Культивирование вируса бешенства в культуре клеток
Обновлено: 15.04.2024
Вирусология:
Популярные разделы сайта:
Культивирование вируса бешенства. Размножение вируса гидрофобии
Размножение вируса бешенства в организме куриного эмбриона было осуществлено в конце 30-х годов (Bernkopf, Kligler). М. А. Селимов и Е. В. Семенова культивировали штаммы фиксированного вируса бешенства после предварительной адаптации путем заражения куриных зародышей в мозг. Адаптированные штаммы успешно размножались при заражении куриных эмбрионов в желток.
Этот вариант вируса, обозначенный как Flury LEP (Low embryon passages), был широко использован для производства живой яичной антирабической вакцины, сыгравшей большую роль в профилактической иммунизации собак. После 180 желточных пассажей он оказался апатогениым для взрослых мышей при интрацсребральном введении, но сохранил патогенную активность для новорожденных мышей.
Некоторые штаммы фиксированного вируса бешенства были адаптированы к организму утиного эмбриона (Powell, Culbertson) или однодневного оплодотворенного куриного яйца (Yoshino е. а.). Адаптация фиксированного вируса бешенства к организму утиного зародыша привела к внедрению в практику инактивированной утиной антирабической вакцины. Эта вакцина для лечебной иммунизации людей широко применяется в США.
Размножение вируса гидрофобии
Размножение вируса бешенства в культуре клеток. Необходимо различать периоды плазменных культур, переживающих тканей и однослойных клеточных структур. Первые плазменные культуры представляли собой кусочки спииальных ганглиев в плазме крови обезьян, зараженных фиксированным вирусом (Levaditi). В этих опытах в течение 6 пассажей наблюдалось переживание или слабое размножение вируса. Stoel в стационарной плазменной культуре из кусочков мозга куриного зародыша в плазме крови кролика сделал 15 серийных пассажей и в плазменной культуре из кусочков сердца — один пассаж фиксированного вируса, Bequignon с соавт. наблюдали накопление фиксированного вируса до 102 в плазменной культуре из кусочков мозга эмбриона мыши.
Vieuchange, пользуясь методикой диализных пробирок в плазменной культуре, содержащей кусочки мозга эмбриона мыши, добился длительного размножения штаммов уличного и фиксированного вируса (до 80 и 102 дней соответственно). Askel, Aykau отметили сохранение уличного вируса бешенства до 30 дней в плазменной культуре роговицы кролика, помещенной в плазму цыпленка с раствором Тироде и сывороткой лошади. Fernandes, Pomerat во вращающейся плазменной культуре из кусочков аммонова рога и мозжечка новорожденных щенят и котят провели 4 пассажа фиксированного вируса. Авторы отметили накопление вируса до 103-3,2, деструкцию нервных клеток и образование в них телец Негри.
В культуре переживающих тканей наблюдалось более активное размножение вируса бешенства, чем в плазменных культурах. Указанная методика казалась перспективной для получения больших объемов вируссодержащей жидкости. Однако экспериментальные серии культуральной антирабической вакцины имели низкие показатели иммуногенной активности в сравнении с мозговыми вакцинами, в связи с чем культура переживающих тканей не нашла практического применения.
История открытия. Отдельные свойства возбудителя бешенства впервые изучены в 1880 г. Л. Пастером. Внутриклеточные кристаллы вирусов бешенства обнаружены в 1892 г. В. Бабешем и в 1903 г. А. Негри. Первая инактивированная антирабическая вакцина была получена Л. Пастером и сотрудниками в 1885 г. методом аттенуации дикого штамма вируса в мозге восприимчивых животных.
Культивирование. Для культивирования вирусов бешенства используют: 1) лабораторных животных (мыши, крысы, обезьяны, собаки, кролики, хомяки); 2) куриные эмбрионы; 3) культуры клеток (опухолевые, Vero, человеческие диплоидные, куриные и утиные эмбриональные клетки).
Резистентность. Вирусы бешенства инактивируются растворами формалина, лизола, фенола, хлорамина, калия перманганата, карболовой кислоты, а также эфиром, ацетоном, спиртом, трипсином, ультрафиолетовыми лучами. При температуре 100˚С вирусы погибают в течение 2 минут, при 60˚С – в течение 10-15 минут.
Эпидемиология. Бешенство – типичный зооноз; от человека к человеку бешенство не передаётся. Резервуаром и источником инфекции являются: 1) псовые (собаки, лисы, волки, енотовидные собаки, шакалы); 2) куньи (куницы, барсуки, ласки, хорьки, горностаи, скунсы, мангусты); 3) рукокрылые (насекомоядные и плотоядные летучие мыши); 4) копытные (коровы, лошади); 5) кошачьи (домашние кошки, дикие кошки, рыси и др.); 6) грызуны (мыши, крысы). Бешенством болеет человек. Механизм передачи инфекции от больного животного к человеку – перкутанный (при укусах животными, либо при ослюнении). Бешенство у собак увеличивается летом. Инкубационный период при бешенстве у животных – 10 дней. Бессимптомного вирусоносительства у животных не бывает.
Патогенез. У животных вирусы бешенства инфицируют головной мозг и слюнные железы. Со слюной вирусы попадают в окружающую среду. В 1 мл слюны бешенного животного содержится 10 8 инфицирующих доз. После укуса или ослюнения раны вирусы бешенства остаются в очаге в течение инкубационного периода, длительность которого варьирует от 12 дней до более года. При связывании с тканью вирус бешенства концентрируется в нервно-мышечных контактах. Тканевым рецептором для вируса бешенства являются ацетилхолиновые и другие рецепторы. Вирусы проникают в аксоны нейронов и попадают в центральную нервную систему. В цитоплазме нейронов гиппокампа, продолговатого мозга, ядер черепно-мозговых нервов, симпатических ганглиев и клетках Пуркинье мозжечка происходит размножение и накопление вирусов бешенства. В пораженных клетках обнаруживаются вирусоспецифические цитоплазматические включения – тельца Бабеша-Негри. Вокруг инфицированных нейронов наблюдаются явления нейронофагии и сателлитоза. Репродукция вирусов бешенства сопровождается увеличением протеина bax и апоптозом нейронов. Поражение нейронов ведет к усилению рефлекторной возбудимости и возникновению судорог, особенно глотательных и дыхательных мышц, к увеличению слюно- и потоотделения..
Причины симптомов бешенства и гибели от него изучены недостаточно. По данным югославских ученых, вирус бешенства не размножается в организме до тех пор, пока не попадет в центральную нервную систему. Достигнув ее, он вызывает в ней необратимые изменения. Они наступают раньше, чем в организме успевает сформироваться активный иммунитет. Непосредственно после инфицирования возбудитель можно нейтрализовать специфическим иммуноглобулином.
Патогенез бешенства зависит от ряда факторов: вирулентности возбудителя, устойчивости организма животного, времени продвижения возбудителя до ЦНС. Случаи спонтанного выздоровления собак после искусственного заражения вирусом бешенства диких животных предполагают наличие у отдельных особей высокой степени защиты, то есть высоких титров гуморальных вируснейтрализующих антител.
Как было сказано выше, вирус бешенства попадает в организм человека через рану или микроповреждение кожи при укусе или ослюнении его бешеным животным. Реже входными воротами инфекции являются слизистые оболочки. Далее наблюдается центростремительное движение вируса по периневральным пространствам со скоростью 1 мм/ч. Дальнейшее размножение и накопление его происходит в основном в головном и спинном мозге с последующим центробежным распространением и поражением всей нервной системы, в том числе нервных узлов слюнных желез. Из слюнных желез вирусы выделяются в окружающую среду.
Иммунитет. Люди и животные, вакцинированные классическими вакцинами против бешенства, отвечают подъемом уровня нейтрализующих антител. Степень подъема определяется силой вакцины. Антитела направлены к G-гликопротеину (гемагглютинину). Сывороточные антитела у людей, больных бешенством, редко появляются до 8 дня болезни. В спинномозговой жидкости антитела появляются на 9-11-й дни. Клеточный иммунитет при бешенстве изучен недостаточно. Остается непонятным тот факт, что у 85 % людей, укушенных заведомо бешеным животным, бешенство не развивается, заболевают только 15 % пострадавших.
В течении болезни различают следующие стадии: продромальную, развившейся болезни с возбуждением, параличей, заканчивающуюся летальным исходом. Продолжительность инкубационного периода в известной степени зависит от локализации укуса (короткий — при укусах в лицо, голову, более длинный — при укусах в стопы), степени его тяжести, возраста укушенного. Инкубационный период чаще всего составляет от 10 до 30—40 дней, реже — до одного года и более.
Клиника. При условии развития клинических признаков заболевания бешенство – абсолютно смертельная болезнь. Заболевание характеризуется неуклонным повышением температуры тела до 42˚С, развитием депрессии, апатии, расстройствами дыхания и глотания. При попытке питья и при виде воды возникают приступы гидрофобии – чувство ужаса и болезненные спазмы мышц глотки и гортани. Приступы гидрофобии могут быть спровоцированы движением воздуха (аэрофобия), ярким светом (фотофобия), громким звуком (акустофобия). Приступ сопровождается болезненными судорогами, агрессивностью, помрачением сознания. Через 1-2 дня от начала болезни появляется обильное слюно- и потоотделение. В последующем развиваются параличи нижних конечностей и черепно-мозговых нервов. Смерть наступает от паралича сердца или дыхательного центра. Общая продолжительность болезни – 3-7 дней.
Лечение. Не разработано.. Применяются симптоматические средства с целью уменьшения страданий больного, снижения возбудимости нервной системы, улучшения сердечно-сосудистой деятельности. Для питания и восстановления потерь жидкости парентерально вводят солевые растворы, плазмозаменители, растворы глюкозы, витамины. Делают попытки лечения антирабическим иммуноглобулином в комплексе с реанимационными мероприятиями. Пока, однако, эти меры не привели к успеху.
Профилактика. Бешенство можно контролировать на 3 уровнях: человек, домашние животные и дикие животные. Имеются вакцины для профилактики среди людей и домашних животных (культуральные инактивированные вакцины, вводимые парентерально). Среди диких животных используется пероральная вакцина.
Предупреждение заболевания человека бешенством после укуса или ослюнения его бешеным или неизвестным животным осуществляется тщательной первичной обработкой раны с промыванием ее перекисью водорода и прижиганием концентрированной йодной настойкой. Затем проводят срочную серотерапию (антирабический γ-глобулин) и вакцинацию на пастеровских пунктах согласно инструкции, утвержденной Министерством здравоохранения Украины.
В настоящее время для профилактики бешенства используется антирабическая инактивированная культуральная сухая вакцина. Вакцина получена Селимовым (1974 г.) методом пассажей вирусов бешенства (штамм-fixe) в культуре клеток почек сирийского хомяка при 32˚С. Вакцинный штамм – Внуково-32 – инактивирован ультрафиолетовыми лучами. Вакцина выпускается в ампулах по 3 мл (после разведения). Вводится подкожно в область живота. В зависимости от категории повреждения и данных о животном разовая доза составляет от 2 до 5 мл. Основной курс вакцинации – от 7 до 21 дня, сроки проведения ревакцинации – согласно инструкции по применению вакцины. Вакцина используется для проведения экстренной профилактики бешенства (укусы, ослюнение бешеными животными). При вакцинации и после ее проведения (даже если она была прервана) употребление алкогольных напитков запрещено в течение 6 месяцев. Антитела появляются через 2 недели после начала прививок, при этом поствакцинальный иммунитет становится действенным примерно через 2 недели после окончания вакцинации. Вакцинация предупреждает возникновение бешенства в 96-99 % случаев. Иммунитет сохраняется в течение 1 года.
Неспецифическая профилактика бешенства городского типа предусматривает предупреждение бродяжничества собак и кошек, обязательную их регистрацию, профилактическую иммунизацию домашних животных, санитарно-ветеринарную пропаганду. Борьба с эпизоотиями природного типа имеет целью поддержание популяции животных, являющихся резервуаром бешенства, на определенном уровне.
10. Вирус клещевого энцефалита. Свойства, экологические варианты. Механизм передачи, патогенез заболевания. Лабораторная диагностика, специфическая профилактика и лечение. Семейство Flaviviridae § 1. Характеристика семейства.
Название семейства происходит от латинских слов flavus – желтый и virus – вирус, и связано с первым открытым представителем семейства – вирусом желтой лихорадки.
Классификация. Семейство Flaviviridae состоит из 3 родов: Flavivirus, Hepacivirus и Pestivirus. Рода Flavivirus и Hepacivirus включают вирусы, патогенные для животных и человека; род Pestivirus объединяет вирусы, вызывающие чуму у копытных животных.
Строение вириона флавивирусов. Вирионы сферической формы, диаметром 30-50 нм (рис. 1). Суперкапсид двухслойный, липидный, покрыт шипами длиной 10 нм, содержащими гемагглютинин. В состав суперкапсида входят белки V3 и V1 (расположен на внутренней стороне). Белок V3 обладает антигенными свойствами и содержит видо-, комплексо- и родоспецифические антигенные детерминанты. Капсид сферической формы, диаметром 20-30 нм, икосаэдрического типа симметрии. В состав нуклеокапсида входит 1 белок – V2. Геном флавивирусов представлен однониточной линейной несегментированной позитивной РНК, длиной 9,5-10*10 3 нуклеотидов. Изолированная РНК инфекционна. РНК имеет 1 открытую рамку считывания, кодирующую структурные и неструктурные белки. Химический состав флавивирусов: белки – 66 %, липиды – 17 %, углеводы – 9 %, РНК – 8 %.
Таксономия: РНК-содержащий вирус, семейство Rhabdoviride, род Lyssavirus.
Морфология и антигенные свойства. Вирион имеет форму пули, состоит из сердцевины (РНП(рибонуклеопротеин) спирального типа и матриксного белка), окруженной липопротеиновой оболочкой с гликопротеиновыми шипами. Гликопротеин G отвечает за адсорбцию и внедрение вируса в клетку, обладает антигенными (типоспецифический антиген) и иммуногенными свойствами. Антитела к нему нейтрализуют вирус и выявляются в РН(рекция нейтрализации). РНП состоит из геномной однонитевой линейной минус-РНК и белков: N-белка, L-белка и NS-белка. РНП является группоспецифическим антигеном; выявляется в РСК, РИФ, РП.
Различают два вируса бешенства: дикий вирус, циркулирующий среди животных, патогенный для человека; фиксированный – не патогенный для человека.
Культивирование. Вирус культивируют путем внутримозгового заражения лабораторных животных (мышей, крыс) и в культуре клеток: фибробластов человека, куриного эмбриона. В нейронах головного мозга зараженных животных образуются цитоплазматические включения, содержащие антигены вируса (тела Бабеша-Негри – эозинофильные включения).
Резистентность: Вирус бешенства неустойчив: быстро погибает под действием солнечных и УФ-лучей, а также при нагревании до 60С. Чувствителен к дезинфицирующим веществам, жирорастворителям, щелочам и протеолитическим ферментам.
Эпидемиология. Источниками инфекции в природных очагах являются волки, грызуны. Вирус бешенства накапливается в слюнных железах больного животного и выделяется со слюной. Животное заразно в последние дни инкубационного периода (за 2—10 дней до клинических проявлений болезни). Механизм передачи возбудителя — контактный при укусах. Иногда заболевание развивается при употреблении мяса больных животных или при трансплантации инфицированных тканей (роговицы глаза).
У собаки после инкубационного периода (14дн.) появляются возбуждение, обильное слюнотечение, рвота, водобоязнь. Она грызет место укуса, бросается на людей, животных. Через 1—3 дня наступают паралич и смерть животного.
Патогенез и клиника. Вирус, попав со слюной больного животного в поврежденные наружные покровы, реплицируется и персистирует в месте внедрения. Затем возбудитель распространяется по аксонам периферических нервов, достигает клеток головного и спинного мозга, где размножается. Клетки претерпевают дистрофические, воспалительные и дегенеративные изменения. Размножившийся вирус попадает из мозга по центробежным нейронам в различные ткани, в том числе в слюнные железы. Инкубационный период у человека при бешенстве — от 10 дней до 3 месяцев. В начале заболевания появляются недомогание, страх, беспокойство, бессонница, затем развиваются рефлекторная возбудимость, спазматические сокращения мышц глотки и гортани.
Иммунитет: Человек относительно устойчив к бешенству. Постинфекционный иммунитет не изучен, так как больной обычно погибает. Введение людям, укушенным бешеным животным, инактивированной антирабической вакцины вызывает выработку антител, интерферонов и активацию клеточного иммунитета.
Микробиологическая диагностика: Постмортальная диагностика включает обнаружение телец Бабеша—Негри в мазках-отпечатках или срезах из ткани мозга, а также выделение вируса из мозга и подчелюстных слюнных желез. Тельца Бабеша—Негри выявляют методами окраски по Романовскому—Гимзе. Вирусные антигены в клетках обнаруживают с помощью РИФ.
Выделяют вирус из патологического материала путем биопробы на мышах: заражают интрацеребрально. Идентификацию вирусов проводят с помощью ИФА, а также в РН на мышах, используя для нейтрализации вируса антирабический иммуноглобулин.
Прижизненная диагностика основана на исследовании: отпечатков роговицы, биоптатов кожи с помощью РИФ; выделении вируса из слюны, цереброспинальной и слезной жидкости путем интрацеребрального инфицирования мышей. Возможно определение антител у больных с помощью РСК, ИФА.
Лечение. Симптоматическое; эффективное лечение отсутствует.
Профилактика. Выявление, уничтожение животных. Иммунизация антирабической вакциной собак. Специфическую профилактику проводят антирабической вакциной и антирабической сывороткой или иммуноглобулином. Инактивированная УФ- или гамма лучами культуральная вакцина. С лечебно–профилактической целью иммунизируют людей; формируется активный иммунитет.
Вирусология:
Популярные разделы сайта:
Вирус бешенства в клеточных культурах. Размножение
Новой эрой в рабиологии, как и в вирусологии вообще, можно считать внедрение в практику методики однослойных клеточных культур. Следует отметить, что для облигатного нейротропного вируса, каким является возбудитель бешенства, клетки внутренних органов не представляют оптимальной среды. При первичном внесении вируса бешенства, например, в культуру клеток почки практически не наблюдается накопления вируса.
Выяснилось, что для размножения вируса бешенства в культуре клеток экстраневрального происхождения необходима предварительная его адаптация, причем адаптация штаммов высоконейротропного фиксированного вируса требует больших усилий, чем штаммов уличного вируса. Циркулирующие в природе штаммы уличного вируса, по-видимому, имеют неодинаковые способности для адаптации к клеточным культурам. Кроме того, предварительно адаптированные к каким-либо экстраневральным клеточным культурам штаммы вируса имеют широкий клеточный диапазон активности: они легко и быстро могут быть адаптированы к различным клеточным системам.
Для адаптации штаммов фиксированного вируса могут быть рекомендованы следующие приемы: чередующиеся пассажи (in vivo, in vitro), методика диализных пробирок и смеси клеток (cell mixing technique), а также добавление в среду поликатионов (DEAE-декстрана, протамина сульфата) или облучение клеток ультрафиолетовыми лучами. Методика диализных пробирок благодаря постоянной смене поддерживающей среды позволила сохранять зараженные клетки в течение долгого времени.
Е. М. Михайловскому в нашей лаборатории удалось адаптировать к культуре первичных клеток почки сирийского хомяка (ПСХ) несколько штаммов уличного вируса бешенства путем постоянной смены среды и сохранения зараженных клеток до 76 дней. Таким образом был выведен культуральный вариант уличного вируса бешенства (штамм Мочалин), который к настоящему времени в нашей лаборатории прошел 130 пассажей, накапливается в культуре ткани до 10-7 lg LD50/0,03 мл при интрацеребральном титровании на мышах, вызывает острую инфекцию (Р. Ш. Ильясова).
Hronowski с соавт. аналогичным путем штамм уличного вируса (R-205) адаптировали к культуре первичных клеток почки собаки.
В настоящее время известно несколько штаммов фиксированного вируса бешенства, адаптированных к культуре ткани (SAD, CVS-11, ERA, Внуково-32, Внуково-37, Flury, Pasteur, Pitman-Moore). Штамм CVS был адаптирован к культуре первичных клеток ПСХ путем чередующихся пассажей и прошел 112 серийных пассажей (Kissling, Rees). Штамм SAD также был адаптирован к культуре первичных клеток ПСХ в диализных пробирках в результате 25 чередующихся пассажей (Fenje).
Штаммы Flury HEP, Pitman-Moore адаптированы к культуре перевиваемых диплоидных клеток легких эмбриона человека (IIDCS, штамм WI-38) путем пассажей в смеси клеток (Wiktor е. а.). Depoux осуществил 66 серийных пассажей штамма Pasteur в культуре первичных клеток подчелюстных желез щенка собаки.
Значительно большее число публикаций относится к размножению в культуре первичных клеточных культур штаммов вируса бешенства, предварительно адаптированных к культуре ткани. Следует упомянуть об успешном размножении штамма SAD в культуре первичных клеток почки эмбриона поросенка (Abelseth), в культуре первичных клеток почки эмбриона овцы (Selimov, Aksenova), в культуре первичных клеток почки щенка собаки, кролика, морской свинки (Т. Л. Аксенова и др.), штамма Pasteur в культуре клеток лимфатических узлов, околоушной слюнной железы щенка (Depoux), штаммов Flury LEP, HEP в культуре первичных клеток куриного эмбриона (Л. И. Калинина, М. А. Селимов, Р. К. Сафаров).
При сравнительном изучении чувствительности к вирусу бешенства различных клеточных систем (первичные клетки ПСХ, почки щенка, морской спинки, теленка, ягненка, обезьяны, кролика, кошки, человека) более чувствительными оказались клетки ПСХ (Kissling, Rees, Аксенова и др., Е. М. Михайловский). Первичные клетки куриного эмбриона чувствительны к штаммам Flury LEP, HEP, глубокоадаптированным к организму куриного эмбриона, и менее чувствительны к классическим штаммам фиксированного вируса. Первичные клетки ПСХ по своей чувствительности, по-видимому, уступают лишь первичным глиальным клеткам из мозга эмбрионов различных животных.
Из перевиваемых клеточных линий высокочувствительными к вирусу бешенства считаются культура эпендимы мышей (ЕрО) и перевиваемые клетки почки эмбриона сирийского хомяка (ВНК-21, клон 13). Последние нашли самое широкое применение в исследовательской работе, так как титры вируса в этой культуре достигают 10-7/0,03 мл при интра-церебральном титровании на мышах, тогда как в самой чувствительной культуре первичных клеток ПСХ вирус обычно имеет титры 10-4,5 и 10-6,5 lg LD50/0,03 мл. Для выращивания вируса бешенства применены различные перевиваемые клетки.
Atanasiu соавт., Fernandes с соавт. выращивали штаммы CVS, Pasteur, Flury, Nishigara в культуре перевиваемых клеток ВНК-21 или ER эндотелия кролика, Т. А. Аксенова с соавт., Р. К. Сафаров — штаммы SAD, Flury в культуре перевиваемых клеток легких, почки, кишечника эмбриона человека или овцы. Clark сообщил об успешном размножении штаммов фиксированного вируса бешенства в культуре перевиваемых клеток холоднокровных пресмыкающихся.
Читайте также: