Исследование мутаций гепатит в
Обновлено: 27.03.2024
Для данного исследования лаборатория принимает следующий биоматериал:
Подготовка к исследованию
Не менее 3 часов после последнего приема пищи. Можно пить воду без газа.
- 030108 ДНК HBV, определение мутаций устойчивости к противовирусным препаратам заказывается одновременно с исследованием 030104 ДНК HBV, количественное определение. На момент выполнения исследования концентрация ДНК HBV в плазме крови должна составлять более 150 МЕ/мл.
- При вирусной нагрузке менее 150 МЕ/мл 030108 ДНК HBV, определение мутаций устойчивости к противовирусным препаратам не выполняется.
Метод исследования
Лекарственная устойчивость (резистентность) - природная или приобретенная способность возбудителя болезни сохранять жизнедеятельность при воздействии на него лекарственных средств. Как правило, этиотропное лечение хронического гепатита В (ХГВ) основывается на применении аналогов нуклеозидов/нуклеотидов - ингибиторов РНК-зависимой ДНК-полимеразы (обратной транскриптазы), которая кодируется Р-геном вируса гепатита В (HBV). Противовирусный препарат (ПВП), являясь конкурентом с естественными нуклеозидами/нуклеотидами, встраивается в синтезируемую ферментом цепь РНК или ДНК, ингибирует прохождение обратной транскрипции и синтез вирусного генома, т.е. эти лекарственные препараты эффективно снижают вирусную нагрузку у больных ХГВ. Однако продолжительные курсы лечения могут приводить к развитию устойчивости (резистентности) вируса к применяемым аналогам нуклеозидов/нуклеотидов.
Мутации лекарственной устойчивости подразделяются на:
- основные (первичные) – мутации, снижающие чувствительность к противовирусному препарату;
- компенсаторные (вторичные) – мутации, которые компенсируют функциональные дефекты активности полимеразы, связанные с появлением первичной мутации.
Мутации устойчивости определяются по номеру позиции аминокислоты в домене обратной транскриптазы вирусной полимеразы, причем аминокислота дикого типа указывается слева от номера аминокислоты, вариант мутации устойчивости – справа. Например, M204I – замена метионина (М), аминокислоты дикого типа, в 204 положении домена обратной транскриптазы на изолейцин (I), наличие которого в данной позиции ассоциировано с возникновением мутаций лекарственной устойчивости к определенным ПВП.
Информация о наличии мутаций лекарственной устойчивости в геноме HBV необходима для выбора оптимальной тактики лечения и своевременной коррекции схемы лечения при ХГВ.
Показания к исследованию:
Исследование предназначено для больных ХГВ в определенных случаях перед началом противовирусной терапии (ПВТ) и во время приема противовирусных препаратов (ПВП):
Срок | Показания |
---|---|
Перед началом ПВТ | Предыдущее лечение аналогами нуклеозидов/нуклеотидов было неэффективным |
Во время проведения ПВТ | Выявлено наличие первичной резистентности 1 |
Наблюдается вирусологический рецидив 2 |
1 Снижение концентрации ДНК HBV менее чем на 1 log10 от начального уровня на 12-ой неделе ПВТ.
2 Подтвержденное возрастание концентрации ДНК HBV более чем на 1 log10 от минимального уровня, достигнутого в процессе ПВТ.
В результате проведенного исследования врач получает информацию о наличии устойчивости HBV к следующим противовирусным препаратам – ламивудину, телбивудину, энтекавиру, адефовиру и тенофовиру, а также информацию по каждой аминокислотной позиции, ассоциированной с мутацией лекарственной устойчивости. Результат исследования выдается в виде таблицы, состоящей из трех частей.
- R – вирус гепатита В устойчив к противовирусному препарату (мутации устойчивости к этому препарату обнаружены);
- S - вирус гепатита В чувствителен к противовирусному препарату (референсное значение, мутации устойчивости не обнаружены);
- I – у вируса гепатита В возможно возникновение устойчивости к противовирусному препарату (т.е. выявлены только компенсаторные (вторичные) мутации устойчивости к этому препарату, основных мутаций не обнаружено).
- 030108 ДНК HBV, определение мутаций устойчивости к противовирусным препаратам заказывается одновременно с исследованием 030104 ДНК HBV, количественное определение. На момент выполнения исследования концентрация ДНК HBV в плазме крови должна составлять более 150 МЕ/мл.
- При вирусной нагрузке менее 150 МЕ/мл 030108 ДНК HBV, определение мутаций устойчивости к противовирусным препаратам не выполняется.
Лекарственная устойчивость (резистентность) – природная или приобретенная способность возбудителя болезни сохранять жизнедеятельность при воздействии на него лекарственных средств. Как правило, лечение ХГВ проводится с применением аналогов нуклеозидов/нуклеотидов – ингибиторов РНК-зависимой ДНКполимеразы (обратной транскриптазы), которая кодируется Р-геном ВГВ. Противовирусный препарат встраивается в вирусный геном в процессе обратной транскрипции, и конкурентно ингибирует вирусную репликацию, т. о. эти лекарственные препараты эффективно снижают вирусную нагрузку у больных ХГВ. При возникновении некоторых точечных мутаций в Р-гене ВГВ аналоги нуклеозидов/нуклеотидов теряют способность встраиваться в растущую цепь ДНК вследствие конформационного изменения локуса связывания обратной транскриптазы. Мутации лекарственной устойчивости подразделяются на:
- основные (первичные) – мутации, снижающие чувствительность к противовирусному препарату;
- компенсаторные (вторичные) – мутации, которые компенсируют функциональные дефекты активности полимеразы, связанные с появлением первичной мутации.
Мутации устойчивости определяются по номеру позиции аминокислоты в домене обратной транскриптазы, причем аминокислота дикого типа указывается слева от номера аминокислоты, вариант мутации устойчивости – справа. Например, M204I – замена метионина, аминокислоты дикого типа, в 204 положении домена обратной транскриптазы на аминокислоту изолейцин, наличие которой в данной позиции ассоциировано с возникновением мутации лекарственной устойчивости.
Информация о наличии мутаций лекарственной устойчивости в геноме ВГВ необходима при выборе препаратов противовирусной терапии у пациентов, ранее получавших аналоги нуклезидов/нуклеотидов.
Показания к обследованию
Исследование предназначено для больных ХГВ в определенных случаях перед началом противовирусной терапии и во время приема противовирусных препаратов (Табл. 8).
Критерии назначения исследований для определения устойчивости ВГВ к противовирусным препаратам
Стадия ПВТ | Характеристика пациента | Назначение исследования |
---|---|---|
До начала ПВТ | Пациент лечения ранее не получал | Нет |
Ранее прерванное лечение | Да | |
Неудачное лечение | Да | |
Во время приема ПВП | Первичная резистентность (12 неделя ПВТ) | Да* |
Вирусологичесий рецидив | Да |
*Если пациент сохраняет приверженность к лечению.
Материал для исследования Плазма крови.
Методы лабораторных исследований
В клинической диагностике определение мутаций устойчивости вируса гепатита В к противовирусным препаратам включает ПЦР-амплификацию ревертазного домена Р-гена ВГВ и последующий анализ специфичных нуклеотидных последовательностей методами:
- прямого секвенирования амплифицированного фрагмента. Данный метод способен выявлять мутации устойчивости, если доля популяции вируса с мутацией составляет более 20%. Метод позволяет идентифицировать все мутации, включая дополнительные потенциальные компенсаторные и новые неизвестные;
Особенности интерпретации результатов
В результате проведенного исследования врач получает информацию по каждой аминокислотной позиции, ассоциированной с мутацией лекарственной устойчивости, и клиническую интерпретацию результатов исследования:
Мутации вируса гепатита В. Генетическая изменчивость ВГВ
Мутантом (от лат. mutare — меняться) называют ген, хромосому, организм или популяцию, отличающуюся от соответствующего дикого типа одним или более генетическим изменением — мутацией. Мутация — это относительно устойчивое и передающееся по наследству изменение генетического материала, представляющее собой биохимическое изменение в кодоне или физическое изменение в межхромосомных взаимоотношениях. Мутации HBV в современной научной литературе описывают довольно часто.
Установлено, что HBV подвержен более частым мутациям, чем предполагалось ранее, поскольку для его репликации необходима обратная транскрипция РНК-прегенома — процесс, при котором вероятность ошибок считывания весьма высока. Эта вероятность, как установлено, составляет 2x10-4 замен оснований на сайт в год, то есть на 4 порядка превышает частоту мутаций других ДНК-вирусов, хотя и не достигает частоты мутаций РНК вирусов.
Наличие длинных участков делеций свидетельствует о присутствии и других механизмов мутагенеза. Это могут быть ошибки считывания на других этапах репликации, действие клеточной топоизомеразы и сплайсинг генов с альтернативными донорными и акцепторными сайтами. Мутации могут возникнуть также в результате рекомбинации между коинфицирующими штаммами. Мутации HBV не ограничиваются отдельными ОРС и происходят во всех генах вируса и регуляторных элементах.
Среду мутантов HBV, выделяемых от пациентов как с острой (фульминантной), так и хронической инфекцией, различают 4 группы: мутанты генов pre-сorе и core, мутанты генов preS и S (поверхностных) белков, мутанты генов полимеразы/обратной транскриптазы и мутанты гена X. Нередко у одного пациента мутанты сосуществуют с вирусами дикого типа. Фактически слугаи инфекции с угастием мутантных штаммов вируса следует рассматривать как микст-инфекцию с разными исходными ДНК, взаимодействующими друг с другом путем trans-активации и рекомбинации.
Впервые мутанты HBV обнаружены у пациентов с хроническим гепатитом В, в крови которых выявляли вирусную ДНК на фоне отсутствия серологических признаков текущей или перенесенной инфекции (т. е. HBsAg и анти-HBs). Поскольку HBV может персистировать в организме в течение нескольких лет и даже десятилетий, мутации способны накапливаться и становиться клинически значимыми.
Точечные мутации в S-гене представляют наибольший интерес для практического здравоохранения, поскольку они способны влиять на иммуногенность HBsAg и, особенно, его детерминанты а, к которой вырабатываются протективные антитела. Для того чтобы объяснить, как мутация в одном участке гена может влиять на структуру двух или более удаленных друг от друга эпитопов, была предложена новая модель большого гидрофильного региона (БГР) S-белка.
Исходная модель детерминанты а белка S предполагала наличие двухпетлевой структуры в районе аминокислотных остатков 124-147 с дисульфидными мостиками между аминокислотными остатками 124 и 137. В соответствии с вновь предложенной моделью (36), которая не отрицает возможного наличия дисульфидных мостиков, большой гидрофильный регион белка S (аминокислотные остатки 100-160 или 169) рассматривают как паутиноподобную структуру, образованную цистеиновыми остатками в позициях 107, 137, 138, 139 и 149 и локализованную на наружной оболочке вириона. Пептидные петли, образованные аминокислотными остатками 107-137 и 139-147, формируют выступы на оболочке вириона, а еще одна плотная петля образована аминокислотными остатками 121-124.
Современная диагностика гепатита В. Выявление HBsAg
Серологическая диагностика гепатита В в настоящее время строится на основании определения маркеров НВ-вирусной инфекции, как правило, с помощью имуноферментного анализа, то есть антигенов вируса гепатита В или антител к ним в биологических субстратах, главным образом, в сыворотке крови. В качестве основных маркеров гепатита В, имеющих самостоятельное значение для серологической диагностики, сегодня признаны:
HBsAg (поверхностный антиген вируса гепатита В) — основной маркер, свидетельствующий о наличии вируса гепатита В. При остром гепатите В HBsAg можно обнаружить еще в продромальном периоде, и длительность его персистенции при неосложненном течении составляет до 10 недель;
HBeAg — показатель высокой степени активности инфекционного процесса. Маркер репликации HBeAg определяется, как правило, при наличии HBsAg, однако циркулирует в крови менее продолжительное время — в среднем 4 недели;
anti-HBc класса IgM — показатель острого инфекционного процесса или, при хронических формах гепатита В, косвенный показатель активной репликации HBV. Возможна их длительная циркуляция;
anti-HBe — не являются показателем, характеризующим какое-либо конкретное состояние при гепатите В. Эти антитела могут быть и в конце острого гепатита В и при хроническом гепатите и в случаях, так называемого здорового носительства HBsAg.
Хронический гепатит В: в фазу обострения наблюдается следующий профиль маркеров: HBsAg, HBeAg, DNA HBV, anti-HBc IgM и суммарные. В период стихания процесса обнаруживаются HBsAg, anti-HBc IgG (суммарные), возможна сероконверсия HBeAg на anti-HBe.
В основе всей серологигеской диагностики гепатита В: как острых, так и хронигеских форм—лежит определение HBsAg. Современные иммуноферментные тест-системы позволяют выявлять HBsAg в концентрациях до 0,1 нг/мл. Схема определения у разных тест-систем, как правило, одна и та же. В качестве иммуносорбента используются антитела к HBsAg. Как правило, применяются моноклональные антитела.
Именно они обеспечивают строгую специфичность применяемых в настоящее время диагностических наборов.
ПЦР (полимеразная цепная реакция) в диагностике гепатита В
Метод полимеразной цепной реакции используют для подтверждения НВ-вирусной инфекции, наличия репликации вируса при остром и хроническом гепатите В, а также определения эффективности курса лечения. Наибольшей чувствительностью обладает двойной нестед-метод, который предполагает использование двух пар праймеров. Чувствительность нестедметода весьма высока и позволяет выявлять несколько копий DNA HBV в образце, что существенно превосходит возможности ИФА.
Сегодня разработаны соответствующие технологии производства отечественные тест-системы для детекции DNA HBV с помощью ПЦР, которые активно применяются в практическом здравоохранении. Высокая чувствительность ПЦР-диагностики при гепатите В расширила возможности раннего определения вируса гепатита В при острой инфекции. Длительность инкубационного периода при гепатите В достигает 6 месяцев, а в ряде случаев и больше. В это время вирус попадает в кровь, проникает в клетки печени, запускается механизм репликации, и в результате размножение приобретает устойчивый характер.
Эти процессы не затрагивают в значительной степени жизнедеятельность печени и других органов в течение длительного времени. В этот период эффекторные реакции иммунной системы организма не задействованы. Число вирусных частиц резко возрастает к концу инкубационного периода и становятся максимальными. В этот период методом ПЦР можно обнаружить в крови вирус гепатита В, тогда как остальные маркеры НВ-вирусной инфекции, главным образом серологические, ещё отсутствуют. Таким образом, с помощью полимеразной цепной реакции стала возможной более ранняя диагностика острого гепатита В.
Варианты HBsAg гепатита В и их распространение
Серологическая гетерогенность вируса гепатита В установлена в 1971 году G. L. Le Bouvier, когда им были описаны две взаимоисключающие субдетерминанты d и у. В 1972 году W. Н. Bancroft et al. выявили еще две дополнительные субдетерминанты — w и r.
Наличие общей детерминанты a HBsAg и двух пар взаимоисключающих детерминант d или у и w или r приводит к существованию 4 серотипов или, как их еще называют, субтипов: adw, ayw, adr, ayr. Общеизвестные серотипы вируса иногда ошибочно называют генотипами.
Между тем, генетический анализ вирусов четырех вышеупомянутых серотипов не выявил четкого соответствия между определенными генотипами и серотипами. В настоящее время известно 6 генотипов (A-F) и 9 серотипов HBV.
Сегодня, с учетом данных о ряде аминокислотных замен, приводящих к образованию нескольких минорных субдетерминант, выделено девять основных субтипов HBsAg — ayw1, ayw2, ayw3, ayw4, ayr, adw2, adw4, adrq-v, adrq-. В различных регионах мира структура циркулирующих субтипов HBsAg неодинакова.
В Северной и Южной Америке, Европе и значительной части Азии преобладают субтипы adw2, ayw3, ayr. Субтипы ayw2, ayw4, adw2 часто встречаются в Африке, adrq+ широко распространен в Юго-Восточной Азии, adrq- — в Австралии. К. Madalinski et al., 1977 показали преимущественное распространение субтипа adw, который был обнаружен в Польше и Венгрии соответственно в 80,7% и 72,2% случаев.
Исследования, проведенные в Финляндии, зафиксировали у 77-100% лиц с HBs-антигенемией субтип ау. По данным G. Gerna et al., 1976, на севере Италии субтип ayw преобладает (83,1%). Представляют значительный интерес данные К. Katsuki et al., 1980 о различиях в частоте обнаружения одного и того же субтипа в различных этнических группах Японии.
В качестве антигена важнейшее значение имеет детерминанта a HBsAg, которая является доминирующим кластером эпитопов HBV, обеспечивает выработку протективного иммунитета и взаимодействует с подавляющим большинством антител к HBV, присутствующих в гипериммунной сыворотке. Кроме того, детерминанта а весьма консервативная структура у всех серотипов HBV, что делает HBsAg важнейшим компонентом всех ныне применяемых вакцин.
Детерминанта а представляет собой часть большого гидрофильного региона HBsAg. Антигенность а детерминанты обусловлена ее третичной структурой. Детерминанта состоит из 23 аминокислотных остатков, локализованных в положении 124-147 пептидной цепочки HBsAg, и образует 2 петли, выступающие над наружной поверхностью вируса.
Большинство антител, вырабатываемых в ответ на вакцинацию, взаимодействует с участком, состоящим из 9 аминокислотных остатков в положении 139-147. С другой стороны, показано, что детерминанта а является конформационным кластером эпитопов, включающим область 120-124 аминокислотных остатков. Так, замены аминокислотных остатков в позициях 139-147 способны влиять на связывание антител с эпитопом в позиции 122, а замены аминокислотных остатков в позициях 120-124 в свою очередь влияют на связывание антител с эпитопом в позиции 139-147. Диагностические методы, разработанные для выявления HBsAg, основаны на применении антител, полученных к удлиненной детерминанте а.
Читайте также: