Иммуноферментный анализ вирусов картофеля
Обновлено: 23.04.2024
Диагностика вирусов и бактерий картофеля методом ИФА
И ммуноферментный а нализ (ИФА, англ. enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) – лабораторный метод качественного и количественного определения разнообразных молекул, вирусов, бактерий и т.п. В основе метода лежит высокоспецифичная иммунологическая реакция антитела и антигена.
Антителами являются сложные белковые молекулы (иммуноглобулины), синтезируемые клетками иммунной системы человека и прочих теплокровных животных в ответ на проникновение в организм антигенов – вирусов, бактерий, молекул и прочих чужеродных объектов. Высокая специфичность взаимодействия между антителом и антигеном обусловлена тем, что активный центр антитела способен связываться с уникальным фрагментом антигена. Именно это свойство реакции антитело-антиген определяет специфичность, надёжность, достоверность и чувствительность ИФА при проведении диагностики патогенов картофеля. При наличии целевого патогена в исследуемом образце формируется комплекс соответствующих антител и антигена, детекцию которого определяют по активности фермента, связанного с антителами.
Существует широкое разнообразие методов проведения ИФА, различающихся природой антигена, принципом связывания, условиями проведения, способами детекции результатов ферментативной реакции и т.п. Для диагностики патогенов сельскохозяйственных культур традиционно используется “сэндвич”-метод с использованием двух типов антител (DAS-ELISA – double antibody sandwich enzyme-linked immunosorbent assay). В качестве фермента, обычно, используется щелочная фосфатаза.
Проведение иммуноферментного анализа
Реакция проводится в 96-луночных полистирольных микропланшетах, характеризующихся высокой эффективностью связывания белковых молекул, в т.ч. иммуноглобулинов (антител), на своей поверхности.
На первом этапе антитела захвата (capture antobodies) разводят в необходимой концентрации в покровном буфере (coating buffer), вносят в лунки микропланшетов и инкубируют от нескольких часов при температуре +30-37°С до нескольких дней при температуре +4°С. Во время инкубирования антитела неспецифически адсорбируются на поверхности лунок микропланшета. По окончании инкубирования планшеты промывают несколько раз промывочным буфером (wash buffer) для удаления антител захвата, которые не связались с поверхностью микропланшета.
Сорбция антител захвата на поверхности лунки микропланшета
На следующем этапе в лунки микропланшета, поверхность которых покрыта антителами захвата, вносят сок, экстракт, или гомогенат растений, исследуемых на наличие антигенов – патогенных бактерий или вирусов и инкубируют 14-16 часов при температуре +4°С. При необходимости, растительный материал можно развести экстракционным буфером (extraction buffer). По окончании инкубирования лунки несколько раз промывают промывочным буфером.
При наличии целевого патогена в образце происходит взаимодействие специфичного фрагмента антигена с соответствующим антигенсвязывающим центром антител захвата.
Связывание антигена с антителами захвата
В промытые лунки наносят антитела детекции, конъюгированные с ферментом щелочная фосфатаза (Ф). Антитела разводят в необходимой концентрации в конъюгатном буфере (conugation buffer). Микропланшеты инкубируют при температуре +30°С в течение 5 часов. По окончании инкубирования микропланшеты несколько раз промывают промывочным буфером для удаления антител детекции, не связавшихся с антигенами.
На данном этапе происходит взаимодействие специфичного фрагмента антигена с соответствующим антиегнсвязывающим центром антител детекции. Антигенсвязывающие центры антител захвата и антител детекции различны и специфично связываются с разными фрагментами антигена.
Связывание антител детекции с антигеном
На заключительном этапе в лунки добавляют пара-нитрофенилфосфат, являющийся субстратом для фермента щелочная фосфатаза. При наличии в растительном образце целевых патогенов формируется комплекс антитело захвата-антиген (вирус или бактерия)-антитело детекции, конъюгированное с ферментом щелочная фосфатаза. Фермент (Ф) катализирует превращение бесцветного пара-нитрофенилфосфата (субстрат, С) в жёлтый пара-нитрофенол (продукт, П), в результате чего происходит окрашивание реакционной смеси в жёлтый цвет. Интенсивность окраски реакционной смеси можно оценивать как визуально, так и с помощью спектрофотометра.
Фермент, конъюгированный с антителами детекции, катализирует реакцию превращения бесцветного субстрата в жёлтый продукт
1. Рогозина Е.В., Мироненко Н.В., Афанасенко О.С., Мацухито Ю. Широко распространённые и потенциально опасные для российского агропроизводства возбудители вирусных болезней картофеля // Вестник защиты растений. 2016. № 4 (90). С. 24–33.
2. Анасимов Б.А., Белов Л.Г., Варицев Ю.А., Еланский С.Н., Журомский Г.К., Завриев С.К., Еланский С.Н., Журомский Г.К., Зейрук В.Н., Иванюк В.Г., Кузнецова М.А., Пляхневич М.П., Пшеченков К.А., Сташевски З., Симаков Е.А., Склярова Н.П., Яшина И.М. Защита картофеля от болезней, вредителей и сорняков. М.: Изд. Картофелевод, 2009. 272 с.
3. Багирова С.Ф., Джавахия В.Г., Дьяков Ю.Т., Озерецская О.Л., Проворов Н.А., Тихонович И.А., Щербакова Л.А. Фундаментальная фитопатология. М.: КРАСАНД, 2012. 512 с.
4. Гнутова Р.В. Вирусы растений азиатской территории России: номенклатура и систематика // Изв. РАН. Сельскохозяйственная биология. 2014. № 5. C. 16–27.
5. Гнутова Р.В. Разнообразие вирусов растений в восточноазиатском регионе России: итоги 50-летнего изучения // Изв. РАН. Серия биол. 2011. № 1. C. 33–44.
6. Карташёва И.А. Сельскохозяйственная фитовирусология: учеб. пособие. М.: Изд. Колос; Ставрополь: АГРУС, 2007. 168 с.
8. Кондакова О.А., Бутенко К.О., Скурат Е.В., Дрыгин Ю.Ф. Молекулярная диагностика Y-вирусом и вирусом скручивания листьев картофеля методом иммунохроматографии // Вестник МГУ, СЕР.16. Биология. М., 2016. № 1. С. 46–51.
9. Файзиев В.Б., Кодирова З.Н., Вахобов А.Х., Жураева У.М. Изучение некоторих биологическых свойств S-вируса картофеля с методом иммуноферментного анализа // Узбекский биологической журнал. Ташкент, 2017. № 2. С. 27–33.
10. Егоров А.М., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б., Гаврилова Е.М. Теория и практика иммуноферментного анализа. М.: Высшая школа, 1991. С. 288.
11. Jones R. Virus disease problems facing potato industries worldwide: viruses found, climate change implications rationalizing virus strain nomenclature and addressing the potato virus Y issue. In: The Potato, botany, production and uses. Ed. R. Navarre and M. Pavec. Washington State University. 2014. P. 202–225.
Картофель во всем мире является вторым хлебом и считается одним из важнейщих сельскохозяйственных продуктов для употребления в пищу человечеством. Среди изученных до ХХ в. из 400 видов фитопатогенных вирусов [1] около 20 видов вирусов [2, 3] поражают картофель. Исследования, проведенные в последующие годы, показали, что картофель поражается более 52 видами фитопатогенных вирусов [1, 4]. К ним относятся такие вирусы, как вирус скручивания листьев картофеля – ВСЛК (potato leaf roll virus, PLRV); Y вирус картофеля – YВК (Potato virus Y, PVY); X вирус картофеля – ХВК (Potato virus X, PVX); S вирус картофеля – SBK (Potato virus S, PVS); M вирус картофеля – МВК (Potato virus M, PVM) [5]. Каждая из них имеет своеобразный симптом поражения: ВСЛК вызывает симптом скручивания листьев картофеля, YВК – мозаичное скручивание, а ХВК – крапчатую мозаику. Признаки поражения проявляются в различных симптомах в зависимости от вида вируса, экологических условий а также от сорта картофеля [4, 6]. Из перечисленных вирусов ВСЛК снижает урожайность картофеля до 80 %, а в случае ХВК поражение, не проявляя видимых симптомов из года в год, через клубеньки передаётся следующему поколению, урожайность снижается до 10–25 %, а при смешанных инфекциях (S + X + A), снижая урожайность до 40 %, приносит большой ущерб сельскому хозяйству [7, 8].
ВСЛК относится к семейству Luteoviridae, роду Polerovirus, форма вириона сферическая, передаётся с помощью Myzus persicae, во всем мире распространена во всех хозяйствах, выращивающих картофель, и является вирусом, приносящим большой вред картофелеводству [4, 8].
ХВК относится к семейству Alphaflexiviridae, роду Potexvirus, является одним из широко распространённых вирусов во всех континентах, легко передаётся механически, контактным путём, а также почвенными грабами [1]. Является одним из фитопатогенных вирусов, приносящим большой вред картофелеводству. Основой разработки мер борьбы против этого вируса является изучение его распространения в определённых регионах и определение его естественных растений-резерваторов в этом регионе. Исследования, проведённые в последние годы, указывают на широкое распространение этих вирусных заболеваний картофеля в Узбекистане [9].
Исходя из вышеизложенного, целью исследований является изучение распространения и естественных растений-резерваторов ВСЛК и ХВК в некоторых районах Самаркандской области.
Материалы и методы исследования
Основные материалы для проведения ИФА: антитела к ХВК (IgG), конъюгат (IgG + фермент), полистироловые платы и химические реактивы, полученные из организaции Internotional Centre of Potato (CIP). Для выявления вируса методом ИФА, первоначально листья картофеля с симптомами поражения и листья индикаторных растений, зараженных с препаратом ХВК, который очищен из смещенных инфекций, были собраны в отдельные полиэтиленовые мешочки. Затем, добавляя фосфатный буфер (Ф.Б.) в соотношении 1:1 (состав для 1 литра – NaСl, KH2PO4, Na2HPO4, KCl, NaN3, рН-7,4), их гомогенизировали и приготовили гомогенат. В полистироловые платы иммобилизировали АТ вируса (IgG) в течение 5–6 ч при 37 °С, не связавшиеся антитела (АТ) смыли с помощью Ф.Б. с твином (на 1 литр Ф.Б. добавили 20 капель (0,5 мл) твина PBS-T). Затем налили гомогенат антигена (АГ), приготовленный из листьев определяемого растения, и инкубировали в течение 3–4 часов при 37 °С. Не связавшиеся АГ смыли Ф.Б. с твином. Затем в полистироловые платы налили конъюгат (IgG + фермент), поместили их в полиэтиленовые мешочки и хранили 3–4 ч при 37 °С. Не связавшиеся конъюгаты смыли Ф.Б. с твином. Затем в каждую полистироловую плату налили по 80 мкл субстрата (состав: диэтаноламин, 37 % HCl, дистиллированная вода и таблетки субстрата – р-нитрофенилфосфат) и наблюдали за проявлением реакции. Реакция проявлялась в течение 30–60 мин в виде изменения окраски. Результаты зафиксировались.
Результаты исследования и их обсуждение
Иммуноферментный анализ (ИФА) представляет собой иммунологический лабораторный тест, позволяющий идентифицировать разнообразные молекулы в биологических образцах. Метод основан на строгой специфичности взаимодействий между антигеном и антителом и ферментативных реакциях, ведущих к изменению окраски реакционной смеси.
На первом этапе антитела, специфичные для идентифицируемого фитопатогена, вносят в лунки пластиковых планшетов. Эти антитела, называемые антителами захвата (capture antibodies), прикрепляются к поверхности. После промывания и удаления избытка антител, в планшеты добавляют растительный материал, как правило, в виде сока или лизата, и, если в нём содержатся молекулы анализируемого патогена (антигены), они специфически связываются с антителами.
На следующем этапе к образовавшимся комплексам антител захвата и антигенов добавляют антитела детекции (detection antibodies), которые также специфичны для анализируемого антигена и связаны с ферментом, способным катализировать превращение бесцветного субстрата в окрашенное вещество. На заключительном этапе в лунки добавляют субстрат и отслеживают развитие окраски.
Таким образом, при наличии в растительном материале антигенов исследуемого фитопатогена, реакционная смесь становится окрашенной, тогда как образцы здоровых растений остаются прозрачными. Изменение окраски может быть измерено и её интенсивность прямо пропорциональна количеству антигена в растительном материале.
Анализ клубней требует больше времени: клубни должны быть сначала пророщены, а содержание вирусов определяется уже в полученных побегах. Необходимость проращивания клубней объясняется тем, что количество частиц вирусов в клубнях, как правило, ниже пределов чувствительности иммунологических методов анализа, тогда как инфицированные молодые побеги всегда содержат достаточное количество вирусов. Определение вирусного статуса клубней позволяет осуществлять как диагностику посадочного материала картофеля, так и диагностику семенного материала картофеля.
Вирусные заболевания картофеля представляют значительную опасность для сохранности посевных качеств и урожайности. Вирусы - это неклеточные организмы, которые могут воспроизводиться только внутри живых клеток, используя генетический материал хозяина для собственного размножения. Будучи мельчайшим из всех живых организмов, вирус состоит из нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК), заключённой в белковую оболочку. Поскольку вне клетки хозяина вирус не проявляет признаков живого организма и слишком мелок для световых микроскопов, диагностика картофеля для клонального размножения и анализ качества посадочного материала картофеля осуществляется лабораторными молекулярными методами: иммуноферментным анализом (ИФА) или полимеразной цепной реакцией (ПЦР).
Вирусы вызывают ряд общих симптомов на наземной части поражённого растения. Это, как правило, общее угнетение растения, скручивание, морщинистость или пятнистость (мозаичность) листьев. Симптомы могут быть типичными для какого-то определённого вируса, но, в большей степени, разные вирусы могут вызвать схожие симптомы. Более того, различные сорта картофеля могут по-разному реагировать на заражение одним и тем же вирусом. В некоторых случаях, вирусные инфекции протекают бессимптомно.
Несмотря на то, что вирусы редко убивают картофельное растение, они могут оказывать существенное негативное влияние на развитие растений, урожайность и качество клубней и являются основной причиной дегенерации (вырождения) картофеля. Поскольку картофель размножают вегетативно и возбудители болезней картофеля могут переходить в дочерние клубни, доля заражённых вирусами растений увеличивается по мере размножения посевного материала. Диагностика вирусов картофеля проводится для того, чтобы выяснить, заражен посевной материал или нет.
Производство и сертификация семенного картофеля требуют полного отсутствия вирусов в исходном материале и, по возможности, поддержания безвирусного статуса растений при их размножении. Введение картофеля в стерильную культуру с использованием апикальной меристемы в сочетании с термической обработкой позволяет получить безвирусный материал. Как правило, в развитых хозяйствах исходный материал культивируемых сортов поддерживается в стерильной культуре клональным размножением и новые партии семенного картофеля получают из этих тщательно контролируемых и свободных от вирусов и бактериальных патогенов фондов. Иммуноферментный анализ на вирусы картофеля обычно используется для контроля заболеваний в большинстве диагностических лабораторий.
На настоящий момент, известно более 50 видов вирусов картофеля, большинство из которых, либо не вызывают серьёзных проблем, либо имеют очень узкий ареал распространения. В России согласно ГОСТ Р 53136-2008 семенной материал высоких репродукций должен быть свободен от 5 вирусов: Y-, X-, S-, M-вирусов картофеля и вируса скручиваемости листьев картофеля.
Вирус Y (PVY) является одним из тяжелейших вирусов картофеля по степени воздействия на снижение урожайности. В зависимости от условий, сорта и присутствия других вирусов в поражённом растении потери могут достигать 70 %. Симптомы первичного заражения вирусом весьма разнообразны и определяются не только сортом картофеля и условиями культивирования, но и штаммом вируса. Как правило, это черно-коричневые угловатые некрозы листьев, пятнистость, пожелтение, пониклость или опадение листьев и преждевременное отмирание растений. Симптомы вторичного заражения выражаются в карликовости растения и пятнистости и морщинистости листьев. Симптомы заражения вирусом Y картофеля могут проявляться как на всём растении, так и на нескольких листьях или отдельных побегах.
Наряду с Y вирусом, вирус скручиваемости листьев картофеля (PLRV) один из самых тяжелых вирусов. Потери урожая при высоком уровне заражения могут достигать 50%. Симптомы, характерные для первичного и вторичного заражения различны. При первичном заражении, происходящем в текущем сезоне, как правило, повреждаются верхние листья – они скручиваются внутрь, бледнеют и, иногда, несколько краснеют. Вторичная инфекция, развивающаяся из заражённых клубней, протекает с гораздо более тяжёлыми симптомами – повреждение листьев начинается снизу и распространяется по всему растению. Листья скручиваются, бледнеют, краснеют и усыхают. Повреждённые растения формируют нормальные по форме, но более мелкие клубни. Развивается некроз флоэмы, который в клубнях носит название сетевой некроз.
Следующими по значимости являются вирусы Х (PVX) и А (PVA). Они проявляют схожие симптомы, выражающиеся в мозаичности листьев. Оба вируса встречаются везде, где выращивают картофель. Незначительные уровни инфекции практически не отражаются на урожайности, тогда как массовое поражение может приводить к потере урожайности на 20-40%. Однако, в развитых странах контроль за распространением этих вирусов позволил значительно снизить их влияние на выращивание картофеля.
Вирусы S и М, как правило, не проявляют симптомов и не оказывают серьёзного влияния на урожайность поражённых растений. Однако, эти вирусы усиливают негативные эффекты, вызванные другими вирусами в случае совместного заражения растений.
Вирусные болезни картофеля не поддаются лечению. Они передаются с насекомыми, в первую очередь, тлями и при механическом контакте с инфицированными растениями. Таким образом, профилактика и борьба с вирусными заболеваниями сводится к использованию здорового посадочного материала. Необходимы своевременный анализ качества семенного материала картофеля, контроль за появлением и распространением вирусов и своевременное удаление заболевших растений, уничтожение насекомых, аккуратность при проведении полевых работ и работ, связанных с хранением, обработкой и транспортировкой клубней.
Помимо вирусных существуют также инфекционные заболевания картофеля - вы можете ознакомиться с ними в соответствующем разделе.
Читайте также: