Метод ифа при диагностике вирусного гепатита а

Обновлено: 18.04.2024

В основе всех серологических реакций лежит взаимодействие антигена и антитела.

Метод обнаружения с диагностической целью антител в сыворотке крови обследуемого .

В этом случае из двух компонентов реакции (антитело, антиген) неизвестным является сыворотка крови, так как постановка реакции проводится с заведомо известными антигенами. Положительный результат реакции свидетельствует о наличии в крови антител, соответствующих применяемому антигену; отрицательный результат указывает на отсутствие таковых.

С внедрением в практику лабораторий метода иммуноферментного анализа (ИФА) стало возможным определять в крови больных антитела, относящиеся к различным классам иммуноглобулинов (JgM и JgG), что существенным образом повысило информативность серологических методов диагностики.

Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР)

Полимеразная цепная реакция (ПЦР), являющаяся одним из методов ДНК-диагностики, позволяет увеличить число копий детектируемого участка генома (ДНК) бактерий или вирусов в миллионы раз с использованием фермента ДНК-полимеразы. Тестируемый специфический для данного генома отрезок нуклеиновой кислоты многократно умножается (амплифицируется), что позволяет его идентифицировать. Сначала молекула ДНК бактерий или вирусов нагреванием разделяется на 2 цепи, затем в присутствии синтезированных ДНК-праймеров (последовательность нуклеинов специфична для определяемого генома) происходит связывание их с комплементарными участками ДНК, синтезируется вторая цепь нуклеиновой кислоты вслед за каждым праймером в присутствии термостабильной ДНК-полимеразы. Получается две молекулы ДНК. Процесс многократно повторяется.

Для диагностики достаточно одной молекулы ДНК, т. е. одной бактерии или вирусной частицы. Введение в реакцию дополнительного этапа — синтеза ДНК на молекуле РНК при помощи фермента обратной транскриптазы — позволило тестировать РНК-вирусы, например вирус гепатита С.

ПЦР — это трехступенчатый процесс , повторяющийся циклично: денатурация, отжиг праймеров, синтез ДНК (полимеризация). Синтезированное количество ДНК идентифицируют методом иммуноферментного анализа или электрофореза.

возбудитель инфекции может быть обнаружен в любой биологической среде организма, в том числе и в материале, получаемом при биопсии;
возможна диагностика инфекционных болезней на самых разных стадиях заболевания;
возможность количественной оценки результатов исследований ( сколько вирусов или бактерий содержится в исследуемом материале);
высокая чувствительность метода.

Исследования вирусов гепатита

В настоящее время выделяют следующие формы вирусных гепатитов: гепатит А, гепатит В, гепатит С, гепатит D, гепатит Е, гепатит G и гепатит ТТ. Для диагностики каждой из перечисленных форм вирусных гепатитов используется определенный перечень маркеров.

Вирусный гепатит А

Гепатит А — острая энтеровирусная инфекция. Возбудитель — вирус гепатита А (ВГА,HAV) — энтеровирус типа 72. Геном вируса представлен однонитчатой РНК. Вирус гепатита А содержит единственный антиген (HA-Ag). Удельный вес гепатита А в суммарной заболеваемости вирусными гепатитами составляет 70-80%. В структуре заболеваемости гепатитом А дети составляют до 80%, причем основная масса — дошкольники и школьники начальных классов.

Вирусный гепатит В

Гепатит В – вирусная антропонозная инфекция. Возбудитель вирус гепатита В (ВГВ, HBV) – относится к семейству гепаднавирусов, ДНК-содержащих вирусов, поражающих клетки печени. Вирионы ВГВ имеют наружную липопротеидную оболочку и нуклеокапсид, содержащий двунитчатую ДНК и ДНК-зависимую ДНК-полимеразу.

В диагностике вирусного гепатита В ведущее значение имеет определение комплекса маркеров гепатита. Свыше 5% населения планеты охвачено этой инфекцией, а частота безжелтушных форм ВГВ составляет, по данным разных авторов, от 60 до 82%.

Вирус гепатита С, генотипы

Гепатит С (ВГС) – вирусное заболевание, наиболее часто протекающее в виде посттрансфузионного гепатита с преобладанием безжелтушных и легких форм и склонное к хронизации процесса.

Возбудитель - вирус гепатита С – имеет сходство с флавовирусами, содержит РНК. На основе филогенетического анализа выделено 6 генотипов ВГС и более 80 субтипов.

Генотип 1 - наиболее распространенный генотип во всем мире (от 40 до 80%). Генотип 1а является доминирующим для США, а 1b преобладает в Западной Европе и Южной Азии.

Генотип 2 распространен во всем мире, однако встречается с меньшей частотой, чем генотип 1 (от 10 до 40%).

ВГС тип 3 характерен для Индии, Пакистана, Австралии и Шотландии. Генотип 4 распространен преимущественно в Средней Азии и Египте, генотип 5 – в Южной Африке, а генотип 6 – в Гонконге и Мокао.

Примерно 90% всех случаев посттрансфузионных гепатитов связано с ВГС. Среди доноров антитела к вирусу гепатита С (анти-ВГС) обнаруживают в 0,2-5% случаев.

У 40-75% пациентов регистрируется бессимптомная форма болезни, у 50-75% больных острым ВГС формируется хронический гепатит, у 20% из них развивается цирроз печени. Важная роль ВГС отводится и в этиологии гепатоклеточной карциномы.

Геном вируса гепатита С представлен одноцепочечной положительно заряженной РНК, которая кодирует 3 структурных и 5 неструктурных белков. К каждому из этих белков вырабатываются антитела, обнаруживаемые в крови больных гепатитом С.

Отличительной чертой ВГС является волнообразное течение заболевания, в котором разграничивают 3 фазы: острую, латентную и фазу реактивации.
Для острой фазы характерно повышение активности печеночных ферментов в сыворотке крови, уровня антител класса IgM и IgG к ВГС с нарастанием титров, а также РНК ВГС.

Латентная фаза характеризуется отсутствием клинических проявлений, наличием в крови антител класса IgG к ВГС в высоких титрах, отсутствием антител класса IgM и РНК ВГС либо их присутствием в низких концентрациях на фоне незначительного повышения активности печеночных ферментов в периоды обострения.
Для фазы реактивации характерно появление клинических признаков, повышение активности печеночных ферментов, наличие антител класса IgG (к нуклеокапсидному белку core и неструктурным белкам NS) в высоких титрах, присутствие РНК ВГС и нарастание титров антител класса IgM к ВГС в динамике.

Вирусный гепатит D

Гепатит D – вирусная инфекция, вследствие биологических особенностей вируса протекающая исключительно в виде ко- или суперифекции при гепатите В, характеризующаяся тяжелым течением,
часто неблагоприятным исходом.

Самостоятельно, без вируса В, вирус гепатита D не может попасть в организм человека

Возбудитель – вирус гепатита D (ВГD), по своим биологическим свойствам приближается к вироидам – обнаруженным молекулам нуклеиновых кислот. Печень человека – единственное место размножения (репликации) ВГD.

Известно существование двух вариантов инфекции: коинфекция (одновременное заражение ВГВ и ВГD) и суперинфекция (заражение HBsAg-позитивных пациентов). Сочетание ВГВ и ВГD сопровождается развитием более тяжелых форм патологического процесса, что определяется главным образом действием ВГD.

Летальность при суперинфекции достигает 15-20%. Инфицирование дельта-вирусом может вызывать острое заболевание, заканчивающееся выздоровлением, или формировать хроническое носительство ВГD.

При гепатите D могут отсутствовать в крови маркеры гепатита В – анти НВс и НВs-антиген – и наблюдается угнетение ДНК-полимеразной активности, так как ВГD ингибирует репликацию вируса гепатита В.

Диагностика вирусных гепатитов. Диагностика гепатита А и В

Для выявления специфических (вирусных) нуклеиновых кислот и их фрагментов в сыворотке крови больных гепатитами, разработана (К. Миллис с соавт., 1985-1987) и широко применяется полимеразная цепная реакция (ПЦР). С высокой степенью разрешения она позволяет определить HBV-ДНК, HCV-PHK, а также генотипы HCV В последнее время с помощью ПЦР выявляют HGV-PHK и TTV-ДНК. Этот набор реакций позволяет осуществлять не только диагностику различных типов вирусного гепатита, но и использовать их для контроля проводимого противовирусного лечения (слежение за динамикой вирусемии).

Используется широкий арсенал методов серологической диагностики вирусных гепатитов1, позволяющий выделять вирусоспецифические антигены в различных биологических материалах, полученных от больных (кровь, фекалии, слюна, сперма, влагалищный секрет, материнское молоко; пунктаты печени; ткань печени и других органов, полученных посмертно, а также методы определения у больных антител различных классов).

Гепатит А. Среди разработанных и апробированных методов специфической диагностики в настоящее время подавляющее распространение получил иммуноферментный анализ (ИФА), позволяющий выявлять как вирусоспецифические антигены в материалах от больных (фекалии), так и антител различных классов IgM и IgG в сыворотке крови. Наиболее информативным является тест определения анти-ВГА класса IgM, поскольку эти антитела синтезируются у всех больных уже в инкубационном периоде вслед за репродукцией вируса. Определение анти-ВГА класса IgG имеет значение в эпидемиологических исследованиях при изучении иммуноструктуры населения, титровании иммуноглобулинов и т.д.

Что касается определения самого возбудителя или его фрагментов в настоящее время, при необходимости, трудоемкий метод иммунной электронной микроскопии может быть заменен ИФА, а также методом молекулярной гибридизации, позволяющим выявлять вирусную РНК в биологических объектах. Тест-системы для диагностики ГА выпускаются многими фирмами из различных стран мира, включая Россию.

Гепатит В характеризуется наличием вируса и(или) его антигенов как в ткани печени, так и циркуляцией их в крови в определенных временных взаимоотношениях с соответствующими антителами. Антигены HBSAg, HBCAg, HBEAg; антитела: анти-HBS, анти-НВС, анти-НВЕ. Для выявления самого вируса может быть использован метод иммунной электронной микроскопии, однако в последнее время он вытеснен молекулярно-биологическими методами, позволяющими определить вирусоспецифическую ДНК в минимальных количествах, отражающих имеющуюся репродукцию вируса - молекулярная гибридизация нуклеиновых кислот (дот-гибридизация, спот-гибридизация, полимеразная цепная реакция).

Определение ДНК гепатита В важно не столько для установления этиологии заболевания, сколько для оценки эффективности противовирусной терапии. Поверхностный антиген ВГВ (HBSAg) является основным маркером инфекции. Он выявляется у больных уже в инкубационном периоде за много недель до появления биохимических сдвигов в крови и исчезает в период реконвалесценции с сероконверсией на анти-HBS при благополучном исходе инфекции и сохраняется при ее хронизации. Аналогичная картина наблюдается и с HBEAg-свидетелем активной репродукции вируса и высокой инфекционности сыворотки. Другим информативным маркером инфекции являются анти-HBCAgM, которые присутствуют в высоких титрах в остром периоде и более низких - при хроническом гепатите. Для определения указанных маркеров в настоящее время, в подавляющем большинстве случаев, применяется ИФА с использованием коммерческих диагностикумов.

Что касается HBsAg, то используется реакция обратной пассивной гемагглютинации (РОПГА), однако ее чувствительность значительно ниже ИФА (20-50 нг/мл и 0,5-3,0 нг/мл соответственно). В связи с этим РОПГА может быть применена при анализе сывороток крови больных, у которых концентрация HBsAg высокая и не рекомендуется в службе крови при выявлении возможных носителей HBsAg в низкой концентрации. При диагностике ГВ необходимо учитывать, что определение маркеров иногда не позволяет адекватно оценить активность и направленность патологического процесса у больных, что может быть связано с индивидуальными особенностями макроорганизма.

ИФА в диагностике вирусных гепатитов. Возможности иммуноферментного анализа

Специфическая лабораторная диагностика вирусных гепатитов основывается на применении иммунохимических и молекулярно-биологических методов исследований. Основными иммунохимическими методами являются радиоизотопный или радиоиммунный (РИА) и иммуноферментный (ИФА). В основе иммунохимических методов диагностики лежит специфическое взаимодействие антиген — антитело с последующим выявлением комплекса при помощи специальных меток. Наиболее распространенным является иммуноферментный анализ.

В результате инкубации иммуносорбента и испытуемой сыворотки при наличии определяемого агента происходит их связывание в комплекс антиген — антитело. После процедуры промывки, в ходе которой удаляются несвязанные антигены и антитела, проводится инкубация с конъюгатом. В качестве конъюгата при детекции HBsAg используют анти-HBs, при детекции антител к вирусу гепатита С —антитела к иммуноглобулинам человека (антивидовой конъюгат), меченные пероксидазой хрена. В итоге этой инкубации происходит присоединение к уже имеющимся комплексам антиген — антитело дополнительно внесенного конъюгата. После удаления несвязавшегося конъюгата (отмывки) в лунки вносится субстрат. При использовании пероксидазного конъюгата в качестве субстрата используют перекись водорода в сочетании с индикатором, в качестве которого наиболее часто применяют ортофенилендиамин (ОФД) или тетраметилбензидин (ТМБ). Результат оценивается фотометрически.

Качество и надежность аналитических возможностей иммуноферментного метода характеризуются рядом критериев, к числу которых относятся чувствительность, специфичность, правильность и воспроизводимость.

Чувствительность — то минимальное количество вещества, которое может быть обнаружено при помощи иммуноферментного анализа. При этом нижним пределом чувствительности данного метода является концентрация исследуемого вещества в образце, которая соответствует наименьшему положительному результату определения, статистически достоверно отличающемуся от показателей заведомо отрицательных образцов. Чувствительность ИФТС зависит от ряда обстоятельств, связанных как с конструкцией тест-системы (аффинность иммуносорбента, качества экстракционных и буферных систем), так и разрешающей способностью и точностью метода регистрации.

Специфичность — способность выявлять именно те компоненты, для определения которых предназначена данная иммуноферментная тест-система. Специфичность ИФА определяется во многом перекрестной реакцией антител или антигенов (то есть композиции, используемой в качестве иммуносорбента), с близкородственными соединениями, а также составом инкубационной среды (матрикс-эффект).

Правильность — соответствие среднего значения результатов повторных определений одного и того же контрольного образца с истинной величиной измеряемого параметра. Правильность определения в ИФА зависит от качества самой тест-системы и контрольного образца. Для хороших иммуноферментных тест-систем показатели правильности лежат в пределах 90-110 %. Особенностью медико-биологических исследований в ИФА является невозможность установления точной величины, и поэтому за истинную величину принимается средняя от нескольких экспертных лабораторий. Статистическим критерием правильности служит средняя арифметическая и степень ее отклонения от истинного значения, выраженная в процентах.

Воспроизводимость — способность тест-системы показывать одни и те же значения при повторных исследованиях одного и того же образца. Воспроизводимость зависит как от случайных погрешностей (ошибок) при проведении процедуры постановки реакции, так и от качества тест-систем и точности метода регистрации результатов. Считается, что воспроизводимость одних и тех же контрольных образцов одной фирмы в разных лабораториях не должна превышать величину коэффициента вариации в 15%.

Из молекулярно-биологических методов диагностики вирусных гепатитов чаще используются полимеразная цепная реакция и гибридизация. Эти методы, особенно ПЦР, позволяют выявлять очень малые количества специфической вирусной ДНК или РНК и, таким образом, судить о репликации, а в ряде случаев и об активности репликации.

Антитела класса JgM к вирусу гепатита А в сыворотке — 0-0,9 ед.
Достоверное подтверждение диагноза ГА достигается обнаружением специфических антител (анти-HAV), принадлежащих к иммуноглобулинам класса М ( анти-HAV JgM ) в сыворотке крове обследуемого.

При гепатите А антитела, относящиеся к JgM , обнаруживаются в крови еще в инкубационном периоде, за 5-10 дней до появления первых симптомов болезни. К моменту первичного обращения больного к врачу уровень анти-HAV JgM успевает достичь высоких показателей, чтобы быть выявленным методом ИФА. Анти-HAV JgM у больных появляются в начале клинических проявлений заболевания и сохраняются до 6 месяцев после перенесенной инфекции. Спустя год после перенесенной инфекции анти-HAV JgM в крови не обнаруживаются.
Определение анти- HAV JgM — основной тест специфической диагностики гепатита А.

Оценка результатов исследования

Результат исследования выражается качественно - положительный или отрицательный. Отрицательный результат исследования указывает на отсутствие антител к вирусу гепатита А в сыворотке крови. Положительный результат — выявление антител к вирусу гепатита, свидетельствует в пользу текущего острого вирусного гепатита или недавно перенесенного заболевания.

Антитела к вирусу гепатита А JgG

Антитела тела JgG у вирусу гепатита А (анти-HAV JgG ) появляются в крови в период клинических проявлений вирусного гепатита или в фазу реконвалесценции, поэтому не могут служить критерием ранней диагностики гепатита А. Вместе с тем отсутствие анти-HAV JgG в период разгара гепатита позволяет исключить его связь с вирусом гепатита А. Количественное определение анти-HAV JgG позволяет наблюдать за динамикой нарастания ил снижения уровня специфических антител.

Выявление анти-HAV JgG у здоровых людей (возможно у 30-60% здорового населения) свидетельствует о предыдущей инфекции и иммунитете (ретроспективная динамика).

Обнаружение вируса гепатита А методом ПЦР

Вирус гепатита А в крови в норме отсутствует. ПЦР позволяет качественно определять в крови РНК вируса гепатита А. Определяемым фрагментом служит консервативный участок генома вируса гепатита А.
Качественное определение вируса гепатита А методом ПЦР в крови позволяет подтвердить наличие вируса в организме больного и тем самым устанавливает этиологию заболевания. Аналитическая чувствительность метода ПЦР составляет не менее 80 вирусных частиц в 5 мкл прошедшей выделение РНК пробы, специфичность — 98%.

Читайте также: