Метод ифа для индикации вирусного антигена в клещах
Обновлено: 25.04.2024
Комплексное исследование, направленное на диагностику инфицирования и оценку эффективности вакцинации против клещевого энцефалита, а также на диагностику системного клещевого боррелиоза.
Синонимы русские
Клещевой энцефалит; системный клещевой боррелиоз (болезнь Лайма); комплексная серологическая диагностика.
Синонимы английские
Тick-borne encephalitis; tick-borne borreliosis (Lyme borreliosis); comprehensive serological diagnostics.
Метод исследования
Иммуноферментный анализ (ИФА).
Какой биоматериал можно использовать для исследования?
Как правильно подготовиться к исследованию?
- Не курить в течение 30 минут до исследования.
Общая информация об исследовании
Клещевой энцефалит – это вирусное природно-очаговое трансмиссивное заболевание, характеризующееся преимущественным поражением центральной нервной системы. Возбудителем является РНКсодержащий вирус, относящийся к роду Flavivirus семейства Togaviridae, группа Arboviruses. Инфекция носит сезонный (весенне-летний) характер и передается преимущественно с укусом клещей, также возможен алиментарный путь передачи через инфицированное сырое молоко коров и коз. Инкубационный период заболевания длится от 3 до 21 дней, в среднем 10-14 дней. Клинические проявления носят разнообразный характер. В зависимости от выраженности неврологических расстройств выделяют следующие формы заболевания: лихорадочную, менингеальную, менингоэнцефалитическую, менингоэнцефалополиомиелитическую и полирадикулоневритическую, двухволновый менингоэнцефалит. По степени тяжести инфекция может протекать в легкой, средней или тяжелой форме, что влияет на длительность заболевания, выраженности клинической симптоматики и варианты исхода болезни. Возможно длительное вирусоносительство в виде латентной, персистентной или хронической инфекции.
Диагностика клещевого энцефалита основана на комплексе эпидемиологических, клинических данных, результатах изменений в лабораторных параметрах. В клиническом анализе крови в острый период заболевания может отмечаться лейкоцитоз с абсолютным и относительным увеличением количества нейтрофилов. Также увеличивается скорость оседания эритроцитов, в анализе мочи может наблюдаться транзиторная протеинурия.
В серологической лабораторной диагностике данного заболевания, главным образом, применяется выявление специфических антител к вирусу клещевого энцефалита. В настоящее время для определения антител классов IgM и IgG используется метод твердофазного иммуноферментного анализа. Данные специфические иммуноглобулины вырабатываются иммунной системой в ответ на инфицирование вирусом клещевого энцефалита или на вакцинацию против данного возбудителя. Важным в серологической диагностике является определение нарастания титра специфических антител в парных сыворотках крови, взятых в первые дни болезни и через две-три недели от ее начала. Антитела класса IgM появляются одновременно с первыми симптомами заболевания, достигая максимального уровня через 3,5-4,5 недели с момента инфицирования, затем постепенно снижаясь в течение нескольких месяцев. Специфические антитела класса IgG возникают в крови спустя неделю после появления первых симптомов, достигают максимума через 1,5-2,5 месяца с момента инфицирования и сохраняются на протяжении всей жизни, обеспечивая стойкий иммунитет.
Системный клещевой боррелиоз, или болезнь Лайма, - природно-очаговое трансмиссивное заболевание, возбудителем которого является грамотрицательная подвижная бактерия Borrelia burgdorferi семейства Spirochaetaceae. Заражение человека может происходить после укусов иксодовых клещей, инокуляции боррелий со слюной клеща, возможна трансплацентарная передача возбудителя от матери к плоду. Чаще всего заражение происходит в весенне-летний период активности клещей. Инкубационный период заболевания может длиться от 3 до 32 дней, по данным некоторых авторов - до 60 дней. Клещевой боррелиоз имеет разнообразные клинические проявления: лихорадка, интоксикация, головные боли, распространенная "мигрирующая" эритема на месте контакта клеща с кожей больного, регионарный лимфаденит. При прогрессировании заболевания, его осложнении и несвоевременном применении лечения могут развиться нарушения в виде менингита, менингоэнцефалита, энцефалита и энцефаломиелита, поражение сердца, глаз, рецидивирующие и/или хронические артриты.
Диагностика заболевания основывается на данных эпидемиологического анамнеза, специфических клинических проявлениях и на оценке лабораторных данных. Особую роль играет специфическая лабораторная диагностика при нетипичной картине протекающей инфекции и безэритемных формах заболевания. В данном случае применяется метод полимеразной цепной реакции для выявления ДНК возбудителя Borrelia burgdorferi и серологическая диагностика.
Серологическая диагностика в настоящее время имеет широкое распространение и направлена на определение наличия и концентрации специфических антител классов IgM и IgG к возбудителю системного клещевого боррелиоза. При применении метода твердофазного иммуноферментного анализа диагностическое значение имеет нарастание титра специфических антител в парных сыворотках. Следует отметить, что антитела класса IgM появляются при первых симптомах заболевания, но их количество нарастает сравнительно медленно, достигая максимума через 2-3 недели, а далее снижаясь. Антитела класса IgG выявляются через несколько недель после инфицирования, максимального уровня достигают через 4-6 месяцев. Таким образом, антитела IgM указывают на недавнее заражение, а IgG подходят для более поздней диагностики. Также определение уровня IgG антител применяется при контроле эффективности проводимой терапии против клещевого боррелиоза.
Внешний вид упаковки и препарата может отличаться от изображённого на фотографии
Инструкция по применению
Описание
Состав
Набор реагентов ИФА ТС АГ ВКЭ Тест-система иммуноферментная для выявления антигена вируса клещевого энцефалита (Комплект № 1) включает следующие реагенты для проведения прямого твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА):
ИГ - иммуносорбент – иммуноглобулин класса G (крысиный) против вируса клещевого энцефалита (ВКЭ) – аморфный порошок белого цвета, после растворения – прозрачная или слабоопалесцирующая бесцветная жидкость.
КА+ - контрольный положительный образец – антиген ВКЭ, экстрагированный из ткани мозга мышей, инфицированных ВКЭ, инактивированный бетапропиолактоном -аморфный порошок кремового цвета, после растворения – прозрачная или слабо опалесци-рующая светло-желтого цвета жидкость.
КА– - контрольный отрицательный образец – антиген из ткани мозга неинфицированных мышей, аморфный порошок кремового цвета, после растворения – прозрачная или слабо опалесцирующая светло-желтого цвета жидкость.
Конъюгат (концентрат) – иммуноглобулин класса G против ВКЭ (крысиный), конъюгированный с пероксидазой хрена, аморфный порошок белого цвета, после растворения – прозрачная или слабо опалесцирующая бесцветная жидкость.
КББ×20 - 20-кратный концентрат карбонатно-бикарбонатного буферного раствора для разведения ИГ – прозрачная бесцветная жидкость.
ФСБ-Т×25 – 25-кратный концентрат фосфатно-солевого буферного раствора с твином, раствор для промывания планшетов и приготовления раствора РР – прозрачная или слабо опалесцирующая бесцветная жидкость, в которой допускается выпадение кристаллов бело-го цвета, растворимых в течение 20-30 мин при температуре 37 ºС.
БСА - бычий сывороточный альбумин – стабилизатор – аморфный порошок от белого до светло-желтого цвета, после растворения в ФСБ-Т – прозрачная или слабо опалесциру-ющая светло-желтого цвета жидкость.
ЦБР - буферный раствор с перекисью водорода – раствор для разведения ТМБ – про-зрачная бесцветная жидкость.
ТМБ - концентрат тетраметилбензидина – хромоген – прозрачная бесцветная жид-кость.
Планшеты полистироловые 96-луночные монолитные для ИФА.
Комплект № 1 рассчитан на одновременное проведение 192 определений, включая контрольные.
Показания для применения
Режим дозирования и способ применения
Подготовка исследуемого материала.
Обработка клещей.
Для испытания в ИФА пригодны лишь неповрежденные клещи. Клещей однократно промывают 70 % спиртом этиловым и 2-3 раза 0,9 % раствором натрия хлорида. Каждого клеща помещают в пробирку для микропроб вместимостью 0,5-1,5 мл, маркируют и хранят до исследования при температуре не выше минус 20 ºС не более 2 недель. Перед испытани-ем в ИФА готовят 10 % суспензию клеща: его растирают металлическим стержнем в той же пробирке, добавляют 0,2 мл РР (см. п. 4.4). Клеща, насосавшегося крови, растирают, добавляя РР в количестве, равном его объёму. Для ИФА берут 0,1 мл суспензии, остаток пробы хранят в той же пробирке и тех же условиях, что и клещей не более 2 недель.
Подготовка мозговой суспензии.
Для исследования мозга инфицированных животных (или мозговой ткани людей, взятой в случае летального исхода) необходимо приготовить 1 % мозговую суспензию на РР. Суспензию центрифугируют при 3000-6000 об/мин в течение 20-30 мин, надосадочную жидкость переносят в стерильную пробирку, маркируют и хранят до исследования также как пробы крови. В ИФА проверяют как неразведенную суспензию, так и в разведении 1:10 и выше.
Подготовка культуральной жидкости.
Культуральную жидкость зараженных клеточных культур перед испытанием в ИФА освобождают от клеток центрифугированием при 3000-6000 об/мин в течение 20-30 мин. В ИФА исследуют как неразведенные пробы, так и в разведении 1:2 и более.
Подготовка растворов и реагентов (для проведения анализа на одном планшете).
Набор перед использованием необходимо выдержать не менее 30 мин при температу-ре от 18 до 25 °C.
Раствор для разведения ИГ (КББ).
0,5 мл КББ×20 разводят в 9,5 мл воды очищенной или дистиллированной (далее воды). Хранение: неиспользованный концентрат КББ×20 хранят при температуре от 2 до 8 ºС не более 1 сут или при температуре не выше минус 10 ºС не более 7 сут.
Иммуносорбент (ИГ).
Рабочее разведение ИГ указано на ампуле.
Содержимое ампулы с ИГ растворяют в 1 мл воды (время растворения 1,5 мин при температуре 20-25 оС), затем разводят в КББ (см. п. 4.1) до разведения, указанного на ампу-ле (например: 1:20 – 0,5 мл ИГ и 9,5 мл КББ).
Хранение: неиспользованный растворенный ИГ хранят при температуре от 2 до 8 ºС не более 1 сут или при температуре не выше минус 10 оС не более 7 сут.
Раствор для промывания планшетов и приготовления РР (ФСБ-Т).
Содержимое флакона с концентратом ФСБ-Т×25 разводят в 480 мл воды. В случае вы-падения осадка концентрат ФСБ-Т×25 предварительно прогревают в течение 20-30 мин при температуре 37 ºС до полного растворения осадка.
Хранение: при температуре от 2 до 8 ºС не более 2 сут или при температуре не выше минус 10 оС не более 14 сут.
Рабочий раствор (РР) для разведения образцов, конъюгата, КА+, КА–.
В 50 мл ФСБ-Т (см. п. 4.3) растворяют навеску 0,5 г стабилизатора БСА (время рас-творения 20 мин при помешивании при температуре 20-25 ºС).
Хранение: при температуре от 2 до 8 ºС не более 1 сут или при температуре не выше минус 10 ºС не более 7 сут.
Подготовка контрольных образцов.
Содержимое ампул с КА+ и КА– растворяют в 0,5 мл воды (время растворения 1,5 мин при температуре 20-25 ºС), затем готовят рабочее разведение каждого контрольного образ-ца в РР (см. п. 4.4) так, как указано на ампуле (например: 1:200 – 0,01 мл антигена и 2 мл РР).
Хранение: неиспользованные растворенные контрольные образцы хранят при темпе-ратуре от 2 до 8 ºС не более 1 сут или при температуре не выше минус 10 ºС не более 14 сут (рекомендуется разлить на аликвоты в микропробирки для исключения повторного замораживания-оттаивания).
Рабочее разведение конъюгата.
Содержимое ампулы с конъюгатом растворяют в 0,5 мл воды (время растворения
1,5 мин при температуре 20-25 ºС), затем разводят на РР (см. п. 4.4) так, как указано на ам-пуле (например: 1:40 – 0,25 мл конъюгата и 9,75 мл РР). Рабочее разведение конъюгата го-товят не ранее чем за 30 мин до использования.
Хранение: оставшийся не использованным растворенный конъюгат хранят при температуре от 2 до 8 ºС не более 1 сут или при температуре не выше минус 10 ºС не более 14 сут.
Проведение иммуноферментного анализа.
Внесение конъюгата.
В каждую лунку планшета, кроме 12А, вносят по 100 мкл раствора конъюгата в рабочем разведении. Планшет закрывают и помещают на 45-60 мин при температуре (37±1) ºС, затем отмывают 5 раз, остатки влаги удаляют (см. п.5.1).
Меры предосторожности при применении
Внешний вид упаковки и препарата может отличаться от изображённого на фотографии
Инструкция по применению
Описание
Форма выпуска
ИГ – 1 ампула, 0,5 мл; Конъюгат (концентрат) – 1 ампула, 0,3 мл; КА+ – 1 ампула, 0,3 мл; КА– – 1 ампула, 0,3 мл; КББ – 1 флакон, 10 мл; ФСБ-Т×25 – 1 фл., 20 мл; РР – 3 фл. по 20 мл; ЦБР – 1 фл., 12 мл; ТМБ концентрат – 1 фл., 3 мл; Стоп-реагент – 1 фл., 6 мл; Планшет 96 луночный для ИФА разборный – 1 шт. В коробку с набором вкладывают инструкцию по применению и нож или скарификатор ампульный (при упаковке ампул, не имеющих кольца излома или точки для вскрытия).
Состав
Набор реагентов ИФА ТС АГ ВКЭ Тест-система иммуноферментная для выявления антигена вируса клещевого энцефалита (Комплект № 2) включает следующие реагенты для проведения прямого твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА):
ИГ - иммуносорбент – иммуноглобулин класса G (крысиный) против вируса клещевого энцефалита (ВКЭ), аморфный порошок белого цвета, после растворения – прозрачная или слабоопалесцирующая бесцветная жидкость.
КА+ - контрольный положительный образец – антиген ВКЭ, экстрагированный из ткани мозга мышей, инфицированных ВКЭ, инактивированный бетапропиолактоном, аморфный порошок кремового цвета, после растворения – прозрачная или слабо опалесци-рующая светло-желтого цвета жидкость.
КА– - контрольный отрицательный образец – антиген из ткани мозга неинфицированных мышей, аморфный порошок кремового цвета, после растворения – прозрачная или слабо опалесцирующая светло-желтого цвета жидкость.
Конъюгат (концентрат) – иммуноглобулин класса G против ВКЭ (крысиный), конъ-югированный с пероксидазой хрена, аморфный порошок белого цвета, после растворения – прозрачная или слабо опалесцирующая бесцветная жидкость.
КББ - карбонатно-бикарбонатный буферный раствор для разведения ИГ – бесцветная прозрачная жидкость.
ФСБ-Т×25 – 25-кратный концентрат фосфатно-солевого буферного раствора с твином, раствор для разведения образцов и промывания планшетов – прозрачная или слабо опалес-цирующая бесцветная жидкость, в которой допускается выпадение кристаллов белого цве-та, растворимых за 20-30 мин при температуре 37 ºС.
РР - раствор для разведения конъюгата, КА+, КА– и исследуемых образцов – опалес-цирующая бесцветная жидкость, допускается образование осадка белого цвета.
ЦБР - буферный раствор с перекисью водорода – раствор для разведения ТМБ – про-зрачная бесцветная жидкость.
ТМБ - концентрат тетраметилбензидина – хромоген – прозрачная бесцветная жид-кость.
Стоп-реагент – прозрачная бесцветная жидкость.
Планшет полистироловый 96-луночный разборный для ИФА.
Комплект № 2 рассчитан на проведение 96 определений, включая контрольные.
Показания для применения
Режим дозирования и способ применения
Подготовка исследуемого материала.
Обработка клещей
Для испытания в ИФА пригодны лишь неповрежденные клещи. Клещей однократно промывают 70 % спиртом этиловым и 2-3 раза 0,9 % раствором натрия хлорида. Каждого клеща помещают в пробирку для микропроб вместимостью 0,5-1,5 мл, маркируют и хранят до исследования при температуре не выше минус 20 ºС не более 2 недель. Перед испытани-ем в ИФА готовят 10 % суспензию клеща: его растирают металлическим стержнем в той же пробирке, добавляют 0,2 мл РР. Клеща, насосавшегося крови, растирают, добавляя РР в количестве, равном его объёму. Для ИФА берут 0,1 мл суспензии, остаток пробы хранят в той же пробирке и тех же условиях, что и клещей не более 2 недель.
Подготовка мозговой суспензии
Для исследования мозга инфицированных животных (или мозговой ткани людей, взятой в случае летального исхода) необходимо приготовить 1 % мозговую суспензию на РР. Суспензию центрифугируют при 3000-6000 об/мин в течение 20-30 мин, надосадочную жидкость переносят в стерильную пробирку, маркируют и хранят до исследования также как пробы крови. В ИФА проверяют как неразведенную суспензию, так и в разведении 1:10 и выше.
Подготовка культуральной жидкости
Культуральную жидкость зараженных клеточных культур перед испытанием в ИФА освобождают от клеток центрифугированием при 3000-6000 об/мин в течение 20-30 мин. В ИФА исследуют как неразведенные пробы, так и в разведении 1:2 и более.
Подготовка растворов и реагентов (для проведения анализа на одном планшете).
Набор перед использованием необходимо выдержать не менее 30 мин при температу-ре от 18 до 25 °C.
Иммуносорбент (ИГ).
Рабочее разведение ИГ указано на ампуле (например, 1:20).
Содержимое ампулы с ИГ растворяют в 0,5 мл воды очищенной или дистиллирован-ной (далее воды) (время растворения 1,5 мин при температуре 20-25 ºС), затем разводят в КББ до разведения, указанного на ампуле (например: 1:20 – 0,5 мл ИГ и 9,5 мл КББ).
Раствор для промывания планшетов (ФСБ-Т).
Необходимое количество концентрата ФСБ-Т×25 (в зависимости от количества стри-пов) разводят в 25 раз водой (см. таблицу 1). В случае выпадения осадка концентрат
ФСБ-Т×25 предварительно прогревают 20-30 мин при температуре 37 ºС до полного раство-рения осадка.
Хранение: неиспользованный концентрат ФСБ-Т×25 хранят при температуре от 2 до
8 ºС не более 2 сут или при температуре не выше минус 10 ºС не более 14 сут.
Подготовка контрольных образцов.
Содержимое ампул с КА+ и КА– растворяют в 0,3 мл воды (время растворения 1,5 мин при температуре 20-25 ºС), затем готовят из них рабочее разведение каждого контрольного образца в РР так, как указано на ампуле (например: 1:200 – 0,01 мл антигена и 2 мл РР).
Хранение: неиспользованные растворенные контрольные образцы хранят при темпе-ратуре от 2 до 8 ºС не более 1 сут или при температуре не выше минус 10 ºС не более
14 сут (рекомендуется разлить на аликвоты в микропробирки для исключения повторного замораживания-оттаивания).
Рабочее разведение конъюгата.
Содержимое ампулы с конъюгатом растворяют в 0,3 мл воды (время растворения
1,5 мин при температуре 20-25 ºС). Необходимое количество конъюгата (в зависимости от количества используемых стрипов) разводят РР до разведения, указанного на ампуле. Тщательно перемешивают. Рабочее разведение конъюгата готовят не ранее чем за 30 мин до использования.
Хранение: неиспользованный растворенный конъюгат хранят так же, как контроль-ные образцы.
Рабочий раствор ТМБ.
Рабочий раствор хромогена готовят непосредственно перед использованием, соединяя концентрат ТМБ с ЦБР в соотношении 1:5, тщательно перемешивают. Смесь готовят в чистой посуде, избегая контакта раствора с металлом, воздействия интенсивного источника света и близости с хлорсодержащими веществами.
Внимание! Посуду и наконечники пипеток, контактирующие с раствором ТМБ нель-зя отмывать с применением синтетических моющих средств, поскольку даже их следы ве-дут к разложению ТМБ в ходе реакции (лучше всего готовить раствор субстрата в специ-ально выделенной промаркированной посуде).
Меры предосторожности при применении
Антитела класса IgG к вирусу клещевого энцефалита – это специфические противовирусные белки-иммуноглобулины, вырабатываемые иммунной системой в ответ на инфицирование вирусом клещевого энцефалита и свидетельствующие о текущей либо перенесенной инфекции или об успешной вакцинации.
При положительном результате указывается концентрация обнаруженных антител, а также титр.
Синонимы русские
Антитела класса IgG к вирусу клещевого энцефалита (Encephalitis virus), иммуноглобулины класса G к вирусу клещевого энцефалита.
Синонимы английские
Anti-arboviral Encephalitis IgG, Encephalitis Virus Antibodies, IgG, Tick-borne encephalitis virus IgG (TBE virus IgG).
Метод исследования
Иммуноферментный анализ (ИФА).
Единицы измерения
Ед/мл (единица на миллилитр).
Какой биоматериал можно использовать для исследования?
Как правильно подготовиться к исследованию?
Не курить в течение 30 минут до исследования.
Общая информация об исследовании
Клещевой энцефалит – это сезонное (весенне-летнее) вирусное заболевание, передающееся в основном с укусом клещей; поражает преимущественно центральную нервную систему.
Возбудитель клещевого энцефалита относится к арбовирусам, семейству флавивирусов, и подразделяется на три подвида: дальневосточный, центральноевропейский и сибирский. Основной переносчик энцефалита – иксодовые клещи. Кроме того, он передается через птиц, грызунов и хищников. Инкубационный период в среднем составляет 3-7 суток. Клинические проявления болезни разнообразны. Выделяют лихорадочную, менингеальную, менингоэнцефалитическую, полиомиелитическую и полирадикулоневритическую формы заболевания. Возможно длительное вирусоносительство в виде латентной, персистентной или хронической инфекции.
В ответ на инфицирование вирусом клещевого энцефалита или на вакцинацию против этого вируса иммунной системой вырабатываются специфические противовирусные антитела – белки-иммуноглобулины. Иммуноглобулины класса G возникают в крови спустя неделю после появления первых симптомов, достигают максимума через 1,5-2,5 месяца с момента инфицирования и сохраняются на протяжении всей жизни, обеспечивая стойкий иммунитет.
Для чего используется исследование?
- Для подтверждения диагноза "клещевой энцефалит" (как текущего, так и недавно перенесенного заболевания).
- Чтобы оценить иммунитет после перенесенного клещевого энцефалита или после вакцинации против него.
- Как часть дифференциальной диагностики при поражении центральной нервной системы (инфекционных менингитах и энцефалитах другого происхождения, эпилепсии, асептическом менингите, тромбозе артерий или вен головного мозга, инсульте, внутричерепном кровоизлиянии, фебрильных судорогах, ВИЧ, цистицеркозе, саркоидозе, сифилисе, карциноматозе мозговых оболочек, паранеопластическом энцефаломиелите и др.).
Когда назначается исследование?
- При подозрении на текущий или перенесенный клещевой энцефалит.
- При проведении вакцинации против клещевого энцефалита.
Что означают результаты?
Концентрация: 0 - 100 Ед/мл.
Причины положительного результата
- Наличие активного иммунитета вследствие ранее перенесенной инфекции или вакцинации (если тест на IgM к вирусу клещевого энцефалита отрицательный).
- Текущий или недавно перенесенный клещевой энцефалит (в сочетании с положительным тестом на IgM к вирусу клещевого энцефалита) при условии, что не проводилась вакцинация.
- Недавно проведенная вакцинация против вируса клещевого энцефалита.
Четырехкратное нарастание титра IgG-антител в парных сыворотках (в остром периоде инфекции и периоде выздоровления), а также повышение уровней IgG и IgM указывает на наличие клещевого энцефалита. Повышение титра IgG после введения вакцины свидетельствует о ее успешности.
Причины отрицательного результата
- Отсутствие недавнего инфицирования и, соответственно, иммунного ответа на вирус (если IgM к вирусу клещевого энцефалита не выявляются). Если есть подозрение на инфекцию, целесообразно назначить повторные анализы на IgM и IgG через 7-10 дней.
- Ранние стадии клещевого энцефалита (если уровень IgM повышен).
- Слабый иммунный ответ (или его отсутствие) на клещевой энцефалит вследствие нарушений иммунной системы (если IgM к вирусу клещевого энцефалита не выявляются).
Что может влиять на результат?
Наличие перекрестно-реагирующих антител к другим возбудителям рода флавивирусов (вирус лихорадки Западного Нила, вирус японского энцефалита и др.).
Читайте также: