Иммунофлюоресцентный метод на грипп
Обновлено: 24.04.2024
Проведен анализ диагностического значения методов прямой иммунофлуоресценции и ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) с целью оптимизации диагностических подходов в тактике ведения больных острыми респираторными заболеваниями и гриппом. Для ранней диагност
Diagnostic meaning of direct immunofluorescence method and PCR with reverse transcription (RT-PCR) was analysed, targeted to optimize diagnostic approaches in the strategy of observing patients suffering from acute respiratory diseases and flu. RT-PCR method is more effective for early flu diagnostics.
Грипп занимает одно из ведущих мест в структуре инфекционной патологии человека. Во всех странах мира основной экономический ущерб от инфекционных заболеваний наносят именно грипп и острые респираторные вирусные инфекции (ОРВИ). В России на их долю приходится примерно 90% всей регистрируемой инфекционной заболеваемости. По данным официальной статистики в РФ ежегодно регистрируется от 900 тысяч до 3,5 млн случаев гриппа, при этом умирает от 20 до 53 тысяч человек в год [1].
Заболеваемость гриппом существенно колеблется в разное время года, увеличиваясь, как правило, в осенне-зимнее время. Тем не менее, случаи гриппа могут регистрироваться даже в межэпидемический период. История изучения гриппа уходит своими корнями еще в средние века. Первая эпидемия, о которой мы знаем, имела место в 1889–1890 гг. и была вызвана подтипом вируса гриппа А (H2N8) [2]. Благодаря уникальным свойствам вируса гриппа А и прежде всего его способности к изменению антигенной структуры, специфический иммунитет, приобретенный после перенесенного заболевания, практически не защищает от инфицирования новым штаммом вируса гриппа. Во время ежегодных вспышек и эпидемий гриппа и других ОРВИ заболевает каждый 10-й взрослый и каждый 3-й ребенок [3]. По данным ВОЗ, во время сезонных эпидемий, вызванных различными вирусами гриппа, в мире ежегодно умирают от 250 до 500 тысяч (большинство из них в возрасте старше 65 лет), причем в некоторые годы число смертей может достигать миллиона [4]. Пандемии гриппа возникают каждые 30–40 лет и характеризуются высокими показателями заболеваемости и смертности [5].
В настоящее время существуют различные противовирусные препараты для лечения гриппа. Их можно разделить на три группы: этиотропные — ингибиторы нейраминидазы (осельтамивир, занамивир, перамивир), блокатор ионного канала, образованного белком М2 (Ремантадин, Альгирем), ингибиторы NP-белка (Ингавирин), ингибитор гемагглютинина (Арбидол); препараты интерферона (рекомбинантные альфа/гамма-интерфероны); индукторы интерферонов (Кагоцел, Амиксин, Циклоферон). Наиболее эффективна противовирусная терапия, начатая в первые 24–48 часов от начала заболевания, которая позволяет существенно сократить продолжительность лихорадки и других клинических симптомов заболевания [6].
Именно поэтому необходимость точной и своевременной диагностики гриппа не вызывает сомнений. На сегодняшний день в клинической практике чаще всего используется метод прямой иммунофлуоресценции (ИФ) и, намного реже, метод полимеразной цепной реакции (ПЦР).
Как известно, метод ИФ предложил А. Кунс еще в 1941 г. Реакция ИФ основана на связывании антигена с антителом, конъюгированным с флуоресцентной меткой (флуорохромом, например, флюоресцеина изотиоционатом (FITС), тетраметилродамин изотиоционатом (TRITC) и др.). Сегодня для проведения этой реакции используют как поликлональные сыворотки, так и моноклональные антитела. Учет результатов реакции осуществляется с помощью люминесцентного микроскопа, в оптическую систему которого устанавливается набор светофильтров, обеспечивающих освещение препарата ультрафиолетовым или сине-фиолетовым светом с заданной длиной волны [7].
Метод ПЦР был разработан сотрудником фирмы Cetus K. Mullis в 1983 г. Существуют различные модификации этой реакции. В настоящее время используют ПЦР с обратной транскрипцией в режиме реального времени (ОТ-ПЦР), суть которой заключается в амплификации определенных участков ДНК в процессе повторяющихся температурных циклов [8, 9].
Настоящее исследование посвящено сравнительному анализу диагностического значения методов прямой ИФ и ОТ-ПЦР с целью оптимизации диагностических подходов в тактике ведения больных острыми респираторными заболеваниями и гриппом.
Материалы и методы
Всем пациентам, включенным в исследование, проводилось стандартное общеклиническое обследование: сбор анамнеза заболевания, объективный осмотр, анализ клинической картины в сопоставлении с данными лабораторно-инструментальных методов исследования (общие анализы крови и мочи, рентгенологическое исследование органов грудной клетки). Для оценки степени дыхательной недостаточности больным проводилась пульсоксиметрия. При наличии у пациента пневмонии по данным рентгенологического исследования органов грудной клетки дополнительно назначался биохимический анализ крови (определение уровней аланинаминотрансферазы (АлАТ), аспартатаминотрансферазы (АсАТ), мочевины, креатинина, креатининфосфокиназы), а также анализ крови для оценки кислотно-основного состояния и электролитов.
Результаты
Для проведения сравнительного анализа методов прямой ИФ и ОТ-ПЦР группа больных (n = 140), в которой были применены одновременно эти две методики с целью уточнения этиологии основного заболевания, была разделена на три подгруппы: 1-я подгруппа — пациенты, у которых диагностика гриппа двумя методиками проводились в один день; 2-я подгруппа — пациенты, которым ПЦР было выполнено раньше метода ИФ на 1–2 суток; 3-я подгруппа — пациенты, которым метод прямой ИФ был проведен раньше ПЦР на 1–2 суток. Результаты исследования эпителия носоглотки методами прямой ИФ и ОТ-ПЦР у 140 больных, включенных в исследование, представлены в табл. 1–3.
Как видно из табл. 1, в группе больных (n = 20), которым ОТ-ПЦР и исследование методом прямой ИФ проводили в один день и в первые 3 дня от начала заболевания, грипп был лабораторно подтвержден тем или иным методом у 17 (85%) пациентов, при этом большая часть (82%, 14/17) положительных результатов получена при использовании метода ОТ-ПЦР. Совпадение результатов исследований методов прямой ИФ и ОТ-ПЦР регистрировалось только в 11,8% (2/17) случаев, в то время как в 70,6% (12/17) случаев методом прямой ИФ антигены вируса гриппа выявить не удалось.
В группе больных, которым ОТ-ПЦР и исследование методом прямой ИФ проводили в один день и на 4–5 сутки от начала заболевания, грипп был лабораторно подтвержден тем или иным методом у 28 (75,7%) пациентов, при этом большая часть положительных результатов (92,9%, 26/28) также была получена при использовании метода ОТ-ПЦР. Совпадение результатов исследований методов прямой ИФ и ОТ-ПЦР регистрировалось в 10,7% (3/28) случаев, а в 82,1% (23/28) выявить антигены вируса гриппа методом прямой ИФ не удалось.
В группе больных (n = 11), которым ОТ-ПЦР и исследование методом прямой ИФ проводили в один день и позже 5 суток от начала заболевания, грипп был лабораторно подтвержден тем или иным методом у всех пациентов. При использовании метода ОТ-ПЦР этиология была установлена у 90,9% (10/11) больных, совпадение результатов двух методик регистрировалось в 3 (27,3%) случаях.
Как видно из табл. 2, в группе пациентов (n = 11), которым ОТ-ПЦР было проведено раньше исследования методом прямой ИФ на 1–2 дня и на 1–3 сутки от начала заболевания, при помощи последнего выявить антигены вируса гриппа не удалось ни у одного пациента, в то время как при использовании метода ОТ-ПЦР генетический материал вируса гриппа был выявлен у 9 (81,8%) больных.
В группе больных (n = 39), которым ОТ-ПЦР было проведено раньше исследования методом прямой ИФ на 1–2 дня и на 4–5 сутки от момента заболевания, грипп был лабораторно подтвержден тем или иным методом в 76,9% случаев, при этом большинство положительных результатов (90%, 27/30) получено при использовании метода ОТ-ПЦР. Совпадение результатов исследований методов прямой ИФ и ОТ-ПЦР регистрировалось лишь в 4 (13,3%) случаях.
В группе пациентов (n = 18), которым ОТ-ПЦР было проведено раньше исследования методом прямой ИФ на 1–2 дня и позже 5 суток от начала заболевания, грипп лабораторно подтвержден тем или иным методом у 77,8% (14/17) больных, при этом большинство положительных результатов также было получено при использовании метода ОТ-ПЦР. Совпадение результатов исследований методов прямой ИФ и ОТ-ПЦР регистрировалось в 14,3% (2/14) случаев.
Среди всех больных с диагностированным гриппом доля положительных результатов ОТ-ПЦР-исследования составляет от 77,8% до 100%. При этом основную группу (78,9%, 90/114) составили пациенты, у которых методом ОТ-ПЦР был выявлен генетический материал вируса гриппа, в то время как антигены вируса гриппа при проведении прямой ИФ идентифицировать не удавалось. Доля лабораторно-подтвержденных случаев гриппа методом прямой ИФ (среди всех подтвержденных случаев как методом прямой ИФ, так и ОТ-ПЦР) составила 21,1%. Полученные результаты свидетельствуют о больших диагностических возможностях метода ОТ-ПЦР у больных гриппом, и что немаловажно, независимо от дня болезни при наличии клинической картины острого заболевания.
Меньшие диагностические возможности метода прямой ИФ объясняются самим механизмом реакции. Антитела взаимодействуют с антигеном в местах их локализации. Эти места выявляют при помощи метки, связанной с антителами. Это наиболее простой метод визуализации, однако чувствительность его крайне низкая, так как на одну молекулу искомого антигена будет приходиться одно меченое антитело [7]. Достоинством метода ОТ-ПЦР является необязательность условия наличия большого количества возбудителя в клетках эпителия, так как сам метод предусматривает увеличение количества копий ДНК/РНК возбудителя (амплификация) с последующей его детекцией [8, 9]. Так как оба метода используются преимущественно для ранней диагностики гриппа, что принципиально для своевременного назначения противовирусной терапии, то, безусловно, клиницист отдаст свое предпочтение тому методу, который позволяет это сделать с наибольшей вероятностью.
Также необходимо учитывать, что большая разница в частоте лабораторного подтверждения гриппа, свидетельствующая о низкой диагностической возможности метода прямой ИФ, может быть объяснена вероятностью перекрестных реакций, быстрым разрушением флуоресцентной метки, субъективностью оценки результатов реакции. Последний фактор зависит непосредственно от квалификации врача-лаборанта, проводящего исследование. Помимо этого проведение прямой ИФ — весьма трудоемкий неавтоматизированный процесс, требующий больших временных затрат от специалиста. По сравнению с методом прямой ИФ ОТ-ПЦР является автоматизированным высокочувствительным методом, дающим возможность выявлять даже единичные копии ДНК/РНК возбудителя на поздних сроках от начала заболевания. ОТ-ПЦР обладает высокой специфичностью, что обусловлено определением участка гена, характерного только для данного возбудителя.
Выводы
- Для ранней диагностики гриппа большую диагностическую ценность демонстрирует метод ОТ-ПЦР по сравнению с методом прямой ИФ.
- Для оптимизации лечебной тактики ведения больных c гриппом целесообразно широкое внедрение метода ОТ-ПЦР в клиническую практику.
- Оптимальные сроки обследования — первые 5 дней болезни, однако при наличии клинической симптоматики гриппа метод ОТ-ПЦР информативен и на более поздних сроках заболевания.
Работа выполнена в рамках гранта Президента Российской Федерации для государственной поддержки ведущих научных школ Российской Федерации (протокол № 1 от 19 марта 2010 г.) по соглашению № 16.120.11.5354-НШ от 01.02.2012 г.
Литература
Н. Д. Ющук*, доктор медицинских наук, профессор, академик РАМН
Н. О. Бокова*
О. О. Знойко*, доктор медицинских наук, профессор
К. Р. Дудина*, доктор медицинских наук
Г. Н. Кареткина*, кандидат медицинских наук, доцент
Е. А. Климова*, доктор медицинских наук, профессор
М. Г. Кулагина*, кандидат медицинских наук, доцент
В. И. Каширин**
О. А. Филиппова**
О. А. Сафонова**
В. Е. Маликов**, кандидат медицинских наук
*ГБОУ ВПО МГМСУ им. А. И. Евдокимова Минздравсоцразвития России,
**ГКУЗ ИКБ № 1 Департамента здравоохранения города, Москва
Диагностика гриппа. Лечение гриппа. Профилактика гриппа.
Материалы для исследования при гриппе — смывы и мазки из носоглотки, мазки-отпечатки из носовой полости и кровь.
Основные методы диагностики гриппа — вирусоскопические, вирусологические и серологические. К методом экспресс-диагностики гриппа относят определение Аг вируса в мазках-отпечатках из носа и смывов носоглотки в РИФ и ИФА.
Выделение возбудителя гриппа проводят заражением 10-11-суточных куриных эмбрионов или, реже, различных клеточных культур. Вирусы гриппа проявляют слабый цитопатический эффект и чаще определяют феномен гемадсорбции. Типовую принадлежность вирусов идентифицируют в РСК; подтип гемагглютинина — в РТГА (вирусы гриппа агглютинируют эритроциты человека и различных животных); подтип нейраминидазы — в реакции ингибирования активности фермента.
Лечение гриппа
Препараты выбора при лечении гриппа —- амантадин или ремантадин, ИФН и его индукторы, противогриппозный у-глобулин. Терапевтические мероприятия следует начинать как можно раньше.
Профилактика гриппа. Иммунопрофилактика гриппа.
Разработаны методы активной и пассивной иммунопрофилактики гриппа. Для пассивной иммунизации применяют противогриппозный иммуноглобулин человека, приготовленный из крови доноров, иммунизированных гриппозными вакцинами.
Для активной иммунизации против гриппа применяют живые и инактивированные вакцины. Живые аттенуироеанные вакцины проявляют большую иммуногенность. Инактивированные вакцины включают вирионные (приготовлены из высоко-очищенных культур вирусов), субвирионные или расщеплённые (получают обработкой высоко-очищенных культур вирусов детергентами), субъединичные (содержат только гемагглютинин и нейраминидазу) препараты. Вакцинацию осуществляют в периоды наибольшего риска развития эпидемий. Она в большей степени показана лицам младшего и преклонного возраста, страдающим обструктивными лёгочными и сердечно-сосудистыми заболеваниями, а также сотрудникам ЛПУ.
Применение убитых вакцин от гриппа требует ежегодной ревакцинации; их эффективность не превышает 60-70%. Поскольку антигенные вариации возбудителя наблюдают часто, то набор Аг соответствующего вируса для иммунизации может быть определён только после начала вспышки заболевания.
Выявление противовирусных антител ( AT ) в сыворотке крови. РТГА. РСК. РИФ. Иммуносорбционные методы выявления противовирусных антител.
Более простой и доступный подход — выявление противовирусных антител ( AT ) в сыворотке. Образцы крови необходимо отбирать дважды: немедленно после появления клинических признаков и через 2~3 нед. Чрезвычайно важно исследовать именно два образца сыворотки. Результаты однократного исследования нельзя считать окончательными из-за невозможности связать появление AT с настоящим случаем. Вполне возможно, что эти AT циркулируют после предшествующей инфекции. В подобной ситуации роль исследования сыворотки, полученной в период рекон-валесценции, трудно переоценить. На наличие заболевания в период отбора первой пробы указывает не менее чем четырёхкратное увеличение титра AT, выявленное при исследовании второй пробы.
Перечисленные ниже методы не позволяют дифференцировать антитела ( AT ), образующиеся во время болезни и циркулирующие после выздоровления (продолжительность этого периода вариабельна для различных инфекций). Поскольку для адекватной диагностики необходимо подтвердить достоверное увеличение титров AT в двух пробах, то первую пробу исследуют в острой фазе, а вторую — в период выздоровления (через 2-3 нед). Полученные результаты носят ретроспективный характер и более пригодны для проведения эпидемиологических обследований.
РТГА выявляет AT, синтезируемые против гемагглютининов вирусов (например, вируса гриппа). Метод позволяет легко выявлять подобные антитела ( AT ) в сыворотке больного.
РСК — основной метод серодиагностики вирусных инфекций (среди доступных). Реакция выявляет комплементсвязывающие IgM и IgG, но не дифференцирует их; для оптимизации получаемых результатов постановка реакции требует определённых навыков персонала.
РИФ. При возможности получить биоптат инфицированной ткани и доступности коммерческих наборов AT, меченных флюоресцеином, диагноз может подтвердить реакция прямой иммунофлюоресценции. Постановка реакции включает инкубацию исследуемой ткани с AT, их последующее удаление и люминесцентную микроскопию образца.
Иммуносорбционные методы выявления противовирусных антител
Иммуносорбционные методы (например, ИФА и РИА) более информативны, поскольку выявляют IgM и IgG по отдельности, что позволяет делать определённые выводы о динамике инфекционного процесса или состоянии реконвалесценции. Для выявления AT известный Аг сорбируют на твёрдом субстрате (например, на стенках пробирок, пластиковых микропланшетах, чашках Петри) и вносят различные разведения сыворотки пациента. После соответствующей инкубации несвязавшиеся AT удаляют, вносят антисыворотку к Ig человека, меченную ферментом, повторяют процедуру инкубирования и отмывания несвязанных AT и вносят какой-либо хромогенный субстрат (чувствительный к действию фермента). Поскольку изменение окраски пропорционально содержанию специфических AT, то вполне возможно определение их титра спектрофотометрическим способом. В диагностике ВИЧ-инфекции наи- большее распространение нашёл метод иммуноблотннга.
Информация на сайте подлежит консультации лечащим врачом и не заменяет очной консультации с ним.
См. подробнее в пользовательском соглашении.
Клиника и диагностика гриппа. Современное лечение гриппа
Болезнь чаще всего начинается внезапно, ознобом и быстрым повышением температуры до высоких цифр, головной болью с локализацией в области лба и глазниц, мышечной болью, резкой слабостью. Ведущим синдромом является общая интоксикация, катаральные явления со стороны верхних дыхательных путей менее выражены. Интоксикация достигает апогея в первые-вторые сутки. В тяжелых случаях появляются головокружение, тошнота, возможны рвота, носовые кровотечения, нарушения сна, сознания, судороги.
Объективные данные обычно скудные: легкая одутловатость и гиперемия лица, глаза блестящие, кожа горячая и влажная. В первый день-тахикардия, а затем брадикардия; тоны сердца приглушены, АД вначале повышено, а позднее понижено. Несколько позднее присоединяются катаральные воспаления слизистых оболочек верхних дыхательных путей: насморк со скудным отделяемым, заложенность носа, першение в горле, болезненность за грудиной (трахеит), сухой болезненный кашель, охриплость, чувство стеснения в груди, одышка. Слизистые оболочки носа, глотки, гортани, особенно трахеи отечны и гиперемированы, иногда с кровоизлияниями.
В неосложненных случаях температура постоянного или ремитирующего характера длится 3-4 дня, реже 6-7 дней и снижается литически. Иногда температурная кривая имеет двугорбый характер.
Клинические проявления могут варьировать, что наиболее полно отражено в классификации, предложенной Ф.Г. Эпштейном. В зависимости от типа вируса, возраста больных и иммунитета формы гриппа могут быть бессимптомными (афебрильная форма гриппа), без выраженных катаральных явлений (акатаральная форма), тяжелые гиперпиретические с быстрым летальным исходом.
Наиболее частыми осложнениями гриппа являются бактериальные суперинфекции (пневмонии, другие очаговые инфекции).
В практике используют чаще всего серодиагностику, применяя метод исследования парных сывороток (кровь у больного берется в первые дни и спустя 5-7 дней); осуществляют постановку РТГА, РСК и др. Возможна экспресс-диагностика: берут мазки-отпечатки со слизистой носа и проводят иммунолюминес-центное исследование - свечение вируса гриппа наблюдается в цитоплазме, тогда как при аденовирусных инфекциях- в ядре. Для определения циркулирующего штамма вируса в данном эпидемическом сезоне проводят вирусологические исследования смывов из ротоглотки и материала, полученного тампоном из носа. Проводят заражение куриных эмбрионов и культур тканей.
Современное лечение гриппа
Во время лихорадки и спустя 2 дня больной гриппом должен соблюдать постельный режим. При гриппе, независимо от тяжести течения, работающим выдают лист нетрудоспособности на 5 дней, при необходимости его продлевают. Лечение основной массы больных проводится на дому. Показанием для госпитализации является тяжелое течение гриппа, наличие сопутствующих заболеваний легких, сердечнососудистой системы и др., при которых высока степень их обострений.
Рекомендуется молочно-растительная витаминизированная (особенно витамином С) диета, обильное питье теплой подкисленной жидкости (чай с лимоном, клюквенный морс, фруктовые соки без консервантов). Показано горячее питье из плодов малины, калины, эвкалипта, цветов ромашки и др., а также горячее молоко с медом.
Назначение противовирусных препаратов показано при тяжелом течении гриппа и больным гриппом с сопутствующими заболеваниями, обострение которых может представлять угрозу для жизни больного. При гриппе А хорошо зарекомендовали препараты этиотропного действия: ремантадин внутрь по схеме. В самом начале болезни показано применение человеческого лейкоцитарного или рекомбинантного интерферона по 3-5 капель в каждый носовой ход через 1-2 ч в течение 2-3 дней. Для лечения ринита используют оксалиновую мазь. При затрудненном носовом дыхании галазолин, нафтизин, эфедрин в виде капель в носовые ходы. Жаропонижающие препараты назначают только при гиперпирексии (аскофен, аспирин, парацетамол и др.); при температуре до 38,5°С назначение их нецелесообразно, так как лихорадочная реакция носит защитно-приспособительный характер (усиливается, в частности, выработка эндогенного интерферона).
Всем больным гриппом показано назначение поливитаминов, особенно аскорбиновой кислоты до 1,0 г в сутки. При мучительном кашле - кодтерпин, коделак, либексин и др. При нарушении сна - микстуру Бехтерева, валокордин.
Проводят дезинтоксикационную терапию: полиглюкин, реополиглюкин, 5% раствор глюкозы, гемодез, плазму в объеме парентерально вводимой жидкости не более 500-800 мл в сутки. Назначают сердечно-сосудистые препараты (коргликон, кордиамин, солюкамфокаин и др.); оксигенотерапию, при геморрагических проявлениях - аскорутин.
Антибактериальные средства назначают только при осложненных формах гриппа; назначение антибиотиков с целью профилактики осложнений недопустимо, так как они профилактическим действием не обладают.
Читайте также: