Консервативные пептиды вирусных оболочек

Обновлено: 28.03.2024

В начале XX столетия впервые было сформировано понятие иммунитета, и практически сразу же его разделили на два основных типа: преформированный, или природный, иммунитет, названный врожденным, или неспецифическим, и приобретенный иммунитет, формирующийся в результате контакта с болезнетворным агентом [11]. В последующем врожденный иммунитет долгое время оставался на положении Золушки, а максимальное внимание уделялось проблеме приобретенного иммунитета, возникающего как следствие контакта организма хозяина и вакцины. В этот период были созданы вакцины против сибирской язвы, бешенства, оспы, полиомиелита, многочисленные анатоксины. Некоторые ученые уже предрекали близкий упадок иммунологии, вызванный разработкой все новых вакцин, и связанное с этим снижение интереса к иммунологии в целом. Однако создание Ф. Бернетом [34] теории иммунитета и последующее открытие Р. Медаваром (Medawar) феномена толерантности убедительно доказало, что предсказания о скорой смерти иммунологии были несколько преувеличены. Начиная со 2-й половины XX столетия, в иммунологии наблюдается быстрый прогресс, связанный с пониманием механизмов врожденного распознавания компонентов микроорганизмов и их непосредственного участия в защите организма человека или животного от инфекции. Теперь понятно, что адаптивный (приобретенный) иммунитет определяет многое, но не всё в механизме защиты от инфекции. По-настоящему революционным стало открытием того, что наличие или отсутствие определённых молекул в организме во многом определяет его способность противостоять разрушающему воздействию патогена или его продуктов, например токсинов. Важным также было осознание того факта, что каждый конкретный возбудитель бактериальной, грибковой, протозойной или вирусной природы обладает неким набором характерных признаков, образующих его молекулярный образ [204, 309].

Новый этап развития теории врожденного иммунитета берет свое начало в 1980 г., когда С. Nüsslein-Volhard [224] установила существование особого гена, ответственного за дорсовентральную дифференциацию дрозофил, причем дефект этого гена сопровождался повышенной восприимчивостью этих насекомых к грибковой инфекции. Автор назвала этот новый белок Toll-рецептором (Toll — нем. отличный, восхитительный). Через несколько лет другой исследователь, C. A. Jr. Janeway [152], высказал гипотезу, что любой патоген обладает некими структурными особенностями, которые распознаются особыми рецепторами, названными толлподобными. Отметим, что за оба открытия авторам были присуждены Нобелевские премии.

В дальнейших исследованиях было установлено, что позвоночные имеют набор из 13 TLR, из них у человека пока обнаружено 10 рецепторов [6, 204, 205]. На рис. 1 и в табл. 1 представлена упрощенная классификация TLR человека, относящихся, как известно, к рецепторам 1-го типа.

Рис. 1. Размещение TLR на клеточной мембране и эндосоме их лиганды (по личному разрешению Р. Меджитова)

r1

Таблица 1. Димеризация и места локализации TLR

Вместе с тем, TLR — не единственные молекулярные структуры, ответственные за распознавание патоген-ассоциированных молекулярных паттернов (ПАМП). Существуют также еще RIG-I-подобные рецепторы, Nod-подобные рецепторы, AIM2-подобные рецепторы, лектиновые рецепторы C-типа и внутриклеточные сенсоры ДНК — cGAS [20]. Каждый из этих рецепторов участвует в огромном количестве внутриклеточных путей. Среди этого разнообразия рецепторов TLR были охарактеризованы первыми и изучены лучше других.

Все TLR в неактивном состоянии существуют в мономерном виде, а после активации лигандом они образуют димерные формы, причем TLR1 и 2, а также TLR2 и 6 образуют между собо гетеродимеры, а все остальные рецепторы — гомодимеры [202]. Отметим, что в своей основе все TLR имеют практически одинаковую архитектуру, представленную на рис. 2 [57]. Как видно из этой схемы, над клеточной или эндоплазматической мембраной расположена та часть рецептора, которая непосредственно контактирует с патогеном. Она представляет собой соленоидоподобную аминокислотную спираль, образованную богатыми лейцином повторами ( рис. 3). Такая форма воспринимающей части считается наиболее функциональной, поскольку позволяет связываться с несколькими лигандами [206]. Было показано, что каждый TLR проявляет специфичность к нескольким веществам (лигандам), имеющим порой весьма разнородную структуру. Из этого вытекает единственный вывод о том, что распознавание чужеродных патогенов является относительно специфичным и опирается на способность организма воспринимать определенные молекулы. Над клеточной или эндоплазматической мембраной расположена та часть рецептора, которая непосредственно контактирует с консервативными структурами патогенов ПАМП [95, 223]. По своей структуре TLR уникальны, и это, естественно, обусловливает такую же уникальность механизмов их функционирования.

Рис. 2. Принципиальная схема строения TLR (по личному разрешению Р. Меджитова)

r2

Рис. 3. Изогнутый повтор TLR3, богатый остатками лейцина (по личному разрешению Р. Меджитова)

r3

C момента открытия TLR началось интенсивное изучение молекулярных механизмов их действия, и к настоящему моменту они считаются самыми изученными объектами регуляторной си-стемы организма. Это, с одной стороны, позволило понять многие механизмы, лежащие в основе патогенеза различных заболеваний, а с другой — выявить возможные терапевтические мишени и создать новые фармакологические препараты.

Существуют некоторые отличия между всеми TLR, связанные, в частности, с локализацией в пределах клетки. Одна часть рецепторов локализована в цитоплазматической мембране. У человека к ним относятся TLR1, TLR2, TLR4, TLR5, TLR6, TLR10. Другая группа, в которую входят TLR3, TLR7, TLR8, TLR9, локализована во внутренних компартментах, таких как эндоплазматический ретикулум (ЭР), эндосомы, лизосомы, эндолизосомы. Такие различия в топографии рецепторов имеют глубокий биологический смысл. Так, поверхностные рецепторы распознают, преимущественно, бактериальные антигены, в том числе липиды, липопротеины, белки, компоненты клеточной стенки бактерий. Иначе говоря, поверхностные TLR распознают структуры, первично контактирующие с цитоплазматической мембраной, в то время как внутриклеточные TLR распознают одно- и двухцепочечные нуклеиновые кислоты.

Рис. 4. Пути передачи сигнала с TLR

r4

Пояснение в тексте:

Активированный TIR-домен рекрутирует вспомогательную адаптерную молекулу TIRAP/MAL (TIRAP = TIR domain containing adaptor protein или; Mal — MyD88 adapter-like), которая активирует белок миелоидной дифференцировки 88 (Myeloid differentiation primary response gene 88 (MyD88)). В свою очередь, MyD88 привлекает комплекс киназ, семейства IRAK (IL1-receptor associated kinase), который образует сигнальный комплекс, названный миддосомой (мyddosoma). Активация семейства IRAK-киназ происходит в определенной последовательности. Так, в первую очередь активируется IRAK4, а затем IRAK1 и IRAK2, а IRAK3 выполняет функцию негативного регулятора активности IRAK4 и IRAK1 [244]. IRAK1 затем самофосфорилируется на нескольких участках молекулы, что при-водит к высвобождению MyD88 из миддосомы [63, 163]. После активации, IRAK1 взаимодействует с TRAF6 (TNF-receptor associated factor 6), запуская RING-домен (really interesting new gene) E3 убиквитинлигазы для TRAF6. В свою очередь, TRAF6 вместе с убиквитинконъюгирующими энзимами и UEV1A (Ubiquitin-conjugating enzyme E2 variant 1A) запускает связанную с K63 полиубиквитинацию самого TRAF6 и протеинкиназного комплекса TAK1 (Transforming growth factor beta-activated kinase 1) [163), который формирует комплекс c семейством регуляторных белков TAB1, TAB2 и TAB3. Основная функция двух последних — активация функции TAK1 во взаимодействии с полиубиквитиновыми цепями, генерированными TRAF6.

Активированная ТАК1, в свою очередь, может транслировать нисходящий сигнал двумя путями (см. рис. 4).

Согласно первому пути, ТАК1 активирует IKK (IκB kinases) комплекс, включающий две активных киназы IKKα и IKKβ [183], третий член семейства IKKγ (NEMO-NF-kappa-B essential modulator) выполняет функцию негативного регулятора двух других членов семейства [175]. Основная функция IKK-комплекса — быстрое фосфорилирование и последующая деградация ингибиторных белков семейства IkB (IκBα, IκBβ и IκBε), которые в нестимулированном состоянии связывают NF-κB в неактивном состоянии. В результате деградации IκB, фактор трансляции подвергается протеасомной обработке и транслоцируется в ядро, за-пуская экспрессию провоспалительных цитокинов [175, 222].

По другому пути нисходящего сигналинга, TAK1 активирует и фосфорилирует семейство митоген-активированных протеинкиназ (MARKKs — Mitogen activated protein kinases) до MARK при участии аксессорных молекул ERK (extracellular signal-regulated kinases), JNK (c-Jun N-terminal kinases) и p38, что, в свою очередь, сопровождается фосфорилированием и активацией фактора трансляции AP-1, и уже этот фактор перемещается в ядро, где он индуцирует экспрессию воспалительных цитокинов и проапоптозных белков [210].

TRAF6 рекрутирует киназу RIP1, которая взаимодействует с TAK1 комплексом, а затем с MARK-киназами с последующей активацией экспрессии воспалительных цитокинов [163]. TRAF3, в свою очередь, привлекает IKK-подобные киназы TBK1 и IKKi совместно с IKKγ для фосфорилирования IRF3 (Interferon regulatory factor 3), который димеризуется и транслоцируется в ядро, где запускает экспрессию ИФН 1-го типа [162]. Дальнейшие события между факторами трансляции и синтезом провоспалительных цитокинов остаются загадочными. Как известно, ядерная ДНК клетки существует в суперспирализованном состоянии, и для начала экспрессии необходимо перевести ее в транскрипционно активное состояние. Эту функцию выполняют две топоизомеразы 1 и 2, основное действие которых — изменение конформационного состояния суперспиральной ДНК путем ее раскручивания и сматывания во время ремоделирования хроматина, транскрипции, репликации и рекомбинации ДНК [236]. Однако остается вопрос, каким образом и что именно управляет факторами трансляции: топоизомеразы или непосредственно суперспиральная ДНК? Одним из возможных вариантов ответа является допущение существования наборов NF-κB, именуемых как REL (Release factor), которые образуют димеры, способные взаимодействовать непосредственно с молекулой ДНК [219]. Однако пока неясно, как взаимодействует топоизомераза с димерами семейства REL. В то же время, участие топоизомераз в экспрессии воспалительных цитокинов не вызывает сомнения, поскольку ингибирование топоизомеразы 1 подавляет выработку провоспалительных цитокинов и защищает организм от смерти в результате воспаления [245]. Столь же загадочны и пути передачи сигналов с других трансляционных факторов — AP1 и IRF3.

Многочисленные исследования указывают на роль TLR2 в повреждении тканей, вызванном ишемией/реперфузией и связанном с инсультом или инфарктом миокарда, или трансплантацией солидных органов [141, 311].

TLR3 — своеобразный рецептор, отличающийся от всех остальных. Он расположен внутриклеточно на поверхности эндосомы. Имея типичное для TLR строение, он способен запускать, по меньшей мере, два разных сигнала (см. рис. 4). Как и другие внутриклеточные TLR-рецепторы, он распознает нуклеиновые кислоты, в частности связывает вирусную двухспиральную РНК (дсРНК), а также два синтетических лиганда TLR3, имитирующих дсРНК, — полирибоинозиновую-полирибоцитидиловую (поли I:C) и полиадениловую-полиуридиловую (поли A:U) кислоты [94]. После связывания с TRIF, последний может рекрутировать TRAF3 или TRAF6 (см. рис. 4). В первом случае нисходящий сигнал завершается экспрессией ИФН 1-го типа, во втором — сигнал активирует TAK1-киназу с последующей активацией NF-κB и синтезом провоспалительных цитокинов. Важно отметить, что активация TLR3 приводит к примированию перекрестно-реагирующим антигеном CD8 + T-клеток посредством молекул 1-го типа главной системы гистосовместимости (major histocompatibility complex — MHC) с последующей генерацией цитотоксических лимфоцитов [34, 94]. Кроме того, TRIF-зависимый сигналинг, следующий за активацией TLR3, приводит к увеличению синтеза ИФН 1-го типа, который еще больше усиливает этот процесс [94]. Показано, что синтетический лиганд TLR3, поли I:C, при его совместном интраназальном применении с инактивированной гриппозной вакциной активирует секреторный и системный гуморальные ответы, что сопровождается комплексной защитой против гомологичных и гетерологичных вирусов, в частности вирусов гриппа, включая высокопатогенный серотип H5N1 [146, 279].

TLR4 был первым рецептором этого семейства, идентифицированным у млекопитающих, и считается наиболее изученным членом среди всех TLR [95, 203]. Это поверхностный трансмембранный рецептор, TIR-домен которого, как и у других трансмембранных TLR-рецепторов, расположен на внутренней стороне цитоплазматической мембраны. TLR4 распознает бактериальные липополисахариды (ЛПС), компоненты наружной мембраны грамнегативных бактерий, вызывающих септический шок, белки некоторых опухолей (меланома), для чего он нуждается в ML2, CD14 и ЛПС-связывающем белке [20, 162, 235, 328]. Кроме того, TLR4 участвует в распознавании слитых белков респираторно-синцитиального вируса, оболочечных белков вируса опухоли молочной железы мышей, пневмолизина Streptococcus pneumoniae и выделенного из растений цитостатического препарата паклитаксел (paclitaxel) [153].

Таким образом, TLR4 способен регулировать воспалительный ответ и интерфероногенез. Это свойство может быть использовано при разработке новых фармакологических препаратов [95].

TLR9 представляет собой внутриклеточный рецептор, вовлеченный в распознавание ДНК бактериального и вирусного происхождения, а также собственной ДНК в составе иммунных комплексов. Как и другие эндосомальные TLR, он передает нисходящий сигнал через MYD88 путь, активируя NF-κB и запуская экспрессию провоспалительных цитокинов [163]. Кроме того, он также может действовать и через IRF7-сигналинг, запуская экспрессию ИФН 1-го класса [20, 162].

TLR7 и TLR8 являются трансмембранными белками, которые структурно близки между собой и экспрессированы на эндосомах. Их основное предназначение — распознавание преимущественно вирусных нуклеиновых кислот, к числу которых относятся двуспиральная РНК из вирусов, богатых U или GU олигонуклеотидами, таких как RNA40 и U5 области ВИЧ-1 RNA, а также вирусы гриппа, Коксаки, вирус гепатита С [87, 190, 303]. Активация TLR7/8 также может достигаться синтетическими лигандами, известными как имидазолхинолины, такими как R-848 (Резихимод) или R-837 (Имихимод), имеющими некоторое структурное сходство с гуанозином ( рис. 5). Имихимод преимущественно активирует TLR7, а резихимод — TLR7 и TLR8 [132].

Рис. 5. Структурная формула гуанозина (а), имихимода (б) и резихимода (в)

r5

TLR7 экспрессирован, в основном, в легких, мозге, желудке, плаценте и мононуклеарных клетках периферической крови, а также в дендритных клетках, моноцитах, макрофагах и В-лимфоцитах [221]. У человека TLR7 состоит из 1049 аминокислот, имеет эктодомен из двадцати семи богатых лейцином повторов (LRR — leucine-rich repeat), трансмембранный домен (TM) и цитоплазматический (TIR) домен [192, 200]. Эктодомен локализован в эндосоме и подвергается воздействию кислого pH [149]. Активация TLR7 тесно связана с протеолитическим созреванием во внутренней зоне между LLR14 и 15, в пределах нескольких предполагаемых участков протеолитического расщепления [139, 199]. Кроме того, удаление N-конца имеет важное значение для сигналинга, но не для связывания лиганда; таким образом, может произойти процесс реассоциации, аналогичный таковому на TLR8 [103, 295].

r6

(для упрощения приведены только ключевые молекулы) [275]:

AP1 — активаторный белок 1; IKK — IκB киназы; IRAK — киназа, ассоциированная с рецептором IL-1; IRF — регулирующий фактор интерферона; ISRE — стимулированный интерфероном респонсивный элемент; MAPK — активированная митогеном протеинкиназа; MyD88 — первичный отвечающий ген 88 миелоидной дифференцировки; NF-κB — ядерный фактор-κB; TIR — Толл/IL-1-рецептор

Резюмируя общие и весьма краткие описания TLR, отметим, что открытие патогенраспознающих рецепторов послужило мощным толчком к разработке новых фармакологических средств лечения многих заболеваний. Глава эта еще далеко не закрыта, и с каждым днем появляются все новые данные, свидетельствующие о важнейшей роли этих рецепторов в поддержании гомеостаза и устойчивости организма к различным патологическим воздействиям. Одним из перспективных направлений в этом отношении является поиск новых синтетических агонистов TLR и их применение в фармакологии. Примером такого подхода явля-ется, например, синтез и изучение агониста TLR7 — имихимода, завершившееся разработкой и последующим использованием его в медицинской практике для топического применения.

За последние годы отмечается резкий рост и распространение инфекционных заболеваний вирусной этиологии, в частности ВИЧ-инфекции, вирусных гепатитов, герпеса и др. Поэтому создание эффективных противовирусных вакцин и препаратов становится сейчас одной из важнейших проблем.

С использованием методов протеомики и биоинформатики в НИИ биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича (г. Москва) занимаются созданием вакцин против вируса гепатита С. Проводился компьютерный анализ строения белков вируса гепатита С. Была создана база данных, в этой базе данных были выявлены участки полипептидной цепи белковых молекул, которые, по сути дела, инвариантны (идентичны) для всех 827 последовательностей оболочечных белков вируса гепатита С. Эти участки получили название консервативные пептиды, а их открытие создало новые возможности для получения противовирусных вакцин. Известно, что постоянная изменчивость вирусных белков - основное препятствие для создания таких вакцин, а найденные участки консервативны и не подвержены мутациям. Поэтому, если будет получена вакцина, вызывающая выработку специфических антител к какому-то набору из этих консервативных пептидных участков, и, если эта вакцина будет обладать вируснейтрализующими свойствами, то проблема вирусной изменчивости не будет играть существенной роли. Необходимое для получения вакцин количество таких полипептидов сейчас легко может быть получено методами генной инженерии или химическим синтезом. Кроме того, предполагается экспрессия таких консервативных пептидов в генетически модифицированных растениях с целью получения “съедобных вакцин”. Еще одним перспективным вариантом было бы создание иммуноглобулиновых сывороток на основе моноклональных антител специфичных к таким консервативным пептидным участкам вирусных белков.

Кроме того, было установлено, что консервативные участки белков - это участки нуклеации, т.е. участки, которые играют наиболее важную роль, когда из линейной структуры белковая молекула превращается в глобулу, приобретая необходимую пространственную структуру (фолдинг). Консервативные участки существуют в белках всех без исключения вирусных вариантов. У разных вирусов они разные, но у одного типа вируса они одинаковы. На основе этого факта может быть создан новый класс лекарств, который будет блокировать фолдинг вирусных белков. Это может стать основным путем, который позволит бороться с вирусными инфекциями.

В последнее время большое внимание уделяется разработке новых антимикробных средств, действующих как ингибиторы белок-белковых взаи­модействий. Подобно консервативным пептидам, обеспечивающим фолдинг, участки полипептидной цепи различных белков, обеспечивающие их взаимодействие друг с другом (димеризацию, олигомеризацию) при образовании комплексов практически не подвержены мутациям. Поэтому возможно значительное снижение риска появления лекарственной резистентности, обу­словленной мутациями такой белковой мишени. Считается, что предпочтительно выбирать в качестве мишеней фер­менты, функционирующие в гомо-, гетеро- или олигомерной форме.

Основными молекулярными мишенями для действия имеющихся сейчас анти-ВИЧ препаратов служат вирусоспецифические белки - обратная транскриптаза, и протеаза вируса. Однако аналоги этих ферментов имеются у человека, поэтому препараты, ингибирующие вирусные белки (азидотимидин, d4T и др.), токсичны и для человека. Более перспективной мишенью является фермент интеграза, обеспечивающая интеграцию линейной провирусной ДНК в геном (хромосому) человека. В клетках органов человека такого фермента нет, поэтому препараты ингибирующие интегразу должны быть значительно менее токсичны для человека. В ГНЦ “Вектор” (г.Новосибирск) и Новосибирском институте органической химии СО РАН получены вещества – ингибиторы этого фермента. Проведенные исследования показали, что амиды бетулоновой и глицеризиновой (корень солодки) кислот, а так же дипептид бетулоновой кислоты эффективно ингибируют интегразу ВИЧ-1. В настоящее время проводятся доклинические исследования соединения, наиболее перспективного для клинического применения.




Достаточно сложной представляется и задача создания эффективных препаратов для лечения герпесвирусных инфекций. Это обусловлено тем, что представители этого семейства вирусов имеют большой размер генома, контролирующий синтез более 100 белков, и широкий спектр ферментов, участвующих в метаболизме нуклеиновых кислот, синтезе вирусной ДНК и экспрессии белков. Представленные сейчас на рынке противогерпесные химиопрепараты прямого действия (ацикловир, ганцикловир и др.), подавляющие синтез вирусной ДНК, являются токсичными, к ним может возникать устойчивость и они не способны предотвратить рецидивы. В связи с этим в последнее время проведены широкие исследования по поиску новых препаратов различной природы (антибиотики, пептиды, растительные субстанции, производные фуллерена-60). Было показано, что поиск препарата действующего на одну, определенную мишень, является длительным и неэффективным. Более перспективным представляется создание комплексного препарата, одновременно направленного на несколько мишеней в вирусе.

В связи с этим сотрудниками Научно-иновационного фонда Здоровья (г. Москва) предложена новая концепция многоуровневой блокады проникновения вирусов в клетки. По мнению ученых, анализ молекулярной организации вирусов позволяет идентифицировать их вирионы, как самоорганизующиеся мульти-интер-биополимерные комплексы наноразмерного уровня (-20-500 нм), на котором и реализуются механизмы паразитической интервенции в клетки. Эта величина на несколько порядков больше размеров молекул низкомолекулярных лекарств, что не обеспечивает полноценной защиты клеток организма от вирусов (мутации которых выводят вирусные структуры из-под моноточечных воздействий несоразмерно малых молекул). Поэтому была разработана принципиально новая стратегия противовирусной защиты, (блокады проникновения), основанная на трех фундаментальных принципах: (1) принцип использования вирус-специфических ингибиторов, представляющих собой высокомолекулярные соединения - полиэлектролиты, соизмеримые с белковыми комплексами вирусов; (2) принцип комбинированного воздействия, по крайней мере, на несколько макромолекулярных мишеней, критически существенных в жизненном цикле вирусов; (3) принцип упреждающей терапевтической блокады вирусов до их проникновения в клетки. В рамках этой стратегии впервые был создан ряд новых синтетических и полусинтетических высокомолекулярных соединений (ВМС) сочетающих в себе комплекс вирус-блокирующих химических структур и функций, которые обеспечивают: стимулирование иммунного ответа, подавление абсорбции вирионов на плазматической мембране, (и) блокаду вирусной фузии на клеточных мембранах посредством полимерсвязанных мембранопротекторов каркасного и терпеноидподобного строения, фокусировку концентрации и активности новых лекарств в эпицентрах повышенного риска вирусного вторжения - в нано-размерных "raft''-доменах липидных оболочек вируса и(или) клеточных мембран, и конкурентную имитацию используемых вирусами клеточных рецепторов - путем введения в структуру высокомолекулярных лекарственных препаратов синтетических пептидных имитаторов таких рецепторов (например, ВИЧ-специфичных CCR5/CXCR4). Эти вещества могут найти применение как микробицидные добавки в различные лекарственные формы (вагинальные свечи, кремы, мази, смазки презервативов и т.д.) Экспериментальные испытания (in vitro/vivo) новых систем подтвердили их уникально высокий потенциал противовирусной защиты в отношении широкого спектра вирусов, включая ВИЧ.

В статье представлены статистические данные об основных семействах эндогенных антимикробных пептидов (АМП), синтезируемых организмом человека. Отмечено, что данные соединения являются важными неспецифическими факторами гуморального иммунитета, обладающими микробоцидной, хемотаксической, иммуномодулирующей и цитотоксической активностью, а также вносят вклад в общую защиту организма и развитие процессов воспаления. Описан механизм действия АМП, который является универсальным даже для выработавших в процессе эволюции резистентность к различным антибиотикам микроорганизмов. При этом отмечено, что многие натуральные пептиды помимо чужеродных микроорганизмов способны разрушать эритроциты крови человека. Несмотря на слабую изученность этих и других аспектов применения АМП, широта затрагиваемых проблем современной науки позволяет данной теме быть актуальной и заслуживающей дальнейшей разработки.


1. Абатуров А.Е. Катионные антимикробные пептиды системы неспецифической защиты респираторного тракта: дефензины и кателицидины. Дефензины — молекулы, переживающие ренессанс (часть 2) // Здоровье ребенка. – 2011. – Т. 7. – С. 34.

2. Алешина Г.М., Кокряков В.Н., Шамова О.В., Орлов Д.С. и др. Cовременная концепция об антимикробных пептидах как молекулярных факторах иммунитета // Медицинский академический журнал. – 2010. – № 4. – С. 149-160.

4. Березняков И.Г. Резистентность к антибиотикам: причины, механизмы, пути преодоления // Клин. антибиотикотерапия. – 2001. – №. 4. – С. 12.

5. Будихина А.С., Пинегин Б.В. Дефензины – мультифункциональные катионные пептиды человека // Иммунопатология, аллергология, инфектология. – 2008. – №. 2. – С. 31.

8. Ильяшенко М.Г. Клинико-диагностическое значение антимикробных пептидов у больных язвенным колитом (дис.). – Ростов н/Д, 2014.

9. Ильяшенко М.Г., Тарасова Г.Н., Гусева А.И. Эндогенные антимикробные пептиды и их клинико-патогенетическая значимость при воспалительных заболеваниях кишечника // Медицинские науки. – 2012. – №. 2.

10. Кулакова Е.В., Елизарова В.М., Пампура А.Н. Эндогенные антимикробные полипептиды - факторы неспецифической защиты организма // Российский стоматологический журнал [М. : Медицина]. – 2012. – С. 42-45.

11. Литвицкий П.Ф., Синельникова Т.Г. Врожденный иммунитет: механизмы реализации и патологические синдромы // Вопросы современной педиатрии. – 2009. – Т. 8. – №. 4. – С. 95-101.

12. Макаренко О.А., Левицкий А.П. Взаимодействие флавоноидов с протеинами // Досягнення біології та медицини, 2012.

13. Межевикина Г.С. и др. Современные аспекты этиологии и патогенеза кандидоза слизистой оболочки полости рта // Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова. - 2012. - № 3. – С. 152-157.

15. Мирошниченко Ю.А., Шестопалов А.В., Смольянинова Л.П. Роль факторов врожденного иммунитета слизистой оболочки репродуктивного тракта // Журнал фундаментальной медицины и биологии. - 2013. - №. 1. – С. 11.

17. Окороченков С.А., Желтухина Г.А., Небольсин В.Е. Антимикробные пептиды: механизмы действия и перспективы практического применения // Биомедицинская химия. – 2012. – Т. 58. – №. 2. – С. 131-143.

19. Сергеев А.Ю., Сергеев Ю.В. Факторы резистентности и иммунитет при грибковых инфекциях кожи и слизистых оболочек // Иммунопатология, аллергол., инфектол. – 2004. – Т. 1. – С. 6-14.

20. Сидоренко С.В., Тишков В.И. Молекулярные основы резистентности к антибиотикам // Успехи биологической химии. – 2004. – Т. 44. – №. 2. – С. 263-306.

21. Симбирцев А.С. Цитокины - новая система регуляции защитных реакций организма // Цитокины и воспаление. – 2014. – Т. 2002. – №. 1.

22. Степанов Ю.М. и др. Аргинин в медицинской практике (обзор литературы) // Журн. АМН України. – 2004. – Т. 10. – №. 2. – С. 339-351.

24. Alice L. Den Hertog, Jan Van Marle, Henk A. Van Veen, WimVant Hof, Jan G.M. Bolscher, Enno C.I. Veerman, Arie V. Candidacidal effects of two antimicrobial peptides: histatin 5 causes small membrane defects, but LL-37 causes massive disruption of the cell membrane // Biochem J. - 2005; 388: 689—695.

25. Bensch K. hBD-1: a novel β-defensin from human plasma / K. Bensch, M. Raida, H-J. Magert et al. // FEBS Lett. — 1995. – Vol. 368. – P. 331-335.

26. Innate immunity in the lower female mucosal tract / M.A. Farage, K.W. Miller, G.F. Gerberick et al. // Steroids and Hormonal science. – 2011. – Vol. 2. - issu 2. – P.

27. Kris De Smet, Roland Contreras. Human antimicrobial peptides: defensins, cathelicidins and histatins // Biotechnology Letters. - 2005; 27: 1337—1347.

28. Rabinovich O.F., Rabinovich I.M., Abramova E.S. Изменение микробной флоры при патологии слизистой оболочки рта // Stomatologia (Mosk). – 2011. – Т. 6. – С. 71.

29. Sumako Yoshioka, Hiroshi Mukae, Hiroshi Ishii Alpha-defensin enhances expression of HSP47 and collagen-1in human lung fibroblasts // Life Sci. – 2007. – Vol. 20. – P. 1736-7817.

В настоящее время в науке и медицине большое внимание уделяется веществам, имеющим антибиотические свойства [20]. Одной из групп таких веществ являются антимикробные пептиды (АМП) - низкомолекулярные соединения, построенные из аминокислот и имеющие катионную или амфипатическую природу [3], которые синтезируются в организме большинства эукариот в ответ на внедрение чужеродных микроорганизмов [21].

АМП являются неспецифическими факторами гуморального иммунитета, обладают эндотоксин-нейтрализующей и иммуномодулирующей активностью, а также обеспечивают защиту против широкого спектра микроорганизмов [16]: грамотрицательных и грамположительных бактерий, грибов, вирусов и простейших [2].

О существовании АМП известно уже несколько десятилетий, но только недавно интерес к этим молекулам перешел из плоскости фундаментальных исследований иммунной системы в клиническую область. На сегодняшний день у человека обнаружено три семейства таких пептидов [7; 16; 18]: дефензины, кателицидины и гистатины.

Впервые дефензины млекопитающих были описаны в 1956 году Robert C. Skarnes и Dennis W. Watson как фагоцитины полиморфноядерных лейкоцитов кролика. В серии работ H.I. Zeya и John K. Spitznagel показали, что данные протеины относятся к одному молекулярному семейству, которое они определили как семейство катионных антимикробных протеинов, и только в 1985 году Michael E. Selste дал им современное название - дефензины [1]. Дефензины - это катионные амфипатические пептиды длиной от 30 до 42 аминокислот с трехнитевой β-пластинчатой структурой, содержащей три дисульфидные связи [24; 29]. На основе способа дисульфидного связывания дефензины разделяют на три семейства - α-, β- и θ-дефензины. В организме человека присутствуют два вида: α- и β-дефензины [9]. Они синтезируются только нейтрофилами, что позволяет считать их специфическими клеточными маркерами этих клеток.

Первый β-дефензин был обнаружен при изучении почки человека из диализата гемофильтрата и описан в начале 1990-х годов. Это был пептид из 36 аминокислотных остатков (HBD1) [25]. Основными β-дефензинами человека являются HBD1-6. Сегодня известно, что молекулы β-дефензинов - более вариабельные пептиды, они менее консервативны в аминокислотной последовательности. Кроме того, HBD найдены в различных изоформах.

Основными продуцентами β-дефензинов являются кератиноциты, эпителиоциты слизистых оболочек, макрофаги, моноциты, дендритные клетки [5].

Активация нейтрофилов при инфекционных и воспалительных процессах приводит к быстрому высвобождению дефензинов, которые затем обнаруживаются в плазме и других жидкостях организма. В нормальной плазме обнаруживается очень низкий уровень дефензинов (от неопределяемых величин до 50-100 нг/мл), однако в условиях сепсиса содержание их может возрасти до 10 мг/мл и даже выше. К примеру, нарушение активации цитокинов и дефензинов на поверхностном эпителии репродуктивного тракта влечет за собой внедрение возбудителя даже при малом его количестве [15].

В дополнение к микробицидному действию α-дефензины проявляют также хемотаксическую, иммуномодулирующую и цитотоксическую активность, вносят вклад в общую защиту организма и развитие процессов воспаления. Совсем недавно была открыта антивирусная активность некоторых дефензинов. Считается, что α-дефензины вносят серьезный вклад в антиВИЧ-1 активность антивирусного фактора CD8. Это обстоятельство открывает новые возможности в исследовании ВИЧ. Показано, что пациенты, у которых отсутствуют α -дефензины, страдают частыми и тяжелыми бактериальными инфекциями [16].

Помимо всего вышеперечисленного, дефензины экспрессируются на всем протяжении репродуктивного тракта женщин, где выполняют ряд функций, которые играют ключевую роль в сохранении и защите плода во время беременности. Более глубокое понимание функций дефензинов и механизмов их действия позволит рассматривать их в качестве терапевтических средств контроля заболеваний женщин, включая осложнения беременности и послеродового периода [26].

Кателицидины - группа пептидов, выявленных в лимфоцитах и моноцитах, а также в эпителиальных клетках [11]. Человеческий катионный антимикробный белок (hCAP18) является к настоящему времени единственным идентифицированным человеческим кателицидином. Было показано, что антибактериальный С-концевой фрагмент hCAP18 - LL37, проявляет антимикробную активность как против грам(-), так и против грам(+) бактерий, грибов, вирусов и простейших. Этот пептид является важным фактором реэпителизации ран, также была показана его ангиогенная активность in vivo и in vitro. Более того, LL37 функционирует в качестве хемотаксического агента для нейтрофилов, моноцитов и Т-клеток.

Значительное повышение содержания LL37 отмечено в семенной плазме и на поверхности сперматозоидов у здоровых доноров. Считается, что LL37 предотвращает поражение сперматозоида микроорганизмами на пути к яйцеклетке и во время оплодотворения. Недостаточность LL37 в слюне согласуется с наличием заболевания периодонта у пациентов с болезнью Костманна. Известно, что больные атопическим дерматитом с дефицитом экспрессии LL37 чаще страдают вакцинальной экземой.

LL37 устойчив к протеолитическому разрушению и, в ограниченной степени, цитотоксичен по отношению к клеткам млекопитающих. Установлено, что нормальное содержание LL37 в плазме составляет 1,2-1,8 мкг/мл. Во время инфекционных заболеваний концентрация этого белка повышается [17].

Гистатины - это семейство богатых гистидином катионных белков слюны с массой 3-5 кДа, синтезируемых ацинарными клетками околоушной и поднижнечелюстной желез [28]. Гистатины оказывают прямое фунгицидное действие [19]. Обнаружены только в слюне человека и некоторых высших приматов. Концентрация гистатинов в слюне - примерно 45-75 мкг/мл. Гистатины способны также осаждать танины, причем более эффективно, чем пролин-богатые протеины, особенно при нейтральных значениях рН и высоких концентрациях танинов [12]. Гистатины являются слабо амфипатичными пептидами. На моделях липосом было показано, что они обладают слабой литической способностью [24; 26]. Интенсивность кандидной колонизации находится в зависимости от концентрации гистатинов, в свою очередь, их уровень повышается при кандидозе полости рта [10; 13].

Большой проблемой современности является развитие резистентности (способности микроорганизмов развиваться и размножаться при внедрении химического препарата, который обычно действует на уничтожение этих микробов или на прекращение их роста) микроорганизмов к антимикробным препаратам [4; 23].

Механизм действия антимикробных пептидов универсален, вследствие чего они губительны даже для тех микроорганизмов, которые выработали устойчивость к различным антибиотикам в процессе эволюции [22].

Существуют значительные различия структуры клеточной стенки и клеточной мембраны у грамположительных и грамотрицательных бактерий. Грамположительные бактерии содержат наружную клеточную стенку, состоящую из многих слоев пептидогликана, под которой находится клеточная мембрана [6]. Грамотрицательные бактерии обладают наружной клеточной мембраной, содержащей большое количество липополисахарида, а также истинной внутренней цитоплазматической мембраной [14]. Последняя покрыта меньшим, чем у грамположительных бактерий, числом полигликановых слоев и отделена от наружной мембраны периплазматическим пространством. Таким образом, грамотрицательные бактерии обладают серьезным барьером на пути проникновения лекарств. Липофильные препараты или водорастворимые вещества с низкой молекулярной массой могут проходить через пориновые каналы. Изменения содержания или состава пориновых белков или липополисахаридов наружной мембраны могут обусловить возникновение резистентности вследствие снижения проницаемости к антибиотикам.

Известно, что большая часть антибактериальных пептидов воздействует на мембрану бактерий, точнее, на её жировой слой. Кроме того, такие пептиды всегда обладают положительным зарядом, а жировой слой мембраны бактерии заряжен отрицательно. Поэтому ясно, что главный принцип антибактериального эффекта - это электростатический эффект. Однако иногда пептиды эффективны в отношении одного типа микроорганизмов, а других, с идентичным зарядом мембраны, нисколько не повреждают. Кроме того, нет объяснений, каким образом положительно заряженные пептиды воздействуют на электрически нейтральный липидный слой клеточной мембраны млекопитающих [2].

Универсальность действия на микроорганизмы, а также способность быстро поражать клетки-мишени и широкий спектр действия позволяют рассматривать антимикробные пептиды в качестве основы для создания новых лекарств, особенно на фоне глобальной проблемы снижения эффективности обычных антибиотиков. Однако стоит обратить внимание на то, что многие натуральные пептиды помимо чужеродных микроорганизмов способны разрушать эритроциты крови [17]. В этом и состоит сложность использования АМП в медицине. Механизм действия пептидов по сей день слабо изучен, поэтому направленный синтез молекул, при котором пептиды бы действовали исключительно на возбудителей, не причиняя вреда клеткам человека, пока невозможен.

Но, несмотря на недостаточную изученность, в последние годы обрисовались перспективы применения антимикробных пептидов в клинической практике. Так, в Европе уже проходят клинические исследования медикамента, основу которого составляет антимикробный пептид, полученный из секрета мушки дрозофила. Он показывает достаточный уровень эффективности в борьбе с тяжёлой грибковой инфекцией, которая часто прогрессирует после химиотерапии или трансплантации органов. Антимикробные пептиды начинают активно вырабатываться клетками человеческого организма при локальных повреждениях или наличии болезнетворных микроорганизмов. Поэтому они оптимальны в терапии местных воспалений.

Клиническое применение эндогенных антимикробных пептидов затрагивает широкий круг проблем современной теоретической и прикладной науки [17]. Многие аспекты применения АМП еще до конца не изучены. Тем не менее эта тема заслуживает пристального внимания и дальнейшей разработки.

Рецензенты:

Белый Л.Е., д.м.н., профессор кафедры госпитальной хирургии, анестезиологии, реаниматологии, урологии, травматологии и ортопедии МФ ИМЭиФК УлГУ, г. Ульяновск;

Кан Н.И., д.м.н., профессор, зав. кафедрой последипломного образования и семейной медицины ФПМиФО ИМЭиФК УлГУ, г. Ульяновск.

Среди различных регуляторных структур организма иммунная система по своей сложности и многофункциональности занимает особое место. Значительная дифференциация функций иммунокомпетентных клеток, большое число их субпопуляций, клонов и способов взаимодействия требуют высокоразвитых селективных и неселективных механизмов передачи информации, обеспечивающих скоординированную работу системы в целом. Большинство эффекторных и вспомогательных функций клеток иммунной системы осуществляются при участии особых эндогенных структур внутрисистемных гормонов и медиаторов. Именно эти молекулы обеспечивают созревание и дифференцировку разных типов клеток, служат передатчиками межклеточных регуляторных сигналов, образуя уже упоминавшуюся APUD-систему, осуществляют контроль над интенсивностью и длительностью иммунного ответа.

Экстракты ткани тимуса

Одним из первых полипептидных экстрактов тимуса был тимозин, выделенный А. Гольдстайном и соавторами (Goldstein) в 1966 году. Гомогенная фракция 8 тимозина, представлявшая собой, агрегат полипептидных цепей, включавших 108 аминокислотных остатков, стимулировала образование антител и способствовала дифференцировке клеток костного мозга в антителообразующие клетки. Было высказано предположение о том, что тимозин активирует хелперную функцию Т-лимфоцитов в кооперативном иммунном ответе на тимуснезависимые антигены. Наименее очищенная фракция 3 тимозина уменьшала проявления вастинг-синдрома, увеличивала выживаемость животных, частично восстанавливала структуру лимфоидных тканей и количество циркулирующих лимфоцитов, а также способность к отторжению кожных трансплантатов (Goldstein et al., 1966; Bach et al., 1971).

Фракция 5 тимозина (тимозин Ф5) – гликопептид, состоящий примерно из 30-ти полипептидов с молекулярной массой от 1 до 15 кД. Препарат усиливал реакцию тимоцитов в смешанной культуре и активность в тесте розеткообразования, а также индуцировал цитотоксичность лимфоцитов и их чувствительность к анти-TL и анти-Thy-1 сывороткам (Pahwa et al., 1979). Эта фракция тимозина стимулировала активность гипоталамо-гипофизарно-адреналовой оси и продукцию ИЛ-6 глиальными клетками (Tijerina et al., 1997). Добавление тимозина Ф5 к культуре спленоцитов, сопровождалось активной выработкой ИЛ-6 (Attia, et al. 1993).

Наиболее широко тимозин применяли при бактериальных, вирусных и грибковых инфекциях (Mutchnic, 1991; Serrate et al., 1987; Reddy, Grieco, 1987; Spangelo et al., 1987). М. Мучник и соавторы (Mutchnick et al., 1991) в двойном слепом плацебоконтролируемом опыте показали, что у больных хроническим вирусным гепатитом В курсовое применение тимозина Ф5 или тимозинаα1 дважды в неделю на протяжении 6 месяцев сопровождалось достоверным увеличением содержания CD3 и CD4 лимфоцитов в периферической крови и активацией выработки интерферонаγ. На фоне применения иммуномодулятора достоверно уменьшалась активность аминотрансфераз. Авторы считают, что терапия тимозином Ф5 способствует наступлению ремиссии или даже выздоровлению больных хроническим вирусным гепатитом В.

Неоднократно предпринимались попытки применения Ф5 в терапии злокачественных опухолей (Wada et al., 1996; Ikemoto et al., 1999; Scher et al., 1988 и др.). Однако однозначных выводов о его эффективности не получено. Так, применение тимозина Ф5 у больных с мелкоклеточным раком легкого на фоне радио- и/или химиотерапии не выявило достоверного влияния иммуномодулятора на течение заболевания и эффективность базисного лечения (Scher et al., 1988).

В 1981 году В.Я. Арионом и соавторами из аутолизата тимуса был получен тактивин – комплексный препарат, содержащий пептиды с молекулярной массой от 1,5 до 6 кДа. В экспериментальных исследованиях и клинических наблюдениях тактивин эффективно восстанавливал сниженную или подавленную иммунологическую реактивность. Введение препарата мышам СВА с индуцированной бензолом депрессией иммунитета, восстанавливало количество ЕК-клеток и Т-киллеров до исходного уровня. Под влиянием тактивина повышалось содержание тимического сывороточного фактора, повышалась активность экспрессии дифференцировочных рецепторов лимфоцитов.

За время, прошедшее с момента создания препарата его использовали для лечения широкого круга заболеваний, сопровождавшихся формированием вторичного иммунодефицитного состояния. Наилучшие результаты были получения при применении тактивина в составе комплексной терапии при радиационной иммунодепрессии кроветворения, при первичных иммунодефицитных состояниях (атаксия-телеангиэктазия, врожденные нарушения тимической регуляции), при лечении генерализованных форм герпеса (Арион, 1989). Клинико-иммунологического эффекта удавалось достичь при рассеянном склерозе, острой септической и гнойно-воспалительной патологии, при острых и хронических инфекционных процессах. Во всех этих случаях после курса тактивина отмечена нормализация состояния иммунной системы, сокращение продолжительности заболевания и повышение эффективности специфической терапии.

Близкий по иммунологическим свойствам пептидный препарат тималин получен путем кислотного гидролиза тимуса крупного рогатого скота (Морозов, Хавинсон, 1978). При экспериментальном изучении тималина показана его способность модулировать процессы репопуляции дифференцировочных рецепторов лимфоцитов (Смирнов и др., 1992). В клинических целях тималин применяли при широком круге заболеваний. Так, парентеральные инъекции препарата в дозе 10-20 мг ежедневно в течение 5-20 сут. у больных с хроническими неспецифическими заболеваниями легких способствовали нормализации большинства показателей клеточного иммунитета и неспецифической защиты организма (Яковлев и др., 1992). Одновременно наблюдалось уменьшение или исчезновение воспалительных явлений в легких. Срок лечения больных сокращался в среднем на 21%. Среди других клинических аспектов иммунотерапии тималином заслуживает внимания его эффективность при лечении различных воспалительных заболеваний, сопровождающихся формированием вторичных иммунодефицитных состояний. Чаще всего при этом наблюдается снижение количества лимфоцитов, экспрессирующих CD2+DR+, CD3+, CD4+, CD8+ рецепторы, на фоне достоверного возрастания индекса миграции лейкоцитов периферической крови. Со стороны системы неспецифической защиты отмечается угнетение экспрессии ОКМ1+ рецепторов на макрофагах, снижение содержания катионных белков, фагоцитарного индекса и активности пероксидазы. Применение тималина в составе комплексной терапии по 10 мг ежедневно на протяжении 5-10 сут. сопровождалось восстановлением сниженных показателей иммунной системы, уменьшением интенсивности внутрисосудистого свертывания и сокращением продолжительности воспаления (Морозов, Хавинсон, 1989; Яковлев и др., 1992). Улучшение клинического состояния наблюдалось в 80-93% случаев. Показатель летальности при таком тяжелом состоянии как перитонит на фоне иммуномодулирующей терапии тималином составил 0,08, в то время как у лиц, получавших стандартную терапию, он был почти в 4 раза выше.

Применение тималина при бронхиальной астме, тимомегалии, системной красной волчанке, саркоидозе, острой пневмонии, псориазе, ревматоидном артрите сопровождалось восстановлением содержания основных субпопуляций Т- и В-лимфоцитов, улучшением клинического течения заболевания, сокращением периода реабилитации. При хронических процессах отмечено увеличение продолжительности периодов ремиссии, а в некоторых случаях и полное выздоровление (Яковлев и др., 1992). Профилактическое назначение тималина ликвидаторам аварии на Чернобыльской АЭС позволяло уменьшить риск формирования вторичного иммунодефицитного состояния (Смирнов и др., 1992).

Тималин применяли при лечении инфекционных заболеваний, в частности, вирусных гепатитов. Показано, что у 50% больных вирусным гепатитом В после 2-х курсов тималина исчезали маркеры возбудителя и наступала стойкая ремиссия, продолжавшаяся 3 и более мес. (Векслер и др., 1987).


Обзор

рисунок автора статьи

Автор
Редакторы

В начале февраля ТАСС опубликовал следующее заявление:

Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии “Вектор” Роспотребнадзора направил результаты клинических исследований вакцины фазы I–II в зарубежные научные рецензируемые журналы. Их публикация ожидается в ближайшее время. В Роспотребнадзоре подчеркнули, что до выхода международных публикаций обнародование результатов в русскоязычных научных изданиях не представляется “целесообразным” из-за “эксклюзивности и значимости для широкого круга потенциально заинтересованных лиц”.

Наблюдается противоречие между намерением разработчиков вакцины печататься в зарубежных изданиях в начале февраля и реальностью, в которой статья выходит в российском издании, аффилированном с Роспотребнадзором, во второй половине марта. Можно предположить, что рецензенты зарубежных изданий не пропустили статью в печать.

Как устроена вакцина

рисунок автора статьи

Химерный белок

В последовательности химерного белка, приведенной ниже, можно выделить часть, соответствующую бактериальному белку MBP (лиловым фоном), гис-тэг (темно-зеленым фоном) и часть, соответствующую вирусному нуклеокапсидному белку (синим фоном) (по патенту №2738081):

MKIEEGKLVIWINGDKGYNGLAEVGKKFEKDTGIKVTVEHPDKLEEKFPQVAATGDGPDIIFWAHDRFGGYAQSGLLAEITPDKAFQDKLYPFTWDAVRYNGKLIAYPIAVEALSLIYNKDLLPNPPKTWEEIPALDKELKAKGKSALMFNLQEPYFTWPLIAADGGYAFKYENGKYDIKDVGVDNAGAKAGLTFLVDLIKNKHMNADTDYSIAEAAFNKGETAMTINGPWAWSNIDTSKVNYGVTVLPTFKGQPSKPFVGVLSAGINAASPNKELAKEFLENYLLTDEGLEAVNKDKPLGAVALKSYEEELAKDPRIAATMENAQKGEIMPNIPQMSAFWYAVRTAVINAASGRQTVDEALKDAQTNSSSNNNNNNNNNNLGIEGRGGSG HHHHHH SGSDNGPQNQRNAPRITFGGPSDSTGSNQNGERSGARSKQRRPQGLPNNTASWFTALTQHGKEDLKFPRGQGVPINTNSSPDDQIGYYRRATRRIRGGDGKMKDLSPRWYFYYLGTGPEAGLPYGANKDGIIWVATEGALNTPKDHIGTRNPANNAAIVLQLPQGTTLPKGFYAEGSRGGSQASSRSSSRSRNSSRNSTPGSSRGTSPARMAGNGGDAALALLLLDRLNQLESKMSGKGQQQQGQTVTKKSAA

Такая сложная конструкция химерного белка объясняется необходимостью его тщательной очистки из лизата кишечной палочки, в которой он производится для вакцинации. Одним из наиболее известных и эффективных способов добиться хорошего синтеза и очистки вирусного или другого нужного исследователям белка в микробах заключается в соединении вирусного белка с мальтозосвязывающим белком (MBP). Это соединение позволяет проводить одностадийную очистку химерного продукта с использованием амилозной смолы.

Функции улучшенной хроматографической очистки химерного белка из бактериального лизата служит и гис-тэг . Он представляет собой пептид из шести гистидинов, который особенно хорошо связывается с ионами металла при хроматографии. Это позволяет посадить на хроматографическую колонку, содержащую ионы металла, исключительно белок с гис-тэгом. Этот тэг работает как крючок. При этом другие белки и компоненты лизата кишечной палочки с колонки смываются. В определенных типах буфера связь гистидинов с ионами металлов разрушается, поэтому белок с гис-тэгом можно элюировать (смыть с колонки) такого рода растворами [5].

  1. 454 C RLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGS 477 — пептид расположен в участке рецептор-связывающего мотива в рецептор-связывающем домене шиповидного белка коронавируса SARS-CoV-2.
  2. 1181 C KEIDRLNEVA KNLNESLIDLQE 1201 — пептид расположен в участке гептаповтора 2 в шиповидном белке.
  3. 1191 C KNLNESLIDLQE LGKYEQYIK 1211 — пептид расположен в участке гептаповтора 2 в шиповидном белке.

Проблема выбора пептидов для вакцины

Экспериментальным поиском линейных B-клеточных эпитопов шиповидного белка, хорошо доступных для взаимодействия с антителами, занимались сразу несколько лабораторий [8–13]. Идея такого поиска в том, чтобы изучить антитела переболевших COVID-19 людей и найти те, которые способны связываться с пептидами, соответствующими последовательности шиповидного белка. Если такие пептиды найдутся, то, иммунизируя человека этими пептидами в составе вакцины, можно надеяться на получение антител, которые будут связываться с B-клеточными эпитопами шиповидного белка и выполнять протективную функцию.

Исследователи из разных стран независимо друг от друга провели скрининговое картирование почти всех пептидных фрагментов шиповидного белка и выявили пептиды, с которыми связываются антитела хотя бы 20% переболевших COVID-19 людей. Таким образом идентифицировали пептиды, которые соответствуют фрагментам белка, где располагаются B-клеточные эпитопы.

Эксперименты были построены так: на подложку последовательно, по принципу черепичной укладки, иммобилизовали пептиды шиповидного белка. Каждый последующий пептид перекрывался с предыдущим на половину своей длины или больше. Поэтому на подложке были представлены почти все линейные В-клеточные эпитопы шиповидного белка. Таких подложек готовилось много. Потом на каждую подложку наливалась плазма крови выздоровевших после COVID-19 людей. Далее методом иммуноферментного анализа (ИФА) [14] происходила идентификация пептидов, с которыми связались антитела.

После первичного картирования и выявления линейных фрагментов шиповидного белка, которые узнаются антителами, последовала вторая фаза исследования. В этой фазе экспериментально установили, какие пептиды способны помешать реакции нейтрализации вируса сывороткой переболевших. Фазу идентификации этих пептидов можно провести разными способами, например реакцией конкурентного вытеснения. Исследователи обогащают плазму переболевшего COVID-19 человека определенным антителом, которое способно связываться с изучаемым пептидом, а потом исследуют, может ли этот пептид помешать реакции нейтрализации живого вируса [9], [10], [13]. Если да, то это означает, что у данного пептида в составе пептидной вакцины больше шансов спровоцировать образование нейтрализующих антител. Хотя гарантий иммуногенности именно такого пептида в составе вакцины всё равно нет.

Участки вирусного шиповидного белка, на которые бывают часто нацелены антитела у переболевших COVID-19

рисунок автора статьи

Тем не менее в вышеприведенных высказываниях разработчиков есть правильная логика; конечно, участки белка, соответствующие пептидам вакцины, должны быть консервативны в эволюции. Иначе пептидная вакцина станет хуже работать для мутантных вариантов вируса. Однако эти участки белка должны быть все же видны иммунной системе большинства людей и должны располагаться в доступном для антител месте. Существующие экспериментальные данные говорят нам о том, что этого не наблюдается; дополнительные доказательства приведены в таблице 1.

Если у людей очень редко образуются антитела, способные взаимодействовать с определенными фрагментами вирусного белка, то это означает, что при иммунизации соответствующими пептидами антитела на эти пептиды не смогут узнать и связать вирус у большинства людей. Нужны ли такие пептиды в вакцине для иммунизации?

Самые иммуногенные пептиды, антитела на которые лучше всего связывались с шиповидным белком и давали самый сильный ИФА-сигнал, отбирали для дальнейшей вакцинной разработки. Идея такого отбора в том, что если антитела, выработанные на пептид-антиген, хорошо связывают вирусный шиповидный белок, то этот же пептид в составе вакцины будет вызывать образование антител у человека, которые будут связывать вирусный белок у вириона и, возможно, выполнять протективную противовирусную функцию.

рисунок автора статьи

Частота образования антител, узнающих короткие пептиды шиповидного белка, у переболевших COVID-19

рисунок автора статьи

Неудивительно, что пептиды, найденные при скрининге и иммунизации кроликов, не совпадают с пептидами, которые узнаются антителами хотя бы у 20% переболевших COVID-19, согласно исследованиям независимых экспериментаторов [8–13].

Таким образом, из всего вышеперечисленного можно заключить, что способ выбора пептидов на основании вышеописанных экспериментов не свободен от возможности появления серьезных артефактов. На основании факта наличия взаимодействия антител с вирусным шиповидным белком на иммуносорбенте нельзя сделать вывод о том, что антитела на пептиды в вакцине могут провзаимодействовать с коронавирусом и защитить организм от вирусной инфекции.

Формирование антител после вакцинации

Итак, для определения уровня антител после вакцинации нужен спецтест. Этот спецтест не описан в открытых документах. Как он устроен — остается загадкой.

Антигены вакцины и антитела

рисунок автора статьи

Эксперимент А.А. Чепурнова

Имеющиеся данные позволяют считать, что необходима официальная комиссионная проверка наличия нейтрализующих антител у людей, привитых этой вакциной. Это недорогое и быстро выполнимое исследование. По его результатам можно принять обоснованное решение о целесообразности использования вакцины в гражданском обороте и о продолжении разработки на данной платформе. Хочу отметить, что ряд крупнейших биотехнологических компаний мира (Sanofi, Merck), свернули свою работу над вакциной, убедившись в неэффективности выбранных ими платформ (ничего зазорного в этом нет).

Т-клеточный иммунитет

Проблема ИФА-тестов

Тестирование наличия, титра и характеристик антител у вакцинированных — это очень важная задача научной работы. Увы, эта задача выполнена создателями вакцины, судя по публикации [1], не на высоком уровне.

Второй ИФА-тест основан на использовании инактивированных вирионов SARS-CoV-2. Поскольку оболочка у части вирионов при инактивации и адсорбции на подложку может быть повреждена, этот тест, вероятно, способен выявлять как антитела к шиповидному, так и к нуклеокапсидному белкам коронавируса. Таким образом, в статье не доказано, что вакцина способна вызывать образование антител именно к шиповидному белку.

Но если нет антител к этому белку, нельзя объяснить наличие нейтрализующих антител в ответ на вакцину.

Тест на антитела, способные к нейтрализации вируса

Проблемы и нестыковки в представлении результатов

Отсутствуют положительные контроли

Вирус-нейтрализующие антитела (обратные титры) в сыворотках добровольцев-испытуемых

Рисунок 7. Вирус-нейтрализующие антитела (обратные титры) в сыворотках добровольцев-испытуемых на 35 и 42 дни после первой иммунизации

В эксперименте с вирус-нейтрализующими антителами (рис. 7) этот контроль также отсутствует. Показаны результаты анализа обратных титров вирус-нейтрализующих антител в сыворотке испытуемых на 35 и 42 дни после вакцинации.

Обнаружены антитела к антигенам вакцины в контрольной группе испытуемых

Вызывает сомнения статистическая достоверность полученных результатов

На рисунке 6 ошибки титров антител в группе вакцинированных и в группе плацебо перекрываются. В таблице 3 представлены очень большие стандартные отклонения титров антител на 35 и 42 сутки.

Вакцина продемонстрировала слабую иммуногенность

В эксперименте с титрами антител к антигенам SARS-CoV-2 (рис. 8) средние геометрические титры после вакцины на последней временной отметке более чем в 10 раз ниже титров антител переболевших. На панели а показаны титры антител к антигенам вируса в сыворотках испытуемых, которые определялись в разные сроки после вакцинации. Определение производилось для сывороток, полученных на 14, 21, 35 и 42 дни после вакцинации. На панели б показан титр антител у переболевших COVID-19. Значения титров показано в логарифмической шкале.

Специфические антитела к антигенам вируса SARS-CoV-2

Рисунок 8. Специфические антитела к антигенам вируса SARS-CoV-2: а — в сыворотках испытуемых на 14, 21, 35 и 42 дни после иммунизации (логарифмическая шкала); б — в сыворотках реконвалесцентов (переболевших COVID-19) (логарифмическая шкала).

Проблема использования вакцины для пожилых

Тут еще стоит немного отвлечься от анализа статьи и рассказать, на основании каких испытаний вакцина была-таки рекомендована пожилым. Специалисты в разработке вакцин выделяют четыре фазы клинических испытаний вакцин, как и других лекарственных препаратов [19]. Первые две фазы нужны для получения первичных данных о побочных эффектах вакцины и ее иммунологических характеристиках. Кроме того, они помогают подобрать дозировки иммуногенного вакцинного материала при введении в организм, а также режим введения вакцины. В качестве иммунологических характеристик чаще всего оценивают выработку антител, хотя есть и другие параметры, такие как клеточный иммунитет. В первых двух фазах, как правило, участвует от нескольких десятков до нескольких сотен человек.

Исследования фазы III делаются уже на большой группе людей — как правило, много тысяч. Эти исследования обычно спланированы таким образом, чтобы получить надежные статистические результаты о способности вакцины предотвращать инфекцию. То есть сравнивают заболеваемость в группе вакцинированных с группой плацебо. На маленькой выборке людей такие исследования проводить невозможно. Ведь только небольшая часть из них заболеет, а надо получить надежную разницу в числе заболевших в группе вакцинированных и плацебо. При этом разница должна быть статистически значимой. Испытания третьей фазы изучают эпидемиологическую эффективность вакцины.

Испытания четвертой фазы проводятся для изучения того, как долго длится иммунитет и нет ли у вакцины долгосрочных побочных эффектов. В принципе, в России действуют примерно такие же правила изучения новых вакцин. Однако в связи с пандемией Минздрав РФ счел возможным регистрировать и даже разрешать выпускать в гражданский оборот вакцины после первых двух фаз, что, по сути, проблематично. В большинстве других стран вакцину выпускают в оборот и дают временное право использования на основании результатов третьей фазы, а именно клинических испытаний, показавших, что в группе вакцинированных заболеваний статистически значимо меньше, чем в контрольной группе. В пандемию эти общие правила не изменились, хотя процедура получения временного разрешения после третьей фазы клинических испытаний упростилась и ускорилась.

Случаи заражения COVID-19 во время клинических испытаний

Вывод в отношении опубликованной работы

Обсуждаемую работу [1] вряд ли можно назвать научной статьей, выполненной на хороших научном и методическом уровнях. С учетом перечисленных замечаний, касающихся контролей, расхождения данных, доверительных интервалов и статистической значимости, статья представляется сырой. Поэтому ее выводы пока не могут быть приняты в качестве подтверждения заявлений разработчиков.

Читайте также: