Как изготовить вакцину от чумы
Обновлено: 19.04.2024
Пастер сказал это, уже умирая, когда последний раз приехал в свой институт. Ему тогда продемонстрировали под микроскопом возбудитель чумы — бактерию, только что открытую его учеником Александром Йерсеном.
Началась третья пандемия чумы: страшная болезнь вырвалась из природного очага в центре Азии и набросилась на Китай, Россию и Индию. Из Индии как раз вернулся самый младший по стажу ученик Пастера — российский подданный Владимир Ааронович Хавкин. Впрочем, россиянином он уже не был даже по бумагам. Хавкин не посетил вовремя русское посольство, чтобы продлить свой заграничный паспорт. Да на родине его особо и не ждали.
Там он числился народовольцем, политически неблагонадежным. Трижды бывал под арестом, 8 лет состоял под надзором полиции. Без особого сожаления русский посол выдал ему рекомендательное письмо для британского правительства, которое пригласило Хавкина в Индию испытывать его противохолерную вакцину. Тоже первую в мире.
В этой вакцине сомневались и покровитель Хавкина Илья Мечников, и сам Луи Пастер. Однако результат оказался прекрасный — 93% гарантированной защиты. Поверив, что Хавкин волшебник, англичане призвали его снова — теперь уже бороться с чумой. Приняли штатным биологом на гражданскую службу, обещали британское подданство и лабораторию.
В самом деле, лабораторию в бомбейском медицинском колледже выделили с небывалой щедростью — целую комнату. В штате — один лаборант и три курьера. Подопытные животные — крысы, которых моряки за гроши отлавливали на приходящих из Европы судах. Одновременно с Хавкиным несколько научных центров разрабатывали противочумную вакцину в гораздо более роскошных условиях. И все же беспаспортный эмигрант всех обставил.
Перед тем как впрыснуть этот яд крысам, чтобы у них образовался иммунитет к чуме, колбы нагревали до 60 градусов — такая пастеризация убивала бактерии, сохраняя их токсин. Пробную партию приготовили всего за три месяца. Лаборант слег с нервным срывом, а Хавкин работал по 14 часов в сутки: он спешил, вокруг ежедневно гибли сотни людей. Параллельно он еще читал о будущей вакцине лекции местным студентам-медикам. Кроме них, никто не отважился бы привиться даже после того, как русский микробиолог 10 января 97-го года вогнал себе под кожу четверную дозу чумного яда — 10 миллилитров раствора.
Между прочим, индийским студентам было легче решиться на вакцинацию оттого, что Хавкин происходил из России. Меры, которыми боролись с чумой британские колонизаторы, вызывали у туземцев ненависть. Начальник бомбейского гарнизона генерал Гатакр действовал неграмотно, и никто был ему не указ. Военные свозили чумных в госпитали, а их семьи — в концлагеря, так что получался надежный контакт здоровых с уже больными, еще переживавшими инкубационный период. Опустевшие жилища несчастных пленников заливали карболкой, и крысы с чумными блохами разбегались оттуда куда попало, разнося заразу.
К тому же Ага-Хан вынашивал политические планы. Для карьеры ему нужен был подвиг. И он его совершил. По просьбе всемогущего имама Хавкин несколько раз сделал ему прививку на глазах у толп исмаилитов. Лаборатория Хавкина переехала из комнатенки на роскошную виллу Ага-Хана, и штат был расширен на средства общины. Это подействовало.
Хавкин еще в 1897 году понял, с кем имеет дело. У него был к Ага-Хану свой интерес. Владимир Ааронович предложил имаму всего-навсего проект освобождения евреев из-под власти других народов. По его замыслу, османский султан Абдул-Хамид II — Палестина принадлежала тогда Османской империи — разрешал евреям покупать землю вокруг Иерусалима. Образовывалась компактная иудейская автономия, которая из благодарности станет опорой власти султана на неспокойном Арабском Востоке.
Любопытно, что глава исмаилитов действительно обсудил этот план с Абдул-Хамидом. Тот наотрез отказал. Ага-Хан III прожил еще 60 лет и не раз повторял, что среди всех ошибок последнего владыки Османской империи эта была самая грубая.
Владимир Ааронович Хавкин (1860 1930) на взлете своей карьеры, в 1896 году. Только что он одержал победу над холерой в Индии, лично привив 42 тысячи человек. Королева Виктория уже включила его в наградной список, приуроченный к ее ближайшему дню рождения: Хавкину будет пожаловано британское подданство и звание кавалера Ордена Индийской империи.
Зима 1896 1897 года. Бомбей, открытый крематорий — так называемый погребальный гхат, где индуисты непрерывно сжигают тела сотен жертв эпидемии чумы. Тело кладется на поленья, уложенные между четырьмя стальными прутьями. После сгорания пепел бросается в море. Слева носилки с только что доставленным телом очередного погибшего.
Владимир Аронович Хавкин. Здесь и далее фото из личного архива В. Хавкина в отделе рукописей библиотеки Еврейского университета в Иерусалиме (Jewish National and University Library, Hebrew University, Jerusalem)
Для врачей и ученых массовые вспышки инфекционных заболеваний всегда профессиональный и моральный вызов. Только на первую половину XIX в. в Российской империи пришлось несколько эпидемий чумы: в 1812 г. в Одессе и Феодосии, во время русско-турецкой войны 1828–1830 гг., снова в Одессе в 1837 г. и т.д. [1]. Пандемия холеры в 1848 г. унесла в России, по официальной статистике, 690 150 жизней и сопровождалась холерными бунтами, когда испуганное население сжигало больницы, считая врачей отравителями. К рубежу XIX–XX вв., когда в Европе эпидемии некоторых болезней (в частности чумы) уже перестали быть частью повседневной жизни, в России они по-прежнему оставались очень актуальными. Достаточно вспомнить о вспышке холеры в 1892–1893 гг., охватившей обширные территории страны. Очевидные недостатки российской государственной противоэпидемической системы требовали ее реорганизации и поддержки. И в 1897 г. по специальному указу императора Николая II Комиссию о мерах предупреждения и борьбы с чумной заразой возглавил уже сам принц А. П. Ольденбургский (1844–1932), основатель и попечитель Института экспериментальной медицины в Петербурге, сумевший привлечь к работе как научных специалистов, так и медицинских практиков [2].
Эти слова Теодора Герцля (1860–1904), основателя современного политического сионизма, Владимир Хавкин неслучайно занес в одну из своих записных книжек, хранящихся в личном фонде ученого в библиотеке Еврейского университета в Иерусалиме, еще в молодости. Они отражали два главных стержня его внутреннего мира и практической деятельности. Один — наука — был открыт миру и хорошо известен; другой — религия — был скрыт от публики и историков и менее известен.
Сын Арона Хавкина и его жены Розалии Владимир (Маркус-Вульф) родился 27/15 марта 1860 г. в процветающем черноморском порту Одесса (Российская империя, ныне Украина), окончил гимназию в Бердянске в 1879 г. и поступил на естественное отделение физико-математического факультета Новороссийского университета в Одессе. Здесь он встретил одного из главных людей в своей судьбе — микробиолога Илью Мечникова (1845–1916), будущего лауреата Нобелевской премии по физиологии или медицине, под руководством которого защитил университетский диплом и благодаря которому начал служить в университетском Зоологическом музее в Одессе, успев опубликовать в России пять небольших научных работ по зоологии простейших.
Семью годами ранее испанец Хайме Ферран (1852–1929) уже пытался сделать такую вакцину, но не смог найти эффективную дозу, и прививки приводили к болезни и смерти. Хавкин, который показал себя блестящим экспериментатором, пошел несколько другим путем: он искал Virus fix — неизменный фиксированный холерный яд, который бы в определенной дозе убивал кролика всегда за строго определенное время. Проведя большую серию экспериментов, он добился этого. Впрыснув кубический сантиметр такого холерного яда в бедренную мышцу кролика, Хавкин мог с точностью до одного часа предсказать, когда погибнет зверек. Так смертельный яд приобрел первые признаки вакцины.
Несмотря на то, что в это время и в Париже, и в Гамбурге, и в других городах Европы усилилась эпидемия холеры, власти, которым Хавкин предложил начать вакцинацию населения своим противохолерным препаратом, побоялись применить его вакцину. Он обращался также в российское и другие посольства, но положительный ответ пришел только от англичан. Лорд Фредерик Дафферин, посол Великобритании в Париже и бывший вице-король Индии (1884–1888), предложил провести испытания новой вакцины в Бенгалии и договорился о встрече Хавкина с лордом Джоном Кимберли, государственным секретарем Индии в Лондоне. Таким образом, британские чиновники сделали возможной поездку ученого в Индию.
Хавкин прибыл в Калькутту в марте 1893 г., когда холера еще не была здесь острой проблемой, и встретил открытое недоверие и сопротивление своим планам как со стороны медицинского сообщества, так и местных жителей. Однако несмотря на личную опасность, он начал настойчиво продвигать свои идеи по профилактической вакцинации населения. Рассказывают, что, когда Хавкин вместе с коллегами-индусами приехал в деревню, страдавшую от холеры, местные жители чуть не забили врачей камнями. Только после того как Хавкин на глазах у всех сделал укол себе, жители деревни согласились на вакцинацию, и впоследствии ни один из них не пострадал от холеры. Друг Хавкина Эрнест Ханкин начал активно помогать ему и пригласил во вновь созданную бактериологическую лабораторию в Агру, чтобы прививать военных и гражданских добровольцев. С апреля 1893 г. по конец июля 1895 г. при содействии военного медицинского персонала Хавкин и его команда привили более 42 тыс. человек, в том числе более 37 тыс. человек местного населения.
Хавкин вакцинирует местное население против холеры. Калькутта, 1894 г. Фото из архива лондонского Института истории медицины (Wellcome Institute for the History of Medicine)
Хавкин вакцинирует местное население против бубонной чумы. Бомбей, 1898 г.
Хавкин (во втором ряду в центре, со светлым пробковым шлемом) с сотрудниками Противочумной лаборатории в Бомбее. Индия, 1902–1903 гг.
В отделе распределения вакцин Противочумной лаборатории Хавкина в Бомбее. Индия, 1902–1903 гг.
Тем не менее удар по научной репутации очень волновал Хавкина. В 1907 г. он повторно обратился в Институт Листера за реабилитацией и своего метода, и своей деятельности и был повторно оправдан. Лауреат Нобелевской премии (1902) за исследования по малярии Рональд Росс, президент Совета Королевского института общественного здравоохранения Уильям Р. Смит, директор лабораторий Рокфеллеровского института в Нью-Йорке Саймон Флекснер и семь других ученых подписали специальное письмо в защиту Хавкина, опубликованное в газете The Times 29 июля 1907 г.
Возвращение в Европу
Впрочем, Владимир Хавкин всегда оставался верен своей религии, но, работая в многонациональной и многоконфессиональной Индии, предпочитал отождествляться прежде всего со своей профессиональной научной и медицинской миссией. Только после ухода с государственной службы он посчитал себя абсолютно свободным в выражении своих личных взглядов и приоритетов.
Из архивных документов известно и то, что Хавкин неизменно играл активную роль в жизни еврейской общины каждой страны, в которой он жил. В Париже в 1891–1893 гг. он был одним из основателей Общества возрождения еврейского языка. В Индии участвовал во всех инициативах, касающихся еврейской общины. В 1898 г. он поддержал призыв об открытии в Бомбее Еврейской чумной больницы и в 1908 г. — Еврейской бесплатной школы в Калькутте. В 1907–1909 гг. Хавкин активно обсуждал статус евреев-сефардов в Индии с французскими евреями и помогал еврейским беженцам эмигрировать в США, а в 1916 г. посетил еврейские поселения в этой стране.
Возможно, поездка в 1926 г. в страну молодости (через сорок лет после отъезда из России), когда Хавкин вновь посетил Одессу и другие города СССР, была попыткой преодоления этого одиночества. Вместе с писателем Рубеном Брайниным он проехал по всем местам, связанным с жизнью семьи Хавкиных, от Украины до Сибири, изучая еврейскую жизнь и религиозное образование при новом социалистическом режиме. Дневники этого путешествия, хранящиеся в библиотеке Еврейского университета в Иерусалиме, также остаются неопубликованными.
В апреле 1928 г. Владимир Хавкин переехал в Лозанну, где оставался в течение последних двух лет своей жизни. Он завещал крупную сумму на развитие религиозного, научного и профессионального образования в еврейских школах Восточной Европы через систему грантов. Фонд Хавкина, созданный в 1929 г. в Лозанне, стал последним даром великого филантропа еврейскому народу и всему человечеству.
Могила В. А. Хавкина. Лозанна, Швейцария. Фото предоставлено Александром Дюэлем (Aleksandr Duel), которому приносим нашу благодарность
Возрождение интереса к научному наследию Владимира Ароновича Хавкина и его незаурядной личности произошло после Второй мировой войны и Холокоста, когда многие поняли, что только совместные усилия всех наций, элит и отдельных людей могут спасти человечество от истребления фанатиками и диктаторами. Изменившийся мир потребовал новых героев: честных интеллектуалов, которые были бы такими же независимыми и влиятельными профессионалами, как Хавкин, который всегда следовал своим собственным убеждениям и верил, что человек может изменить мир.
Правительства Индии и Израиля выпустили марки в его честь. В знаменитом Лесу Кеннеди в Иерусалиме в память о выдающемся бактериологе и еврейском филантропе в 1960-е годы были посажены тысячи деревьев. В Одессе именем Хавкина названа одна из улиц.
Сегодня мир вновь кардинально меняется под воздействием самых разных вирусов — биологических, идеологических, национальных. Может быть, и в России, которую Хавкин всегда считал своей родиной, стоит вспомнить о его наследии и его уроках — нравственных и научных.
Литература
1. Васильев К. Г., Сегал А. Е. История эпидемий в России. Материалы и очерки. М., 1960.
2. Михель Д. Чума и эпидемиологическая революция в России, 1897–1914 // Вестник Евразии. 2008; 3: 142–164.
3. Чехов А. П. Письмо Суворину А. С., 17 января 1897 г. Мелихово // Полное собрание сочинений и писем. М., 1978; 6: 273.
4. Поповский М. Судьба доктора Хавкина. М., 1963.
5. Waksman S. The Brilliant and Tragic Life of W. M. W. Haffkine, Bacteriologist. New Brunswick, 1964.
6. Маркиш Д. Махатма. Вольные фантазии из жизни самого неизвестного человека. Москва, 2019.
7. Haffkine Institute platinum jubilee commemoration volume, 1899–1974. Bombay, 1974.
8. Löwy I. From Guinea Pigs to Man: the Development of Haffkine’s Anticholera Vaccine // Journal of the History of Medicine and Allied Sciences. 1992; 47: 270–309.
9. Kumar D. «Colony’ under a Microscope: The Medical Works of W. M. Haffkine. Science // Technology & Society. 1999; 4(2): 239–271.
10. Hagwood B. Waldemar Mordecai Haffkine, CIE (1860–1930): Prophylactic Vaccination Against Cholera and Bubonic Plague in British India // Journal of Medical Biography. 2007; 15(1): 9–19.
11. Sorokina M. Haffkine. Dictionary of Medical Biography. W. F. Bynum, H. Bynum (eds). 5 Volumes. Westport, Connecticut; London, 2007; 3: 594–595.
12. Sorokina M. Between Faith and Reason: Waldemar Haffkine (1860–1930) in India // Western Jews in India: From the Fifteenth Century to the Present. W. X. Robbins, M. Tokayer (eds). Delhi, 2013; 161–178.
13. Hanhart J. Waldemar Mordekhaï Haffkine (1860–1930). Biographie intellectuelle, Éditions Honoré Champion, 2016.
14. Waldemar Haffkine, C.I.E. // Br. Med. J. 1930; 2(3644): 801. DOI: 10.1136/bmj.2.3644.801.
2 Георгий Юльевич Явейн (1863–1920) летом 1892 г., после защиты диссертации на степень доктора медицины, был командирован Императорской военно-медицинской академией в Институт Пастера для прослушивания курса лекций по бактериологии у профессора Ру; впоследствии стал профессором Военно-медицинской академии в Петербурге.
3 Михаил Иванович Томамшев (1852/53–1908) — известный кавказовед, просветитель и благотворитель. В Париже вел курсы по религии и истории Востока в Русской высшей школе общественных наук.
В 1894 году на борьбу с третьей пандемией чумы, начавшейся в Китае, были брошены лучшие врачебные силы многих стран мира. Японское правительство направило в Китай врача Шибасабуро Китадзато, а французское — Александра Иерсена. К этому времени уже были открыты возбудители холеры, туберкулеза, сибирской язвы и некоторых других инфекций, но микроорганизм, вызывающий чуму, оставался неизвестным. Китадзато выделил из тканей умершего больного микроорганизмы, которые посчитал возбудителями чумы. Независимо от японского врача Иерсен, получив культуру микроорганизмов из погибших от чумы, одновременно обнаружил чумную палочку в трупах павших крыс. Долгое время в медицинских кругах считалось, что микроорганизмы, обнаруженные исследователями, идентичны. Но через два года японские бактериологи К. Накамура и М. Огата с патологом М. Ямагава установили, что истинным возбудителем чумы все же является микроб, выделенный А. Иерсеном, а микроорганизм, изолированный Ш. Китадзато, относится к сопутствующей микрофлоре. Об этом Огата сделал доклад на Международном конгрессе в Москве в 1896 году.
Микроорганизм, вызывающий заболевание чумой, — чумная палочка — несколько раз менял свою таксономическую номенклатуру: Bacterium pestis — до 1900 года, Bacillus pestis — до 1923-го, Pasteurella pestis — до 1970-го и, наконец, Yersinia pestis как признание приоритета французского ученого.
Итак, возбудитель чумы был найден, но оставалось непонятным, какими путями происходит распространение болезни.
Первое объективное подтверждение того, что чумный микроб может передаваться от грызунов к человеку, получено в 1912 году. Тогда в северо-западном Прикаспии начали работу передвижные лаборатории под началом Д.К. Заболотного и И.И. Мечникова. Участник экспедиции врач И.А. Деминский выделил чумного микроба из органов суслика. Работая с полученным штаммом, И.А. Деминский заразился чумой и умер.
Изобретение предназначено для получения живых культуральных вакцин против чумы плотоядных. Для изготовления вакцины используют новый аттенуированный штамм "ВНИИВВиМ-88" (регистрационный номер "ВНИИВВиМ Деп" в коллекции ВГНКИ). В качестве клеточной системы при выращивании вируса применяют высокочувствительную сублинию СV-1 перевиваемых клеток почки африканской зеленой мартышки, а из сред высушивания - среду соответствующего состава на основе продуктов гидролиза белков. Монослойную культуру клеток сублинии СV-1 поддерживают серийным пассированием. Выращивание вируса в перевиваемой культуре клеток осуществляют в роллерных условиях. Сбор вируссодержащего материала проводят при достижении титра вируса до 3,5 - 4,5 lg ТЦД 50/ см 3 . Смешивают его с защитной средой в объемном соотношении 3 : 2. Корректируют рН смеси в пределах 6,4 - 6,8 и лиофилизируют. Способ получения вакцины производителен, прост в исполнении, доступен и легко реализуем в промышленном масштабе. Вакцина, изготовленная по новому способу, эффективнее аналогов по иммуногенности, безвредна, стабильна при хранении, стандартна, дешева. 1 табл.
Формула изобретения
Способ получения вакцины против чумы плотоядных, включающий выращивание вируса в культуре клеток, сбор вируссодержащего материала, смешивание его с защитной средой и лиофилизацию, отличающийся тем, что в качестве вируса используют аттенуированный штамм "ВНИИВВиМ-88" вируса чумы плотоядных, из культур клеток - перевиваемую культуру клеток сублинии CV-1 из почки африканской зеленой мартышки, из защитных сред - среду, содержащую ферментативный пептон или гидролизат белков молочной сыворотки или ферментативный гидролизат мышечных белков, сорбит или сахарозу и гидролизованный желатин, при этом сбор вируссодержащего материала проводят при достижении уровня накопления вируса 3,5 - 4,5 lg ТЦД 50/см 3 и смешивают его с защитной средой в объемном соотношении 3 : 2.
Описание изобретения к патенту
Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и биотехнологии, а именно к способам получения живых культуральных вакцин против чумы плотоядных, и может использоваться на предприятиях биологической промышленности.
Известен способ получения живых культуральных вакцин против чумы плотоядных (ЧП), включающий адаптацию аттенуированных штаммов вируса к первичным культурам клеток из тканей органов плотоядных животных из семейств псовых и куньих, почечной ткани африканской зеленой мартышки и тканей куриных и перепелиных эмбрионов, выращивание в указанных культурах вакционного вируса и его стабилизацию последующей лиофилизацией в подходящей среде (Патенты США кл. 424-89 N 2965544, 1960; N 3080291, 1963; кл. 435-237 N 4224412, 1980. Патенты ФРГ кл. 30h6 N 1138888, 1963; N 1235505, 1967. Автор. св-ва СССР кл. C 12 N 7/08 N 527072, 1977; кл. A 61 K 39/12 N 1287592, 1984).
Известен также способ получения культуральных вирусвакцин против ЧП, отличающийся тем, что в качестве клеточной системы для выращивания вируса используют линии трансформированных, неонкогенных перевиваемых клеток из почетной ткани животных: зеленой мартышки (Vero N 4647), макаки резус (LLC-MK2), собаки и сирийского хомяка (BHK-21S, BHK-21 13S) (Патенты США кл. 424-89 N 3836626, 1974: N 4004974, 1977; N 4351827, 1982; N 5000951, 1991. Патент Англии кл. A 61 K 39/175 N 2053679, 1981. Патент СРР кл. A 61 K 39/175 N 82518, 1983. Грачев В.Л. и др. //Вопр. вирусол. - 1990. - N 1).
Второй способ имеет несомненные преимущества перед первым, так как при производстве вакцины отпадает необходимость в использовании дорогостоящих, нестандартных и небезопасных первичных культур клеток. Основной недостаток второго способа состоит в невысокой иммуногенности получаемых вакцин, их прививочная доза варьирует в пределах от 1 тыс. до 1 млн ТЦД 50 (БОЕ 50). Другим недостатком способа является то, что репродукция вируса ЧП в ряде перевиваемых культур (LLC-MK2, BHK) протекает в течение 3 - 7 (иногда 10) сут и не сопровождается развитием специфического цитопатогенного действия (ЦПД), что с свою очередь затрудняет оценку результатов культивирования, усложняет и удорожает технологический процесс изготовления и контроля вакцины (Патенты США кл. 424-89, N 3836626, 1974; N 4351827, 1982. Патент Англии кл. A 61 K 39/175 N 2053679, 1981).
Наиболее близок к предлагаемому способ получения сухой культуральной вирусвакцины, содержащий аттенуированный штамм ЭПМ вируса ЧП, выращенный в первичной культуре клеток тканей эмбрионов японской перепелки (ЭП), и стабилизаторы высушивания - сорбит и желатозу (Патент США кл. 424-89 N 4224412, 1980).
Выращивание штамма ЭПМ выполняют в роллерной установке при множественности заражения 0,0001 - 0,001 ТЦД 50/клетку взвеси клеток ЭП с посевной концентрацией 0,8 - 1,0 млн на 1 см куб. В качестве ростовой среды применяют 0,5%-ный гидролизат лактальбумина на растворе Хенкса или среду 199 с 10% об. сыворотки крови крупного рогатого скотам (КРС), а в качестве среды поддержки - среду 199. Культивирование вируса проводят в течение 11 - 14 сут при температуре 36,5 - 37,5 o C и скорости вращения сосудов 12 - 25 об. в час. Перед лиофилизацией вирус смешивают в объемном соотношении 1:1 с защитной средой, содержащей равные объемы 20%-ного раствора сорбита и 6%-ного раствора желатозы. Титр вакцинного вируса в сухом препарате составляет от 2,8 до 3,8 1g ТЦД 50/см куб (Технические условия ТУ 10.19. 87-89 на вакцину против чумы плотоядных культуральную сухую из штамма ЭПМ. - Временная инструкция по изготовлению и контролю вакцины, ассоциированной против вирусного энтерита, ботулизма, псевдомоноза и чумы плотоядных, утвержденная 08.08.92 г.).
Основным недостатком ближайшего аналога является использование ЭП в качестве клеточного субстрата при выращивании вируса, которые, как известно, несвободны от посторонних микроорганизмов (эндогенных вирусов и микроплазм). Устранение этого недостатка возможно путем создания специализированных, постоянно контролируемых птицеферм со здоровым поголовьем, но это чрезвычайно повышает расходы на производство живой вакцины и контроль контаминированности перепелиного стада, яиц и биопрепарата. При этом применяемые индикации не могут гарантировать полного отсутствия контаминантов в объектах контроля.
Второй недостаток известного способа состоит в нестандартности применяемого клеточного субстрата, а следовательно, нестандартности вируса и вакцины, что обусловлено невозможностью получить из гомогената тканей ЭП больших партий однородных по своим свойствам клеточных культур и требует дополнительных затрат на контроль пригодности каждого источника ткани. Выход клеток от одного ЭП невысок, обычно составляет не более 40%, что также приводит к большим затратам на получение промышленных серий культуры клеток и повышает себестоимость вакцины.
К другим недостаткам аналога следует отнести длительный процесс культивирования (10 - 14 сут), что усложняет и удорожает производство препарата. Вакцина из штамма ЭПМ создает напряженный и продолжительный иммунитет после введения плотоядным в большом диапазоне доз: норкам, соболям, хорькам - от 120 до 120 ТЦД 50, лисам и песцам - от 240 до 2400 ТЦД 50, собакам - от 630 до 6300 ТЦД 50 вакционного вируса
Техническим результатом данного изобретения является получения безвредной, высокоиммуногенной, стабильной при хранении культуральной вакцины против ЧП.
Сущность изобретения состоит в том, что из штаммов вируса ЧП при изготовлении вакцины используют новый аттенуированный штамм "ВНИИВВиМ-88", в качестве клеточной системы - высокочувствительную сублинию CV-1 перевиваемых клеток почки африканcкой зеленой мартышки, из сред высушивания - среду соответствующего состава на основе продуктов гидролиза белков.
Предлагаемый способ получения живой культуральной вакцины против ЧП включает в себя: поддержание монослойной культуры клеток сублинии CV-1 серийным пассированием, выращивание вируса в перевиваемой культуре клеток в роллерных условиях, сбор вируссодержащего материала при достижении титра вируса 3,5 - 4,5 1g ТЦД 50/ см куб., смешивание его с защитной средой в объемном соотношении 3:2, коррекцию pH смеси в пределах 6,4 - 6,8 и лиофилизацию.
Новый вакцинный штамм, получивший название "ВНИИВВиМ-88" (регистрационный номер "ВНИИВиМ-88 Деп" в коллекции ВГНКИ), выделен из штамма ЭПМ адаптацией его к сублинии CV-1 посредством серии перемежающих пассажей и последующим клонированием методом предельных разведений. Новый штамм характеризуется следующими свойствами:
1) Штамм обладает морфологическими свойствами, характерными для вируса ЧП рода Morbillivirus семейства Paramyxoviridae.
2) Штамм размножается в перевиваемой культуре клеток сублинии CV-1 с развитием ярко выраженного ЦПД в виде симпластов и последующей деструкцией клеток, титр вируса в указанной культуре достигает 3,5 - 4,5 1g ТЦД 50/см куб. Без адаптации вирус размножается в культуре клеток из тканей куриных и перепелиных эмбрионов, вызывая специфическое ЦПД и накапливаясь в титрах до 3,0 - 4,0 1g ТЦД 50/см куб.
3) Штамм культивируют в монослое перевиваемых клеток сублинии CV-1 в стационарных и роллерных условиях, при оптимальных режимах максимум биологической активности достигается через 44 - 52 час.
4) Нерегулярно образует бляшки на ХАО куриных эмбрионов.
5) Не контаминирован бактериями, грибами, микоплазмами и посторонними вирусами.
6) Безвреден для лабораторных и восприимчивых животных, неконтагиозен, нереверсибелен; непатогенен для человека.
7) Индуцирует формирование напряженного и продолжительного иммунитета против чумы у вакцинированных пушных зверей (норок, тхорзофреток, песцов, лис, енотов) и собак.
8) Вызывает образование вируснейтрализующих антител в титрах 1:8 - 1:32 и выше; гемагглютинирующими свойствами не обладает.
9) Генетически стабилен в течение 10 последовательных пассажей в культуре клеток сублинии CV-1.
В отличие от известного способа вирус выращивают в перевиваемой культуре клеточной сублинии, полученной во ВНИИВВиМ из исходной культуры перевиваемых клеток CV-1 из почки африканской зеленой мартышки (номер 43.2 в каталоге клеточной коллекции ВНИИВВиМ). В данном случае из технологического процесса изготовления вакцины исключается дорогостоящая, нестандартная, малотехнологичная и контаминированная посторонними микроорганизмами первичная культура клеток ЭП.
Для виращивания вируса используют монослойную культуру клеток сублинии CV-1, полученную серийным пассированием с коэффициентом пересева 1:3 - 1:5 в пределах 50 последовательных пассажей. Для обеспечения стандартности производства вакцины создан криобанк рабочих клеток сублинии CV-1, содержащий клетки 17 пассажа в количестве 165 млн, охарактеризованные по стабильности морфологических, ростовых и кариологических показателей на отсутствие туморогенности и контаминации бактериями, грибами, микоплазмами и посторонними вирусами.
Новый штамм и используемые перевиваемые клетки легко культивируются в роллерных условиях на недефицитной питательной среде Игла-МЕМ с сывороткой крови КРС (соответственно по 4 - 5 и 9 - 10% об.), не теряют своих свойств после низкотемпературного хранения и "освежения" - восстановления. При температуре 36,5 - 37,5 o C время формирования монослоя клеток сублинии CV-1 и продолжительность культивирования вируса составляют по 44 - 52 час (каждый), что чрезвычайно выгодно для производства.
Применение быстроразмножающегося штамма и высокопродуктивной клеточной линии позволяет повысить технологичность и производительность производства, уменьшить экономические затраты и снизить себестоимость новой вакцины, а следовательно, обеспечивает ее коммерческое преимущество.
Безвредность, ареактогенность, высокая антигенная и иммуногенная активность вакцины, изготовленной по новому способу, гарантируются условиями адаптации и поддержания штамма "ВНИИВВиМ-88", при которых достигается стабильность его аттенуированных свойств, генетических и иммунобиологических признаков. В повышенных дозах (до 2000 ТЦД 50/см куб.) вакцина из штамма "ВНИИВВиМ-88" безвредна и не вызывает у иммунизированных плодоядных каких-либо отклонений от физиологической нормы в поведении и приеме пищи, признаков заболевания чумой и гибели.
Прививочная доза вакцины из штамма "ВНИИВВиМ-88" содержит: для норок и тхорзофреток - не менее 100 ТЦД 50/см куб., для лис, песцов и енотов - не менее 200 ТЦД 50/см куб., для собак - не менее 500 ТЦД 50/см куб. При внутримышечном введении в прививочной дозе новая вакцина не вызывает поствакцинальных реакций и осложнений. Иммунитет у пушных зверей наступает на 14 - 21-е сут после однократной вакцинации, у взрослых собак - на 10 - 14-е сут после однократного введения, а у щенков собак - после второй вакцинации в те же сроки. Ревакцинацию взрослых плотоядных проводят ежегодно в тех же дозах.
Вакцина из штамма "ВНИИВВиМ-88" создает 100%-ную защиту от чумы среди пушных зверей и собак, привитых начиная с двухмесячного возраста. У вакцинированных животных выявляют вируснейтрализующие (ВН) антитела к вирусу ЧП: у собак и тхорзофреток - в титрах 1:16 - 1:128, песцов, лис и енотов - 1:8 - 1:32. Продолжительность иммунитета у плотоядных составляет не менее 12 мес.
В отличие от аналогов для стабилизации физических и иммунобиологических свойств новой вакцины предлагается защитная среда на основе продуктов полного и неполного гидролиза белков, содержащая ферментативный пептон или гидролизат белков молочной сыворотки или ферментативный гидролизат мышечных белков, сорбит или сахарозу, гидролизованный желатин. Положительный эффект достигается при смешивании вируссодержащего материала с титром вакцинного вируса 3,5 - 4,5 1g ТЦД 50/см куб. и защитной среды в объемном соотношении 3:2. Предлагаемая среда гарантировано обеспечивает устойчивую эвтектическую зону препарата в пределах от минус 42 до минус 35 o C, минимальные потери титра вируса при лиофилизации (не более 0,5 lg), высокую сохраняемость вакцины.
Ниже в таблице приведены физические и иммунобиологические свойства 5 серий сухой культуральной вакцины против ЧП, приготовленной по новому способу как из длительно хранившегося (серия 1), так и из свежеполученного вируссодержащего материала (серии 2 и 5), сразу после изготовления и спустя 12 - 13 мес хранения препарата при температуре 4 - 6 o C. Титр вируса в свежеприготовленном препарате составляет 3,0 - 4,2 lg ТЦД 50/см куб. Срок годности вакцины - не менее 12 мес при температуре 4 - 6 o C, при температуре хранения от минус 50 до минус 40 o C он увеличивается до 18 мес.
Таким образом, предлагаемый способ обеспечивает получение сухой культуральной вакцины против ЧП из штамма "ВНИИВВиМ-88", характеризующейся безвредностью, высокой иммуногенностью, отсутствием контаминации посторонними микроорганизмами (бактериями, грибами, микоплазмами и патогенными для плотоядных вирусами), высокой сохраняемостью своих полезных свойств. Новый способ изготовления вакцины прост в исполнении, доступен и может быть реализован в промышленном масштабе.
Для подтверждения преимуществ настоящего изобретения приведены примеры конкретного исполнения.
Пример 1. Получение вируссодержащего материала.
Для получения вакцины вирус выращивают в монослойной культуре клеток сублинии CV-1 на роллерной установке производительностью 48 дм куб. материала за один цикл. Перевиваемую культуру получают серийным пассированием с коэффициентом пересева 1:4. В качестве ростовой среды применяют Игла-МЕМ с 9,5% об. сыворотки крови КРС. При температуре инкубирования 37 o C и скорости вращения сосудов 11 об. в час монослой клеток формируется через 48 час.
Выращивание вируса проводят в течение 48 час при температуре 37 o C, регулярно просматривая инфицированную культуру под микроскопом. В качестве поддерживающей среды используют Игла-МЕМ с 4,5% об. сыворотки крови КРС. По завершении процесса проводят контроль вируссодержащего материала на контаминацию бактериями, грибами, микоплазмами и по титру вируса в культуре клеток сублинии CV-1. В нашем опыте с одной роллерной установки, несущей 96 роллерных сосудов, получено 48 дм куб. стерильного вируссодержащего материала с титром вируса 4,25 lg ТЦД 50/ см куб., который используется для изготовления сухой культуральной вакцины.
Пример 2. Изготовление вакцины.
Для иммунизации собак и пушных зверей готовят по одной серии вакцины соответственно в ампулах и во флаконах.
Перед лиофилизацией вируссодержащий материал смешивают с защитной средой в объемном соотношении 3:2. С помощью 6%-ного (по массе) водного раствора янтарной кислоты устанавливают pH смеси в уровне 6,6.
Вакцину фасуют по 1 см куб. в стеклянные ампулы, по 5 см куб. - в стеклянные флаконы и высушивают лиофильно. Ампулы с сухой вакциной отпаивают, флаконы - герметично укупоривают.
Полученный препарат контролируют по внешнему виду, цвету, растворимости, содержанию массовой доли влаги, контаминации бактериями, грибами, микроплазмами, биологической активности (титру вируса по ЦПД в культуре клеток сублинии CV-1), безвредности (для тхорзофреток в дозе 3000 ТЦД 50), реактогенности и иммуногенности (в опытах на тхорзофретках). Результаты испытаний вакцины серий 3 и 5, приготовленных соответственно для иммунизации собак и пушных зверей, представленны в таблице.
Обе серии приготовленной вакцины отвечают нормативным требованиям и пригодны к применению.
Из 48 дм куб. вируссодержащего материала, полученного только на одной роллерной установке (пример 1), вышеописанным способом может быть изготовлено 80 тыс. доз для собак или 2 млн доз вакцины для иммунизации пушных зверей.
Пример 3. Испытания вакцины в производственных условиях.
Для испытания новой вакцины в производственных условиях проведена иммунизация 580 собак, 18640 норок, 14032 песцов и 628 енотов. Прививочная доза вакцины из штамма "ВНИИВВиМ-88" составила: собакам - от 1000 до 3000 ТЦД 50/см куб., норкам - от 200 до 470 ТЦД 50/см куб., песцам и енотам - от 400 до 940 ТЦД 50/2 см куб. вакцинного вируса. Поствакцинальных реакций и осложнений среди иммунизированных животных не наблюдали.
Через 9 - 12 мес после вакцинации пушных зверей ВН-антитела к вирусу ЧП выявляли в титрах, достаточных для защиты от полевого вируса на уровне 1:8 - 1: 32 в 82% проб и 1:4 - в 13,5% проб сывороток крови. В ходе испытаний вакцины у привитых собак и пушных зверей не было отмечено случаев прорыва иммунитета в течение года наблюдения.
С положительными результатами проведена межведомственная проверка иммунобиологических свойств вакцины, имеется положительное решение Госветбиокомиссии, утверждены технические условия ТУ 9384-005-0000864-96 на опытно-промышленную серию препарата и временное наставление по его применению. Налажено опытно-промышленное производство вакцины по новому способу.
Вакцина из штамма "ВНИИВВиМ-88" может использоваться для профилактической иммунизации домашних и служебных собак, пушных зверей в крупных зверокомплексах и фермерских хозяйствах. Применение вакцины безопасно в ветеринарно-санитарном отношении. Внедрение в производство предлагаемого способа позволит расширить ассортимент профилактических препаратов и повысить эффективность противоэпизоотических мероприятий против чумы плотоядных.
Со времен первых эпидемий чумы врачи-практики спорили о том, можно заразиться чумой от больного или нет и если можно, то каким способом. Мнения высказывались противоречивые. С одной стороны, утверждалось, что прикосновение к больным и их вещам опасно. С другой стороны, близость к больным, нахождение на инфицированной территории считались безопасными. Ясного ответа не было, поскольку втирание гноя больного в кожу или ношение его одежды далеко не всегда приводило к заражению.
Многие врачи усматривали связь между чумой и малярией. Первый опыт по самозаражению чумой провел в городе Александрия в 1802 году английский врач А. Уайт. Он хотел доказать, что чума может вызвать приступ малярии. Уайт извлек гнойное содержимое бубона чумной больной и втер себе в левое бедро. Даже когда на его собственном бедре появился карбункул и лимфатические узлы начали увеличиваться, врач продолжал утверждать, что заболел малярией. Лишь на восьмой день, когда симптомы стали очевидными, он поставил себе диагноз чумы и был доставлен в госпиталь, где и скончался.
Сейчас понятно, что от человека к человеку чума передается в основном воздушно-капельным путем, поэтому больные, особенно легочной формой чумы, представляют огромную опасность для окружающих. Также возбудитель чумы может проникнуть в организм человека через кровь, кожу и слизистые оболочки. Хотя причина болезни долгое время оставалась невыясненной, врачи давно искали способы защиты страшного заболевания. Задолго до начала эры антибиотиков, с помощью которых сегодня чуму довольно успешно вылечивают, и вакцинопрофилактики они предлагали различные способы повышения устойчивости организма к чуме.
Трагически закончился эксперимент, проделанный в 1817 году австрийским врачом А. Розенфельдом. Он уверял, что снадобье, приготовленное из костного порошка и высушенных лимфатических желез, взятых из останков умерших от чумы, при приеме внутрь полностью защищает от болезни. В одном из госпиталей Константинополя Розенфельд заперся в палате с двадцатью больными чумой, предварительно приняв рекламируемый им препарат. Сначала все шло хорошо. Шесть недель, отведенные для проведения эксперимента, заканчивались, и исследователь уже собирался покинуть госпиталь, когда внезапно заболел бубонной формой чумы, от которой и скончался.
Создатель первой в мире вакцины от чумы Владимир Хавкин проводит вакцинацию местного населения. Калькутта, 1893 год
Поиски средств профилактики и лечения чумы продолжались. Первую лечебную противочумную сыворотку приготовил Иерсен. После инъекции сыворотки больным чума протекала в более легкой форме, число смертельных случаев снижалось. До открытия антибактериальных препаратов эта вакцина была главным терапевтическим средством в лечении чумы, но при наиболее тяжелой, легочной, форме заболевания она не помогала.
В это же время на островах Ява и Мадагаскар французские ученые Л. Оттен и Г. Жирар тоже вели работы по созданию живой вакцины. Жирару удалось выделить штамм чумного микроба, который спонтанно потерял вирулентность, то есть перестал быть опасным для человека. Вакцину на основе этого штамма ученый назвал инициалами погибшей на Мадагаскаре девочки, у которой он был выделен, – EV. Вакцина оказалась безвредной и высоко иммуногенной, поэтому штамм ЕV и по сей день используется для приготовления живой противочумной вакцины.
Новую вакцину против чумы создал научный сотрудник Иркутского научно-исследовательского противочумного института Сибири и Дальнего Востока В.П. Смирнов, участвовавший в ликвидации 24 локальных вспышек чумы за пределами нашей страны. На основании многочисленных опытов на лабораторных животных он подтвердил способность микроба чумы вызывать легочную форму болезни при заражении через конъюнктиву глаза. Эти эксперименты легли в основу разработки конъюнктивального и комбинированного (подкожно-конъюнктивального) методов вакцинации против чумы. Чтобы убедиться в эффективности предложенного им метода, Смирнов сделал себе инъекцию новой вакцины и одновременно инфицировал себя вирулентным штаммом наиболее опасной, легочной, формы чумы. Для чистоты эксперимента ученый категорически отказался от лечения. На 16-й день после самозаражения он покинул изолятор. По заключению врачебной комиссии Смирнов перенес кожно-бубонную форму чумы. Эксперты констатировали, что предложенные В.П. Смирновым методы вакцинации оказались эффективными. Впоследствии в Монгольской Народной Республике при ликвидации вспышки чумы этими методами было привито 115 333 человека, из которых заболели лишь двое.
Читайте также: