствует экспрессия цитокинов (аутокринная регуляция), факторов регуляции клеточного цикла (отбор самых стойких раковых клонов), MDR-гена (отвечает за восприимчивость к некоторым медикаментам).

Иммунотерапия

Благодаря генной терапии, в последнее время начала активно развиваться иммунотерапия — новый подход для лечения рака с помощью противоопухолевых вакцин. Основная стратегия метода — активная иммунизация организма против раковых антигенов (ТАА) с помощью технологии переноса генов [18].

Главным отличием рекомбинантных вакцин от других препаратов является то, что они помогают иммунной системе пациента распознавать раковые клетки и уничтожать их. На первом этапе раковые клетки получают из организма реципиента (аутологичные клетки) или из специальных клеточных линий (аллогенные клетки), а затем выращивают их в пробирке. Для того чтобы эти клетки могли узнаваться иммунной системой, вводят один или несколько генов, которые производят иммуностимулирующие молекулы (цитокины) или белки с повышенным количеством антигенов. После этих модификаций клетки продолжают культивировать, затем проводят лизис и получают готовую вакцину.

Когда было доказано, что большинство видов рака имеют специфические антигены и способны индуцировать свои защитные механизмы [22], была выдвинута гипотеза, что блокировка иммунной системы раковых клеток облегчит отторжение опухоли. Поэтому для производства большинства противоопухолевых вакцин в качестве источника антигенов используют опухолевые клетки пациента или специальные аллогенные клетки. Основные проблемы иммунотерапии опухолей — вероятность возникновения аутоиммунных реакций в организме больного, отсутствие противоопухолевого ответа, иммуностимуляция роста опухоли и другие.

Стволовые клетки

Заключение

Если подвести итоги, можно с уверенностью говорить, что наступает эпоха персонализированной медицины, когда для лечения каждого онкобольного будет подбираться определенная эффективная терапия. Уже разрабатываются индивидуальные программы лечения, которые обеспечивают своевременный и правильный уход и приводят к значительному улучшению состояния пациентов. Эволюционные подходы для персонализированной онкологии, такие как геномный анализ, производство таргетных препаратов, генная терапия рака и молекулярная диагностика с использованием биомаркеров уже приносят свои плоды [17].

Сециалисты Вюрцбургского университета имени Юлиуса и Максимилиана в Баварии в содружестве с британскими коллегами расшифровали геном вируса простого герпеса. Результаты опубликованы в журнале Nature Communications.

Вирус простого герпеса типа 1 (ВПГ-1) считается одним из самых распространенных среди людей вирусом. Он диагностируется практически у каждого взрослого: до 95 процентов населения планеты инфицированы им.

При попадании в организм человека вирус простого герпеса обретает там постоянную прописку. При этом может никак не проявляться, пока иммунитет человека не ослабнет в результате сильного стресса, переутомления или простудных заболеваний.

Тогда человек обнаружит, например, высыпания на губах или на коже в нижней части лица, что достаточно легко лечится. Однако бывают и более тяжелые формы проявления герпеса, он может давать серьезные осложнения на головной мозг, печень или легкие, в виде герпетического энцефалита, гепатита или пневмонии.

Ранее считалось, что геном вируса достаточно простой, состоящий из последовательностей нуклеотидов в ДНК, которые называют открытыми рамками считывания, поскольку они способны кодировать белок.

На этот раз исследователи разработали специальную программу визуализации, способную показывать результаты на любом уровне - от полного генома до разрешения одного нуклеотида. используя в своей работе широкий спектр новейших подходов системной биологии, включая методы количественной протеомики и обратной генетики для целых клеток.

И выяснили, что этих рамок считывания гораздо больше, и их число достигает 284, а не 68. Увеличение этого числа связано с тем, что ученым удалось идентифицировать сотни новых вирусных транскриптов - молекул РНК, образующихся в результате транскрипции - экспрессии соответствующего гена или участка ДНК.

Генетики пояснили, что кодирующая способность трех других герпесвирусов, а именно цитомегаловируса человека (HCMV), саркома-ассоциированного герпеса Капоши (KSHV) и вируса Эпштейна-Барр (EBV), значительно больше, чем считалось ранее. Для первых двух, в частности, были идентифицированы сотни вирусных генных продуктов. Обнаружено также, что эти вирусы кодируют сотни коротких рамок считывания неизвестной функции. Подобно своим клеточным аналогам, они могут либо регулировать трансляцию вирусных генных продуктов, либо кодировать функциональные вирусные полипептиды.

Таким образом специалистам удалось получить более точную картину генома вируса герпеса.

Работа очень важна для разработки на основе вируса простого герпеса специальных онколитических вирусов. Ведь уже доказан эффект лечения ряда онкологических заболеваний, таких как злокачественная меланома, с помощью вируса, и существует целое направление при лечении рака - виротерапия. Особые генно-модифицированные вирусы способны проникать в раковые клетки, ослаблять их или заставлять самоуничтожиться. При этом вирусы не трогают здоровые клетки, так как не способны делиться внутри них.

Нобелевскую премию по химии - 2020 получили Эммануэль Шарпантье и Дженнифер Дудна за развитие метода "молекулярных ножниц" CRISPR / Cas9. Этот метод был заявлен меньше десяти лет назад, но уже стал самым популярным механизмом генетического редактирования. С помощью молекулярных ножниц сейчас создают ГМО и лечат редкие заболевания. CRISPR / Cas9 даже засветился в громком научном скандале, когда китайский учёный Хэ Цзянькуй отредактировал геном двух девочек, чтобы они стали невосприимчивы к ВИЧ. Мы попросили молодых российских исследователей, взявшихся за молекулярные ножницы, рассказать о своей работе.

"Мы создаём мутантов"

Нариман Баттулин, заведующий лабораторией генетики развития. Институт цитологии и генетики Сибирского отделения РАН

Как вы решили стать учёным?

Честнее будет сказать, что я не решил, а обнаружил себя учёным. В какой-то момент пришло осознание "ого, я стал учёным". Но помню, что в детстве я очень любил природу. Мне было интересно, как устроено живое: вот если рыбу потрошили, было интересно посмотреть, как у неё органы расположены. В какой-то момент была идея стать медиком, но потом понял, что резать по живому - не моё. Так и оказался в биологии.

Какими исследованиями занимается ваша лаборатория?

Мы смотрим, как уложена ДНК. ДНК - очень длинная молекула, чуть ли не два метра. Чтобы уместить длиннющую ДНК в крохотном ядре, приходится её особым образом укладывать: сворачивать в спирали, скатывать в клубки-глобулы, в узлы завязывать. Мы в лаборатории изучаем, как эта укладка может влиять на экспрессию генов. Что, если мы сломаем укладку? С помощью CRISPR / Cas9 мы вырезаем кусочек ДНК, ответственный за образование структур-клубочков, и смотрим, меняется ли экспрессия генов. Но пока ничего не меняется, по крайней мере в экспериментах нашей лаборатории. Может, мы немножко переоценили влияние трёхмерной структуры на экспрессию генов. А может, мышки с поломанной структурой ДНК только в лаборатории хорошо живут - в природе же всё будет плохо.

Ещё мы создаём мутантов - тоже с помощью CRISPR/Cas9. Создали, например, трансгенную мышь, которая выделяла в молоко кроветворный белок человека. Даже собрали специальный доильный аппарат и выяснили, что удой от одной лабораторной мыши - 200 микролитров молока.

В обычном стакане 200 миллилитров, а 200 микролитров - это примерно на стакан меньше.

Сейчас работаем над созданием мышиной модели для изучения коронавируса. Мышам повезло: они невосприимчивы к SARS-Cov-2, потому что рецептор ACE2, через который вирус попадает в клетку, у них другой. А мы с помощью CRISPR / Cas9 сделали так, чтобы рецептор у мышей стал похож на человеческий и мыши стали восприимчивы к вирусу. Надеюсь, получится удобная и полезная модель для вирусологов - на трансгенных мышках можно будет испытывать вакцины и лекарства.

Почему для работы вы выбрали метод молекулярных ножниц?

Любая модификация генома связана с разрезанием ДНК. Необходим соответствующий инструмент. С 1970-х годов для этого используют ферменты рестриктазы. Но в больших геномах типа человеческого их очень сложно нацелить в определённое место, а значит, рестриктазы просто искрошат весь геном. Учёным нужен был механизм, который не просто разрезает ДНК, но и делает этот разрез в конкретном месте. Прежние системы были очень громоздкие, сложные и дорогие. CRISPR/Cas9 обходится почти в 10 раз дешевле.

Но и у этой системы есть недостатки. Иногда, например, может разрезать не там, где надо. А иногда - неправильно залатать брешь в ДНК. Второе гораздо опаснее, потому что довольно сложно обнаружить. У нас в лаборатории был такой случай: мы внесли в мышиный геном маленькое, точечное изменение. Но оказалось, что молекулярные ножницы заодно убрали и соседний ген. Поняли мы это только потому, что у мышек-мутантов на животе появилось белое пятно. Мы решили разобраться, откуда такая странная окраска, - и обнаружили пропажу большого куска ДНК.

Когда технология CRISPR/Cas9 окончательно созреет, в каком проекте вы бы хотели её применить?

Я большой фанат генной инженерии, и мне кажется, что даже с помощью "недозревшей" технологии учёные делают невероятные вещи. Например, есть такой способ лечения трофических язв (эти язвы появляются у больных диабетом и очень долго заживают. - КШ): на рану выпускают личинок зелёной мясной мухи. Звучит, может, не очень приятно, но эти личинки, как микрохирурги, сгрызают отмершие ткани и клетки, а живые, наоборот, не трогают. Генные инженеры усовершенствовали эти личинки, наделив их способностью выделять со слюной особый фактор, способствующий заживлению ран. И теперь трансгенные личинки не только чистят язву, но и лечат её.

Ваша любимая научная шутка?

Я преподаю генетику в университете. Поэтому одна из моих любимых шуток - картинка, мем на больную для студентов тему "когда решил в последнюю ночь подготовиться к экзамену по генетике". На огромной крыше, засыпанной снегом, стоит человек с лопатой. Он расчистил крохотный уголок, подписанный "первый закон Менделя".

Законы Менделя - принципы передачи наследственных признаков от родителей к потомкам, основа основ классической генетики.

Ну а нерасчищенные 99,9% крыши под толстым слоем снега - это вся остальная генетика.

Как работают молекулярные ножницы

CRISPR / Cas - что-то вроде иммунной системы бактерий. В ДНК бактерий есть участок, CRISPR-кассета, в котором хранятся кусочки генов вирусов, которые когда-то проникали в клетку или в её предков. Бактерия регулярно пролистывает эту картотеку вирусов-преступников, считывает с неё информацию (синтезирует РНК) и затем разрезает её на отдельные генные портреты вирусов - целевые РНК. А белки Cas потом сравнивают эти портреты с проникшими в клетку молекулами и, если находят ту, что соответствует целевой РНК, то беспощадно разрезают её ДНК. Однажды учёные подумали: а почему бы не использовать CRISPR/Cas для редактирования геномов? Ведь можно собрать кусочек ДНК с геном "ножниц" Cas9 и инструкцию, какой ген или гены резать, - CRISPR-кассету. И правда, когда такую ДНК-конструкцию запускают в клетки, синтезируется комплекс CRISPR/Cas9, который начинает резать геном там, где ему повелели учёные.

От зубастого цыплёнка к воскрешению динозавров

Дмитрий Карпов, старший научный сотрудник лаборатории регуляции внутриклеточного протеолиза. Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН

Как вы решили стать учёным?

Летом между 6-м и 7-м классом, пока одноклассники отдыхали, я готовился к первой в своей жизни школьной олимпиаде по биологии. Учитель разрешал пользоваться всем, что можно было найти в биологическом классе: плакатами, муляжами, коллекциями насекомых. Был в классе и микроскоп. Когда я устал рассматривать готовые препараты для микроскопа, в голову пришла необычная мысль. Я приготовил препарат на основе воды из-под цветочного горшка. В этой капле я с изумлением обнаружил микроскопическую живность! Этот день полностью перевернул моё представление о мире, и именно тогда мне захотелось изучать клеточную биологию.

Какими исследованиями занимается ваша лаборатория?

Мы изучаем внутриклеточные механизмы разрушения белков. Они нужны, чтобы клетка могла избавиться от повреждённых или мутировавших белков. Если эти механизмы сломаются, могут начатьcя проблемы: развиваются, например, нейродегенеративные заболевания вроде болезни Альцгеймера, появляются злокачественные образования.

А ещё мы занимаемся разработкой новых редакторов генома. Сердце большинства таких технологий - белок Cas9. Именно его свойства определяют безопасность и эффективность геномного редактирования. Но, к сожалению, у природного белка Cas9 есть ряд недостатков: невысокая скорость работы, большой размер и относительно низкая точность. Генетики научились её повышать, но в этом случае белки становятся менее активны. Наша цель - редакторы нового поколения, имеющие и высокую активность, и высокую точность. Кое-что нам уже удалось: мы получили несколько вариантов Cas9, чья активность сопоставима с природным белком на некоторых участках генома. Но так как на других участках активность наших вариантов Cas9 всё ещё ослаблена, мы продолжаем работу.

Почему для работы вы выбрали метод молекулярных ножниц?

Эта технология удобна по сравнению с предшествующими. Необходимо определиться только с последовательностью направляющей РНК, которая нацеливает редактор в нужное место генома. Кроме того, метод позволяет работать одновременно с несколькими мишенями: можно легко удалить часть гена, ген целиком или несколько генов.

Когда технология CRISPR/Cas9 окончательно созреет, в каком проекте вы бы хотели её применить?

У меня есть детская мечта по мотивам фильмов "Парк юрского периода" - попробовать возродить динозавров. Это кажется фантастикой, но есть научные данные, что курица до сих пор хранит гены древних предков - динозавров. Эти гены вполне работоспособны, и их можно активировать. Так, например, был получен зубастый цыплёнок.

Ни у одной из современных птиц, кроме этого трансгенного цыплёнка, зубов нет.

Ваша любимая научная шутка?

Одна голова - хорошо, а две - мутант.

2012 - год, когда Дженнифер Дудна и Эммануэль Шарпантье предложили использовать для редактирования генов механизм CRISPR / Cas9.

Как починить генетическую поломку

Татьяна Егорова, научный сотрудник лаборатории моделирования и терапии наследственных заболеваний. Институт биологии гена РАН

Как вы решили стать учёным?

Парадоксально, но учёным я стала практически тогда же, когда ушла из науки. Не окончив аспирантуру в Институте биоорганической химии, я устроилась работать в частную компанию "Марлин Биотех". Эту компанию основали родители ребёнка с миодистрофией Дюшенна - генетическим заболеванием, вызывающим поначалу слабость мышц, затем поражение сердца и смерть к 20-30 годам. Именно работая в этой компании, я заинтересовалась генной терапией. Мы сотрудничали с Институтом биологии гена, и в конце 2018 года это сотрудничество привело к образованию новой лаборатории, в которую я с радостью пошла. Удачное получилось возвращение в науку - на этот раз я занимаюсь темой, которая мне интересна и близка.

Какими исследованиями занимается ваша лаборатория?

Мы изучаем миодистрофию Дюшенна. Это заболевание развивается из-за мутаций в гене одного из белков мышечных волокон - дистрофина. Генетическая поломка приводит к тому, что мышцы перестают нормально работать. Первое, что мы сделали, - создали модель заболевания на мышах. То есть с помощью CRISPR / Cas9 внесли мышкам ту же мутацию, что была обнаружена у пациента. Встал вопрос: а как это лечить? Какой механизм выбрать? Сейчас болезнь является неизлечимой, а существующие методы вроде приёма кортикостероидов лишь ненадолго задерживают её развитие. Если же отредактировать ген дистрофина и вырезать ещё небольшой участок с помощью CRISPR / Cas9, то синтез белка восстанавливается и заболевание не развивается. Мы в лаборатории проверили более 10 комбинаций редакторов комплекса CRISPR/Cas9, выбрали наиболее эффективную пару и протестировали её на мышиной модели. Введение нашего препарата приводило к образованию функционального белка дистрофина. Эту генную терапию можно было бы применить на человеке - и мы бы справились с заболеванием, которое считается неизлечимым.

Почему для работы вы выбрали метод молекулярных ножниц?

Технология довольна простая: любой молекулярный биолог может собрать вектор - конструкцию, которая донесёт гены комплекса CRISPR / Cas9 в клетку. Наверное, сыграла роль и популярность метода.

Когда технология CRISPR / Cas9 окончательно созреет, в каком проекте вы бы хотели её применить?

Сейчас мы не можем провести генное редактирование на человеке in vivo, то есть ввести препарат живому человеку. Разрешены только эксперименты ex vivo - вне живого. Можно взять у человека клетки, отредактировать их и пересадить обратно. Так, например, уже лечат рак, анемию, синдром Хантера. Миодистрофию Дюшенна тоже можно лечить ex vivo - редактировать геном предшественников мышечных клеток и вводить их обратно пациенту. Но когда технология докажет свою безопасность, было бы здорово менять гены не порциями по клеткам, а во всём организме. Ведь нарушения происходят во всех мышцах тела - не только в тех, с помощью которых мы бегаем и прыгаем, но и в сердце, в диафрагме.

Ваша любимая научная шутка?

Когда ставишь эксперимент, то ожидаешь увидеть один результат или другой. А получаешь нередко третий. Поэтому со студенческих времён одна из моих любимых шуток - это "Вывод эксперимента: эксперимент надо повторить".

Читайте также: