Методы индикации вирусов в исследуемом материале
Обновлено: 28.03.2024
Вирусы не способны размножаться на питательных средах - это строгие внутриклеточные паразиты. Более того, в отличие от риккетсий и хламидий, вирусы в клетке хозяина не растут и не размножаются путем деления. Составные части вируса - нуклеиновые кислоты и белковые молекулы синтезируются в клетке хозяина раздельно, в разных частях клетки - в ядре и в цитоплазме. При этом клеточные белоксинтезирующие системы подчиняются вирусному геному, его НК.
Репродукция вируса в клетке происходит в несколько фаз:
1. Первая фаза - адсорбция вируса на поверхности клетки, чувствительной к данному вирусу.
2. Вторая фаза - проникновение вируса в клетку хозяина путем виропексиса.
В зависимости от типа нуклеиновой кислоты этот процесс совершается следующим образом.
ДНК-содержащие (ДНК —> иРНК —>белок):
1. Репродукция происходит в ядре: аденовирусы, герпес, паповавирусы. Используют ДНК-зависимую РНК - полимеразу клетки.
2. Репродукция происходит в цитоплазме: вирусы имеют свою ДНК-зависимую РНК полимеразу.
РНК-содержащие вирусы:
1. Рибовирусы с позитивным геномом (плюс-нитиевые): пикорна-, тога-, коронавирусы. Транскрипции нет.
2. Рибовирусы с негативным геномом (минус- нитевые): грипп, корь, паротит, орто-, парамиксовирусы.
(-)РНК —> иРНК —> белок (иРНК комплементарная (-)РНК). Этот процесс идет при участии специального вирусного фермента - вирионная РНК-зависимая PHK-полимераза ( в клетке такого фермента быть не может).
(-)РНК -> ДНК —> иРНК —>белок (и РНК гомологична РНК). В этом случае процесс образования ДНК на базе (-)РНК возможен при участии фермента - РНК-зависимой ДНК-полимеразы (обратной транскриптазы или ревертазы)
4. Четвертая фаза - синтез компонентов вириона. Нуклеиновая кислота вируса образуется путем репликации. На рибосомы клетки транслируется информация вирусной иРНК, и в них синтезируется вирус-специфический белок.
5. Пятая фаза - сборка вириона. Путем самосборки образуются нуклеокапсиды.
6. Шестая фаза - выход вирионов из клетки. Простые вирусы, например, вирус полиомиелита, при выходе из клетки разрушают ее. Сложноорганизованные вирусы, например, вирус гриппа, выходят из клетки путем почкования. Внешняя оболочка вируса (суперкапсид) формируется в процессе выхода вируса из клетки. Клетка при таком процессе на какое-то время остается живой.
Описанные типы взаимодействия вируса с клеткой называются продуктивными, так как приводят к продукции зрелых вирионов.
Иной путь - интегративный - заключается в том, что после проникновения вируса в клетку и "раздевания" вирусная нуклеиновая кислота интегрирует в клеточный геном, то есть встраивается в определенном месте в хромосому клетки и затем в виде так называемого прови-руса реплицируется вместе с ней. Для ДНК- и РНК-содержащих вирусов этот процесс совершается по-разному. В первом случае вирусная ДНК интегрирует в клеточный геном. В случае РНК-содержащих вирусов вначале происходит обратная транскрипция: на матрице вирусной РНК при участии фермента "обратной транскриптазы" образуется ДНК, которая встраивается в клеточный геном. Провирус несет дополнительную генетическую информацию, поэтому клетка приобретает новые свойства. Вирусы, способные осуществить такой тип взаимодействия с клеткой, называются интегративными. К интегративным вирусам относятся некоторые онкогенные вирусы, вирус гепатита В, вирус герпеса, вирус иммунодефицита человека, умеренные бактериофаги.
Кроме обычных вирусов, существуют прионы - белковые инфекционные частицы, не содержащие нуклеиновую кислоту. Они имеют вид фибрилл, размером до 200 нм. Вызывают у человека и у животных медленные инфекции с поражением мозга: болезнь Крейтцфельда-Якоба, куру, скрепи и другие.
Методы индикации вирусов в исследуемом материале.
О репродукции вирусов в культурах клеток судят по их цитопатическому действию (ЦПД), которое носит разный характер в зависимости от вида вируса, по бляшкообра- манию на клеточном монослое, покрытом тонким агаровым слоем, гемадсорбции эритроцитов и другим тестам.
Таким образом, индикация вирусов производится микроскопически по наличию ЦПД, бляшкообразованию на клеточном монослое, гемадсорбции эритроцитов, добавленных к клеточной культуре вируса, а также в реакции гемагглютинации с исследуемым вируссодержащим материалом. Реакцию гемагглютинации вызывают вирусы, содержащие в составе своего капсида или суперкапсида гемагглютинин.
Вирусы не способны размножаться на питательных средах - это строгие внутриклеточные паразиты. Более того, в отличие от риккетсий и хламидий, вирусы в клетке хозяина не растут и не размножаются путем деления. Составные части вируса - нуклеиновые кислоты и белковые молекулы синтезируются в клетке хозяина раздельно, в разных частях клетки - в ядре и в цитоплазме. При этом клеточные белоксинтезирующие системы подчиняются вирусному геному, его НК.
Репродукция вируса в клетке происходит в несколько фаз:
Первая фаза - адсорбция вируса на поверхности клетки, чувствительной к данному вирусу.
Вторая фаза - проникновение вируса в клетку хозяина путем виропексиса.
В зависимости от типа нуклеиновой кислоты этот процесс совершается следующим образом.
ДНК-содержащие (ДНК —> иРНК —>белок):
Репродукция происходит в ядре: аденовирусы, герпес, паповавирусы. Используют ДНК-зависимую РНК - полимеразу клетки.
Репродукция происходит в цитоплазме: вирусы имеют свою ДНК-зависимую РНК полимеразу.
РНК-содержащие вирусы:
Рибовирусы с позитивным геномом (плюс-нитиевые): пикорна-, тога-, коронавирусы. Транскрипции нет.
Рибовирусы с негативным геномом (минус- нитевые): грипп, корь, паротит, орто-, парамиксовирусы.
(-)РНК —> иРНК —> белок (иРНК комплементарная (-)РНК). Этот процесс идет при участии специального вирусного фермента - вирионная РНК-зависимая PHK-полимераза ( в клетке такого фермента быть не может).
(-)РНК -> ДНК —> иРНК —>белок (и РНК гомологична РНК). В этом случае процесс образования ДНК на базе (-)РНК возможен при участии фермента - РНК-зависимой ДНК-полимеразы (обратной транскриптазы или ревертазы)
Четвертая фаза - синтез компонентов вириона. Нуклеиновая кислота вируса образуется путем репликации. На рибосомы клетки транслируется информация вирусной иРНК, и в них синтезируется вирус-специфический белок.
Пятая фаза - сборка вириона. Путем самосборки образуются нуклеокапсиды.
Шестая фаза - выход вирионов из клетки. Простые вирусы, например, вирус полиомиелита, при выходе из клетки разрушают ее. Сложноорганизованные вирусы, например, вирус гриппа, выходят из клетки путем почкования. Внешняя оболочка вируса (суперкапсид) формируется в процессе выхода вируса из клетки. Клетка при таком процессе на какое-то время остается живой.
Описанные типы взаимодействия вируса с клеткой называются продуктивными, так как приводят к продукции зрелых вирионов.
Иной путь - интегративный - заключается в том, что после проникновения вируса в клетку и "раздевания" вирусная нуклеиновая кислота интегрирует в клеточный геном, то есть встраивается в определенном месте в хромосому клетки и затем в виде так называемого прови-руса реплицируется вместе с ней. Для ДНК- и РНК-содержащих вирусов этот процесс совершается по-разному. В первом случае вирусная ДНК интегрирует в клеточный геном. В случае РНК-содержащих вирусов вначале происходит обратная транскрипция: на матрице вирусной РНК при участии фермента "обратной транскриптазы" образуется ДНК, которая встраивается в клеточный геном. Провирус несет дополнительную генетическую информацию, поэтому клетка приобретает новые свойства. Вирусы, способные осуществить такой тип взаимодействия с клеткой, называются интегративными. К интегративным вирусам относятся некоторые онкогенные вирусы, вирус гепатита В, вирус герпеса, вирус иммунодефицита человека, умеренные бактериофаги.
Кроме обычных вирусов, существуют прионы - белковые инфекционные частицы, не содержащие нуклеиновую кислоту. Они имеют вид фибрилл, размером до 200 нм. Вызывают у человека и у животных медленные инфекции с поражением мозга: болезнь Крейтцфельда-Якоба, куру, скрепи и другие.
Методы индикации вирусов в исследуемом материале.
О репродукции вирусов в культурах клеток судят по их цитопатическому действию (ЦПД), которое носит разный характер в зависимости от вида вируса, по бляшкообра- манию на клеточном монослое, покрытом тонким агаровым слоем, гемадсорбции эритроцитов и другим тестам.
Таким образом, индикация вирусов производится микроскопически по наличию ЦПД, бляшкообразованию на клеточном монослое, гемадсорбции эритроцитов, добавленных к клеточной культуре вируса, а также в реакции гемагглютинации с исследуемым вируссодержащим материалом. Реакцию гемагглютинации вызывают вирусы, содержащие в составе своего капсида или суперкапсида гемагглютинин.
Перед выявлением вируса в клетках его обычно отделяют от клеток хозяина путем их разрушения с помощью многократного замораживания и оттаивания или растирания со стерильным песком. Полученный вирусосодержащий материал центрифугируют или пропускают через бактериальный фильтр, обрабатывают антибиотиками для предотвращения бактериального загрязнения.
Индикация (выявление) вирусов
Индикация вирусов в культуре клеток осуществляется, прежде всего, по цитопатическому действию (ЦПД) вирусов, сроки и характер которого зависят от свойств вируса, проявляясь дегенеративными изменениями клеток с последующей их гибелью и отслаиванием от стекла.
Полная дегенерация клеток сопровождается значительными изменениями в виде пикноза ядра и цитоплазмы, отслаиванием клеточного монослоя от стекла. Частичная дегенерация культур кл. может протекать по следующим типам:
гроздеобразования (округление, увеличение и слияние клеток с образованием гроздевидных скоплений, типично для аденовирусов),
очаговой деструкции (очаги пораженных клеток на фоне в целом сохранившегося монослоя), характерной для вирусов гриппа;
симпластообразования (слияние кл. с образованием гигантских многоядерных клеток в виде симпластов или синцитиев, характерных для вирусов кори, паротита, парагриппа, респираторно-синцитиального, герпеса, иммунодефицита человека).
Пролиферативный тип ЦПД с трансформацией клеток в злокачественные, обладающие неограниченными потенциями к росту, способны вызывать онкогенные вирусы.
Сроки, в течение которых наступает ЦПД, вариабельны (например, 1-2 дня у полиовирусов, 7-14 суток у аденовирусов).
Индикация вирусов с помощью реакции гемадсорбции (РГа).Сущность этой реакции заключается в способности эритроцитов человека или животных адсорбироваться на поверхности клеток, инфицированных рядом вирусов в ранние сроки их репродукции (до развития ЦПД) в результате действия гемагглютининов – гликопротеидов, входящих в состав суперкапсида вируса. Для постановки РГА в культуру клеток добавляют 0,2 мл 0,5%-й взвеси эритроцитов, выдерживают 15-20 мин при температуре 40, 200 или 370 С в зависимости от свойств вируса, после чего взвесь эритроцитов удаляют и производят учет реакции под малым увеличением микроскопа по скоплению эритроцитов на отдельных клетках или на всем монослое.
Индикация вирусов по внутриклеточным включениям. Репродукция некоторых вирусов (оспы, герпеса, бешенства) приводит к образованию внутриклеточных включений, локализующихся в цитоплазме или в ядре клеток и представляющих собой скопления вируса (или его антигенов). Включения выявляют путем световой микроскопии культур клеток, окрашенных по Романовскому- Гимзе или другими методами, а также с помощью прямого флюорохромирования (например акридиновым оранжевым) с последующей микроскопией препаратов в люминесцентном микроскопе.
Для индикации вирусов в инфекционном материале могут быть использованы следующие методы и критерии:
Микроскопический: обнаружение вирусных включений в препаратах, окрашенных но Муромцеву, Морозову, Романовскому, Пигаревскому, Павловскому, обработанные флюорохромами.
Вирусологическое выделение вирусов в культурах клеток, в развивающихся куриных эмбрионах, на лабораторных животных (состояние, симптомы).
В культуре тканей: реакция гемаглютинации (РГА), реакция гемадсорбции (РГадс), цитопатогенное действие (ЦПД), цветная проба, метод бляшек.
Идентификация вирусов осуществляется с помощью серологических (иммунологических) методов:
реакция торможения гемагглютинации (РТГА),
реакция торможения гемадсорбции (РТГадс),
реакция связывания комплемента (РСК),
реакция нейтрализации цитопатогенного действия (РН),
реакция иммунофлюоресценции прямая и непрямая (РИФ, РНИФ),
реакция преципитации в геле (РП),
реакция нейтрализации цветной пробы.
Приложение 4
Культивирование вирусов в развивающихся куриных эмбрионах
Берут 7-11 дневные куриные эмбрионы, проверяют их жизнеспособность на овоскопе, на нем же у эмбриона простым карандашом обводят воздушную камеру - главный ориентир для последующих манипуляций.Стерильным тампоном с йодом протирают верхнюю (тупую) часть яйца, затем 60° спиртом.
Заражение невскрытого эмбриона
А) В хорион аллантоисную полость: Делают по границе воздушной камеры яйца под углом 45° к его поверхности на глубине 0,3-0,5 см. После введения вирусного материала отверстие заливают расплавленным парафином, и эмбрион в специальных лотках помещают в термостат-инкубатор приt° +40; +42С° и влажности в 60 %.
Б) В амнион и куриный зародыш:Инфицируют толстой тупой иглой для спинномозговыхпункций. Манипуляцию выполняют в темной комнате под контролем глаза, осторожно упираясь в эмбрион.
После заражения отверстие парафинируют, а инкубацию эмбриона продолжают.
Заражение вскрытого эмбриона:
Выполняют после снятия изогнутыми ножницами крышки яйца над его воздушной камерой, которую снимают очень осторожно.
А) Заражение в амниотический мешок выполняют после его подтягивания стерильным пинцетом.
Б) Заражение в желточный мешок проводят также.
В) обоих случаях дефект в скорлупе яйца закрывают: либо возвращением снятого тупого конца скорлупы, либо крышечкой от стеклянного бюкса. Их края для приданиягерметичности заливают парафином. Помещают в термостат-инкубатор.
Контрольные наблюдения ведут по критериям:
подвижность эмбриона, как показатель жизнеспособности;
появление на оболочках эмбриона бляшек с просяное зерно из внутриклеточных вирусных включений;
общепринятая индикация и идентификация вируса (Приложение 3).
Приложение 5
РЕПРОДУКЦИЯ ВИРУСОВ С РАЗНЫМ ГЕНОМОМ
ДНК- геномные цитоплазматические (вирус натуральной оспы)
Адсорбция на клетке- виропексис
Депротеинизация, освобождение генома
Стратегия вирусного генома (СВГ)
Все этапы в цитоплазме клетки
Репродукция ДНК (с участием эндорепликазы)
Трансляция на рибосомы
Выход из клетки
Синтез вирусного белка
Эндогенная (вирусная) транскриптаза
Транскрипция
Синтез вирусного белка на рибосомах клетки-хозяина
ДНК -геномные ядерные (вирус герпеса)
Адсорбция на клетки -виропексис
Депротеинизация. Освобождение генома
СВГ
Редупликация ДНК в ядре клетки хозяина
Разобщенный (дизъюнктивный) синтез
Репродукция ДНК в ядре клетки с участием экзорепликаз
Сборка вириона в цитоплазме
Синтез вирусного белка на рибосомах клетки
Экзогенная транскрипция (клеточная)
И-РНК транскрипция
Трансляция на рибосомы
Итак, синтез идёт по схеме: ДНК РНК белок
РНК-геномные минуснитевые (вирус гриппа)
Адсорбция на клетке- виропексис
Депротеинизация. Освобождение генома
СВГ
Редупликация ДНК
И-РНК
Экзогенная транскриптаза
М-РНК
М-РНК + репликативная форма
Синтез вирусного белка на рибосоме
+РНК
Сборка вириона
+РНК выполняет функции И- РНК
Трансляция на рибосомы
Синтез вирусного белка
Итак, синтез идет по схеме РНК РНК белок
РНК геномные + нитевые
Адсорбция
Депротеинизация
СВГ
Функции И-РНК выполняет +РНК нить
+РНК
Трансляция на рибосомы
Синтез вирусной репликазы (эндорепликазы)
Матрица для образования +нитей ДНК
Синтез вирусного белка
Итак, синтез идет по схеме: РНК белок
ДНК онкогенные вирусы
Адсорбция
депротеинизация
Интеграция в геном ДНК клетки хозяина
Редупликация ДНК
И-РНК
Белок вирусный
Итак, синтез идет по схеме: ДНК РНК белок
РНК онкогенные вирусы (обратная транскрипция)
Адсорбция- виропексис
Депротенизация
РНК (одна нить)
В вирионе формируется РНК зависимая ДНК полимераза
Синтез двунитчатой ДНК (провирус)
СВГ
Редупликация ДНК
Сборка вириона созревание на мембранах клетки
Трансляция ДНК (провируса при участии РНК- полимеразы клетки)
Для выявления (индикации) вирусов применяются следующие методы.
Индикация вирусов в культуре клеток осуществляется, прежде всего, по цитопатическому действию (ЦПД) вирусов, сроки и характер которого зависят от свойств вируса, проявляясь дегенеративными изменениями клеток с последующей их гибелью и отслаиванием от стекла (рис. 29).
Полная дегенерация клеток сопровождается значительными изменениями в виде пикноза ядра и цитоплазмы, отслаиванием клеточного монослоя от стекла. Частичная дегенерация культур клеток может протекать по следующим типам:
гроздеобразования (округление, увеличение и слияние клеток с образованием гроздевидных скоплений, типично для аденовирусов),
очаговой деструкции (очаги пораженных клеток на фоне в целом сохранившегося монослоя), характерной для вирусов гриппа;
симпластообразования (слияние клеток с образованием гигантских многоядерных клеток в виде симпластов или синцитиев, характерных для вирусов кори, паротита, парагриппа, респираторно-синцитиального, герпеса, иммунодефицита человека).
Пролиферативный тип ЦПД с трансформацией клеток в злокачественные, обладающие неограниченными потенциями к росту, способны вызывать онкогенные вирусы.
Сроки, в течение которых наступает ЦПД, вариабельны (например, 1-2 дня у полиовирусов, 7-14 суток у аденовирусов).
Рис. 29. Культура клеток почек обезьян (а – незараженная, б – цитопатическое действие вируса) х200
Индикация вирусов с помощью реакции гемадсорбции (РГад). Сущность этой реакции заключается в способности эритроцитов человека или животных адсорбироваться на поверхности клеток, инфицированных рядом вирусов (например, орто и парамиксовирусов и др.) в ранние сроки их репродукции (до развития ЦПД) в результате действия гемагглютининов – гликопротеидов, входящих в состав суперкапсида вируса. Для постановки РГад в культуру клеток добавляют 0,2 мл 0,5%-й взвеси эритроцитов, выдерживают 15-20 мин при температуре 4 0 , 20 0 или 37 0 С в зависимости от свойств вируса, после чего взвесь эритроцитов удаляют и производят учет реакции под малым увеличением микроскопа по скоплению эритроцитов на отдельных клетках или на всем монослое.
Индикация вирусов по цветной пробе. Принцип метода основан на определении кислых продуктов метаболизма, накаливающихся в клетке в процессе ее жизнедеятельности с помощью индикатора фенолового красного, меняющего свой цвет с красного в щелочной среде на оранжево-желтый в кислой среде. При заражении культуры клеток вирусами, вызывающими ЦПД (например, аденовирусы, энтеровирусы и др.), метаболизм клеток подавляется, рН среды не меняется и она остается окрашенной в красный цвет.
Индикация вирусов по внутриклеточным включениям. Репродукция некоторых вирусов (оспы, герпеса, бешенства) приводит к образованию внутриклеточных включений, локализующихся в цитоплазме или в ядре клеток и представляющих собой скопления вируса (или его антигенов). Включения выявляют путем световой микроскопии культур клеток, окрашенных по Романовскому- Гимзе или другими методами, а также с помощью прямого флюорохромирования (например акридиновым оранжевым) с последующей микроскопией препаратов в люминесцентном микроскопе.
Индикация вирусов с помощью прямой РИФ – выявление вирусных антигенов, находящихся в инфицированной клетке культуры ткани, с помощью антител диагностической иммунной сыворотки, специфических иммуноглобулинов или моноклональных антител, меченых флюорохромом, обычно флюоресцеином (рис. 30).
Индикация вирусов с помощью электронно-микроскопического метода (ЭММ) применяется, в основном, в научных исследованиях. Материал для ЭММ концентрируют различными методами (ультрацентрифугирование, хроматография на колонках, адсорбцией с помощью специальных сорбентов или антител – для метода иммунной электронной микроскопии). ЭММ позволяет обнаружить в ядре или цитоплазме клеток отдельные вирионы, а также их скопления. В практических целях ЭММ может быть полезен для индикации и идентификации вирусов с типичной морфологией (оспенные вирусы, ротавирусы, коронавирусы, ВИЧ и т.д.).
Рис. 30. Реакция иммунофлюоресценции (РИФ) – выявление вирус-специфических антигенов. х900
Индикация вирусов по образованию бляшек - очагов разрушенных вирусом монослоя культуры клеток под агаровым покрытием. Количество бляшек отражает инфекционную активность вируса.
Для постановки этой пробы вирусную суспензию в разных разведениях вносят в культуры ткани, находящиеся в плоских сосудах, после чего монослой клеток заливают гелем (слой агара или бентонита с индикатором нейтральным красным). Время бляшкообразования для большинства вирусов, обладающих ЦПД, варьирует от 36 до 48 ч. Бляшки выглядят в виде неокрашенных светлых пятен на розово-красном фоне окрашенного монослоя. В бентонитовом методе монослой клеток молочного цвета, бляшки прозрачные.
Индикация вирусов в куриных эмбрионах. Зараженные РКЭ инкубируют в термостате при 35- 37 0 С в течение 48 -72 ч., после чего производят их вскрытие, амниотическую и аллантоисную жидкость отсасывают шприцем, а оболочки и эмбрион извлекают и помещают в стерильные чашки Петри.
При репродукции некоторых вирусов (натуральной оспы, осповакцины, простого герпеса) на ХАО куриных эмбрионах появляются характерные бляшки - беловатые пятна диаметром 1-2 мм, количество которых соответствует числу инфекционных частиц.
В аллантоисной и амниотической жидкости зараженных эмбрионов ряд вирусов (например, ортомиксовирусы, парамиксовирусы, аденовирусы и т.д.) может быть выявлен с помощью реакция гемагглютинации (РГА). Принцип реакции состоит в способности гемагглютининов -поверхностных вирусных структур гликопротеидной природы этих вирусов склеивать (агглютинировать) эритроциты определенных видов животных, птиц или человека. РГА не относится к иммунологическим реакциям, поскольку в ее основе отсутствует взаимодействие АГ и AT.
Определение титра вирусов можно проводить также на хорионаллантоисной оболочке. Для этого в лунки стерильных полистироловых пластин помещают кусочки скорлупы 11-12-дневного куриного эмбриона с неповрежденной ХАО, добавляют вирусосодержащую жидкость в десятикратных разведениях на буфере, накрывают пластины фольгой и инкубируют при 35-37 0 С в течение 24-72 часов. После этого скорлупу удаляют, добавляют 0,5% взвесь куриных эритроцитов и производят учет реакции по эффекту гемагглютинации, который свидетельствует о репродукции вируса.
Рис. 31. Реакция гемагглютинации для выявления вируса гриппа в хорион-аллантоисной жидкости куриного эмбриона.
Индикация вирусов в организме лабораторных животных находится в зависимости от вируса и вида чувствительного лабораторного животного, будет описана в лабораторной диагностике конкретных вирусных инфекций.
Читайте также: