Как обнаруживается вирус гриппа в курином эмбрионе

Обновлено: 28.03.2024

Использование в вирусологии куриных эмбрионов. Заражение куриных эмбрионов

Цель занятия: ознакомить студентов с методами заражения куриных эмбрионов для культивирования вирусов.

Оборудование и материалы: куриные эмбрионы 9-12 дневного возраста инкубации, овоскоп, спиртовые тампоны, подставки для эмбрионов, пинцеты, ножницы, лейкопластырь, иглы, шприцы, простые карандаши, пробойники, иголочки, таблицы, схемы, мультимедийное оборудование, презентации MS Office Power Point по теме занятия.

Объяснение преподавателя.

Существенно влияет на размножение вирусов в эмбрионах метод заражения. Перед заражением инкубированные яйца про­свечивают, погибшие отделяют. На скорлупе яиц с живыми эмбрионами, кото­рые различают по красному цвету кровеносных сосудов и движению эмбриона, карандашом отмечают место заражения.

Заражают эмбрионы в стерильном боксе, имеющем рабочий стол, два табуре­та, подводку газа, водопровод и вакуум. Заражение в амниотическую полость проводят в затемненной комнате. Рабочее место должно быть хорошо освещено. Перед работой стол дезинфицируют. Для дезинфекции поверхности яиц под­готавливают антисептический раствор (70%-ный спирт, 2%-ный раствор йода) и обернутую ватой деревянную палочку, согнутый зубной зонд или бормашину для просверливания яичной скорлупы. Яйца заражают при помощи стерильных шприца для туберкулинизации и специальных игл. Место заражения на яйце заливают парафином. Для этого готовят парафиновые палочки: в пробирку, за­полненную расплавленным парафином, вводят стеклянную палочку, следя за тем, чтобы она находилась в центре пробирки до остывания парафина.

Когда парафиновая палочка понадобится, стенки пробирки нагревают на го­релке и за стеклянную палочку вытягивают парафин из пробирки. Подержав палочку над пламенем, расплавляют необходимое для закрытия отверстия в яйце количество парафина. Этот способ очень чист, и при нем не образуются пары парафина.

Кроме того, на рабочем столе в боксе размещают стакан со стерильными ватными тампонами, стакан с 3 % раствором едкого натра для использо­ванных инструментов и сосуд с раствором хлорамина для использованных стек­лянных предметов. В случае надобности можно приготовить подставку для яиц, небольшую эмалированную чашку и стерильные питательные среды. Подготов­ленный таким образом рабочий стол в течение 1–2 ч подвергают УФ-облучению.

Учитывая патогенность исследуемых вирусов, работы ведут в маске, резино­вых перчатках и защитных очках.

Существует шесть методов заражения эмбрионов. Наиболее часто используют заражение в аллантоисную полость и на хорионаллантоисную оболочку, реже – в амниотическую полость и в желточный мешочек и совсем редко – в тело зародыша и в кровеносные сосуды ХАО. Выбор метода определяется тропизмом вируса, а также целью заражения. При любом методе заражения вводят 0,1–0,2 мл инфекционного материала.

Заражение в аллантоисную полость.

При заражении этим методом хорошо размножаются вирусы гриппа, ньюкаслской болезни, ринопневмонии лошадей, везикулярного стоматита и др. Существует несколько вариантов метода.

Первый вариант. Эмбрион фиксируют вертикально тупым концом вверх. В скорлупе на стороне зародыша, а иногда с противоположной зародышу стороны на 5–6 мм выше границы воздушной камеры делают отверстие диаметром около 1 мм. Иглу вводят параллельно продольной оси на глубину 10–12 мм (рис. 16). После инъекции вируссодержащего материала иглу извлекают, а отверстие в скорлупе закрывают каплей расплавленного стерильного парафина.


Рисунок 16. Заражение в аллантоисную полость (первый вариант) (по Николау)

Второй вариант. Сделанное в скорлупе над воздушной камерой отверстие используют лишь для выхода части воздуха. Отверстие же для самого заражения делают на участке бессосудистой зоны хорионаллантоисной оболочки (ХАО) со стороны зародыша. Иглу вводят на глубину не более 2–3 мм. Инъецируют инфицирующую жидкость в объеме 0,1–0,2 мл и закрывают отверстие парафином (см. рис. 17).

Заражение на хорионаллантоисную оболочку.

Этот метод заражения куриных эмбрионов чаще используют для культивирования эпителиотропных и пантропных вирусов оспы, инфекционного ларинготрахеита птиц, чумы плотоядных, болезни Ауески, катаральной лихорадки овец и др.




Такое заражение может быть выполнено через естественную или искусственную воздушную камеру.

Для заражения через естественную воздушную камеру эмбрион помещают в штатив вертикально тупым концом вверх и в скорлупе против центра воздушной камеры вырезают круглое окно диаметром 15–20 мм. Через это окно пинцетом снимают подскорлупную оболочку. На обнажившийся участок ХАО наносят 0,2 мм вируссодержащей суспензии (рис. 18), отверстие закрывают лейкопластырем или реже покровным стеклом, укрепив его расплавленным парафином.

Заражение через искусственную воздушную камеру применяют чаще первого, так как оно обеспечивает контакт вируссодержащего материала с большей поверхностью ХАО и, следовательно, ведет к образованию большего количества вируса.


Рисунок 17. Заражение куриного эмбриона в аллантоисную полость (второй вариант) (по Николау)

Рисунок 18. Заражение на ХАО через естественную воздушную камеру (по Николау и др.)


Рисунок 19. Заражение куриного эмбриона на ХАО через искусственную воздушную камеру (по Николау и др.)

Для заражения эмбриона этим методом его помещают в штатив горизонтально зародышем вверх. В скорлупе делают два отверстия: одно небольшое над центром воздушной камеры (предназначено для отсасывания из нее воздуха), а другое диаметром 0,2–0,5 см сбоку, со стороны зародыша. Сложность метода в том, что, делая второе отверстие, необходимо осторожно снять вначале кусочек скорлупы, затем скользящим движением, не повреждая ХАО, сдвинуть подскорлупную оболочку в сторону так, чтобы через образовавшийся дефект мог пройти воздух. После этого резиновой грушей через первое отверстие отсасывают воздух из естественной воздушной камеры (рис. 19, а).В результате через боковое отверстие наружный воздух устремляется внутрь, образуя искусственную воздушную камеру, дном которой является ХАО (рис. 19, б).

Через боковое отверстие на поверхность ХАО наносят инфекционную жидкость и отверстие закрывают кусочком лейкопластыря. Закрывать первое отверстие нет необходимости, так как внутренний листок подскорлупной оболочки при этом методе заражения не нарушается и продолжает выполнять роль барьера для микрофлоры окружающей среды.

Дальнейшую инкубацию эмбрионов, зараженных этим методом, проводят в горизонтальном положении боковым отверстием вверх.

Заражение в желточный мешок.

Большей частью им пользуются для размножения хламидий, а также вирусов болезни Марека, ринопневмонии лошадей, катаральной лихорадки овец и др. Заражают эмбрионы 5–7-дневного, а иногда и 2–3-дневного возраста (вирус лихорадки долины РИФ). Используют два варианта заражения.

Первый вариант. Эмбрионы помещают в штатив в вертикальном положении. Делают отверстие в скорлупе над центром воздушной камеры и вводят иглу на глубину 3,5–4 см под углом 45° к вертикальной оси в направлении, противоположном месту нахождения зародыша (рис. 20).


Рисунок 20. Заражение куриного эмбриона в желточный мешок (по Николау и др.)

Второй вариант. Иногда аналогичный путь заражения осуществляется на горизонтально укрепленном в штативе эмбрионе; при этом зародыш находится внизу, а желток над ним. Отверстие в скорлупе закрывают каплей расплавленного парафина.

Заражение в амниотическую полость.

Для этой цели используют эмбрионы 6 - 10-дневного возраста. Метод используется при культивировании вирусов гриппа, ньюкаслской болезни, ринопневмонии лошадей и др. Есть два способа заражения.

Закрытый способ. Заражение проводят в затемненном боксе. Яйцо помещают на овоскопе в горизонтальном положении зародышем вверх. Через отверстие в скорлупе над воздушной камерой вводят иглу с затупленным концом по направлению к зародышу. Доказательством того, что игла проникла в амнион, служит движение тела зародыша в направлении передвижения.

Открытый способ. Скорлупу над воздушной камерой срезают так, чтобы образовалось окно диаметром 1,5–2,5 см. Через него пинцетом под контролем глаза снимают подскорлупную оболочку. Затем анатомический (14 см) пинцет с сомкнутыми браншами ведут, продавливая хорионаллантоисную оболочку по направлению к зародышу. Когда пинцет достигнет его, бранши размыкают, захватывают амниотическую оболочку вместе с ХАО и подтягивают к окну. Удерживая левой рукой пинцет с фиксированной в нем оболочкой амниона, вводят вируссодержащий материал (рис. 21). Далее все оболочки опускают, окно закрывают лейкопластырем и эмбрион инкубируют в вертикальном положении.


Рисунок 21. Заражение куриного эмбриона в амнион открытым способом (по Николау и др.)

Заражение в кровеносные сосуды ХАО.

При овоскопировании 11– 13-дневных эмбрионов отмечают крупный кровеносный сосуд. По его ходу удаляют участок скорлупы, наносят 1–2 капли спирта, что делает на некоторое время подскорлупную оболочку прозрачной. Под контролем глаза на овоскопе иглу вводят в сосуд, что подтверждается его подвижностью при небольших боковых движениях иглы. Обнаженный участок подскорлупной оболочки закрывают кусочком лейкопластыря.

Можно материал в сосуды ввести и несколько отличающимся способом: срезают скорлупу над воздушной камерой, подскорлупную оболочку смачивают спиртом и в ставшие видными сосуды ХАО вводят материал. Отверстие закрывают кусочком стерильного лейкопластыря.

Описанные технические приемы экспериментального заражения куриных эмбрионов не единственные, а имеют различные варианты.

Заражение в тело зародыша.

Для заражения используют эмбрионы 7–12-дневного возраста. Известно два варианта метода.

Первый вариант. Заражают так же, как в амнион закрытым способом, с той лишь разницей, что берут острую иглу и на овоскопе показателем попадания иглы в тело считают подчинение зародыша движениям иглы.

Второй вариант. Заражают так же, как в амнион открытым способом: через окно в скорлупе подтягивают пинцетом тело зародыша. Материал вводят в головной мозг или определенные участки тела. При таких методах заражения бывает значительный процент неспецифической гибели эмбрионов.

Накопление вируса в курином эмбрионе

Перед дальнейшей инкубацией на скорлупе зараженных любым методом куриных эмбрионов простым (графитным) карандашом пишут, чем заражен эмбрион и когда, а если нужно, то и другие сведения. Зараженные куриные эмбрионы помещают в термостат для дальнейшей инкубации, в процессе которой происходят репродукция внесенных вирусов и их накопление в соответствующих структурах. Температура инкубации эмбрионов варьирует от 33 до 38 °С в зависимости от свойств вируса, которым проведено заражение. За эмбрионами ведут постоянное наблюдение, просматривают на овоскопе, отбирая павшие.

Гибель эмбрионов в первые 24 ч после заражения чаще всего обусловлена размножением грибов, бактериальной микрофлоры, внесенных в эмбрион вместе с инокулятом, или травмированием при заражении. Эта гибель считается неспецифической. В более поздние сроки эмбрионы гибнут в результате, как правило, размножения в эмбрионах вируса. Обнаружив погибшие эмбрионы, их сразу же переносят в холодильник с температурой 4 °С. Такие условия, с одной стороны, способствуют сохранению активности накопившегося в эмбрионе вируса, с другой – уплотнению тканей и запустению сосудов, что значительно облегчает последующее вскрытие.

Эмбрионы инкубируют до момента максимального накопления вируса. Для каждого вируса и даже штамма этот срок является определенным и варьирует в пределах от 2 до 7-8 сут. Так, для вируса ньюкаслской болезни штамма Н он составляет 2-3 дня, для того же вируса штамма В,– 5 дней, для вируса инфекционного ларинготрахеита птиц – 5 дней и т. д. Затем все эмбрионы умерщвляют охлаждением при 4 °С в течение не менее 3–4 ч и вскрывают.

Деэмбринированные яйца.

В основе метода лежит удаление эмбриона из яйца в период, когда к его скорлупе изнутри полностью прилегает хорионаллантоисная оболочка. Если внутрь такого яйца добавить питательную среду, то образует­ся своеобразная культура ткани, в которой может размножаться вирус. Метод обладает рядом преимуществ: он позволяет получить более чистый вирус, чем в аллантоисно-амниотической жидкости, что важно для снижения аллергизирующих свойств вакцин, приготовленных из этого материала; отсутствие желточного мешка и, следовательно, содержащихся в нем специфических антител позволяет лучше размножаться некоторым вирусам. В некоторых случаях этот метод дает хорошие результаты в диагностических работах, так как при нем можно вводить большие количества исследуемого материала, что увеличивает возможность вы­деления вируса.

Метод предложил Бернкопф еще в 1949 г., но из-за трудностей применения широко не используется. Трудности эти связаны со свойством хорионаллантоисной оболочки в процессе инкубации отделяться от скорлупы, что снижает ценность культуры и затрудняет манипуляции получения вируса и замены пита­тельной среды.

Е. Гройель (1963) ввел ряд модификаций, которые позволили устранить эти трудности. Он предложил использовать 15-дневные и даже более старые яйца, которые в процессе инкубации следует часто переворачивать для равномерного развития оболочки на скорлупе яйца. При просвечивании обозначают границы воздушной камеры. Скорлупу отпиливают на 0,5 см выше этой линии, на край скорлупной оболочки наливают расплавленный парафин (56-58 С°), который застывая, фиксирует край яйца. Затем вырезают круглое отверстие в оболочке над зародышем, оставляя вокруг узкий ободок. Следующий этап – осторожное удаление зародыша из яйца. При этом яйцо следует удерживать в горизонталь­ном положении и медленно поворачивать. Таким путем находят сосуды, связы­вающие эмбрион с ХАО, и перерезают их ножницами. Если яйцо держать верти­кально, то зародыш своей массой оттягивает оболочку, отрывая ее обычно в области острого конца яйца. Попадание даже небольшого количества жидкости между ХАО и скорлупой вызывает полную отслойку оболочки в течение 1–2 дней.

После удаления зародыша оболочку, выстилающую яйцо, несколько раз про­мывают физиологическим раствором, охлажденным до 4–0°С, до тех пор, пока жидкость не станет прозрачной. Затем в полость яйца вводят 20 мл питательной среды, подогретой до 37 °С, и яйцо закрывают стерильным резиновым колпач­ком, предварительно погрузив его в парафин. Трубка с резиновой пробкой, вмонтированная в яйцо, обеспечивает как взятие, так и введение жидкости без опасности бактериального заражения. Такой биологический объект сохраняет жизнеспособность в течение нескольких дней.

По методике Йошино и других, полость деэмбринированных яиц заполняют раствором агара в растворе Хенкса. Заражают деэмбринированные яйца через трубку в колпачке.

Перед развитием в культуре клеток многие вирусы культивируются в куриных яйцах с развивающимся эмбрионом. На сегодняшний день этот метод в большинстве случаев используется для выращивания вируса гриппа. Превосходный урожай вируса из куриных яиц привел к их широко распространенному использованию в исследовательских лабораториях и при производстве вакцин. В действительности подавляющее большинство противогриппозных вакцин, как инактивированных, так и инфекционных, производится в куриных яйцах. Как вирус гриппа размножается в яйцах?

Рис. 41 демонстрирует срез куриного яйца с развивающимся эмбрионом. Показаны различные пути инокуляции в яйцо, так же как и различные отделения, где размножаются вирусы.

Рисунок 41.

Для размножения вируса гриппа используются свободные от патогена яйца 11 – 12-го дня после оплодотворения. Яйцо располагают перед источником света для определения области аллантоисной полости без прожилок, расположенной под воздушным мешком. Она помечается карандашом. После того, как все яйца просвечены таким образом, делается небольшая зарубка в скорлупе в этой позиции с использованием ювелирного резца. Затем просверливается отверстие сверху яйца при помощи моторизированного инструмента Дремеля (Dremel). Если этого не сделать, то после введения вируса давление в воздушном мешке просто вытеснит посевной материал.

После того как на всех яйцах поставлена зарубка и они просверлены, в них вводится вирус при помощи шприца для инъекций туберкулина – шприц на 1 мл, заполненный на ½ дюйма, стрелка указателя в позиции 27. Игла проходит через отверстие в скорлупе, сквозь хориоаллантоисную мембрану, и вирус помещается в аллантоисной полости, заполненной аллантоисной жидкостью. Два отверстия в скорлупе запечатываются расплавленным парафином, и яйца помещают на 48 часов в термостат, установленный на 37°С.

В течение инкубационного периода вирус размножается в клетках, составляющих хориоаллантоисную мембрану. Так как новые вирусные частицы образуются почкованием (см. 4.1.), они выходят в аллантоисную жидкость. Чтобы собрать вирус, удаляют верхушку яичной скорлупы – часть, покрывающую воздушный мешок. Для этого когда-то мы пользовались специальным инструментом, который располагался над яйцом. Было легко удалить эту часть скорлупы пинцетом. Скорлуповая оболочка и хориоаллантоисная мембрана протыкались пипеткой, которая использовалась для удаления аллантоисной жидкости – примерно 10 мл в каждой яйце. Достаточное количество вируса для производства 15 мкг дозы вакцины могло быть собрано из одного или двух яиц (в зависимости от штамма вируса).

Когда-то мы выращивали так много вируса гриппа, что большая термальная комната с отдельным входом использовалась как инкубатор для яиц. Когда вы открывали дверь инкубатора и слышали писк, это значило, что кто-то оставил неиспользованные яйца на слишком долгое время и они вывелись. В этом случае вам предстояло поймать неуловимых цыплят.

Взрослые обладают перекрестно-реагирующими антителами к A/California/04/2009 (H1N1)

[Главы нет в содержании, но есть ссылка на нее из глав 7.2. и 7.3.]

Дает ли предыдущее знакомство с вирусами гриппа H1N1, обусловленное заражением или вакцинацией, какую-либо защиту против заражения новыми штаммами H1N1? Ответ на этот вопрос может прояснить, почему свыше 60% подтвержденных случаев гриппа были вызваны вирусами, подобными вирусам свиного гриппа H1N1, в США у людей от 5 до 24 лет, как сообщалось на пресс-конференции CDC.

Для ответа на этот вопрос CDC проанализировал образцы сыворотки, собранные в течение предыдущих исследований вакцины. Эти сыворотки собрали от детей и взрослых до и поле того, как их привили вакциной против гриппа, в сезоны гриппа 2005 – 2006, 2006 – 2007, 2007 – 2008 и 2008 – 2009 гг. Применялись методы нейтрализации вируса и торможения гемагглютинации для определения того, содержат ли эти сыворотки антитела, перекрестно-реагирующие с новым штаммом H1N1. В качестве образца новых изолятов вируса H1N1 использовался A/California/04/2009.

Результаты показали, что предварительная вакцинация детей (в возрасте от 6 месяцев до 9 лет, всего 79 образцов) или сезонной тривалентной инактивированной вакциной, или инфекционной аттенуированной противогриппозной вакциной в предыдущие 4 года не вызвала перекрестно-реагирующих антител для ответа на A/California/04/2009 у взрослых. Среди людей возраста от 18 до 64 лет был двукратный рост перекрестной реактивности антител к вирусу в сравнении с 12 – 19-кратным ростом в титрах антител против сезонных штаммов. У людей старше 60 лет не было роста кросс-реактивности антител. Эти данные показывают, что иммунизация сезонной противогриппозной вакциной, содержащей прежние штаммы H1N1 (2005 – 2009 гг.), похоже, не дает защиты против инфицирования новыми штаммами H1N1.

Важным является вопрос, содержат ли сыворотки, полученные до введения вакцины, перекрестно-реагирующие титры антител против A/California/04/2009. Такой анализ показал бы, дает ли естественное заражение штаммами H1N1 некоторую защиту против новых изолятов. У 79 детей в возрасте от 6 месяцев до 9 лет до вакцинирования не было обнаружено перекрестно-реагирующих антител в сыворотке к A/California/04/2009. Однако 6% взрослых в возрасте от 18 до 40 лет, 9% – от 18 до 64 лет и 33% старше 60 лет имели перед вакцинацией нейтрализующие титры антител к A/California/04/2009 выше 160 или равные этому значению. Эти антитела, скорее всего, были приобретены с инфицированием вирусом H1N1, по антигенным свойствам более близким к A/California/04/2009, чем к другим штаммам сезонного H1N1. Неизвестно, могут ли эти антитела дать защиту против заражения, но они могут уменьшить тяжесть симптомов болезни.

Я подозреваю, что не все знакомы с методами микронейтрализации и торможения гемагглютинации, используемыми в этом исследовании. Впоследствии я объясню механизм действия этих методов и важность их результатов.

Рекомендуемая литература.

  • J Katz, PhD, K Hancock, PhD, V Veguilla, MPH, W Zhong, PhD, XH Lu, MD, H Sun, MD, E Butler, MPH, L Dong, MD, PhD, F Liu, MD, PhD, ZN Li, MD, PhD, J DeVos, MPH, P Gargiullo, PhD, N Cox, PhD (2009). Serum Cross-Reactive Antibody Response to a Novel Influenza A (H1N1) Virus After Vaccination with Seasonal Influenza Vaccine Morbid.Mortal. Weekly Rep., 58 (19), 521-524.

7.2. Метод торможения гемагглютинации гриппа

Центры по контролю и профилактике заболеваний определили, что некоторые взрослые имеют сывороточные перекрестно-реагирующие антитела к новому вирусу гриппа H1N1. Чтобы сделать такой вывод, использовали одну из методик, называемую методом торможения гемагглютинации. Как он действует?

7.3. Анализ микронейтрализации гриппа

Анализ микронейтрализации – другой метод, с помощью которого Центры по контролю и профилактике заболеваний определили, что некоторые взрослые имеют перекрестно-реагирующие антитела к новому вирусу гриппа H1N1. Рассмотрим, как действует этот метод.

Репликация вируса часто исследуется в лаборатории путем инфицирования клеток, выращиваемых в пластмассовых планшетах или колбах, которые обычно называются клеточными культурами. На рис. 43 – пример клеток HeLa, убиваемых полиовирусом.

Рисунок 43.

Верхний левый квадрат показывает неинфицированные клетки, а другие части показывают клетки в течение определенного времени после заражения. По мере размножения вируса зараженные клетки округляются и отделяются от планшета с культурой клеток. Эти видимые изменения называются цитопатическим эффектом.

Есть и другой путь сделать видимым уничтожение клеток вирусом без использования микроскопа – окрашивание клеток красителем. На рис. 44 клетки были расположены в маленьких лунках 96-луночного планшета. В одну лунку добавили вирус, а в другие – нет. После периода инкубации клетки окрасились в кристаллический фиолетовый, который окрашивает только живые клетки. Видно, какие клетки были поражены вирусом, а какие нет.

7.4. Определение вирусов: анализ бляшкообразования

Одним из наиболее важных процессов в вирусологии при измерении титра вируса является концентрация вирусов в образце. Широко используемый подход для определения количества инфекционного вируса – это анализ бляшкообразования. Данная методика впервые была разработана для подсчета титров линии бактериофагов. Р. Дульбекко (Renato Dulbecco) модифицировал этот процесс в 1952 г. для использования в вирусологии животных, и с тех пор он используется для надежного определения титров многих различных вирусов.

Рисунок 46.

Для проведения анализа бляшкообразования приготавливают 10-кратные разведения линии вирусов и вводят 0,1 мл аликвоты в чувствительные клеточные монослои. После инкубационного периода, во время которого вирус прикрепляется к клеткам, монослои покрываются питательной средой, содержащей вещество (обычно агар), способствующее образованию геля. Когда планшеты инкубируют, в изначально зараженных клетках выводится вирусное потомство. Распространение новых вирусов ограничено гелем до соседних клеток. Следовательно, каждая инфекционная частица производит круговую зону зараженных клеток, называемую бляшкой. В итоге бляшка становится достаточно большой, чтобы стать видимой невооруженным глазом. Краситель, помечающий живые клетки, часто используется для усиления контраста между живыми клетками и бляшками. Этим способом пригоден для анализа только тех вирусов, которые причиняют видимый ущерб клеткам. Пример бляшек, образованных полиовирусом на монослое клеток HeLa, показан на рис. 46. Клетки окрашены кристаллическим фиолетовым, а бляшки без труда видны там, где клетки разрушены вирусной инфекцией.

Титр линии вируса может быть подсчитан в бляшкообразующих единицах (PFU) на миллиметр. Для определения титра вируса подсчитываются бляшки. В целях снижения погрешности подсчитываются только планшеты, содержащие от 10 до 100 бляшек, в зависимости от размера используемого планшета с культурой клеток. Согласно правилам статистики, при подсчете 100 бляшек титр образца будет варьироваться в пределах ± 10%. Каждое разведение проводится дважды для повышения точности. На рис. 47 показано 17 бляшек на планшете, сделанном из разведения 10 -6 . Поэтому титр вируса составит 1,7 × 10 8 PFU/мл.

Рисунок 47.

Впоследствии мы обсудим, как анализ бляшкообразования может использоваться для приготовления клональных линий вирусов – очень важной стадии в исследовании вирусной генетики.

Рекомендуемая литература.

  • Dulbecco, R., & Vogt, M. (1953). Some problems of animal virology as studied by the plaque technique. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 18, 273-279.

7.5. Сколько вирусов требуется для образования бляшки?

Анализ бляшкообразования – главный инструмент для определения титров вируса. Идея проста: вирусная инфекция ограничивается до соседних клеток полутвердым верхним слоем. Подсчитывая количество бляшек, можно вычислить титр вируса в PFU на мл. Основной вопрос: сколько нужно вирусов для формирования одной бляшки?

Для большинства вирусов животных одной инфекционной частицы бывает достаточно для начала инфекции. К этому выводу можно прийти, изучая отношения между количеством вирусных частиц и подсчетом бляшек. Линейная зависимость означает, что бляшку может образовать одна инфекционная частица. Считается, что в этом случае вирус заразил клетку с динамикой в один удар. Эта концепция продемонстрирована на рис. 48. Количество бляшек, образованных с динамикой одного или двух ударов показано на графике в сравнении с относительной концентрацией вируса.

Рисунок 48.

Есть некоторые примеры вирусов с динамикой в два удара, другими словами, два различные типа вирусных частиц должны заразить клетку для запуска инфекционного цикла. Примеры включают геномы некоторых РНК вирусов растений с (+) нитью, состоящие из двух молекул РНК, упакованных в различные частицы. Кривая зависимости от дозы подобных вирусов, скорее, параболическая, чем линейная.

Когда единичная вирусная частица способна образовать бляшку, вирусное потомство внутри бляшки представляет собой клоны. Вирусная линия, приготовленная из единичной бляшки, называется очищенной линией вирусов из бляшки. Чтобы приготовить такую линию вирусов, наконечник маленькой пипетки вставляют в верхний слой агара над бляшкой. Пробка агара удаляется и помещается в буферный раствор. Вирусы в пробке агара перемещаются в буферный раствор, который затем можно использовать для заражения клеточных культур. Для обеспечения чистоты этот процесс обычно повторяют как минимум еще раз. В значительной степени очищение бляшки используется в вирусологии для основания клональных линий вирусов. Способность подготовки клональных линий вирусов было важным шагом, позволившим проводить генетический анализ вирусов.

7.6. Измерение вирусов методом конечного разведения

Анализ бляшкообразования – замечательный метод определения титров вируса, но он не применим для всех вирусов. К счастью, доступно несколько альтернативных методов, включая метод конечного разведения.

Метод конечного разведения использовался для измерения титра вируса до развития метода бляшкообразования и все еще применяется для вирусов, не образующих бляшек. Подготавливаются последовательные разведения линии вируса, которые вносятся в копируемые культуры клеток, часто в многолуночных форматах (например, в 96-луночный пластмассовый планшет). Количество заражаемых культур клеток определяется впоследствии для каждого разведения вируса, обычно путем поиска цитопатического эффекта.

В данном примере метода конечного разведения каждый из 10 монослоев клеточных культур был инфицирован разведением вируса. После инкубационного периода планшеты, показавшие цитопатические эффекты, были помечены +. При высоких разведениях ни одна из клеточных культур не была заражена, так как не было частиц. При низких разведениях каждая культура клеток была инфицирована. Половина клеточных культур показала цитопатические эффекты при разведении 10 -5 . Это и есть конечная точка: разведение вируса, при котором 50% клеточных культур оказалось заражено. Это количество может быть высчитано на основании данных и выражено как 50% инфекционной дозы (ИД50) на миллилитр. Линия вирусов в приведенном примере содержит 10 5 ИД50 на мл.

Рисунок 49.

В реальной жизни конечная точка со значением 50% обычно не встречается, как мы показали на примере разведения. Поэтому привлекаются статистические методы подсчета конечной точки титрования.

Методы конечного разведения также могут использоваться при определении вирулентности вируса у животных. Применяется тот же подход: производятся последовательные разведения вирусов и вводятся в ряд подопытных животных. Заражение животного можно определить по его смерти или клиническим симптомам, таким как повышенная температура, потеря веса или паралич. Результаты выражаются в виде 50% летальной дозы (LD50) на мл или 50% паралитической дозы (PD50) на мл, когда смертность или паралич используются как конечные точки.

Следующий пример поясняет использование конечного разведения при подсчете смертности от полиовируса у мышей. Восьми мышам ввели разведение вируса, а конечной точкой была смерть. Статистический метод Рида – Мюнха использовался для определения конечной точки со значением 50%. В этом методе объединены результаты, и смертность подсчитана для каждого разведения. Конечная точка в 50%, которая находится между пятым и шестым разведениями, подсчитана как 10 -6,5 . Поэтому образец вируса содержит 10 6,5 LD50 единиц.

Мы кратко рассмотрели структуру вирионов гриппа и процесс кодирования вирусными РНК одного и более белков. Теперь обратимся к размножению вирусов гриппа.

Вирусы – это исключительно внутриклеточные паразиты, они не могут воспроизводиться вне клетки. Появление новых инфекционных частиц должно протекать внутри клетки. Войдя в клетки, вирусы начинают паразитировать в структуре хозяина для воспроизводства вирусного потомства. Все события, происходящие в инфицированной вирусом клетке, называются инфекционным циклом, или вирусной репликацией. Вирусологи искусственно разделяют инфекционный цикл на несколько стадий, чтобы проще было его изучить. Эти стадии включают прикрепление и вхождение вириона, трансляцию мРНК в белок, репликацию генома (создание большего количества РНК или ДНК), скопление новых частиц и выход частиц из клетки. Мы рассмотрим каждую из названных стадий, а затем обсудим, как вирус гриппа инфицирует нас и вызывает болезнь.

Остановимся на первой стадии – прикреплении вириона к клетке. Возьмем обычную клетку, с которой, я уверен, знаком каждый. Но не будет лишним повториться.

Рисунок 10.

Слева показан клеточный белок, прикрепленный к цитоплазматической мембране. Снизу изображена внутренняя часть клетки – цитоплазма. Часть белка пересекает мембрану, и также видны части цитоплазматической и внеклеточной сторон. Сферы – это сахара, прикрепленные ко множеству белков (белок + сахар = гликопротеин). Сиаловая кислота всегда является последним сахаром в цепи, которая прикрепляется к белку. Справа показана химическая структура сиаловой кислоты; следующий сахар (справа) – галактоза. Вирионы гриппа прикрепляются к клеткам, когда HA захватывает очень маленькую сиаловую кислоту.

Сахар в сравнении с HA в действительности очень мал – он подходит к небольшому кармашку на острие шипа. На рис. 11 изображена молекулярная модель, демонстрирующая, как HA прикрепляется к аналогу сиаловой кислоты. Шаровидный конец HA показан в верхней части рис. 11. Маленькие красные и белые сферы показывают места будущего прикрепления сиаловой кислоты – кармашки на верхнем конце HA.

Рисунок 13.

Процесс вхождения вируса гриппа в клетки – наиболее понятный из всех известных механизмов проникновения вирусов. После прикрепления вириона к сиаловой кислоте, имеющей рецепторы на поверхности клетки, вирус-рецепторный комплекс входит в клетки посредством эндоцитоза – процесса, в ходе которого клетки обычно берут молекулы из внеклеточной жидкости. Пока эндосомальные везикулы, содержащие частицы вируса, движутся к ядру клетки, их pH понижается. Это изменение в pH завершает клеточный канал, закачивающий протоны (H+) в везикулу. Когда эндосомальная pH достигает 5,0, вирусный белок HA подвергается конформационной перестройке. Это изменение подвергает пептид слияния на HA короткой гидрофобной последовательности, вставляющей его в эндосомальную мембрану, которая от этого сливается с вирусной оболочкой. Когда это происходит, вирусные РНК проникают в цитоплазму. Затем они транспортируются в ядро клетки, где начинается размножение.

В вирионе гриппа вирусные РНК не оголены, поскольку к ним прикреплены вирусные белки, включая белок M1. Этот белок образует оболочку, лежащую в основе липидной мембраны вириона. К сожалению, если вирусные РНК прикрепляются к белку M1, когда выходят из вириона, они не могут достичь ядра. Для решения этой проблемы вирион гриппа имеет в своей мембране несколько копий белка, называемого M2. Этот вирусный белок образует канал в мембране, который активно закачивает протоны из эндосомы во внутреннюю часть вириона. Данные протоны понижают pH внутри вириона, освобождая вирусные РНК от M1. В этом случае РНК могут войти в ядро.

Ионный канал M2, являющийся мишенью для противовирусных адамантанов, показан на рис. 14. Эти образования забивают канал и не позволяют протонам закачиваться в вирион. В присутствии адамантанов вирусным РНК нужно прикрепляться к M1, отчего они не могут достичь ядра. Поэтому вирусная репликация подавляется. Устойчивость к адамантанам возможна при изменении в аминокислотах, прокладывающих канал M2. Такие изменения не дают лекарству забить канал.

Рисунок 15.

На рис. 15 сферический конец белка HA, который прикрепляется к рецепторам клетки, изображен сверху, а вирусная мембрана – снизу. Для наглядности помечен только сайт расщепления HA. Нерасщепленная форма белка называется HA0; после расщепления клеточным ферментом образуются два белка, называемые HA1 (синий) и HA2 (красный). Две субъединицы остаются вместе на поверхности вирусной частицы. Новая амино(N)-концевая область HA2, образовавшегося при расщеплении, содержит последовательность гидрофобных аминокислот, называемых пептидом слияния. Во время вхождения вируса гриппа в клетки пептид слияния вставляется в эндосомальную мембрану и вызывает слияние вирусной и клеточной оболочек. Следовательно, вирусные РНК гриппа могут войти в цитоплазму. Процесс слияния описан в предыдущем параграфе.

Если белок HA не расщеплен, чтобы образовать HA1 и HA2, слияния не происходит. Поэтому вирусы гриппа с нерасщепленным HA не заразны. Расщепление вирусного HA происходит после того, как вновь синтезированные вирионы выходят из клетки. Вирусы гриппа эффективно размножаются в яйцах из-за присутствия протеазы в аллантоисной жидкости, способной расщеплять HA. Однако репликация многих штаммов вируса гриппа в культурах клеток требует добавления в среду соответствующей протеазы (как привило, трипсина).

У людей репликация вируса гриппа ограничена дыхательными путями, потому что это единственный участок, где производится протеаза, расщепляющая HA. Однако белок HA высокопатогенных штаммов H5 и H7 вируса птичьего гриппа может расщепляться протеазами, производимыми во многих различных тканях. В результате эти вирусы способны размножаться во многих органах птиц, включая селезенку, печень, легкие, почки и мозг. Это свойство объясняет способность штаммов H5N1 вируса птичьего гриппа размножаться вне дыхательных путей человека.

Подобно белкам HA высокопатогенных вирусов H5 и H7, HA штамма вируса гриппа 1918 г. может также расщепляться повсеместно присутствующими клеточными протеазами. Следовательно, вирус может размножаться в культурах клеток без добавления трипсина.

Белки HA H5 и H7 имеют множество основных аминокислотных остатков на сайте расщепления HA1-HA2, которые делают возможным расщепление посредством широко представленных протеаз. Но HA вируса гриппа H1 1918 г. не обладал этим свойством. Также N1 1918 г. не был в состоянии привлечь протеазы, которые расщепляли бы HA, т. е. не было механизма, позволяющего штамму A/WSN/33 вируса гриппа размножаться в клетках без трипсина. Понимание того, как белок HA вируса H1 1918 г. мог быть расщеплен протеазами – основной в понимании высокой патогенности данного штамма.

Рекомендуемая литература.

Chaipan, C., Kobasa, D., Bertram, S., Glowacka, I., Steffen, I., Solomon Tsegaye, T., Takeda, M., Bugge, T., Kim, S., Park, Y., Marzi, A., &Pohlmann, S. (2009). Proteolytic Activation of the 1918 Influenza Virus Hemagglutinin Journal of Virology, 83 (7), 3200-3211 DOI:10.1128/JVI.02205-08.

Метод выделения вирусов гриппа человека и животных, включая высоко патогенные штаммы вирусов гриппа птиц, в клеточных культурах является высоко чувствительным тестом при использовании клинических образцов высокого качества.

Предназначен для вирусологов, микробиологов, эпидемиологов. Его использование позволяет, в первую очередь, значительно повысить эффективность изоляции эпидемических штаммов из клинических материалов (смывы, аспираты, секционный материал), а также расширить число выделяемых возбудителей с составлением более полной картины о природе вирусных популяций, циркулирующих среди людей, что необходимо для более полного понимания закономерностей распространения и эволюции возбудителей, прогнозирования эпидемий, а также быстрого распознавания появления нового пандемического вируса гриппа типа А.

Методические рекомендации подготовлены проф., д.м.н.А.А.Сомининой и к.м.н.Е.И.Бурцевой (при участии специалистов ГУ НИИ гриппа РАМН Т.Г.Лобовой, Н.И.Коноваловой, Т.М.Гудковой, к.б.н.О.М.Литвиновой, а также специалистов ГУ НИИ вирусологии РАМН проф., д.м.н.А.Н.Слепушкина и д.б.н.В.Т.Ивановой).

При подготовке настоящих Методических рекомендаций были использованы инструктивные материалы, разработанные WHO Collaborating Center for Surveillance, Epidemiology and Control of Influenza (CDC, Atlanta, USA), за предоставление которых авторы выражают свою искреннюю благодарность.

1. Введение

Важным преимуществом метода изоляции перед другими тестами является получение инфекционного вируса, который может быть далее использован для антигенного и генетического анализа, а также выяснения таких важнейших свойств возбудителя, как чувствительность к химиопрепаратам, неспецифическим ингибиторам, тропизм к разным системам хозяина и др. Ряд факторов (трудоемкость, необходимость использования высоко чувствительных клеточных линий, длительность анализа, высокая стоимость) ограничивает использование метода выделения вирусов гриппа в качестве диагностического теста. В прошлые годы для этих целей, как правило, использовали куриные эмбрионы, однако изменение тропизма современных вирусов с резким снижением частоты изоляции в них возбудителей гриппа обусловило необходимость широкого лабораторного применения клеточных культур. Одной из таких линий, которая была рекомендована экспертами ВОЗ, является перевиваемая культура клеток, полученная из почек собаки породы спаниель - MDCK. Вместе с тем, поскольку кандидаты в вакцинные штаммы должны быть изолированы на куриных эмбрионах, лабораториям, располагающим такими возможностями рекомендуется использовать для выделения вирусов гриппа обе системы. В любом случае исходные клинические материалы необходимо хранить до начала следующего эпидемического сезона при низкой температуре (-70°С) для обеспечения возможностей выделения наиболее перспективных в антигеном отношении штаммов в куриных эмбрионах в специализированных лабораториях научно-исследовательских институтов.

2. Описание метода

2.1. Формула метода

Суть метода заключается в заражении сформированного монослоя клеток MDCK, характеризующихся наиболее высокой чувствительностью к современным вирусам гриппа, клиническими материалами, полученными от больных гриппоподобными заболеваниями. Инфицированные культуры инкубируют в термостате при 37°С, контролируя под микроскопом состояние монослоя, а также периодически определяют наличие гемагглютининов в культуральной среде. При развитии специфического цитопатического действия, проявляющегося в разрушении монослоя, культуральную жидкость используют для типирования вирусного изолята в реакции торможения гемагглютинирущей активности (РТГА), а также осуществляют последующий пассаж в целях накопления вируса, который затем направляют в холодовом режиме в соответствующие Центры по гриппу (Федеральный центр по гриппу и ОРВИ на базе ГУ НИИ гриппа РАМН или Центр экологии и эпидемиологии гриппа на базе ГУ Института вирусологии им.ДИ.Ивановского РАМН) для последующей идентификации и изучения особенностей антигенной структуры возбудителя.

Непременным условием успешного выделения вирусов являются правильный сбор клинических материалов, соответствующий состав транспортных сред, соблюдение условий доставки материалов в лабораторию (на холоду и в кратчайшие сроки) и безотлагательное заражение заранее подготовленных клеточных культур.

2.2. Показания и противопоказания к применению метода

Показанием к применению метода является рост гриппа и острых респираторно-вирусных заболеваний, регистрация вспышек гриппа среди людей, а также среди птиц, обследование контактных лиц из групп риска в случае появления у них симптомов гриппа. Противопоказания к использованию метода отсутствуют.

2.3. Материально-техническое обеспечение

Для выполнения работ по изоляции вирусов гриппа в клеточной культуре MDCK необходимо иметь 2 набора реагентов, один из которых предназначен для субкультивирования клеток, а второй - непосредственно для работ по выделению вирусов из материалов от больных.

2.3.1. Перечень материалов, необходимых для субкультивирования клеток MDCK (из расчета на 10 пассажей):

Клеточная культура MDCK (7 млн.) в монослое, выращенном во флаконе Т 25*

_______________
* - как указано выше

Модифицированная среда Игла D-MEM, "GIBCO BRL", (США), кат. N 11965-092, производитель - "Биолот" (Санкт-Петербург) или среда Игла MEM с двойным набором аминокислот (Предприятие при ГУ НИИ полиомиелита и вирусных энцефалитов РАМН, Москва) ФС 42-94 ВС-88

Альбумин бычий, фракция V, 7,5% раствор), "Sigma" (США), кат. N А8412 или "GIBCO BRL", США, кат. N 15260-011

HEPES - буфер 1М раствор, рН 7,2, "Sigma" (СШA), кат. N Н0887 или "GIBCO BRL", США, кат. N 15630-023

Эмбриональная сыворотка КРС, "Sigma" (США), кат. N F3018 или Ну Clone Lab.Inc, кат. N A-1111-L

Раствор для отторжения клеточной культуры (0,05% трипсин в смеси с 0,53 мМ раствором EDTA .4Na) "GIBCO BRL", США, кат. N 25300-054 или раствор химопсина (0,125 мг/мл) на 0,53 мМ растворе версена

Пенициллин, ОАО "Красфарма", ГФХ ст.95

Стрептомицин, ОАО "Биохимик", ГФХ стр.636

Флакон для культивирования клеток Т 25, "Sarstedt" (Германия), кат. N 7245082

Примечание: набор может храниться при +4°С в течение 6 месяцев (за исключением клеточной культуры MDCK, которая подлежит непрерывному субкультивированию, но не более 10-20 пассажей, после чего ее чувствительность понижается, что определяет необходимость ее повторного восстановления из криобанка). Культура получена из CDC, Atlanta (USA), хранится в Коллекциях клеточных культур при ГУ НИИ гриппа РАМН и ГУ Институт вирусологии им Д.И.Ивановского РАМН.

2.3.2. Перечень материалов, необходимых для изоляции вирусов гриппа (рассчитан на проведение 100 анализов):

А. Транспортная среда (для получения и доставки клинических материалов):

Среда 199 на растворе Хенкса, "Биолот" (Санкт-Петербург) или Предприятие при ГУ НИИ полиомиелита и вирусных энцефалитов (Москва)

Альбумин бычий, V фракция (7,5% раствор), "Sigma" (США), кат. N А8412 или "GIBCO BRL", США, кат. N 15260-011

HEPES - буфер 1М раствор, рН 7,2, "Sigma"(CLUA), кат. N Н0887 или "GIBCO BRL", США, кат. N 15630-023

Гентамицин "ХИНОИН", Венгрия, кат. N АТС: JOIGB03

Тампоны стерильные для взятия мазков

Б. Растворы для культивирования клеток (10 пассажей) и выделения вирусов (100 анализов):

Среда Игла в модификации Дальбекко (DMEM) или среда Игла MEM с двойным набором аминокислот *

_______________
* - как указано выше

Эмбриональная сыворотка КРС*

_______________
* - как указано выше

Альбумин бычий, фракция V, 7,5% раствор), "Sigma" (США), кат. N А8412 или "GIBCO BRL", США, кат. N 15260-011

Трипсин ТРСК, тип XIII, "Sigma", США, кат.N Т1426 (расфасован по 200 мкг/амп.)

Раствор для отторжения клеточной культуры*

_______________
* - как указано выше

HEPES - буфер 1М раствор, рН 7,2, "Sigma"(CUIA), кат. N Н0887 или "GIBCO BRL", США, кат. N 15630-023

Пенициллин* 500 ед.

_______________
* - как указано выше

Стрептомицин* 0,5 г.

_______________
* - как указано выше

Дистиллированная вода (для растворения трипсина ТРСК), ГОСТ 6709-72

Глицерин АО "Каустик" ГОСТ 6259-75 кв "Z"

В. Клеточная культура MDCK* (в монослое, флакон Т25, 7 млн.клеток)

_______________
* - как указано выше

Среда Игла с сывороткой для транспортирования клеток*

Флакон культуральный Т25*

_______________
* - как указано выше

Насадка фильтрующая шприцевая GyroDisc, размер пор 0,2 мкм, "Биолот"

Примечание: Набор хранится при +4°С в течение 6 мес. После растворения трипсин ТРСК и антибиотики хранить при температуре не выше -20°С, а остальные компоненты набора - при 4°С.

2.3.3. Материалы и оборудование для постановки реакции гемагглютинации и торможения гемагглютинации в целях индикации и идентификации выделенных вирусов:

Автоматическая пипетка с переменным объемом 5-50 мкл

Наконечники для автоматических пипеток до 200 или 250 мкл

Пипетки 10,0 мл; 5,0 мл и 1,0 мл

Эритроциты человека 0 (I) группы крови, 0.75%

Сыворотки диагностические гриппозные к различным субтипам вируса гриппа А и к вирусу гриппа В, ООО "Предприятие по производству диагностических препаратов" при ГУ НИИ гриппа РАМН, ВФС 42-03215509-04

2.3.4. Оборудование

Бокс ламинарный II уровня защиты Холодильник бытовой (4 ± 1) °С

Рефрижератор (-70 ±2)°С

Центрифуга лабораторная (до 3000 об/мин) Термостат (36 ± 1)°С, желательно - CO инкубатор

Микроскоп биологический (МБИ-3) или инвертированный (ЛОМО, Россия или Unico 1 V 900, United Product and Instrum. Inc., США )

2.4. Описание метода

Принцип метода заключается в заражении сформированного в пенициллиновых флаконах (или пробирках) монослоя клеток MDCK клиническими образцами, полученными от больных с симптомами гриппа.

Инфицированные культуры инкубируют при 35-37°С, желательно в инкубаторе с подачей воздуха в смеси 5% СО. Ежедневно контролируют состояние монослоя. При появлении первых признаков размножения вируса вируссодержащую культуральную жидкость исследуют на наличие гемагглютининов в среде, которую используют далее для накопления вируса. Полученные изоляты направляют в холодовом режиме в соответствующие Центры по гриппу. Использование метода изоляции вирусов гриппа в клеточной культуре MDCK в дополнение к известному способу выделения вирусов гриппа на куриных эмбрионах позволяет резко расширить диапазон выделяемых возбудителей с составлением наиболее полной картины о структуре циркулирующих вирусных популяций, что необходимо для надзора за гриппом, понимания закономерностей эволюции возбудителя и прогнозирования предстоящих эпидемий, а также составления рекомендаций по штаммовому составу вакцин и диагностических препаратов на предстоящий эпидемический сезон.

Большинство известных вирусов обладают способностью размножаться в курином эмбрионе (рис.4). Используют эмбрионы в возрасте от 8 до 14 дней в зависимости от вида вируса, способа заражения и задач исследования. Вирусы гриппа культивируются в 9-10, оспо вакцины - в 12, паротита - в 7-дневных куриных эмбрионах. Размножение вируса в куриных эмбрионах происходит в разных частях зародыша, что связано с особенностями тропизма вируса. Методику выращивания вируса в курином эмбрионе широко используют при промышленном культивировании.

Строение куриного эмбриона и способы его заражения: 1 - в амнион; 2 - в аллантоисную полость; 3 - в желточный мешок. (Микробиология и иммунология. Под редакцией Воробьева А.А. - М. - 1999).

Самая наружная внезародышевая оболочка, примыкающая к скорлупе или материнским тканям и поэтому служащая местом обмена между зародышем и окружающей его средой, называется Хорионом. У видов, откладывающих яйца, основная функция хориона — осуществление дыхательного газообмена. У млекопитающих хорион участвует в дыхании и питании, выделении, фильтрации и синтезе веществ. У примитивных организмов хорион – вторичная оболочка, а у продвинутых – оболочка плода. Полость между хорионом и амнионом – хорионамниотическая.

Амнион (греч. Amnion), Амниотический мешок или Водная оболочка — одна из зародышевых оболочек у эмбрионов пресмыкающихся, птиц, млекопитающих.

Аллантоис (от греч. allantoeid?s — колбасовидный) — эмбриональный орган дыхания высших позвоночных животных; зародышевая оболочка, развивающаяся из задней кишки эмбриона. Кроме того, аллантоис участвует в газообмене зародыша с окружающей средой и выделении жидких отходов. Аллантоис, вкупе с другими эмбриональными оболочками — амнионом и хорионом, является определящим признаком высших позвоночных животных — млекопитающих, птиц и рептилий.

У яйцекладущих птиц и рептилий аллантоис развивается вокруг эмбриона вдоль стенок скорлупы. В своём внешнем слое, называемым мезодермой, он создаёт разветвлённую сеть кровеносных сосудов, с помощью которых происходит взаимодействие с внешней средой. У млекопитающих аллантоис входит в состав пуповины.

Существует несколько способов заражения развивающегося куриного эмбриона: на хорионаллантоисную оболочку, в аллантоисную и амниотическую полости, желточный мешок, тело эмбриона.

Заражение на хорионаллантоисную оболочку применяется для выделения и культивирования вирусов, образующих на оболочках бляшки (вирусы вакцины, натуральной оспы, простого герпеса). Перед заражением яйца просвечивают с помощью овоскопа, карандашом очерчивают границу воздушного пространства и хорионаллантоисной оболочки. Поверхность яйца над воздушным пространством и в месте заражения протирают спиртом, прожигают, обрабатывают йодом и делают отверстие в полости воздушного мешка.

На месте заражения скорлупу удаляют так, чтобы не повредить подскорлупную оболочку, которую затем прокалывают короткой стерильной иглой, чтобы не повредить хорионаллантоисную оболочку. Воздух из полости воздушного мешка отсасывают. Вирусный материал (0,05 - 0,2 мл) наносят на хорионаллантоисную оболочку туберкулиновым шприцем с короткой иглой или пастеровской пипеткой. Отверстие в скорлупе закрывают стерильным покровным стеклом или тем же выпиленным кусочком скорлупы и по краям заливают расплавленным парафином. Зараженные эмбрионы располагают на подставке горизонтально и инкубируют в термостате. Вскрытие эмбрионов производится не раньше 48 часов инкубации. На зараженной оболочке обнаруживаются беловатые непрозрачные пятна разной формы (бляшки).




Заражение в аллантоисную полость. Вирус, введенный в аллантоис, размножается в эндодермальных клетках, переходя затем в аллантоисную жидкость. Заражение осуществляют следующим способом: в скорлупе над воздушной камерой острием скальпеля или ножниц производят прокол, после чего через отверстие в вертикальном направлении вводят иглу со шприцем, которая проходит через хорионаллантоисную оболочку и попадает в аллантоисную полость, материал вводится в объеме 0,1 мл и отверстие заливают парафином.

Заражение в желточный мешок. С этой целью используют эмбрионы 5 - 10-дневного возраста. Наиболее употребительны два метода заражения. По первому материал вводится через воздушное пространство. В центре яйца делают отверстие, помещают его на подставку тупым концом вправо и через отверстие в вертикальном направлении вводят иглу, надетую на шприц, игла проходит через хорионаллантоисную оболочку, аллантоисную полость в желток. В желточный мешок можно ввести от 0,1 до 0,5 мл вируссодержащего материала. После заражения отверстие в скорлупе заливают парафином, и эмбрион помещают в термостат. По второму методу на границе воздушного пространства с той стороны, где лежит желток (стороны, противоположной от эмбриона), делают прокол скорлупы, через который вводят инфекционный материал. Направление иглы должно быть к центру яйца.


Куриный эмбрион, инфицированный вирусным материалом, ставят в инкубатор на 2-3 дня, в зависимости от характера внесенного вируса. Для развития вирусов из проб, взятых у больного (например, смывов из носоглотки, использующихся при диагностировании гриппа), куриный эмбрион представляет хорошую среду. По типу изменений, скажем в тканях хорионаллантоисной оболочки, можно непосредственно определить, с каким вирусом мы имеем дело. Очень характерные изменения дают вирусы оспы и герпеса. Некоторые вирусы очень интенсивно размножаются в различных тканях куриного эмбриона и дают исходный материал для приготовления вирусных антигенов, необходимых при лабораторной диагностике вирусных заболеваний. Вирусы, размноженные в курином эмбрионе, были использованы как исходный материал для получения восемнадцати видов прививочных вакцин.

Читайте также: