Изолят вируса что это

Обновлено: 13.05.2024

Ключевые слова

Об авторах

Федеральный исследовательский центр фундаментальной и трансляционной медицины Сибирского отделения РАН
Россия

Чепурнов Александр Алексеевич – ведущий научный сотрудник отдела экспериментального моделирования и патогенеза инфекционных заболеваний, д.б.н., профессор

Казачинская Елена Ивановна – ведущий научный сотрудник отдела экспериментального моделирования и патогенеза инфекционных заболеваний, д.б.н.

Хрипко Ольга Павловна – старший научный сотрудник отдела экспериментального моделирования и патогенеза инфекционных заболеваний, к.б.н.

Список литературы

2. Masters, P.S. The molecular biology of coronaviruses / P.S. Masters // Adv. Virus. Res. – 2006. – Vol. 66. – P. 193- 292. – doi: 10.1016/S0065-3527(06)66005-3.

3. Accessory proteins of SARS-CoV and other coronaviruses / D.X. Liu, T.S. Fung, K.K. Chong, et al. // Antiviral Res. – 2014. – Vol. 109. – P. 97-109. – doi: 10.1016/j.antiviral.2014.06.013.

4. The origin, transmission and clinical therapies on coronavirus disease 2019 (COVID-19) outbreak – an update on the status / Y.R. Guo, Q.D. Cao, Z.S. Hong, et al. // Mil. Med. Res. – 2020. – Vol. 7. – N. 1. – P. 11. – doi: 10.1186/s40779-020-00240-0.

6. Virus Isolation from the First Patient with SARS-CoV-2 in Korea / W.B. Park, N.J. Kwon, S.J. Choi, et al. // J. Korean Med. Sci. – 2020 – Vol. 35. – N. 7. – e84. – doi: 10.3346/jkms.2020.35.e84.

7. Получение очищенного вируса Эбола / А.А. Чепурнов [и др.] // Вопросы вирусологии. – 1994. – Т. 39, № 6. – С. 254–257.

8. Разумов, И.А. Антигенные отличия дикого и адаптированного к морским свинкам штаммов вируса Эбола / И.А. Разумов, Е.И. Казачинская, А.А. Чепурнов // Вопросы вирусологии. – 2010. – Т. 55. – №. 6. – С. 35-38.

9. Взаимодействие фрагментов оболочечного белка вируса Зика с антителами сывороток людей, переболевших флавивирусными инфекциями / Д.В. Шаньшин [и др.] // Инфекция и иммунитет. – 2020. – Т. 10, № 1. – С. 73– 82. – doi: 10.15789/2220-7619-AIO-805.

10. Казачинская, Е.И. Штамм гибридных клеток животного Mus musculus L. 5Н6 – продуцент моноклональных антител для выявления гликопротеина Е вируса Западного Нила; моноклональные антитела 5Н6, продуцируемые указанным штаммом гибридных клеток и иммуноферментный набор для выявления гликопротеина вируса Западного Нила с использованием указанных моноклональных антител / Е.И. Казачинская, И.А. Разумов, В.Б. Локтев // Патент на изобретение RU 2595429 C1, 27.08.2016. Заявка № 2015115059/10 от 21.04.2015.

12. Dea S. Identification and Location of the Structural Glycoproteins of a Tissue Culture-Adapted Turkey Enteric Coronavirus. / S. Dea, S. Garzon, P. Tijssen // Arch Virol. – 1989. – Vol. 106. –N. 3-4. – P. 221-237. doi: 10.1007/BF01313955.

13. A complete sequence and comparative analysis of a SARS-associated virus (Isolate BJ01) / E.D. Qin, Q.Y. Zhu, M. Yu, et al. // Chin. Sci. Bull. – 2003. – N. 48. – P. 941-948. doi: 10.1007/BF03184203.

14. Rapid Development of an Inactivated Vaccine Candidate for SARS-CoV-19 / Q. Gao, L. Bao, M. Haiyan, et al. // Science. – 2020. – eabc1932. – doi: 10.1126/science.abc1932

15. Kuo L. Analyses of Coronavirus Assembly Interactions With Interspecies Membrane and Nucleocapsid Protein Chimeras. / L. Kuo, K.R. Hurst-Hess, C.A. Koetzner, et al. // J. Virol. – 2016. – Vol. 90. – N. 9. – P. 4357-4368. – doi: 10.1128/JVI.03212-15.

16. Liu X. Profile of Antibodies to the Nucleocapsid Protein of the Severe Acute Respiratory Syndrome (SARS)-associated Coronavirus in Probable SARS Patients. / X. Liu, Y. Shi, P. Li, et al. // Clin. Diagn. Lab. Immunol. – 2004. – Vol. 11. – N. 1. – P. 227-228. – doi: 10.1128/cdli.11.1.227-228.2004.

17. van der Hoek L. Human coronaviruses: what do they cause? / L. van der Hoek // Antivir. Ther. – 2007. – Vol. 12. – N. 4. – Pt. B. – P. 651-658.

18. SARS and MERS: recent insights into emerging coronaviruses / E. de Wit, N. van Doremalen, D. Falzarano, et al. // Nat. Rev. Microbiol. – 2016. – Vol. 14. – N. 8. P. 523-534. – doi: 10.1038/nrmicro.2016.81.

19. SARS-CoV-2 Cell Entry Depends on ACE2 and TMPRSS2 and Is Blocked by a Clinically Proven Protease Inhibitor / M. Hoffmann, H. Kleine-Weber, S. Schroeder, et al. // Cell. – 2020. – Vol. 181. – N. 2. – P. 271-280. – e8. – doi: 10.1016/j.cell.2020.02.052.

21. Antibody responses to individual proteins of SARS coronavirus and their neutralization activities / M. Qiu, Y. Shi, Z. Guo, et al. // Microbes Infect./Institut Pasteur. – 2005. – Vol. 7. – N. (5-6). – P. 882-889. – doi: 10.1016/j.micinf.2005.02.006.

22. Temporal profiles of viral load in posterior oropharyngeal saliva samples and serum antibody responses during infection by SARS-CoV-2: an observational cohort study / K.K. To, O.T. Tsang, W.S. Leung, et al. // Lancet Infect. Dis. – 2020. – Vol. 20. – N. 5. – P. 565-574. – doi: 10.1016/S1473-3099(20)30196-1.

23. Profile of IgG and IgM antibodies against severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) / J. Qu, C. Wu, X. Li, et al. // Clin. Infect. Dis. – 2020. – ciaa489. – doi: 10.1093/cid/ciaa489.

24. Serological responses in patients with severe acute respiratory syndrome coronavirus infection and cross-reactivity with human coronaviruses 229E, OC43, and NL63. / K.H. Chan, V.C. Cheng, P.C. Woo, et al. // Clin. Diagn. Lab. Immunol. – 2005. Vol. 12. – N. 11. – P. 1317-1321. – doi: 10.1128/CDLI.12.11.1317-1321.2005.

1) в биологии- небольшие, генетически изолированные популяции разных видов, в т. ч. людей; 2) в микробиологии под И. иногда понимают к-ры вирусов или др. микробов, изолированные из какого-либо конкретного источника.

Смотреть что такое "Изоляты" в других словарях:

ИЗОЛЯТЫ — (от франц. isoler отделять), сравнительно небольшие группы людей, к рые в силу своего терр. положения (напр., расселения на небольшом о ве, в горах и др. труднодоступных местах) или иных причин (религиозных, этнических и пр.) оказались… … Демографический энциклопедический словарь

Изоляты — Изолированный язык (язык изолят) язык, который не входит ни в одну известную языковую семью. Таким образом фактически каждый изолированный язык образует отдельную семью, состоящую только из этого языка. Наиболее известные примеры включают… … Википедия

Род Фитофтора (Phytophthora) — В роде фитофтора насчитывают около 70 видов. По морфологическим, физиологическим и экологическим особенностям этот род занимает промежуточное положение между питиевыми и пероноспоровыми грибами. Мицелий грибов фитофторы белый,… … Биологическая энциклопедия

Изолированный язык — (язык изолят) язык, который не входит ни в одну известную языковую семью. Таким образом фактически каждый изолированный язык образует отдельную семью, состоящую только из этого языка. Наиболее известные примеры включают бурушаски, шумерский,… … Википедия

Изолированные языки — Не следует путать с изолирующими языками. Изолированный язык (язык изолят) язык, который не входит ни в одну известную языковую семью. Таким образом фактически каждый изолированный язык образует отдельную семью, состоящую только из этого… … Википедия

Язык-изолят — Изолированный язык (язык изолят) язык, который не входит ни в одну известную языковую семью. Таким образом фактически каждый изолированный язык образует отдельную семью, состоящую только из этого языка. Наиболее известные примеры включают… … Википедия

H5N1 — H5N1 … Википедия

Род Питиум (Pythium) — Представители рода питиум имеют тонкий, паутинистый мицелий (толщина гиф 3 6 мкм), простирающийся по пищевому субстрату. Большинство водных питиумов обитает в пресной воде, однако Pythium marinum, P. maritimum (рис. 24) и P. reptans… … Биологическая энциклопедия

Инванз — Действующее вещество ›› Эртапенем* (Ertapenem*) Латинское название Invanz АТХ: ›› J01DH03 Эртапенем Фармакологическая группа: Карбапенемы Нозологическая классификация (МКБ 10) ›› A41 Другая септицемия ›› E14.5 Язва диабетическая ›› J18.9… … Словарь медицинских препаратов

Семейство Питиевые (Pythiaceae) — Питиевые грибы занимают промежуточное положение между водными сапрофитами из семейства сапролегниевых и высокоспециализированными паразитами высших наземных растений из семейства пероноспоровых. Это семейство очень важно для понимания… … Биологическая энциклопедия

Вся следующая информация и доказательства, приведенные ниже, основаны на том факте, что так называемые эксперты никогда не выделяли и не очищали вирус в соответствии с золотым стандартом постулатов Коха (Постула́ты Ко́ха— утверждения, которые можно сделать относительно микроорганизма, доказывающие, что он является возбудителем некоторой болезни: Микроорганизм постоянно встречается в организме больных людей (или животных) и отсутствует у здоровых), или даже модифицированных постулатов Ривера. Постулаты Коха:

1. Микроорганизм должен быть идентифицирован у всех людей, пораженных заболеванием, но не у здоровых людей.

2. Микроорганизм можно выделить от больного человека и выращивать в культуре.

3. При попадании в организм здорового человека культивируемый микроорганизм должен вызывать заболевание.

4. Затем микроорганизм должен быть повторно изолирован от экспериментального хозяина и признан идентичным исходному микроорганизму.

Постулаты Ривера были предложены Томасом М. Ривером в 1973 году для установления роли определенного вируса как причины определенного заболевания. Это модификации постулатов Коха. Вот они:

1. Вирусный агент должен находиться либо в жидкостях организма хозяина (животного или растительного) во время заболевания, либо в клетках, демонстрирующих поражения, характерные для этого заболевания.

2. Материал-хозяин с вирусным агентом, используемый для инокуляции здорового хозяина (тест-организм), не должен содержать каких-либо других микроорганизмов.

3. Вирусный агент, полученный от инфицированного хозяина, должен вызывать конкретное заболевание у подходящего здорового хозяина и / или обеспечивать свидетельство инфекции, индуцируя образование антител, специфичных к этому агенту.

4. Подобный материал (вирусная частица) от вновь инфицированного хозяина (тестируемого организма) должен быть изолирован и способен передавать конкретное заболевание другим здоровым хозяевам.

Какой бы набор постулатов ни использовался, SARS-CoV-2 не проходит проверку.

Процесс использования сертифицированных стандартных образцов (CRM) для проверки методов анализа и последовательностей калибровки приборов в лаборатории выглядит следующим образом:

3) Проводят через прибор неизвестные образцы (сыворотки крови, мочи, слюны, воды, экстрактов образцов пищи и т. д.). Смотрят, содержит ли неизвестный образец что-либо из того, что вы искали (аналит). Поскольку вы построили количественную кривую, вы также можете определить концентрацию аналита в исходной пробе. Обычно это выражается как отношение массы к объему, например нг / мл (нанограмм на миллилитр). Нанограмм - это одна миллиардная грамма. Когда мы тестируем продукты на глифосат, мы можем обнаружить всего 1 нанограмм на миллилитр, что кое-что говорит вам о чрезвычайной чувствительности высококлассных инструментов.

Федеральное агентство министерства здравоохранения США, Центр по контролю и профилактике заболеваний США (CDC) - в 2020г сообщил, что вирус Sars-cov-2 (COVID-19) никогда и никем не был выделен, а это значит что его существование, как и болезнь COVID-19 не доказаны.

CDC огласил миру этот факт в своём многостраничном документе, под названием "CDC 2019-Novel Coronavirus (2019-nCoV) Real-Time RT-PCR Diagnostic Panel" (CDC 2019-Новый Короновирус (2019-nCoV) Диагностическая панель ПЦР в реальном времени) датированном 01 декабря 2020г. Информация запрятана глубоко в документе в разделе Performance Characteristics (Рабочие характеристики) на странице 40.

CDC сообщает: "Since no quantified virus isolates of the 2019-nCoV were available for CDC use at the time the test was developed and this study conducted, assays designed for detection of the 2019-nCoV RNA were tested with characterized stocks of in vitro transcribed full length RNA (N gene; GenBank accession: MN908947.2) of known titer. "

"Поскольку на момент разработки теста и проведения настоящего исследования количественные изоляты вируса 2019-nCoV не были доступны для использования CDC, анализы, предназначенные для обнаружения РНК 2019-nCoV, были протестированы с охарактеризованными запасами полноразмерной РНК, транскрибированной in vitro (N ген; номер в GenBank: MN908947.2) с использованием известного титра. "

Что это всё значит? Каждый объект можно определить количественно, значит измерить его. Использование слова "количественные" в этой фразе означает, что у них нет измеримого количества вируса потому, что он не доступен. Получается измерять нечего, нет вируса.

Использование слова "изоляты" в данной фразе означает, что у них нет изолированного (выделенного) вируса. Выделенного измеримого количества вируса у них нет. Вирус они не выделили, а раз вирус не выделен, то его существование не доказано!

Фраза: ". были протестированы с охарактеризованными запасами полноразмерной РНК, транскрибированной in vitro (N ген; номер в GenBank: MN908947.2) с использованием известного титра. " означает, что т.к. вирус не был выделен, то никто не знает какая нуклеотидная последовательность ему принадлежит. Поэтому они создали искусственную нуклеотидную/генетическую последовательность с помощью образцов взятых из банка генов без участия какого-либо вируса. Эта нуклеотидная последовательность, которую они создали - всего лишь предположение о том как по их мнению должна выглядеть нуклеотидная последовательность вируса Sars-cov-2.

То же самое, что и CDC, заявляет и Высший орган исполнительной власти Европейского союза - Европейская комиссия. Такой же многостраничный документ под названием: "Текущая эффективность методов и устройств тестирования COVID-19 и предлагаемые критерии эффективности", опубликованный 16 апреля 2020 года, интересующая информация размещена на странице 19, в разделе Analytical performance (аналитическая производительность).

"Since no virus isolates with a quantified amount of the SARS-CoV-2 arecurrently available, assays designed for detection of the SARS-CoV-2 RNA couldbe tested with characterised stocks of invitrotranscribed RNA containing the target of interest of a calculated titer (RNA copies/μL) spiked into a diluent consisting of a suspension of human cells in viral transport medium (VTM) to mimic a clinical specimen."

"Поскольку в настоящее время отсутствуют изоляты вируса с определенным количеством SARS-CoV-2, анализы, предназначенные для обнаружения РНК SARS-CoV-2, могут быть протестированы с охарактеризованными запасами приглашенной транскрибированной РНК, содержащей интересующую мишень с рассчитанным титром (копии РНК). / мкл) добавлен в разбавитель, состоящий из суспензии человеческих клеток в вирусной транспортной среде (VTM), чтобы имитировать клинический образец."

То же самое, что и в документе CDC, отсутствуют изоляты вируса, заимствованная РНК. Всё предельно прозрачно, ничего не скрывается.

Кроме того группа авторитетных ученых из США, в числе которых признанные светила медицины, такие как Эндрю Кауфман (судебный психиатр с опытом работы в области молекулярной биологии), Томас Коуэн (доктор медицинских наук, имеет практику семейной медицины в Сан-Франциско, где он специализируется на питании, гомеопатии и фитотерапии), Салли Фаллон Морелл (является автором нескольких книг о питании - в том числе Nourishing Traditions® - и соучредителем и президентом организации Уэстон А. Фонд цен) и другие, объявили награду 1 миллион долларов за доказательство существовании COVID-19. По некоторым данным, более года никто так и не смог доказать существование этого вируса, и в настоящий момент награда возросла до 1,5 миллиона евро. Условия получения премии описаны на сайте.

Мнения, высказываемые в данной рубрике могут не совпадать с позицией редакции

Новость

Комплекс-белок Cas9/sgRNA/viral RNA (слева) и модель вируса иммунодефицита человека (справа), построенная коллективом Visual science.

Автор

Редактор

Генеральным спонсором конкурса, согласно нашему краудфандингу, стал предприниматель Константин Синюшин, за что ему огромный человеческий респект!

Спонсор публикации этой статьи — Виктор Татарский.

Врага нужно знать в лицо

Об иммунитете, апоптозе и вообще.

Иммунная система развивалась сотни миллионов лет. По типу реакции ее обычно делят на врожденный (неспецифичный) и приобретенный (специфичный) иммунитет [1], [2]. Считается, что специфичный (то есть вырабатываемый к конкретному патогену) иммунитет впервые появился у челюстноротых (рыб и всех вышестоящих по эволюционному древу таксонов) после отделения от бесчелюстных (миног и миксин), хотя у вторых имеется аналогичная система защиты [3]. К клеткам специфичного иммунитета относят В-лимфоциты, Т-лимфоциты и NK-клетки (естественные киллеры, natural killer cells). Помимо этого существуют моноциты, которые хоть и не являются истинными инструментами приобретенного иммунитета, однако выполняют некоторые функции по нейтрализации патогена: фагоцитоз, презентация антигена, выделение бактерицидных веществ и цитокинов.

Рисунок 1. Взаимодействия Т-киллеров (слева) и Т-хелперов (справа) с зараженными клетками. Для передачи сигнала о заражении необходимо выполнение двух условий: контакт комплекса МНС-патоген с TcR (T-cell Receptor, рецептор Т-клеток) и CD. Двигаясь по организму, Т-лимфоциты проверяют каждую клетку на предмет наличия у нее антигена в комплексе с МНС. Их можно сравнить с подслеповатой глуховатой бабушкой, пришедшей забирать дитятко из детского сада. Для опознания ей надо подойти вплотную и по нескольким (в данном случае по двум) признакам определить, ее ли это чадо или нет.

Т-лимфоциты, в свою очередь, необходимы для уничтожения клеток, зараженных внутриклеточными паразитами, и опухолевых клеток. Они делятся на два основных типа в зависимости от класса рецепторов, находящихся на внешней стороне их мембраны.

Т-киллеры несут CD8 рецепторы и отвечают за:

Т-хелперы имеют CD4 рецепторы и ответственны за секрецию цитокинов, которые:

активируют макрофаги для борьбы с внутриклеточными паразитами;
способствуют продукции антител В-лимфоцитами.

Но не менее важна роль Т-хелперов в подготовке зрелых Т-киллеров из клеток-предшественниц, активации NK-клеток и моноцитов.

Как же происходит опознавание антигена на молекулярном уровне? Здесь надо упомянуть еще об одном очень важном классе рецепторов — МНС (Major Histocompability Complex или главном комплексе гистосовместимости). Они бывают двух классов: I и II. МНС I присутствует на поверхности всех ядерных клеток организма человека. Он необходим для опознавания клетки натуральным киллером и Т-киллером (рис. 1, 2). Если по какой-то причине МНС I изменен, несет на себе антиген или отсутствует, клетка будет подвергнута апоптозу. МНС II находится на поверхности В-лимфоцитов, макрофагов и дендритных клеток. Он необходим для презентации антигена Т-хелперам (рис. 1, 2). Жизнь пула Т-хелперов можно представить как прогулку с ребенком в зоопарке, только вместо животных — антигены, вместо ребенка — Т-хелпер, а вместо взрослых, объясняющих, кто есть кто, — три перечисленных типа клеток.

Рисунок 2. Процесс передачи сигнала Т-киллеру и Т-хелперу. Первый этап — сборка комплекса МНС-антиген, второй этап — презентация комплекса на поверхности клетки.

Первый этап проникновения вируса в клетку — взаимодействие вирусного белка gp120 (рис. 3) с рецептором CD4. Отсюда понятно, почему ВИЧ размножается именно в Т-хелперах. Взаимодействию способствуют корецепторы CCR5 и CXCR4 [8]. В норме они являются рецепторами цитокинов, а при взаимодействии ВИЧ с клеткой их связь является необходимым условием проникновения вируса внутрь. Мутации в генах этих рецепторов обеспечивают частичную устойчивость носителей таких мутаций (таких людей около 2%, причем некоторые штаммы вируса все равно могут их поражать) [9]. Затем в мембрану клетки погружается белок gp41, после чего мембрана вируса сливается с клеточной, и происходит распаковка генетического материала. По принципу обратной транскрипции с РНК-матрицы вируса с помощью фермента ревертазы (обратной транскриптазы) синтезируются молекулы кДНК (комплементарной ДНК). Синтезированная кДНК вставляется вирусной интегразой в геном клетки хозяина. После попадания в геном хозяина вирус может никак себя не проявлять до нескольких лет — протекает так называемый инкубационный период. Только когда клетки активно пролиферируют, а значит, синтезируют белки на матрице ДНК, начинается сборка вирусных частиц , выход их из клеток и гибель последних (так как каждая частица забирает с собой часть клеточной мембраны клетки, вирусы попросту разрывают клетку).

Рисунок 3. Строение ВИЧ. Белки gp120 и gp41 участвуют в рецепции вируса клеткой и проникновении вирусной частицы внутрь. Липидная оболочка захватывается от клетки хозяина вместе с частью мембранных белков. Белки матрикса синтезируются в клетке после встраивания кДНК в геном в момент наработки клеточных белков для деления. Протеаза, возможно, необходима для разрезания противоапоптотического фактора Bcl-2 [9]. Ферменты обратная транскриптаза и интеграза создают кДНК на матрице РНК и встраивают кДНК в геном Т-хелпера соответственно. Tat — белок, вовлеченный в индукцию апоптоза. Нуклеокапсид — комплекс из РНК и белков вируса, представляющий собой компактную упакованную форму генома. Капсид — белковая оболочка, защищающая содержимое от воздействия внешних условий.

Как иммунитет бактерий правит геномы

Система редактирования геномов CRISPR/Cas известна уже довольно давно (впервые локус описал в 1987 году Есизуми Исино из университета Осаки), но только недавно (в 2005 году) ученые поняли ее истинное предназначение [11], [12].

Как вы уже поняли, система состоит из двух компонентов: CRISPR-локуса (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats или сгруппированные и регулярно разделенные короткие палиндромные повторы) и белков Cas, которые, являются нуклеотид-специфичными эндонуклеазами (а название получили за работу в команде с CRISPR — Crispr associated).

Помимо CRISPR-локуса и блока генов Cas в ДНК бактерии (не обязательно в нуклеоиде [12]) находится ген tracrРНК (transactivated crispr RNA), частично комплементарной палиндромам.

Для формирования специфичной устойчивости к вирусу бактерия, как и человек, должна встретиться с ним дважды.

Первый раз после внедрения вирусной ДНК в клетку происходит разрезание ДНК белками Cas1 и Cas2 на протоспейсеры и встраивание их в начало CRISPR-локуса. Cas1 и Cas2 формируют при этом комплекс, причем Cas2 играет только структурную роль, удерживая ДНК, тогда как Cas1 встраивает ее. Каждый протоспейсер вставляется в CRISPR-локус так, чтобы от другого (уже имеющегося) спейсера его отделял палиндром.

Соответственно, после транскрипции ДНК всего комплекса образуются три продукта (рис. 4):

tracrРНК;
РНК белка Cas (наиболее изученным является Cas9, поэтому далее повествование пойдет о нем), далее транслирующаяся;
pre-crРНК (poly-spacer precursor crRNA или многоспейсерный предшественник crРНК), которая представляет собой транскрипт спейсеров, разделенных образовавшимися из палиндромов шпильками или петлями.

Рисунок 4. Строение CRISPR-локуса и результат транскрипции. leader — лидерная последовательность, отвечающая за начало транскрипции, со стороны которой вставляется новый спейсер. repeat — палиндромный повтор, который после транскрипции превращается в шпильку или петлю.

Второй этап — образование комплекса pre-crРНК/Cas9/РНКаза III. Очевидно, что вся длинная pre-crРНК не может участвовать в опознавании инвазивной ДНК, так как, во-первых, очень длинна, что конформационно неудобно, а во-вторых, при сравнении спейсеров РНК с протоспейсерами инвазивной ДНК длинный транскрипт начнет путаться и в итоге образует клубок, непригодный для дальнейшей работы. Самое логичное — разделить длинную последовательность на короткие участки, которые могли бы проверятся на соответствие инвазивной ДНК белком Cas9. И тащить за собой не надо, и не запутается.

С помощью фермента РНКазы III и при участии tracrРНК pre-crРНК разделяется по границам повторов так, что в белково-нуклеиновый комплекс входят один спейсер и один повтор, комплементарно связанный с tracrРНК (рис. 5) [13]. Повтор полностью теряет свою вторичную структуру, tracrРНК же оставляет несколько шпилек (обычно три).

Рисунок 5. Белково-нуклеиновый комплекс после созревания транскрипта. crРНК состоит из спейсера (слева) и повтора, соединенного с частью tracrРНК (справа). Три петли на tracrРНК нужны для удержания ее эндонуклеазой Cas9.

комплементарность спейсера комплекса Cas9/crРНК/tracrРНК протоспейсеру инвазивной (например, вирусной) ДНК;
наличие в геноме вируса около протоспейсера последовательности из трех нуклеотидов — РАМ (Protospacer Adjacent Motif, прилежащий к протоспейсеру мотив).

Таким образом клетка страхуется от уничтожения своей ДНК. Но даже просто разрезанная в одном месте вирусная ДНК может представлять опасность, поэтому завершает инактивацию негомологическое сращивание концов (non-homologous end joining, NHEJ). При этом происходит инсерция/делеция одного или нескольких нуклеотидов, что приводит к потере инфекционности.

Рисунок 6. Полная схема механизма работы CRISPR/Cas9 системы. а — Транскрипция CRISPR локуса с образованием pre-crРНК. б, в — Разрезание РНК РНКазой III и образование комплексов Cas9/tracrРНК/crРНК. г — Вторичное проникновение в клетку чужеродной ДНК. д — Соединение комплекса с инвазивной ДНК. е — Образование двухнитевого разрыва в протоспейсере.

А где же тут редактирование геномов? А вот где:

во-первых, таким образом можно просто нокаутировать целевой ген и добиться прекращения экспрессии того или иного белка;
во-вторых, после создания двухцепочечного разрыва в образовавшуюся брешь можно вставить нужный нам ген и заставить организм синтезировать нужный нам белок.

Рисунок 7. Сравнение искусственной (а) и естественной (б) систем CRISPR/Cas9. Отличие состоит лишь в том, что искусственная РНК едина, а природная — состоит из двух частей, гены которых разделены.

Битва века

Однако вернемся к теме этой статьи.

Так как система редактирования геномов может помочь в избавлении от ВИЧ? Очень просто: вирус можно вырезать! Нацелив Cas9, путем создания sgРНК с последовательностью, комплементарной вирусной кДНК.

Некоторое время назад группа ученых из немецкого Института экспериментальной вирусологии и иммунологии уже пыталась использовать инструмент редактирования геномов для удаления ВИЧ из культуры HeLa [15]. Они модифицировали Cre-рекомбиназу методом направленной эволюции и один из полученных вариантов использовали для удаления вируса путем контролируемой рекомбинации [16]. Однако надо учитывать, что между Т-хелперами и опухолевой HeLa есть немало различий, к тому же, авторы не предлагают вариантов доставки или экспрессии гена Tre-рекомбиназы (усовершенствованный вариант фермента Cre).

С другой стороны, группа американских исследователей опубликовала в марте этого года статью [17], где подробно описывались метод доставки и механизм удаления вируса. Ученые ставили перед собой задачу не только полностью избавить клеточную культуру Т-хелперов от вируса, но и проверить отсутствие цитотоксического действия самой CRISPR/Cas9 системы. Единственный недостаток этого геномного инструмента в том, что из-за сравнительно небольшой длины спейсера, даже при наличии страхующего элемента PAM, в больших геномах могут быть найдены нецелевые сайты, подверженные разрезанию (off-target sites). Именно поэтому исследователи уделяли данной проблеме немало внимания.

Работа проводилась с использованием штамма ВИЧ-1 и клеточной линии Т-хелперов 2D10, зараженной вирусом в покоящейся стадии. Доставка и экспрессия sgРНК/Cas9 осуществлялась с помощью лентивирусного вектора.

Для оценки того, вырезался ли вирус из двух мест встраивания (1-я и 16-я хромосомы), было проведено полногеномное секвенирование. Оно показало, что в клетках, где экспрессировались и гены Cas9, и sgРНК, провирусная ДНК отсутствует.

Был проведен анализ того, могут ли гены, куда встроился провирус (RSBN1 и MSRB1), и близлежащие гены нормально транскрибироваться после его вырезания. Ученые показали, что как RSBN1, так и MSRB1 нормально экспрессируются. Соседние гены также не претерпели изменений.

С помощью биоинформатических методов и анализа баз данных было показано, что sgРНК/Cas9 не проявляет активности по отношению к нецелевым сайтам.

Таким образом, можно с уверенностью сказать, что группа Камински впервые успешно удалила ВИЧ из культуры зараженных Т-хелперов. Данное достижение приблизило человечество к победе на ВИЧ. Да, это только культура клеток. Да, до внедрения данной техники в медицину пройдут годы, а может и десятки лет, но данная работа является уникальной в своем роде, ибо ученые не только бросили вызов одному из страшнейших заболеваний на планете, но и смогли победить его — пусть даже масштаб сражения пока невелик.

Перспективы применения данной технологии очевидны: введя пациенту вектор, содержащий гены Cas9 и sgРНК, мы добьемся их экспрессии и полного удаления вируса из клеток. Современная терапия, направленная против ретровирусов, являющаяся основным средством борьбы с ВИЧ, не удаляет вирус из клеток, так как провирус остается встроенным в ДНК хозяина. В свою очередь, данный подход не оставляет вирусу шансов укрыться.

Директор института гриппа им. А.А. Смородинцева Дмитрий Лиознов — о новых вакцинах, противовирусных препаратах и опасных инфекциях

— Коронавирусы, которые берутся, допустим, от соседей по палате, сильно отличаются? Или это одна и та же генетическая последовательность?

— В основном нет. Это очень и очень похожие последовательности, иногда отличающиеся на один нуклеотид, иногда совсем одинаковые. Это не всегда означает, что люди друг друга перезаражали. Обычно у нормальных среднестатистических РНК-вирусов так не бывает, они могут отличаться довольно заметно у двух людей рядом. Здесь же наоборот. Коронавирусы ужасающе похожи. Если брать вирус, выделенный в начале пандемии в Ухане, то варианты, которые у нас есть сейчас, отличаются от него всего на 30 нуклеотидных позиций на 30-тысячный геном.

Новый вариант возбудителя COVID-19 быстрее распространяется и может частично ускользать от иммунитета

AYDAR-1 содержит ровно эти семь мутаций. У него есть и D614G, это как минимум на одну меньше, чем у всяких британских штаммов, американских, южноафриканских и прочих.

— У нас не очень много штаммов, так как штамм — это закрепленный в клеточной культуре или на животных вариант вируса, который имеет строго определенные свойства. А вот изолятов у нас много. Изолят — это, по сути, мазок, взятый от больного человека, которым мы заразили клетки, а потом собрали вирусы в размноженном виде в культуральной жидкости. Это еще не штамм, он может меняться, приобретать замены, поскольку переходит из человеческого организма в культуру клеток. Изоляты носят просто порядковый номер, а вот штамм уже носит имя. В коллекции Института Чумакова, может, пара десятков штаммов, а вот изолятов — тысячи.

— Зачем нужно много штаммов?

— Мы вакцинируем одним штаммом, а проверяем, заразив животных другим штаммом. Это некий хороший тон. Когда вы делаете вакцину на одном штамме и проверяете на антитела к нему же, то очевидно, что они будут. Мы же хотим, чтобы препарат вообще против вируса работал и это не были специфичные только к этому штамму антитела.

— Чтобы вакцина потом работала даже при встрече с британским, южноафриканским и еще неизвестными будущими вариантами вируса?

— Да, это наша задача. Когда к нам приходит другой вирус, у него часть аминокислотной последовательности отличается. Соответственно, часть выработанных вакциной антител на него сядет, а часть — нет. Но надо понимать, что часть на него всё равно сядет. И относиться спокойно к тому, что в течение пандемии у SARS-CoV-2 появляются мутации.

— Вы смотрите все научные статьи, которые выходят по мутациям?

— Да, насколько успеваю.

— Откуда вы узнаете о новых мутациях?

— Из прессы, конечно. Я не успеваю проснуться, как мне уже сообщают о том, что в Индии всё ужасно.

— И дальше вы идете смотреть научную статью про индийский штамм? Смотрите базу геномов?

— Допустим, из прессы вы поняли, что индийский штамм вам интересен. Вы идете в международную базу смотреть, что это такое?

Замдиректора ЦНИИ эпидемиологии Александр Горелов — о формировании коллективного иммунитета и старте испытаний детской вакцины

— Действительно ли нужно следить за каждым меняющимся нуклеотидом SARS-CoV-2?

— Конечно, нет. Когда вы нашли какую-то мутацию, вам еще надо доказать, что она действительно имеет какое-то значение. Например, что вирус стал действительно лучше распространяться. Однако убедиться в том, что вирус лучше распространяется именно из-за той или иной мутации, довольно трудно. Допустим, вы меряете показатель распространения патогена от человека к человеку и видите, что его трансмиссивность (передаваемость) резко возросла. Но она же могла вырасти и по какой-то другой причине. Возможно, то, что происходит сейчас в Индии, не связано со свойствами штамма. А связано с тем, что стало, например, теплее или улучшилась диагностика.

— Так получается, сравнивать мутации бесполезно?

— В них, наверное, надо разбираться. Например, смотреть именно значимые мутации: не нуклеотидные, а аминокислотные. С другой стороны, я абсолютно уверена, что есть локальные варианты SARS-CoV-2, например, в Африке, про которые мы никогда ничего не узнаем. Их там просто не секвенируют. А они, возможно, значительно вирулентнее (заразнее) либо значительно лучше распространяются, чем то, с чем мы имеем дело. Если поискать, возможно, и у нас в России есть какой-нибудь ямало-ненецкий штамм, который ужасен, но мы о нем пока ничего не знаем. А в базе лежат британские — 420 тыс., так как эта страна отсеквенировала нечеловеческое количество последовательностей.

Ведущий научный сотрудник Центра им. М.П. Чумакова Любовь Козловская

— SARS-CoV-2 мутирует не так, как остальные РНК-вирусы?

— По-другому. У SARS-CoV-2 часто мутация отбирается достаточно случайно: она появляется, а дальше из-за высокой точности полимеразы остается. Если она нелетальная, вирус с этой мутацией может спокойно жить, как жил.

— А обычно как бывает у РНК-вирусов?

— Что вы думаете по поводу третьей, четвертой волн COVID-19 в России?

— Что будет через год? В мае 2022-го?

Читайте также: