Ифа тесты для вирусных инфекций

Обновлено: 19.04.2024

Иммуноферментный анализ (ИФА) — способ обнаружения в крови специфических иммуноглобулинов (антител). Характеризуется достоверностью и чувствительностью. С помощью ИФА врачи одновременно определяют качественное и количественное содержание иммуноглобулинов в кровотоке. В медицинской практике такое исследование назначают для диагностики различных заболеваний, вызываемых бактериальными клетками, вирусами, грибками, простейшими микроорганизмами и паразитами. С помощью ИФА также возможно обнаружение иммунопатологических состояний.

Что такое иммуноферментный анализ (ИФА)?

Иммуноферментный анализ (ИФА) — способ лабораторной диагностики инфекционных и аутоиммунных патологий, предполагающий выявление разнообразных химических соединений (патогенов) с помощью реакции антиген-антитело. При проникновении в организм бактериальных клеток или иных вредных агентов из внешней среды развиваются иммунные процессы, направленные на их связывание и удаление. Выделяются иммуноглобулины, способные соединяться с определенным патогеном. Иммунитет для борьбы с инфекцией использует клеточные и гуморальные механизмы. К гуморальным факторам помимо антител относят разнообразные медиаторы.

ИФА проводится с использованием иммунного и ферментативного компонентов. Изначально иммунитет с помощью иммуноглобулинов связывает чужеродные агенты, представленные отдельными молекулами, клеточными элементами или целым организмом. Иммунный компонент направлен на их обнаружение. Ферментативная реакция дает возможность отобразить и оценить результат действия первого компонента. ИФА — непрямой способ исследования, поскольку результаты выявляют специфические иммуноглобулины к патогену, а не самого возбудителя инфекционного процесса.

Иммуноферментный анализ желательно проводиться вместе с ПЦР-тестом для получения достоверных клинических данных. Значимость ИФА в современной медицинской практике сложно переоценить: его используют для уточнения степени прогрессирования болезни, оценки эффективности лечебных мероприятий и скрининга определенных патологических состояний.

Эффективность и достоверность

Иммуноферментное исследование крови используется повсеместно в разных областях медицины, поскольку процедура отличается следующими преимуществами:

высокий показатель чувствительности, благодаря которому выявить инфекционного агента можно даже тогда, когда его уровень в кровотоке очень низкий;
диагностика патологического состояния до его симптоматических проявлений (эффективный способ скрининга);
с помощью современного оборудования ИФА проводится быстро, и врачи могут назначать лечение сразу после получения результатов;
по результатам можно понять, как давно человек заразился;
ИФА определяет, какой у человека инфекционный процесс: хронический или острый;
эффективная идентификация различных патогенов, которых сложно обнаружить с помощью иных способов диагностики.

По этой причине обследование больных при наличии симптомов инфекции или скрининг в современных реалиях редко обходится без подобной процедуры.

Показания к проведению ИФА

Иммуноферментный анализ дает возможность обнаружить антигены любого типа. Можно выявить собственные антигены организма, к которым иммунная система выделяет антитела для связывания. Наиболее распространенный повод для выполнения ИФА — подозрение на латентное протекание инфекционного процесса.

диагностика разнообразных форм инфекций: вирусного воспаления печеночной ткани, паразитарного заболевания, герпетической инфекции, венерической болезни, сальмонеллеза, вируса Эпштейн-Барра;
оценка уровня гормональных веществ для обследования эндокринной системы;
обнаружение онкологических маркеров и их мониторинг;
выявление иммунопатологических состояний: системной красной волчанки, синдрома Шегрена и других.

Подобный метод лабораторной диагностики дает возможность выявить специфические иммуноглобулины к вирусу после вакцинации. При этом анализ непосредственно не влияет на антигенные структуры. Суть обследования заключается только в оценке реакции иммунитета на наличие такой структуры.

Подготовка к исследованию

Для снижения вероятности получения ложноположительного или ложноотрицательного результата больному следует соблюдать определенные правила. Примерно за десять суток до проведения процедуры нужно следовать следующим врачебным рекомендациям:

отказаться от применения антибактериальных, антигистаминных и противовирусных медикаментов (согласованно с врачом);
воздержаться от употребления продуктов, провоцирующих развитие аллергических реакций: шоколада, орехов, цитрусовых фруктов и других;
не употреблять жирную, острую и жареную пищу;
отказаться от алкогольных напитков и продуктов, содержащих большое количество сахара;
избегать физического и психоэмоционального стресса.

За день до проведения процедуры нужно отказаться от табакокурения.

Как проводится иммуноферментный анализ?

Способ выполнения ИФА определяется по рекомендациям врача, выбравшего этот метод диагностики. В большинстве случаев в качестве материала получают кровь из вены натощак. Это обычная процедура, не отличающаяся от забора крови для проведения ее клинического или биохимического анализа. Медицинский работник использует жгут, протирает место прокола спиртом и вводит иглу в вену для получения 10 миллилитров жидкости. Полученный материал направляют в лабораторию, где используется специальное оборудование с реагентами для определения результатов.

Реже в качестве материала для выполнения исследования используют ликвор, околоплодные воды, слизь из мочеиспускательного канала или иную биологическую жидкость. В этом случае этапы проведения процедуры отличаются.

Расшифровка результатов ИФА

Специалисты обнаруживают разные типа иммуноглобулинов. При остром течении инфекции спустя несколько дней после заражения в крови появляются антитела IgM. Если речь идет о хроническом инфекционном процессе или о наличии стойкого иммунного ответа, когда с момента инфицирования прошло больше 3 недель, врачи обращают внимание на IgG. Переходная стадия выявляется по иммуноглобулинам IgA. В большинстве случаев у пациента выявляют различные сочетания этих антител, указывающие на особенности протекания болезни.

Достоверность анализа

Иммуноферментное исследование — одно из самых точных в лабораторной диагностике. Показатель чувствительности достигает 90%. Процедура направлена на обнаружение даже небольшого количества иммунных комплексов, выделенных в результате присутствия антигенов в органах и тканях. Ложные положительные или отрицательные результаты встречаются редко. ИФА хорошо дополняет другие обследования и заменяет различные тесты, не позволяющие идентифицировать возбудителя инфекции.

Иммуноферментный анализ (ИФА) — это метод выявления в крови специфических антител, представляющих собой молекулы иммуноглобулинов. Он отличается высокой точностью и чувствительностью, позволяет определить не только качественный, но и количественный состав антигенов и антител в организме. В медицине иммуноферментный анализ применяется для выявления болезней, которые провоцируют микроорганизмы различных классов — от вирусов до паразитов, а также для диагностики аутоиммунных заболеваний.

Особенности анализа ИФА

Иммуноферментный анализ состоит из двух компонентов — иммунной и ферментативной реакции. Иммунная реакция связывает биологические молекулы, элементы клетки или микроорганизма, которые пытаются выявить. Ферментативная реакция позволяет увидеть и измерить результат иммунологической реакции.

ИФА относится к непрямым методам диагностики, так как с ее помощью можно определить наличие антител к патогенному микроорганизму, а не самого возбудителя. Этот анализ рекомендуется выполнять совместно с ПЦР-диагностикой.

Важность иммуноферментного анализа несомненна: его применяют, если требуется определить стадию развития заболевания, провести мониторинг проведенного курса лечения, оценить ответ организма на лечение либо подобрать оптимальную схему терапии.

К преимуществам ИФА относят следующее:

высокая чувствительность (до 90%), позволяющая обнаружить микроорганизмы даже в том случае, если они присутствуют в минимальных концентрациях;
возможность выявить заболевание еще до проявления симптомов;
скорость проведения анализа и получения результатов;
возможность определить примерный срок заражения, а также тип течения инфекции (острая или хроническая);
выявление с высокой степенью достоверности микроорганизмов, которые невозможно определить путем применения других диагностических методов (посева, микроскопии и т.д.).

Показания к проведению иммуноферментного анализа крови

Методика ИФА позволяет выявить в крови любой антиген — не только собственный, но и чужеродный для организма. Ее назначают при подозрении на скрытую инфекцию. Показаниями для проведения этого анализа являются:

выявление различных инфекций (гепатиты, паразитарные инфекции, герпес, хламидии, токсоплазмоз, сальмонеллез, вирус Эпштейн-Барра);
определение содержания гормонов для оценки работы органов эндокринной системы — щитовидной железы, гипофиза, половых желез;
выявление и отслеживание онкомаркеров (ПСА у мужчин, фактор некроза опухоли и т.д.);
диагностика аутоиммунных заболеваний (системный васкулит, ревматоидный артрит, системная красная волчанка, синдром Шегрена).

Также иммуноферментный анализ позволяет определить наличие антител к вирусу у пациента после прививки.

ИФА не оказывает непосредственного воздействия на антиген: этот метод позволяет оценить реакцию организма на присутствие такого антигена.

Чаще всего для проведения иммуноферментного исследования используют сыворотку венозной крови, взятой у пациента натощак. Также для анализа могут использоваться околоплодные воды, спинномозговая жидкость, содержимое стекловидного тела и слизь цервикального канала и уретры.

Подготовка к анализу ИФА

Чтобы снизить риск ошибки при проведении иммуноферментного анализа, пациенту рекомендуют подготовиться к этой процедуре. Речь идет о том, чтобы в течение 7-10 дней до назначенного исследования:

прекратить прием антибиотиков, а также противовирусных и антигистаминных препаратов;
исключить из рациона продукты-аллергены (шоколад, мед, орехи, яйца);
отказаться от жирных, острых, жареных блюд, алкоголя, сладостей;
ограничить физические нагрузки;
избегать сильных эмоциональных потрясений.

За сутки до забора крови нужно прекратить курение.

Интерпретация результатов анализа

При выполнении иммуноферментного анализа выявляют антитела разных типов – иммуноглобулины классов M, A, G (JgM, JgA, JgG). Они появляются в разные промежутки времени.

IgM указывает на то, что инфекция находится на острой стадии развития. Этот иммуноглобулин появляется в крови на 4-5 день после предполагаемого заражения. Если выявляют IgM, то пациент в данный момент является больным.

IgG характеризует хроническую форму инфекционного процесса, а также свидетельствует о наличии стойкого иммунитета к антигену. Выработка этого иммуноглобулина происходит на 20-28 день с момента заражения. IgG может сохраняться в крови долгое время – несколько месяцев и даже лет.

IgA – иммуноглобулины, выявление которых указывает на переход острой формы инфекционного процесса в хроническую. Они вырабатываются на 14-20 день с момента заражения и сохраняются в крови больного около двух месяцев.

Анализ ИФА может демонстрировать разные комбинации этих иммуноглобулинов. В зависимости от сочетания, они указывают на определенный этап в развитии заболевания:

JgM (-), JgG (-), JgA (-). Иммунитет к инфекции отсутствует.
JgM (-), JgG (+), JgA (-). У больного имеется иммунитет, приобретенный после введения вакцины или выполнения прививки.
JgM (+), JgG (-/+), JgA (-/+). У пациента присутствует острая инфекция.
JgM (+), JgG (+), JgA (+). У больного протекает период обострения хронической инфекции.
JgM (-), JgG (+/-), JgA (+/-). У пациента имеется хроническая инфекция.
JgM (-). Пациент был заражен, но сейчас выздоровел.

Если ИФА направлен на исследование гормонов щитовидной железы, то его допустимые границы находятся в таких пределах:

При диагностике аутоиммунных заболеваний у пациента могут выявляться такие антитела:

Антинуклеарные (аутоантитела к антигенам ядра клеток). Они характерны для системных аутоиммунных заболеваний.
Антитела к растворимым нуклеарным антигенам. Такие компоненты проявляются при различных системных аутоиммунных процессах.
Антикардиолипиновые антитела IgG и IgM. Они характерны для антифосфолипидного синдрома.
Антитела к двухспиральной ДНК, которые являются специфичными для системной красной волчанки.
Ревматоидный фактор. Антитела такого типа выявляют при ревматоидном артрите, хотя они не специфичны конкретно для этого заболевания и могут обнаруживаться при других отклонениях, а также у абсолютно здоровых пациентов.

Сейчас ИФА-анализ широко используется для выявления антител к коронавирусной инфекции.

Серология — современный метод лабораторной диагностики различных заболеваний, отличающийся эффективностью и надежностью. В первую очередь с помощью серологического исследования выявляют инфекционные процессы в организме. Анализ дает возможность идентифицировать возбудителя инфекции и подобрать правильную схему медикаментозной терапии. Также тест можно проводить для подтверждения аутоиммунных расстройств, при которых иммунная система ошибочно атакует здоровые клетки и ткани. Серология часто назначается при целиакии. Открытие этого метода позволило с большей точностью выявлять ВИЧ-инфекцию, гепатит, сифилис и иные патологии.

Что это за исследование?

В крови человека присутствуют так называемые форменные элементы, выполняющие определенные функции. Это красные кровяные клетки (эритроциты), лейкоциты, тромбоциты. Жидкий компонент крови называют плазмой. В ней присутствуют разнообразные химические соединения, включая иммунологические комплексы. Их выявление требуется для постановки диагноза и проведения лечения. Например, забор крови проводится для оценки уровня глюкозы, гормональных веществ, ферментов, иммуноглобулинов. Для правильного выполнения анализа полученную плазму превращают в сыворотку. Для этого необходимо вывести из жидкости фибриноген, ответственный за свертывание крови.

Серологическое исследование — метод лабораторной диагностики, позволяющий обнаружить в полученной жидкости определенные иммуноглобулины. Это компоненты гуморального иммунитета, вырабатываемые лимфоцитами для связывания и нейтрализации чужеродных компонентов. Антитела действуют против бактериальных клеток, грибков, вирусов, простейших, паразитов, аллергенов и других угроз. Клетки иммунитета умеют вырабатывать специфические иммуноглобулины, соответствующие определенным агентам. Это свойство позволяет проводить диагностику заболеваний.

Серология не ограничивается идентификацией возбудителей инфекции с помощью антител. Иммунитет вырабатывает иммуноглобулины разных классов в зависимости от этапа развития патологического процесса. Определение типа этих иммунных комплексов в крови дает возможность уточнить, когда пациент был инфицирован, и как быстро болезнь развивается.

Что показывает серология?

Это исследование требуется для обнаружения определенных патологических состояний. Нет общих анализов, направленных на обнаружение всех возможных иммуноглобулинов крови. По этой причине серология назначается только врачом при наличии строгих показаний. Пациенты приходят с определенными жалобами, а специалист проводит необходимые обследования для постановки диагноза. Серологическое исследование отвечает на вопрос, почему у человека появились симптомы.

В педиатрической практике серологическая диагностика играет важную роль в своевременном выявлении опасных инфекций, вызывающих серьезные осложнения у ребенка. С помощью анализа крови педиатр может обнаружить краснуху, ветряную оспу, скарлатину, коклюш или другую инфекцию. Это исследование обязательно выполняется при обследовании у венеролога. Правильно подобранный тест помогает идентифицировать патогенный микроорганизм, передающийся половым путем. Ставится диагноз сифилис, трихомониаз, герпес, ВИЧ.

Серологическая диагностика — часть скрининга у беременных женщин. Это необходимо для раннего выявления факторов риска возникновения серьезных осложнений. Обнаружение специфических антител в крови дает возможность исключить токсоплазмоз, цитомегаловирусную инфекцию, герпес и другие патологии. Они могут крайне негативно сказаться на внутриутробном развитии ребенка.

В гепатологической практике серология выполняется для обнаружения вирусного поражения печени. Повторные тесты делают для оценки эффективности лечебных мероприятий. Врач проверяет уровень вирусной нагрузки, оценивает динамику состояния больного. Подобная диагностика иногда требуется после вакцинации от гепатита В. Антитела класса IgG — эффективный компонент иммунитета, поэтому их уровень нужно определить для подтверждения результативности иммунизации.

Как проводится серология?

Это простая процедура, к которой не нужно специально готовиться. Уровень иммуноглобулинов в крови определяется только активностью присутствующих в организме патогенных микроорганизмов, вроде бактериальных клеток или вирусов. В некоторых случаях пациента просят отказаться от приема пищи в утренние часы перед выполнением процедуры.

Есть определенные исключения, при которых подготовительный этап требуется для повышения достоверности результатов:

Проведение контрольного исследования для оценки динамики состояния во время медикаментозной терапии. В таком случае диагностика выполняется только после окончания курса лечения. Врач отменяет прием медикаментов минимум за семь суток до сдачи крови.
Серологический тест требуется провести во время лечебных мероприятий — врач хочет удостовериться в эффективности подобранной схемы. В таком случае пациент продолжает принимать препараты.
Иногда требуется изменение рациона. Например, при лабораторной диагностике по поводу различных видов аллергии.

Сама процедура ничем не отличается от стандартного забора крови. Материал получают из локтевой вены. Медицинский работник использует жгут, протирает место прокола спиртом и вводит иглу в сосуд. Производится забор небольшого количества крови. Образец направляют в лабораторию.

Расшифровка

Распространенным видом серологии является иммуноферментное исследование, проводимое для обнаружения антител разных классов. Такой способ диагностики применяют для выявления острой или хронической болезни, ее обострения, иммунной защиты от определенных инфекционных агентов. В этом случае интерпретация результатов теста проводится с учетом следующих показателей:

IgM. Это первичный иммуноглобулин, вырабатываемый почти сразу после столкновения организма с патогеном. Может появляться при обострении.
IgG. Такие антитела синтезируются на более поздних сроках и перед выздоровлением. Если другие факторы не были обнаружены, в бланке указывается присутствие стойкой иммунной защиты или хронической формы заболевания.
IgA. Антитела этого класса указывают на протекание определенного патологического процесса. Если они сочетаются с IgM, врач делает вывод о наличии острого заболевания, его постепенного развития. При сочетании с IgG можно предположить, что хроническая инфекция обострилась.

Если по результатам серологии антитела не были обнаружены в целом, интерпретация теста меняется. Врач говорит об отсутствии инфекционного процесса или иммунной защиты от него. Требуются дополнительные сведения для правильной трактовки таких клинических данных. Например, если до этого была введена вакцина, отсутствие иммуноглобулинов в некоторых случаях свидетельствует об ее неэффективности. Может потребоваться исключение иммунодефицита и определенных факторов, ослабляющих защитную систему организма.

Важно понимать, что интерпретировать серологическое исследование будет врач. Специалист ориентируется не только на результаты такого теста. Нужно оценивать анамнез в целом, результаты других видов диагностики.

Иммуноферментный анализ крови является распространенным методом выявления различных патологий. Результат анализа крови, расшифровка ИФА которого была интерпретирована врачом лабораторной диагностики, является достоверным в большинстве случаев.

Что такое ИФА

ИФА — современный диагностический метод, который применяется для диагностики инфекций, гормональных и иммунных нарушений, онкологических заболеваний в лабораторных условиях. Метод позволяет выявить антитела к инфекции уже на ранних сроках заболевания. Данный метод относится к непрямым диагностическим методам, так как он выявляет иммунный ответ организма. Среди преимуществ ИФА в сравнении с другими методами диагностики можно выделить высокий уровень технологичности, что уменьшает вероятность ошибок. Метод является высокочувствительным и применяется для диагностики заболеваний как у детей, так и у взрослых. Существует обширное количество различных модификаций ИФА.

Метод ИФА основывается на специфичности иммунохимических реакций, а также физико-химических закономерностях реакций комплексов антиген-антитело. Реакции производятся с участием специфических ферментов, которые являются метками для определения антител. В результате иммунохимической реакции строго определенные антитела связываются с соответствующими антигенами. Исследование крови методом иммуноферментного анализа почти исключает возможность получения ложноположительного результата. О положительном или отрицательном результате специалисты лабораторной диагностики судят исходя из того, произошло ли окрашивание раствора в ходе ферментативной индикации комплекса антиген-антитело. Если раствор окрасился, то произошло взаимодействие антигена с антителом, результат ИФА положителен.

Какие заболевания можно выявить методом ИФА

Исследование методом иммуноферментного анализа позволяет:

выявить ряд инфекционных заболеваний;
диагностировать аутоиммунные заболевания;
выявить наличие онкологии;
определить гормональные нарушения;
произвести иные исследования.

Анализ крови методом ИФА позволяет определить наличие следующих инфекций:

вирусные гепатиты;
ВИЧ;
цитомегаловирус;
вирус Эпштейн-Барра;
герпетические инфекции;
краснуха;
боррелиоз;
паразитарные инфекции;
ЗППП;
иные инфекции.

Метод применяется для выявления антигенов возбудителей ряда инфекций, а также для выявления антител различных классов. Большую популярность метод ИФА получил для выявления сифилиса, ВИЧ, вирусных гепатитов. Определять наличие и уровень антител в сыворотке крови с целью первичной диагностики ИППП не рекомендуется. В данном случае наличие антител в крови может быть лишь признаком того, что организм пациента контактировал с возбудителем инфекции в прошлом.

Диагностика различных аутоиммунных заболеваний методом ИФА производится посредством исследования:

антинуклеарных тел;
антител к двухспиральной ДНК;
антител к растворимым нуклеарным антигенам (ENA скрин);
антикардиолипиновых антител;
IgG к цитрулиновому пептиду;
ревматоидного фактора;
С-реактивного белка;
аутоантител к цитоплазматическим антигенам нейтрофилов (ANCA скрин).

Специфические иммунные комплексы характерны для определенных аутоиммунных заболеваний. Например, антитела двуспиральной ДНК являются характерными для такого заболевания, как системная красная волчанка.

Определение онкологических заболеваний производится при иммуноферментном исследовании сыворотки крови на специфические онкомаркеры, такие как ПСА, СА-125.

ПСА свидетельствует о наличии аденомы простаты и рака простаты. СА-125 — это онкомаркер злокачественной опухоли яичника. Значение повышается и при раковых опухолях матки, молочных желез, эндометрия.

Подготовка к анализу

Чтобы обеспечить максимальную точность результатов, нужно следовать определенным правилам подготовки к исследованию. Анализ для лабораторной диагностики методом ИФА, как правило, сдается утром из локтевой вены. Сдавать кровь необходимо строго натощак. Кроме этого простого предписания, следует выполнять следующие рекомендации по подготовке:

за 24 часа до исследования необходимо исключить прием алкоголя и курение;
избегать тяжелых физических нагрузок;
пребывать в спокойном состоянии;
избегать нервного напряжения;
сдавать кровь на ИФА не ранее, чем через 10 дней после отмены лекарств;
предупредить врача о приеме необходимых лекарств.

Кроме того, за несколько дней до сдачи анализа рекомендуется придерживаться диеты. При этом из рациона исключить жирные продукты, жареную пищу. Перед анализом на вирусные гепатиты из рациона исключить не только жирное и жареное, но и цитрусовые, а также оранжевые овощи.

Следует отметить, что на результаты определенного спектра гормональных исследований влияет такой фактор, как фаза менструального цикла. Необходимость сдавать анализ в ту или иную фазу менструального цикла следует заранее обговорить с лечащим врачом. В противном случае можно получить неожиданные показатели. Так, например, нормальный уровень лютеинизирующего полового гормона у женщин варьируется в зависимости от дня цикла:

1-12 день — 2-14 мЕд/л;
12-14 день — 24-150 мЕд/л;
с 15 дня до начала нового цикла — 2-17 мЕд/л.

Расшифровка результатов ИФА

Анализ позволяет установить наличие в организме антител различных классов. Существуют антитела 3 классов:

Выработка этих антител происходит на различных стадиях заболевания. Самыми первыми после заражения в организме начинают вырабатываться антитела IgM. Их наличие является показателем болезни в любом случае. В организме здорового человека этот класс антител отсутствует.

Эти иммуноглобулины присутствуют в сыворотке крови около 5-6 недель.

Иммуноглобулины класса G, присутствующие в крови, говорят о том, что человек либо уже перенес заболевание, либо является носителем инфекции. Эти антитела начинают вырабатываться после антител класса М, при большинстве заболеваний на 3-4 неделю после заражения. Их присутствие в организме возможно в течение нескольких лет. А при некоторых болезнях (например, сифилисе) IgG присутствуют в крови пожизненно.

Если в организме присутствуют IgA, необходимо как можно интенсивнее бороться с инфекцией. Антитела этого класса появляются лишь в случае хронического инфекционного заболевания. Исчезновение IgA говорит об уничтожении инфекции.

Если анализ ИФА производится в детском возрасте до 1,5 лет, должна учитываться следующая особенность: кровь ребенка содержит IgG матери к различным инфекциям. Это совсем не означает, что ребенок болен. В таком случае это скорее норма. Наличие IgM является свидетельством внутриутробной инфекции либо инфекции, приобретенной уже после рождения. IgM матери не могут проникнуть в организм ребенка через плаценту.

В таблице представлены возможные комбинации наличия или отсутствия в организме антител 3 классов и их интерпретации.

IgM	IgG	IgA	Расшифровка
—	—	—	Иммунитет к инфекции отсутствует
—	+	—	Имеется поствакцинальный или постинфекционный иммунитет
+	-/+	-/+	Острая инфекция
+	+	+	Обострение хронической инфекции
—	+/-	+/-	Наличие хронической инфекции

При расшифровке анализов (+) свидетельствует о положительном результате, а (-) говорит об обратном, то есть об отрицательном. Результат, показывающий наличие или отсутствие какого-либо вещества в организме, называется качественным. Он может быть дополнен количественным. Количественный результат отображает количественное содержание различных веществ в организме.

Стоит отметить, что тест-системы имеют собственные, определенные изготовителем, референтные значения, которые характеризуют показатели. Превышения референтных значений, как правило, означают наличие тех или иных патологий в организме исследуемого.

После получения результатов ИФА расшифровку полученных значений должен производить лечащий врач. Только он сможет произвести правильную оценку полученных результатов и определить стадию заболевания.

Иммуноферментный анализ (сокращённо ИФА, англ. enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) – лабораторный иммунологический метод качественного или количественного определения различных соединений, макромолекул, вирусов и пр., в основе которого лежит специфическая реакция антиген-антитело. Выявление образовавшегося комплекса проводят с использованием фермента в качестве метки для регистрации сигнала.

Твердофазный ИФА был предложен в 1971 году. Основные принципы твердофазного ИФА, независимо от модификации, заключаются в следующем:

1. На 1 этапе реакции адсорбируют антигены или антитела на твердой фазе. При этом не связавшиеся с твердой фазой реагенты легко удаляются отмыванием.

2. В сенсибилизированных лунках инкубируют исследуемый образец. В лунках с положительным контролем – стандартные реагенты. При этом на поверхности твердой фазы формируются иммунные комплексы. Несвязавшиеся компоненты удаляют отмыванием.

3. При добавлении конъюгата антитело-фермент или антиген-фермент и связывании его с иммобилизованным иммунным комплексом активный центр фермента остается доступным для последующего взаимодействия с субстратом. Инкубация субстрата в лунках с иммобилизованным конъюгатом приводит к развитию цветной реакции. Эту реакцию можно остановить на нужной стадии, выраженность окрашивания можно оценить визуально или по оптической плотности.

Из-за разнообразия объектов исследования – от низкомолекулярных соединений до вирусов и бактерий, и многообразия условий проведения ИФА существует большое количество вариантов этого метода.

Одним из принципов классификации методов ИФА является их разделение по типу проводимых на каждой из иммунохимических стадий реакций. В соответствии с эти все методы можно разделить на две группы –
гомогенные и гетерогенные. Если в ходе выполнения анализа все реакции, включая ферментативную стадию, протекают в растворе, то метод является гомогенным. Гетерогенный ИФА объединяет методы, в которых анализ проводится в двухфазной системе, при этом разделение на фазы может происходить на любой стадии определения [16].

В настоящее время EMIT (гомогенный ИФА) широко распространен во всем мире наряду с твердофазным ИФА (тИФА). EMIT по сравнению с тИФА является более экспрессным (до 2-х минут) и менее трудоемким, хотя менее чувствительный, и поэтому используется только в качественном анализе.

Возможна также классификация по типу иммунохимического взаимодействия на первой стадии анализа (в которой происходит связывание определяемого вещества). Если в системе присутствуют только анализируемое соединение и соответствующие ему центры связывания (антиген и специфические антитела), то метод является неконкурентным. Если же на первой стадии в системе одновременно присутствует анализируемое соединение и его аналог (меченное ферментом анализируемое соединение или анализируемое соединение, иммобилизованное на твердой фазе), конкурирующие за ограниченное количество центров специфического связывания, то метод является конкурентным.

Рис. 10. Конкурентный (а) и неконкурентный (б) ИФА

Другим типом классификации схем ИФА является разделение по типу определения концентрации анализуемого вещества:

1) прямое определение образовавшихся иммунокомплексов (аналитический сигнал прямо пропорционален концентрации определяемого вещества) – прямой ИФА;

2) определение концентрации оставшихся свободными, т.е. не вступившими в реакцию компексообразования антител – непрямой ИФА.

Так, среди конкурентных схем твердофазного ИФА существует два основных формата:

Прямой конкурентный формат ИФА использует в качестве меченного ферментом реагента одного из участников иммунохимической реакции (рис. 3) – определяемое соединение или специфический к нему диагностический реагент (антитела). В результате схема ИФА состоит из 3-х стадий:

– сорбции (иммобилизации) специфических антител, либо конъюгата антигена,

– аналитической стадии: конкурентной реакция Аг-Ат с участием меченого ферментом реагента (антигена или антител),

– фермент-субстратной реакции, в результате которой образуется окрашенный (или люминисцентный) продукт.

Например, на полистирольный планшет иммобилизуют специфические антитела (рис. 11 в) иммобилизованые на твердой фазе специфические антитела. На второй стадии к иммобилизованным антителам добавляют раствор, содержащий определяемое вещество и фиксированную концентрацию меченого антигена, инкубируют и после отмывки носителя от несвязавшихся компонентов регистрируют ферментативную активность образовавшихся на твердой фазе специфических иммунных комплексов. В этой схеме меченый ферментом и немеченый антиген конкурируют за связывание с иммобилизованными специфическими антителами.

Рис. 11. Виды конкурентного ИФА:
а – непрямой конкурентный ИФА с иммобилизацией конъюгата антигена с высокомолекулярным веществом и использованием меченых антивидовых антител; б – непрямой конкурентный ИФА с иммобилизацией конъюгата антигена с высокомолекулярным веществом и использованием меченых специфических антител; в – прямой конкурентный ИФА с иммобилизацией специфических антител и использованием меченого антигена (аналита)

Преимуществом прямой схемы является небольшое число стадий, что позволяет легко автоматизировать анализ. К недостаткам схемы относятся сложность методов синтеза ферментных конъюгатов, а также возможное влияние компонентов образца на активность фермента.

В непрямом конкурентном формате ИФА используются меченные ферментом антитела (специфические или вторичные) и иммобилизованный на твердой фазе конъюгат антиген-белок-носитель
(рис. 11 а, б). Непрямая схема с использованием меченых антивидовых антител является одной из наиболее распространенных схем ИФА (рис. 11 а). На поверхности носителя иммобилизуют конъюгат антиген-белок, к которому добавляют раствор, содержащий определяемый антиген и фиксированную концентрацию немеченых специфических антител, инкубируют и после удаления несвязавшихся компонентов добавляют фиксированную концентрацию меченых антивидовых антител. После инкубации и отмывки носителя детектируют ферментативную активность образовавшихся на твердой фазе специфических иммунных комплексов. Величина аналитического сигнала в этом случае находится в обратно-пропорциональной зависимости от концентрации определяемого антигена.

Применение универсального реагента – меченых антивидовых антител – даёт возможность выявлять антитела к разным антигенам. Кроме того, анализируемый образец и меченый реагент вводятся в систему на разных стадиях, что устраняет влияние различных эффекторов, содержащихся в образце, на каталитические свойства ферментной метки. Однако такая схема анализа усложняет его проведение из-за введения дополнительных стадий.

ИФА наркотических веществ и их метаболитов в биологических жидкостях и тканях широко используется в ХТЛ, бюро судмедэкспертизы, клинико-диагностических лабораториях, медицинских центрах. Чаще всего применяется полуколичественный вариант методики, т.к. в большинстве случаев необходимо дать заключение о том, превышает ли уровень метаболитов ПАВ в образце определенную пороговую концентрацию. Однако метод ИФА может использоваться (и используется в некоторых случаях) для количественного определения метаболитов ПАВ с высокой чувствительностью – до 10–9 г/л.

Отдельно следует выделить иммунохимический метод выявления фактов употребления наркотиков в отдаленные промежутки времени (до 4 месяцев после последнего употребления ПАВ), основанный на определении антител к наркотическим веществам в крови человека [4, 5]. Данный метод использует прямую неконкурентную схему ИФА.

Компоненты, используемые в ИФА

Ферментные метки обладают чрезвычайно мощным каталитическим действием, одна молекула фермента может реагировать с большим количеством молекул субстрата. Таким образом, фермент, присутствующий в ничтожных количествах, можно выявить и количественно определить по образованию продуктов катализируемой им реакции. Другое преимущество применения ферментов в качестве меток обусловлено наличием в молекуле многочисленных функциональных групп (сульфгидрильных, карбоксильных, остатков тирозина и др.), через которые можно ковалентно присоединить молекулы лиганда.

В ИФА может использоваться не менее 15 различных ферментов. Наибольшее применение, в соответствии с вышеназванными требованиями, нашли пероксидаза хрена (ПХ), щелочная фосфотаза (ЩФ) и β-D-галактозидаза. Все три стабильны и катализируют высокочувствительные реакции. Кроме того, продукты, получаемые в результате реакций, катализируемых этими ферментами, в зависимости от используемого субстрата, могут выявляться не только колориметрическими методами, но также флуоресцентными методами. Другие ферменты используются значительно реже. Это объясняется их более низкой в сравнении с ПХ и ЩФ удельной активностью.

Выбор субстрата в первую очередь определяется используемым в качестве метки ферментом, так как реакция фермент-субстрат высоко специфична.

Чаще используют хромогенные субстраты, которые, разрушаясь, образуют окрашенное вещество. Перспективным является использование высокоэнергетических субстратов – флуоресцентных, хемилюминесцентных.

3. Антигены и антитела.

Аг и Aт, используемые в ИФА, должны быть высокоочищенными и высокоактивными. Кроме того, Аг должны обладать высокой антигенностью, оптимальной плотностью расположения и количеством антигенных детерминант и гомогенностью. Многие синтетические и рекомбинантные Аг вирусов и бактерий хорошо себя зарекомендовали при использовании в ИФА. Это существенно повысило специфичность и воспроизводимость метода за счет сведения к минимуму перекрестных реакций.

Одним из наиболее важных реагентов в ИФА являются антитела. Чувствительность ИФА зависит от концентрации, активности и специфичности используемых антител. Используемые антитела могут быть поли- или моноклинальными, различного класса (IgG или IgM) и подкласса (IgGl, IgG2), антиаллотипическими или антиидиотипическими. При низкой аффинности Ат распад комплекса Аг-Ат приводит к удалению связанного Аг из системы. Чувствительность и специфичность метода повышается при использовании моноклональных антител. В этом случае появляется возможность обнаруживать низкие концентрации Аг (Aт) в испытуемых образцах.

4. Получение конъюгата.

При синтезе конъюгата с ферментом подбирают такой оптимальный метод введения ферментной метки, чтобы оба компонента конъюгата сохраняли свою биологическую активность: фермент – способность взаимодействовать с субстратом, а антиген или антитело – антигенность и антигенсвязывающую активность, соответственно. Наличие меченого, высокоочищенного антигена позволяет использовать конкурентные методы ИФА. Однако антигены разнообразны по своим физико-химическим свойствам и строению, а значит невозможно разработать универсальные методики для получения конъюгата с антигеном. В этом случае получение конъюгата антигена с ферментом представляет собой отдельную сложную задачу. Приготовление меченых антител для ИФА методически более доступно.

Конъюгирование фермента с иммунохимически активными белками производится различными методами: химическая сшивка, ковалентное связывание молекулы фермента с Аг или Aт и образование соединений через нековалентные связи, например, когда связь между ферментом и Аг или Aт осуществляется иммунологически, через взаимодействие антиген-антитело.

В качестве твердой фазы для проведения ИФА можно применять различные материалы: полистирол, поливинилхлорид, полипропилен и другие вещества. Твердой фазой могут служить стенки пробирки, 96-луночные и др. планшеты, шарики, бусины, а также нитроцеллюлозные и другие мембраны, активно сорбирующие белки.

Иммобилизация антигена или антител на твердой фазе возможна тремя путями:

– пассивная адсорбция, основанная на сильных гидрофобных взаимодействиях между белками и синтетической поверхностью;

– ковалентное прикрепление к твердой фазе;

– иммунохимическое и др. (нековалентное и неадсорбционное присоединение).

Пассивная адсорбция белков широко используется при проведении ИФА на платах для титрования, на нитроцеллюлозных мембранах. Пассивная адсорбция идет по принципу насыщения и коррелирует с молекулярной массой адсорбируемого вещества. В стандартных наборах ИФА используются 96-тилуночные прозрачные полистирольные планшеты.

Рис. 12. Набор для ИФА-определения наркотических еществ в биологических жидкостях: – планшет с нанесенным антигеном; 2 – положительный и отрицательный контрольный образец; 3 – реагент для выявления образовавшихся иммунных комплексов; 4 – растворы буфера для приготовления анализируемых образцов; 5 – раствор буфера для проведения фермент-субстратного окрашивания; – раствор для остановки реакции окрашивания субстрата; – инструкция по применению

Свободные сайты на поверхности твердой фазы, не связавшиеся с сорбируемым агентом, могут фиксировать в ходе теста другие молекулы, в том числе и конъюгаты, что приводит к повышению фонового сигнала. Для предотвращения неспецифического связывания после иммобилизации на твердую фазу основного материала проводят обработку нейтральными для теста веществами. Наиболее популярные блокирующие агенты – бычий сывороточный альбумин (БСА), казеин и др. Выбор блокирующего агента и условия проведения этого этапа зависят от типа твердой фазы, чувствительности системы.

Готовый набор для ИФА-определения наркотических веществ в биологических жидкостях выглядит следующим образом (рис. 12).

Читайте также: