Методы концентрирования вирусов в воде

Обновлено: 28.03.2024

Для выделения вирусов из воды применяют и седи-ментационные процессы. Установлено [86], что ультрацентрифугирование образцов бытовых сточных вод можно рассматривать как наиболее эффективный метод концентрирования вируса. Он позволяет чаще, чем при использовании других методов, выделять вирусы из инфицированной воды. Возможность выделения вирусов из воды с низким содержанием в ней болезнетворных агентов реальнее, по нашему мнению, при использовании материалов, обладающих адсорбционными свойствами и последующим осаждением их на центрифугах с ускорением до 15 ООО £.[ . ]

Существующие методы концентрирования и изоляции вирусов из проб воды можно условно подразделить на несколько групп, сформированных по принципу используемых процессов. Это методы концентрирования вирусов с преимущественным использованием адсорбции или седиментации; метод выпаривания исследуемого образца жидкости [8]; диализ его [69], а чаще комбинацией различных процессов. Однако из-за недостаточной эффективности методы диализа и выпаривания не нашли широкого применения при проведении санитарно-вирусологических исследований.[ . ]

К упоминавшемуся методу концентрирования вирусов при помощи ватно-марлевых салфеток можно было бы отнести недавно предложенный Г. А. Багдасарьян и В. Ф. Жевержеевой [3] метод пенной флотации. В качестве адсорбента вирусов применяли нативную бычью сыворотку по 0,1 мл на 100 мл испытуемой воды. Одновременно белки сыворотки крови выполняли функцию пенообразователя. При продувании исследуемого образца воды на поверхность жидкости воздухом выносилась пена, состоящая из сыворотки с адсорбированными на ней вирусами. В экспериментально зараженной воде Г. А. Багдасарьян и В. Ф. Жевержеевой удавалось сконцентрировать энтеровирусы в 50 раз. Этот метод перспективен для выделения энтеровирусов из открытых водоемов при условии значительного увеличения первоначального объема пробы.[ . ]

На различных стадиях выделения вируса возникает необходимость сконцентрировать вирусный препарат и удалить из него соли или сахарозу. Для вирусов, которые стабильны при осаждении, с целью концентрирования вируса и удаления низкомолекулярных примесей обычно применяют высокоскоростное центрифугирование, а для удаления или смены солей используют обычный диализ. Для работы с нестабильными вирусами применяют некоторые другие приемы. К препарату можно добавить порошок сухого геля (например, сефадекса) или поместить препарат в мешочек для диализа, обложенный порошком сухого геля, и оставить на холоду в течение нескольких часов. Для концентрировапия больших объемов и удаления солей можно применить ультрафильтрацшо под давлением через мембранные фильтры. Испарение, которое происходит в то время, когда препарат вируса находится в мешочке для диализа и висит в токе воздуха, может вызвать потери вируса вследствие локального подсушивания стенок мешка и концентрирования в таких местах солей, имеющихся в препарате. Для концентрирования очищенных препаратов ВТМ применяются также бактериальные фильтры из пористого стекла с размером пор 1,0—1,7 мкм [1308]. Задержка вируса на фильтре зависит от концентрации соли и обусловлена, по-видимому эффектом высаливания и адсорбцией вируса на поверхности стекла. Далее вирус элюируют с фильтра водой.[ . ]

Постоянный мониторинг проб воды на вирусы пока не доступен большинству местных лабораторий, контролирующих качество водоисточников. Однако существует возможность вирусологического исследования замороженных проб воды, содержащих концентрированный вирус, которые могут длительно храниться при температуре —20°С.[ . ]

Факт существования разнообразных методов концентрирования вирусов из воды указывает на отсутствие единого эффективного дешевого метода, доступного для всех исследований в полевых условиях.[ . ]

Б. Метод накопления в питательных средах. В концентрированную питательную среду вводят 10—60 мл анализируемой пробы [13] или большие объемы среды, приготовленной из исследуемой воды, засевают в культуры клеток [14]. Хотя концентрирование вирусов из воды до заражения в этих случаях не проводится, тем не менее определение вирусов этим методом увеличивается по сравнению с обычным посевом.[ . ]

Центрифугирование при высокой скорости в течение достаточного периода времени приводит к осаждению вируса. Если при этом вирус не денатурирует, то его можно затем перевести в активной форме обратно в раствор. Этот этап выделения очень важен, так как он преследует сразу две цели. Во-первых, при этом происходит концентрирование вируса, а во-вторых, препарат вируса освобождается от низкомолекулярных примесей. Не следует применять при центрифугировании растворы вирусов в низкой концентрации, так как это приводит к значительным потерям (фиг. 3).[ . ]

Эти методы требуют дальнейшей разработки с использованием ряда вирусов. Их, вероятно, можно рассматривать как полезный этап на пути первичного концентрирования вируса из осветленного клеточного экстракта.[ . ]

При отборе проб для вирусологического анализа следует выполнять все требования, установленные для отбора проб для микробиологического анализа. Однако в данном случае могут потребоваться большие объемы пробы. Здесь могут потребоваться методы концентрирования пробы, однако следует помнить, что даже самые новейшие методы концентрирования вирусов в воде все еще находятся в стадии совершенствования.[ . ]

Вирусологическими, бактериологическими и санитарно-химическими исследованиями процесса очистки бытовых сточных вод на лабораторных моделях сооружений подземной фильтрации и в естественных условиях ими установлено, что бытовые стоки хорошо освобождаются от вирусов. В качестве тест-организмов использовались вирусы Коксаки А5, А14 и бактериофаг кишечной палочки № 163. Хотя после искусственного инфицирования сточная жидкость содержала 105ИД50 вируса/мл, в 0,1— 1,0 мл фильтрата сточной жидкости, полученного после сооружений, обнаружить вирусы не всегда удавалось. Поэтому исследователи для концентрирования вирусов использовали ионообменники, в частности ЭДЭ-10П. Однако выделить вирусы из фильтрата позже 20 дня со времени внесения не удавалось. В то же время случаи выделения в упомянутый срок составляли не более сотых долей процента (0,042% и близкие к этому цифры).[ . ]

Тем не менее еще не устранены следующие их недостатки: сложность и трудность изготовления строго калиброванных пор; малая производительность фильтров; необходимость использования больших перепадов давления; очень ограниченная концентрация микроорганизмов в жидкости (не более 100 клеток в 1 л), поскольку в противном случае фильтры быстро забиваются, так как весь задерживаемый материал собирается на верхней поверхности, а не в объеме фильтров, и их регенерация практически невозможна. Для увеличения срока службы фильтров осуществляют предфильтрацию, во время которой пытаются отделить возможно большее количество грубодисперсных примесей, что, хотя и несколько увеличивает срок службы мембран фильтра, усложняет процесс фильтрования. Производительность фильтра составляет 1000 л/ч, и его используют для концентрирования вирусов из значительных объемов воды.[ . ]

Ловушечное устройство состоит из насадки на водопроводный кран, к которой с помощью синтетической трубки прикреплен держатель. В держатель, состоящий из двух свинчивающихся частей с резьбой, вставляется специальная ловушка, внутри которой находится адсорбент, сорбирующий вирусы из воды. Применяемая ловушка является одноразовой, а само устройство может использоваться после стерилизации многократно в соответствии с прилагаемой инструкцией.

5.6.1. Область применения.

Метод используют для концентрирования вирусов из водопроводной воды.

5.6.2. Подготовка ловушечного устройства и фильтрование воды.

Перед использованием в ловушечное устройство вставляют ловушку, после чего его заворачивают в бумагу для стерилизации и стерилизуют сухим жаром при температуре 80 °С 45 мин. Ловушечное устройство с вставленной ловушкой доставляют на место отбора в стерильной упаковке. После трехкратного обжигания водопроводного крана и спуска воды в течение 15 мин. устанавливают необходимую скорость ее протекания - 1 л за ~ 1,5 мин., что составляет 40 - 45 л/ч. Ловушечное устройство извлекают из стерильной упаковки и устанавливают его на кран. Объем пропускаемой воды должен составить 1000 л, что достигается при скорости тока воды 40 - 45 л/ч в течение 24 ч. Спустя 24 ч ловушечное устройство снимают с крана и помещают в стерильный пакет, который доставляют в вирусологическую лабораторию. После извлечения ловушки использованное ловушечное устройство подвергают обеззараживанию в 3% растворе перекиси водорода в течение 12 ч, затем многократно (не менее 10 раз) промывают в проточной воде и высушивают для последующей стерилизации и повторного использования.

5.6.3. Элюция сконцентрированных вирусных частиц.

Ловушку с адсорбентом в стерильных условиях извлекают из ловушечного устройства и помещают в чашку Петри. С помощью ножниц ловушку вскрывают, содержащийся внутри адсорбент вымывают в чашку Петри стерильной дистиллированной водой в объеме 5 - 10 мл. Полученную взвесь адсорбента в дистиллированной воде переносят с помощью пипетки с отпиленным концом в стеклянную колонку. Вытекающую из колонки воду собирают в стерильный пенициллиновый флакон. Элюцию вирусов осуществляют с помощью специального элюента, содержащегося в наборе. Для получения рабочего раствора концентрат разводят стерильной дистиллированной водой в соотношении 1:10 (объем элюента/объем воды). Вирус элюируют путем пропускания 3 мл элюента через адсорбент в колонке. Полученную фракцию (элюат) собирают в стерильный пенициллиновый флакон.

Использованный адсорбент заливают 3% раствором перекиси водорода для обеззараживания на 12 ч.

С целью увеличения эффективности обнаружения вирусов в элюатах проб воды при исследовании методом ПЦР (обнаружение РНК энтеровирусов) и ИФА (обнаружение антигенов энтеровирусов) проводят дополнительное концентрирование элюатов с помощью ультрацентрифугирования либо обрабатывают элюаты полиэтиленгликолем 6000 (ПЭГ 6000).

5.6.3.1. Ультрацентрифугирование элюата.

Ультрацентрифугирование проводят при 40000 - 50000 g в течение 2 ч с использованием угловых или бакет-роторов. В стерильную центрифужную пробирку наливают вируссодержащий элюат, а затем с помощью шприца на дно пробирки наслаивают 10 - 20% раствор сахарозы так, чтобы она занимала 5 - 10% от объема пробирки. После центрифугирования супернатант удаляют. Осадок ресуспендируют в 0,5 мл стерильной дистиллированной воды для ПЦР-исследований или в фосфатно-солевом твинсодержащем буфере (рН 7,2) для ИФА.

5.6.3.2. Обработка элюата полиэтиленгликолем 6000 (ПЭГ 6000).

В элюат добавляют ПЭГ 6000 и хлористый натрий, находящийся непосредственно в пробирках для центрифугирования, до конечных концентраций 10% и 0,5 М соответственно. Смесь тщательно перемешивают до растворения ПЭГ и затем выдерживают в течение 10 - 12 ч при 4 °С. Образовавшуюся суспензию центрифугируют при 10000 g в течение 1 ч или при 6000 g в течение 2 ч. Супернатант удаляют, а осадок ресуспендируют в 0,5 мл стерильной дистиллированной воды для ПЦР-исследований или в фосфатно-солевом твинсодержащем буфере (рН 7) - для ИФА.

1. Разработаны: ГУ НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им. А.Н. Сысина РАМН (А.Е. Недачин, Р.А. Дмитриева, Т.В. Доскина, Д.В. Лаврова, А.Г. Санамян); ГУ Центральный НИИ эпидемиологии Роспотребнадзора (Г.А. Шипулин); Московской медицинской академией им. И.М. Сеченова (М.В. Богданов).

Методические указания подготовлены с учетом замечаний и предложений Главного эксперта Комиссии по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека член-корр. РАМН Л.В. Урываева.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-гигиеническому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 6 октября 2005 г. (протокол № 3).

3. Утверждены и введены в действие Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 2005 г.

4. Введены впервые.

Содержание

УТВЕРЖДАЮ

Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации

Г.Г. Онищенко

18 ноября 2005 г.

Дата введения: с момента утверждения

4.3. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ФИЗИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Санитарно-вирусологический контроль
эффективности обеззараживания питьевых и
сточных вод УФ-облучением

Методические указания
МУК 4.3.2030-05

1.1. Методические указания устанавливают требования к организации и осуществлению санитарно-эпидемиологического надзора обеззараживания питьевых и сточных вод УФ-облучением в отношении вирусного загрязнения.

1.2. Методические указания предназначены для органов и учреждений Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, осуществляющих государственный санитарно-эпидемиологический надзор (контроль) за обеззараживанием питьевых и сточных вод, а также могут использоваться организациями, деятельность которых связана с проектированием и эксплуатацией УФ-установок.

2.1. Вода является важнейшим фактором риска в распространении вирусных инфекций. Более ста различных вирусов, которые с выделениями больных попадают в водные объекты, могут вызывать у человека заболевания разной тяжести - полиомиелит, гепатиты А и Е, серозные менингиты, миокардиты, гастроэнтериты и др. (прилож. 5).

2.2. Значительное количество вспышек кишечных вирусных инфекций, в т.ч. ротавирусных, гепатитов А и Е, обусловлено употреблением недостаточно очищенной или загрязненной воды.

2.3. Концентрация кишечных вирусов в воде колеблется в зависимости от эпидемической обстановки, эффективности очистки и обеззараживания сточных вод и может варьировать от тысяч до десятков тысяч вирионов в литре неочищенной сточной воды и от сотен до тысяч в литре воды поверхностных водоемов в сезон подъема заболеваемости кишечными вирусными инфекциями. В воде водных объектов вирусы могут длительно сохранять свою инфекционную активность (прилож. 5).

2.4. Сроки выживания вирусов в воде зависят от таких факторов, как температура, рН воды, присутствие органических веществ и др. В сильно загрязненных и очень чистых водах длительность сохранения инфекционной активности кишечных вирусов увеличивается. В силу высокой устойчивости в водных объектах, кишечные вирусы могут распространяться на значительные расстояния от источников загрязнения.

2.5. Присутствие вирусов в питьевой воде является чрезвычайно высоким фактором риска, поскольку попадание одной или нескольких вирусных частиц в кишечник человека способно вызвать заболевание.

2.6. При наличии неорганизованных сбросов бытовых сточных вод вирусы обнаруживаются в подземных водоисточниках, в воде которых выживаемость и инфекционная активность энтеровирусов выше по сравнению с поверхностными водоемами.

2.7. Эпидемические вспышки кишечных вирусных инфекций могут наблюдаться в любое время года, однако для большинства инфекций характерна определенная сезонность. Для вирусного гепатита А рост заболеваемости начинается в июле-августе и достигает максимума в октябре-ноябре с последующим снижением в первой половине очередного года. Сезонность вирусного гепатита Е выражена нечетко, вспышки и спорадические случаи могут возникать постоянно в течение года.

2.8. Широкое распространение на всех территориях имеет ротавирусная инфекция. Эпидемический процесс при ротавирусной инфекции характеризуется выраженной зимне-весенней сезонностью, высокой контагиозностью и очаговостью, локальностью домашних очагов, наличием бессимптомного выделения вируса.

2.9. Циркуляция энтеровирусов среди населения имеет выраженную летне-осеннюю сезонность, что коррелирует с их содержанием в сточных водах. Так, максимальное количество штаммов энтеровирусов (32-60 %) определяется в августе, сентябре и октябре, минимальное (до 10 %) - в весенние месяцы (апрель-май).

2.10. Этапы осветления и обесцвечивания воды на водопроводных сооружениях централизованных систем питьевого водоснабжения не обеспечивают полного удаления вирусов. Эффект задержки ДНК-содержащих колифагов составляет 97 - 99 %, а полиовируса - 83 - 93 % в сравнении с концентрацией в исходной воде. В этой связи необходимо обеззараживание питьевой воды, обеспечивающее 100%-ю инактивацию вирусов.

2.11. Частота выделения вирусов из неочищенных сточных вод может составлять 90-100 % от количества исследованных проб при концентрации колифагов до 10 000 БОЕ/100 мл исследуемой воды. После механической очистки частота выделения вирусов может незначительно возрастать за счет дезагрегирования крупных конгломератов и реадсорбции вирусов.

2.12. После этапа биологической очистки на станциях аэрации частота выделения энтеровирусов обычно снижается до 40 %, при этом вирусы удаляются на 75 % и ДНК-содержащие колифаги - на 90 %.

3.1. Для обеззараживания природных и сточных вод используют биологически активную область спектра УФ-облучения с длиной волны от 205 до 315 нм, называемую бактерицидным излучением.

3.2. Максимум вирулицидного действия приходится на область спектра 250-270 нм. Наибольший коэффициент полезного действия в области коротковолнового излучения имеют лампы низкого давления. В лампах этого типа до 95 % электрической энергии преобразуется в излучение с длиной волны 254 нм.

3.3. Механизм обеззараживания УФ-облучения основан на повреждении молекул ДНК и РНК вирусов. Фотохимическое воздействие предполагает разрыв или изменение химических связей органической молекулы в результате поглощения энергии фотона. Имеют место также вторичные процессы, в основе которых лежит образование в воде под действием УФ-облучения свободных радикалов, которые усиливают вирулицидный эффект.

3.4. Степень инактивации микроорганизмов под действием УФ-облучения пропорциональна интенсивности излучения (мВт/см 2 ) и времени облучения (с). Произведение интенсивности излучения и времени называется дозой облучения (мДж/см 2 ) и является мерой вирулицидной энергии.

3.5. Основными факторами, влияющими на эффективность обеззараживания природных и сточных вод УФ-облучением, являются:

- чувствительность различных вирусов к действию УФ-облучения;

- степень поглощения УФ-облучения водной средой;

- уровень взвешенных веществ в обеззараживаемой воде.

3.6. Различные виды вирусов при одинаковых условиях облучения различают по степени чувствительности к УФ-облучению. Дозы облучения, необходимые для инактивации отдельных видов вирусов на 99,0-99,9 %, приведены в прилож. 6.

3.7. Лампы низкого давления имеют электрическую мощность 2 - 200 вт и рабочую температуру 40-150 °С. В лампах этого типа 30 - 95 % электрической энергии преобразуется в биоцидное излучение с длиной волны 254 нм. Срок службы ламп низкого давления составляет до 15 тыс. ч.

3.8. Лампы высокого давления обладают широким спектром излучения, имеют мощность 50-10 000 вт при рабочей температуре 600 - 800 °С. Они характеризуются относительно низким коэффициентом полезного действия в биоцидном диапазоне (5-10 % от потребляемой электрической энергии).

3.9. Проникновение ультрафиолетовых лучей в воду сопровождается их поглощением как самой водой, так и веществами, находящимися в растворенном и взвешенном состоянии. Степень поглощения определяется физико-химическими свойствами обрабатываемой воды, а также толщиной её слоя. Коэффициенты поглощения УФ природными и сточными водами колеблются в пределах от 0,2 до 0,7. Коэффициенты поглощения УФ питьевой водой, полученной из подземных источников водоснабжения, имеют значения 0,05-0,20, а из поверхностных - 0,15 - 0,30. Наибольшее влияние на интенсивность поглощения биоцидной энергии оказывают цветность, мутность воды и содержание в ней железа.

3.10. С целью достижения гигиенической надежности, наименьших эксплуатационных и экономических затрат, обеззараживание питьевых, природных и сточных вод необходимо проводить при соответствии их качества параметрам, представленным в табл. 1. В случае превышения допустимых характеристик воды, представленных в табл. 1, хотя бы по одному из показателей, требуется проведение дополнительных санитарно-вирусологических исследований с целью обеспечения эффективного обеззараживания воды в отношении вирусов и выявления величины рабочей дозы облучения для конкретных условий. Необходимую дозу облучения рекомендуется определять по степени инактивации колифагов как индикаторов вирусного загрязнения.

Таблица 1

Дозы УФ-облучения в зависимости от качества обрабатываемой воды

Вода из подземных источников I класса (по ГОСТ 2161-84), питьевая вода

Мутность, мг/дм 3

Марганец, мг/дм 3

Колифаги, БОЕ/100 мл*

Вода из подземных источников II , III класса (по ГОСТ 2161-84) и поверхностных источников

Мутность, мг/дм 3

Марганец, мг/дм 3

Колифаги, БОЕ/100 мл*

Бытовые и городские сточные воды

Взвешенные вещества, мг/дм 3

Колифаги, БОЕ/100 мл*

* колифаги выделяют без концентрирования.

3.11. Выбор дозы УФ-облучения определяют характером и качеством воды, поступающей для обеззараживания: не менее 16 мДж/см 2 для воды из подземных источников I класса и питьевых вод; не менее 25 мДж/см 2 для воды из подземных источников II, III класса и поверхностных источников; не менее 30 мДж/см 2 для бытовых и городских сточных вод; не менее 40 мДж/см 2 для любого типа вод при неблагоприятной эпидемической ситуации. Под неблагоприятной эпидемической ситуацией подразумевают систематическое обнаружение колифагов в питьевой воде и энтеровирусов в источнике и питьевой воде и (или) наличие водных вспышек энтеровирусных заболеваний.

3.12. При УФ-облучении воды не существует проблемы передозировки. Повышение дозы не приводит к гигиенически значимым неблагоприятным изменениям свойств воды и образованию побочных продуктов.

3.13. В случае ухудшения эпидемической ситуации, возникновения угрозы появления в источнике водоснабжения высокой концентрации энтеровирусов либо другой чрезвычайной ситуации, доза УФ-облучения может быть увеличена за счет снижения объема обрабатываемой воды, проходящей через единицу времени через УФ-оборудование путем включения в работу резервного оборудования или снижения общего расхода воды. Доза УФ-облучения должна находиться в прямой зависимости от расхода обрабатываемой воды.

3.14. Совместное применение УФ-облучения и хлора при подготовке питьевой воды повышает надежность обеззараживания в отношении вирусов.

4.1. Контроль эффективности УФ-облучения для обеззараживания воды осуществляют при ее использовании населением в питьевых, хозяйственно-бытовых и рекреационных целях, сбросе очищенной сточной воды в поверхностные водоемы. При этом необходимо учитывать, что содержание и частота выделения кишечных вирусов из водных объектов и питьевой воды может значительно различаться, что определяется:

- сезонностью распространения различных групп вирусов в течение года;

- изменением или нарушением технологии очистки и обеззараживания питьевых и сточных вод;

- авариями на водопроводных или канализационных очистных станциях;

- возникновением вспышки или эпидемии вирусных инфекций водного происхождения на данной территории.

4.2. Индикатором вирусного загрязнения воды являются колифаги. Несоответствие характеристик обеззараженной воды допустимым уровням колифагов свидетельствует о возможном присутствии энтеровирусов в данной пробе. В этом случае организуют повторный отбор и анализ проб до и после обеззараживания УФ-облучением. При наличии колифагов в трехкратно последовательно отобранных пробах после УФ-облучения воду анализируют на наличие энтеровирусов.

4.3. Объемы воды для определения эффективности обеззараживания должны соответствовать критериям эпидемиологической безопасности по вирусологическим показателям (прилож. 2).

4.4. В системе государственного санитарно-эпидемиологического надзора используют следующие виды санитарно-вирусологического контроля: производственный, плановый и внеплановый.

4.4.1. Производственный санитарно-вирусологический контроль выполняют организации, в ведении которых находятся очистные и водопроводные сооружения. При отсутствии в организации производственной лаборатории, исследования осуществляют на договорной основе лабораториями, аккредитованными в установленном законодательством Российской Федерации порядке.

Программа производственного лабораторного контроля за эффективностью обеззараживания воды УФ-облучением должна быть согласована с территориальным управлением Роспотребнадзора. При разработке программы следует использовать рекомендации, представленные в прилож. 4.

Производственный санитарно-вирусологический контроль эффективности УФ-установок проводят:

- на этапе пуско-наладочных работ при внедрении на станциях очистки питьевых и сточных вод обеззараживания с использованием УФ-установок - на наличие и уровень колифагов в воде до и после установки;

- в процессе эксплуатации УФ-установок в соответствии с рабочей программой (рекомендуемая частота отбора проб в соответствии с прилож. 4) - на наличие колифагов;

- при превышении норматива мутности для питьевой воды - на наличие колифагов;

- при превышении норматива колифагов в трех последовательно отобранных пробах воды - на наличие энтеровирусов.

4.4.2. Плановый санитарно-вирусологический контроль осуществляют органы и учреждения Роспотребнадзора в соответствии с разработанной рабочей программой. Периодичность контроля определяют задачами региональных планов и корректируют в зависимости от эпидемической ситуации на территории.

4.4.3. Внеплановый санитарно-вирусологический контроль проводят органы и учреждения Роспотребнадзора в случае внезапных или непредвиденных изменений санитарно-эпидемической ситуации на контролируемой территории: аварий или нарушений в системах водоснабжения и канализации, в результате которых может произойти массивное микробное загрязнение поверхностных и подземных водоисточников, а также питьевой воды; по санитарно-эпидемиологическим показаниям при вспышках и подъеме заболеваемости кишечными вирусными инфекциями, уровень которых превышает средние сезонные показатели; в период эпидемического риска. Кратность и точки отбора проб, объемы исследуемой воды определяют эпидемиолог и врач по коммунальной гигиене.

5.1. Санитарно-вирусологическую оценку воды водных объектов проводят по косвенным показателям вирусного загрязнения - ДНК- и РНК-содержащим колифагам, РНК или ДНК вирусов, определяемых методом ОТ-ПЦР, а также прямому обнаружению возбудителей кишечных вирусных инфекций культуральным методом.

5.2. Современные стандартные методы индикации колифагов позволяют выделять их:

- из сточных вод при посеве 1 мл из исследуемой пробы или последовательных десятикратных разведений;

- из поверхностных и питьевых вод при посеве от 10 до 100 мл в соответствии с нормативно-методическими документами.

5.3. Для прямого обнаружения энтеровирусов в воде, в которой они могут содержаться в незначительных количествах, требуется применение методов концентрирования вирусов из больших объемов воды в связи с тем, что нижний предел чувствительности используемых культур тканей составляет не менее 1 инфекционной вирусной частицы в 1 мл воды.

5.4. Отбор проб воды производят в специально предназначенную для этих целей одноразовую посуду или стерильные емкости многократного применения, изготовленные из материалов, не влияющих на жизнедеятельность вирусов с плотно закрывающимися пробками (силиконовыми, резиновыми или из других материалов) и защитным колпачком (из алюминиевой фольги или плотной бумаги). Емкость открывают непосредственно перед отбором, удаляя пробку вместе со стерильным колпачком. Во время отбора пробка и края емкости не должны чего-либо касаться.

5.5. При исследовании воды из распределительных сетей отбор проб из крана производят после его предварительной стерилизации обжиганием и последующего спуска воды не менее 10 мин при полностью открытом кране. При отборе пробы напор воды может быть уменьшен. Пробу отбирают непосредственно из крана без резиновых шлангов, водораспределительных сеток и других насадок. Если через кран вода течет постоянно, отбор проб производят без предварительного обжига, не изменяя напора воды и существующей конструкции (при наличии силиконовых или резиновых шлангов). После наполнения емкость закрывают стерильной пробкой и колпачком.

5.6. Отобранную пробу маркируют и сопровождают актом отбора проб воды с указанием места, даты, времени забора и другой необходимой информации.

К исследованию проб воды необходимо приступить сразу же после доставки их в лабораторию.

При исследовании воды на наличие вирусов проводят их концентрирование из соответствующих объемов, а на наличие колифагов - прямое определение сразу после доставки проб в лабораторию.

5.9. Пробы воды до УФ-обеззараживания считают положительными при наличии:

- РНК энтеровирусов, обнаруженной методами ОТ-ПЦР и ДНК аденовирусов - методом ПЦР в лизатах культур тканей через двое суток после заражения;

- ЦПД на культурах тканей в одном из трех последовательных пассажей.

4. Водный кодекс Российской Федерации от 16 ноября 1995 г. № 167-ФЗ.

20. Инструкция по использованию полимеразной цепной реакции для выявления энтеровирусного загрязнения воды. Минск, 2001.

21.Методики по санитарно-вирусологическому контролю питьевой воды и оценке её эпидемической безопасности от 18 мая 1999 г. № 136-9811, Минск.

23. Рекомендации по надзору за вирусом полиомиелита в окружающей среде. Женева, 2003.

УФ-облучение - ультрафиолетовое облучение;

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота;

РНК - рибонуклеиновая кислота;

мДж/см 2 - миллиджоуль на см 2 ;

ПЦР - полимеразная цепная реакция;

ОТ-ПЦР - полимеразная цепная реакция с этапом обратной транскрипции;

ФМНЦ - фильтрующая мембрана из нитроцеллюлозы;

ММК - мембрана микропористая капроновая;

ВГА - вирус гепатита А;

БОЕ - бляшкообразующая единица;

БПК - биохимическое потребление кислорода;

ХПК - химическое потребление кислорода;

ЦПД - цитопатическое действие.

Метод используют для концентрирования вирусов из питьевой воды различных видов (водопроводной, бутылированной, из родников и др.), воды подземных водоисточников, воды из бассейнов и других чистых вод. Объем исследуемой воды составляет 10 л. При необходимости объем воды может быть увеличен. Время концентрирования данным методом из 10 л составляет в среднем 1,5 - 2,5 ч. Для концентрирования используют фильтрующие мембраны из нитроцеллюлозы типа ФМНЦ, ФМПА и мембраны микропористые капроновые (ММК) или другие, равные по эффективности.

5.1.2. Подготовка мембранных фильтров.

Фильтрующие мембраны должны быть подготовлены к анализу в соответствии с указаниями организации-изготовителя (листовка-аннотация, сопровождающая фильтры). Перед исследованием фильтрующие мембраны смачивают стерильной водопроводной водой в стерильной емкости.

5.1.3. Подготовка фильтровального аппарата.

Для фильтрования исследуемой воды используют установку, например, типа АФ-142 "К" или другую с аналогичными характеристиками, которая состоит из фильтродержателя, емкости на 10 и более литров для исследуемой воды и ее последующей фильтрации и устройства, нагнетающего жидкость.

Перед фильтрацией фильтродержатель протирают ватным тампоном, смоченным спиртом ректификованным 70%, и обжигают. После охлаждения на нижнюю часть фильтродержателя кладут стерильным пинцетом влажный мембранный фильтр, предварительно смоченный в стерильной водопроводной воде. Затем фильтр прижимают верхней частью фильтродержателя и закрепляют зажимами, равномерно завинчивая последние со всех сторон.

5.1.4. Фильтрование воды.

Исследуемый объем воды наливают в напорную емкость, крышку тщательно закрепляют зажимами, включают подачу давления (1,5 - 2,0 бара), после чего воду направляют в фильтродержатель со скоростью около 100 мл/мин. и фильтруют через мембрану. При использовании для концентрирования мембран, например, типа ФМНЦ, в исследуемую воду добавляют хлористый магний до конечной концентрации 0,05 М или хлористый алюминий до конечной концентрации 0,0005 М для увеличения сорбционной способности мембраны. При использовании фильтров ММК хлористый магний не добавляют.

5.1.5. Элюция сконцентрированных вирусных частиц.

Элюцию вирусов с мембран проводят 20 мл элюента с соблюдением всех правил эпидемической безопасности (перчатки, маска, спецодежда и т.д.) в ламинарном боксе. После окончания фильтрования откручивают зажимы и снимают верхнюю часть фильтродержателя. Мембрану осторожно приподнимают за край пинцетом, стерилизованным путем обжигания и переносят в стерильную емкость, соответствующую диаметру мембраны (может быть использована тарелка, чашка Петри диаметром не менее 142 мм и др.). Затем на поверхность мембраны наносят 10 мл элюента (3% бифэкстракт на трисбуфере с рН 9,1 - 9,5) и стерильной пипеткой с целым концом проводят механический смыв (соскабливанием и струей) вируса с поверхности мембраны в течение нескольких минут. К концу манипуляции мембрана должна приобрести первоначальный вид. Полученный элюат переносят в стерильный флакон. Затем на эту же мембрану наносят второй объем (10 мл) того же элюента и проводят вторичное смывание вирусов струей с обеих сторон мембраны, и вторую часть элюата помещают в тот же флакон, что и первую. Затем рН полученного элюата доводят до 7,0 - 7,5 1 N раствором соляной кислоты.

5.1.6. Обработка проб.

Для удаления бактериальной микрофлоры элюат подвергают обработке одним из двух методов: обработкой хлороформом или фильтрацией через стерилизующие мембраны.

5.1.6.1. При использовании хлороформа его добавляют в элюат (1 мл на 10 мл элюата), интенсивно встряхивают 10 мин. и центрифугируют 10 мин. при 2000 об./мин. для разделения фаз. Водную фазу (верхнюю) аккуратно отбирают пипеткой в стерильный флакон, добавляют 100 МЕ/мл пенициллина и 10,0 мг/мл стрептомицина.

5.1.6.2. При использовании стерилизующих насадок с фильтрами 0,22 мкм элюат пробы переносят в стерильный шприц объемом 5 - 20 мл с установленной фильтрующей насадкой и поршнем шприца продавливают в стерильный флакон. Этот способ позволяет избежать использования антибиотиков, токсичного хлороформа и связанных с этим мер безопасности, не требует длительного встряхивания и центрифугирования.

5.1.7. Хранение проб.

Стерильные элюаты хранят до испытания при 4 °С не более 24 ч. При температуре -20 °С их можно хранить в течение 1 года. При необходимости многократного исследования элюат делят на несколько порций, чтобы избежать повторного замораживания.

Концентрирование вирусов из водных объектов

С введением в действие СанПин 2.1.4.559-96 "Вода питьевая", а также СанПин 2.1.5.980-2000 "Гигиенические требования к охране поверхностных вод" разработана новая нормативная база, предусматривающая контроль качества воды различного вида водопользования не только по показателям бактериального, но и вирусного загрязнения, в частности по колифагам, а также энтеровирусам.

В связи с низкой концентрацией вирусов в воде, важным первичным этапом вирусологического исследования является их концентрирование из больших объемов воды (10-100 л и более до 10 - 50 мл).

Минимальный размер патогенных вирусов составляет 0,03 микрометра, что значительно меньше размера пор микрофильтрационной мембраны. Поэтому для их выделения можно использовать низкопроизводительные мембраны (нанофильтры), либо микрофильтрационные мембраны обладающие повышенной сорбцией вирусов.

Схема установки с использованием компрессора и напорной емкости

Схема установки с использованием компрессора и напорной емкости

Установка для вирусологического анализа состоит из мембранного модуля МФМ-0142 с мембраной ММПА+, напорной емкости на 10 л ( или 20л) и компрессора. Исследуемую воду заливают в напорную емкость, крышку которой тщательно закрывают и включают компрессор. С помощью компрессора в напорной емкости создается давление 1,0-1,5 Bar. В процессе фильтрации фильтрат поступает на слив, а концентрат вирусов остается на мембране модуля.

Схема установки концентрирования вирусов с перистальтическим насосом

Схема установки концентрирования вирусов с перистальтическим насосом

При фильтрации значительных объемов исследуемой воды предлагается разработанная схема с перистальтическим насосом. Исследуемая вода из расходной емкости подается перистальтическим насосом на мембранный модуль МФМ-0142. Фильтрат после модуля поступает в сборник фильтрата, а концентрат остается на мембране. При фильтрации сильнозагрязненной воды установка комплектуется предфильтром в виде капсульного фильтра (миникапсула МКМ).

Стадия элюции вирусов

Стадия элюции вирусов

Используемый ранее большинством вирусологов способ элюции предусматривал изъятие мембраны из модуля и механический смыв вирусов с мембраны струей элюента из пипетки, что представляло определенную опасность инфицирования работающего персонала. Исключение риска инфицирования возможно было только при выполнении данной процедуры в условиях ламинарного бокса, что сопряжено с существенными сложностями и значительными финансовыми затратами.

В разработанном специалистами НПП "Технофильтр" способе элюция вирусов осуществляется без извлечения мембраны, т.е. в режиме закрытого модуля.

Элюция вирусов с мембраны осуществляется без разборки модуля (в закрытом режиме), путем продавливания элюента в три приема по 20 мл двумя одноразовыми шприцами. Шприцы, один из которых содержит элюент, присоединяется к стыковочным устройствам на линии воды и на линии выхода фильтрата. Все соединительные шланги оснащены быстросъемными соединениями. В каждый прием элюент продавливается через мембрану с помощью этих шприцов не менее 8÷10 раз.

Рекомендовано НИИ ЭЧ и ГОС им. А.Н. Сысина

Преимущества

Основные преимущества мембранного модуля МФМ-0142

Основными достоинствами фильтрующего модуля МФМ-0142 (ТУ 3614-005-32915592-2005) являются:

  • возможность совмещения процессов концентрирования и элюции в одном аппарате,
  • высокая эффективность концентрирования и элюции, достигаемая за счет оригинальной конструкции, обеспечивающей интенсивный массоперенос жидкости над мембраной и через неё,
  • возможность осуществления щадящих условий концентрирования и десорбции вирусов (фильтрация проводится при средах близких к нейтральным без использования каких-либо реагентов),
  • снижение количества элюанта до 60мл,
  • обеспечение безопасности обслуживающего персонала (элюция проводится с помощью шприцев без разборки аппарата),
  • простота и удобство при эксплуатации.

Особенности и преимущества мембран ММПА+

Высокая эффективность мембран ММПА+-0,2 была подтверждена при многочисленных испытаниях (фильтрация речной воды, воды из подземных источников, а так же сточных вод). В 2007 году в Нижегородском НИИ эпидемиологии и микробиологии им. И.Н. Блохиной мембраны ММПА+-0,2 были использованы в процессе концентрирования вирусов гепатита А, одного из трудно культивируемых вирусов. Были использованы искусственно приготовленные суспензии ВГА в дистиллированной воде взятых в разведении от 1·10-4 до 1·10-8 ПУЛ.

Установлено, что использование мембран ММПА+-0,2 обеспечивает повышение чувствительности метода контролирования ВГА на 2 порядка по сравнению с ранее известными методами. При этом достигается надежное удержание вируса даже при концентрациях ниже пороговой чувствительности используемого метода. Было показано, что концентрирование вирусов на мембране ММПА+-0,2 можно проводить при нейтральном рН в отличие от нитроцеллюлозных мембран, для которых достаточный уровень выделения достигается при рН ниже 4,0. Поскольку элюирование собранных вирусов не всегда удобно проводить сразу же после концентрирования важно, чтобы условия проведения процесса и сам материал фильтрата не оказывали влияния на жизнеспособность вируса (экстремальные значения рН могут инактивировать некоторые вирусы). Этим требованиям в наибольшей мере соответствует мембрана ММПА+.

Сравнительные испытания мембран ММПА+-0,2 дают основания для заключения об их превосходстве над остальными по эффективности задержания производительности и универсальности.

Читайте также: