Методы лабораторной диагностики вирусных болезней животных и птиц
Обновлено: 24.04.2024
Издание второе, исправленное
Министерством сельского хозяйства РФ в качестве учебного пособия для студентов вузов, обучающихся по направлению подготовки (специальности) "Ветеринария"
УМО вузов РФ по образованию в области зоотехниии и ветеринарии в качестве учебного пособия для студентов вузов, обучающихся по направлению подготовки (специальности) "Ветеринария" (квалификация (степень) "Ветеринарный врач")
Учебное издание содержит действующие методические указания, наставления и инструкции по лабораторной диагностике вирусных болезней животных, утвержденные Министерством сельского хозяйства СССР, РФ и Россельхознадзором РФ. Документы систематизированы по видам животных, в большинстве прошли многолетнюю апробацию в Алтайской краевой ветеринарной лаборатории и включены в "Перечень нормативной документации, разрешенной для использования в государственных ветеринарных лабораториях при диагностике болезней животных, рыб, пчел, а также контроля безопасности сырья животного и растительного происхождения" (по состоянию на июль 2011 г.). Приводятся предметный указатель и библиографический список.
Предназначено для студентов, обучающихся по специальности "Ветеринария" и направлению "Ветеринарно-санитарная экспертиза", ветеринарных врачей и лаборантов ветеринарных лабораторий.
Рецензенты: И.И.Гуславский - доктор ветеринарных наук, профессор кафедры микробиологии, эпизоотологии, паразитологии и ВСЭ Алтайского государственного аграрного университета; В.И.Плешакова - доктор ветеринарных наук, профессор, зав. кафедрой ветеринарной микробиологии, вирусологии и иммунологии Омского государственного аграрного университета им.П.А.Столыпина; В.А.Синицын - доктор ветеринарных наук, зав. отделом ФГБУ "Новосибирская межрегиональная ветеринарная лаборатория".
КРАТКИЙ СЛОВАРЬ ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ВЕТЕРИНАРНЫХ ТЕРМИНОВ
Антигены (анти + греч. genes - порождающий) - чужеродные для организма высокомолекулярные органические вещества коллоидной структуры (белки, белково-липидные и белково-полисахаридные комплексы), способные при поступлении (введении парентерально) вызывать синтез особых глобулинов-антител и вступать в специфическое взаимодействие с ними.
Антитела (анти. + тело) - противотела - специфические белки (иммуноглобулины), образующиеся в организме под воздействием антигенов. Они накапливаются в сыворотке крови и тканях, вступают в специфическую связь с соответствующими антигенами и разрушают или обезвреживают их.
Биологическая проба (биопроба) - один из методов диагностики инфекционных болезней с помощью заражения патологическим материалом подопытных животных (куриных эмбрионов, культур клеток) и их исследования.
Вирион - полноценная внеклеточная вирусная частица.
Вирусовыделение - выделение возбудителей инфекции из организма больного животного или вирусоносителя.
Вирусоносительство - наличие возбудителя инфекции в определенных органах и тканях клинически здорового животного, не сопровождающееся иммунологической перестройкой организма.
Вирусы (лат. virus - яд) - облигатные внутриклеточные паразиты, отличающиеся от растительных и животных организмов малыми размерами, отсутствием клеточного строения и автономного метаболизма, наличием только одного типа нуклеиновой кислоты и дезъюнктивным способом размножения.
В. безоболочечные - вирусы, в структуре которых отсутствует липопротеидная оболочка.
В. оболочечные - вирусы, в структуре которых присутствует липопротеидная оболочка.
Вирусоскопия (вирусы + skopeo - смотрю, наблюдаю) - метод микроскопического изучения морфологии вирусов.
Гемагглютинация (греч. haima - кровь + agglutinatio - склеивание) - склеивание и выпадение в осадок эритроцитов под воздействием вирусов, бактерий, токсинов и др., способных адсорбироваться на поверхности эритроцитов, а также гемагглютининов.
Гемадсорбция (греч. haima - кровь + adsorbtio - поверхностное поглощение) - способность культур клеток, зараженных вирусами, адсорбировать эритроциты различных животных, что объясняется включением в плазматическую мембрану синтезирующихся вирусных белков.
Диагностика (греч. diagnostikos - способный распознавать) - раздел клинической ветеринарии о методах исследования животных для распознавания их болезней и состояния организма с целью назначения необходимого лечения и профилактических мероприятий.
Диагностический набор - набор стандартных препаратов, используемых для постановки диагноза (антиген, специфическая и контрольная сыворотки и др.).
ДНК-зондов метод - метод генодиагностики, основанный на способности меченой одноцепочечной молекулы ДНК взаимодействовать с комплементарной ей молекулой нуклеиновой кислоты определенного вируса с образованием двухцепочечной структуры.
ДНК-содержащие вирусы - вирусы, имеющие один тип нуклеиновой кислоты - ДНК, у большинства она представлена двухцепочечной структурой, у некоторых - одной цепью.
Идентификация (лат. identifico - отождествляю) - признание тождественности, опознание-определение видовой (типовой) принадлежности микроорганизма на основании всестороннего изучения его свойств.
Иммуноферментный анализ - группа методов, позволяющих выявлять комплекс антиген - антитело с помощью субстрата, который расщепляется ферментом (пероксидазой, щелочной фосфатазой и др.) с появлением окрашивания.
Инактивация вирусов (лат. inactivus - неактивный) - уничтожение инфекционной активности вирусов путем повреждения генома физическим или химическим воздействием.
Индикация возбудителя инфекции (лат. indicatio - указание) - выявление и идентификация патогенных микроорганизмов в различных объектах.
Инокуляция возбудителя (лат. inoculatio - прививка) - введение возбудителя путем инъекции (искусственное заражение или внесение его в организм животного членистоногими переносчиками при укусах).
Консервирование вирусов (лат. conservare - сохранять) - общее название методов воздействия физическими и (или) химическими факторами на какие-либо объекты с целью длительного сохранения в них вирусов.
Контаминация (лат. contaminatio - смешение) - обсеменение поверхности тела животного, предметов ухода, почвы, воды, кормов, биопрепаратов и других объектов патогенными микроорганизмами.
Культивирование вирусов - выращивание вирусов в искусственных условиях.
Культуры клеток (клеточные культуры) - клетки многоклеточного организма, живущие вне его в искусственно созданных условиях среды.
Куриный эмбрион - оплодотворенное куриное яйцо, выдержанное в инкубаторе.
Лабораторные животные - животные, используемые в лабораториях при проведении исследований (мыши, крысы, кролики, морские свинки, хомяки, голуби и др.).
Лиофилизация (греч. lyo - растворяю + phileo - люблю) - высушивание предварительно замороженного материала в глубоком вакууме.
Моноклональные антитела - строго специфические антитела, способные выявить минимальные различия в химическом составе и пространственной конфигурации молекул, являются продуктом отдельных клонов антителопродуцирующих клеток.
Парные сыворотки - сыворотки, взятые в самом начале заболевания и 2. 3 недели спустя. Повышение титра антител в 4 раза и более считается основой положительной реакции.
Пассаж (фр. passage - переход) - последовательное заражение восприимчивых объектов (животные, куриные эмбрионы, культуры клеток) микроорганизмами.
Полимеразная цепная реакция (от англ. Polymerase Chain Reaction, ПЦР) - метод генодиагностики, основанный на многократном увеличении копий строго определенных фрагментов молекулы ДНК вируса при помощи фермента термостабильной ДНК-полимеразы.
Реакция гемагглютинации (РГА) - метод обнаружения и идентификации вирусов, основанный на способности многих вирусов, обладающих тканевым тропизмом, агглютинировать эритроциты определенных видов животных.
Реакция иммунофлуоресценции (РИФ) (лат. fluorescens - светящийся) - серологическая реакция, основанная на взаимодействии антиген - антитело, при этом один из компонентов, участвующий в реакции, связан с флуоресцирующим красителем.
Реакция нейтрализации (РН) - метод идентификации вируса, основанный на феномене потери им инфекционности в результате взаимодействия со специфическими антителами.
Реакция связывания комплемента (РСК) - метод серологического исследования, основанный на способности образующегося комплекса антиген - антитело связывать комплемент, что выявляется по отсутствию гемолиза при добавлении гемолизина и эритроцитов.
Реакция торможения гемагглютинации (РТГА) - метод идентификации вируса или выявления противовирусных антител в сыворотке крови, основанный на феномене отсутствия агглютинации эритроцитов вирусом, в присутствии специфических к нему антител.
РНК-содержащие вирусы - вирусы, имеющие один тип нуклеиновой кислоты - РНК, у большинства она представлена одной цепью, у некоторых - двухцепочечной структурой.
Серовариант - самостоятельная группа внутри определенного вида и серогруппы (серотипа) микроорганизмов, обусловленная наличием антигенов, отличающихся от антигенов других микроорганизмов этого вида и серогруппы (серотипа), что выявляется с помощью серологических реакций.
Серогруппа (серотип) - самостоятельная группа внутри определенного вида микроорганизмов, обусловленная наличием антигенов, отличающихся от антигенов других микроорганизмов этого вида, что выявляется с помощью серологических реакций.
Серологические реакции - реакции, широко используемые при постановке диагноза инфекционных болезней, методы обнаружения антител и антигенов в крови и других тканях.
Сыворотка крови (лат. serum - сыворотка + sanguis - кровь) - составная часть крови, представляющая собой плазму, из которой удалены форменные элементы и фибрин в процессе свертывания крови.
Тельца включения - своеобразные морфологические образования, обнаруживаемые в цитоплазме или ядрах клеток определенных тканей при некоторых вирусных инфекциях и состоящие из скопления вирионов и вирусных белков.
Термолабильность (греч. thermos - теплый + лат. labilis - нестойкий) - неустойчивый к тепловому воздействию, изменяющийся при нагревании.
Термостабильность (греч. thermos - теплый + лат. stabilis - неизменный) - сохраняющий свои свойства при нагревании.
Титр вируса - концентрация инфекционных единиц вируса в определенном объеме материала.
Цитопатогенное действие вирусов (ЦПД, цитопатический эффект) - специфическая морфологическая деструкция (разрушение) и функциональная патология зараженных вирусами клеток в культурах.
Штамм (нем. stamm - род, корень) - культура микроорганизмов одного вида с одинаковыми морфологическими и биологическими свойствами.
Элементарные тельца - см. Вирион (2, 3).
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
1. Лабораторные исследования в ветеринарии. Вирусные, риккетсиозные и паразитарные болезни: справочник/под ред. Б.И.Антонова. - М.: Агропромиздат, 1987. - 240 с.
2. Бакулов, И.А. Эпизоотологический словарь-справочник/И.А.Бакулов, Г.Г.Юрков, В.А.Ведерников [и др.]. - М.: Россельхозиздат, 1986.
3. Нымм, Э.М. Словарь ветеринарных микробиологических и вирусологических терминов/Э.М.Нымм, К.А.Петерсон, Э.А.Аавер [и др.]. - М.: Росагропромиздат, 1989.
Диагностика играет одну из решающих ролей в системе мероприятий по борьбе с болезнями животных вирусной этиологии.
Быстрый и правильно поставленный диагноз обеспечивает успех в ликвидации вспышки болезни, так как позволяет четко выяснить эпизоотическую ситуацию и своевременно принять целенаправленные меры по оздоровлению поголовья животных с наименьшими потерями.
Для постановки диагноза требуются сбор, изучение, анализ и сопоставление целого комплекса различных данных. Поэтому диагноз — это результат кропотливой и вдумчивой работы.
На первом этапе диагностики используют данные, которые можно быстро собрать непосредственно в хозяйстве. К таковым относятся:
эпизоотологические данные, включающие сведения об охвате болезнью данного поголовья животных, скорости и территориальном распространении болезни, видах заболевших животных, динамике выявления больных и т. д.;
клинические признаки болезни. Они включают определение (по сравнению с нормой) температуры тела, частоты и формы дыхания, частоты пульса, нарушения аппетита, поведения, состояния кожных покровов и слизистых оболочек, функционирования органов пищеварения, выделения и т. д.;
патологоанатомические изменения, которые обычно устанавливают при вскрытии павших или вынужденно убитых животных. Различают макроскопические изменения (по сравнению с нормой) формы, размера, цвета, консистенции, появление узелков, кровоизлияний, везикул и другие образования, не встречающиеся в норме, а также микроскопические изменения в клетках и тканях, обнаруживаемые гистологическими методами.
Чаще всего на основании этих данных можно поставить предварительный диагноз, так как многие вирусные болезни имеют сходные эпизоотологические данные, клинические признаки и патологоанатомические изменения (например, парагрипп-3, вирусная диарея, инфекционный ринотрахеит, респираторно-синцитиальная и аденовирусная инфекции крупного рогатого скота или болезни Ньюкасла и грипп птиц и др.).
Кроме того, часто болезнь может быть вызвана не одним, а двумя и более этиологическими агентами (например, вирусом и бактериями или двумя и более вирусами). Даже такое заболевание, как ящур крупного рогатого скота, можно довольно уверенно диагностировать по эпизоотологическим, клиническим и патологоанатомическим данным, однако требуются лабораторные исследования для определения типа и варианта возбудителя.
Несмотря на ориентировочный характер предварительного диагноза, он играет весьма важную роль, так как ориентирует ветеринарных специалистов на проведение соответствующих мероприятий.
Окончательный диагноз на вирусную болезнь в большинстве случаев может быть поставлен только с учетом результатов лабораторных исследований. В лабораторной диагностике вирусных болезней точность диагноза прежде всего зависит от правильности взятия материала (пробы) от больных и павших животных, его транспортировки, качества приготовления и техники исследования вирусного материала.
Материал для исследования следует брать как можно быстрее после проявления четких признаков болезни или не позднее 1—2 ч после клинической смерти или убоя (позже начинается бактериальное обсеменение, и по мере продолжения инфекционного процесса количество вируса может уменьшаться в результате воздействия защитных механизмов организма).
При взятии материала для выделения вируса следует исходить из патогенеза предполагаемой инфекции (входные ворота, пути распространения вируса в организме, места его размножения, клинические признаки и пути выделения). В лабораторию направляют тот материал, который с наибольшей вероятностью может содержать возбудителей болезни. При этом необходимо соблюдать следующие общие правила:
материал должен быть взят строго асептически;
материал должен быть немедленно законсервирован (помещен в термос с охлаждающей смесью или добавлением 50%-ного стерильного глицерина), чтобы предотвратить разрушение вирусов;
материал удобнее брать в стерильные пробирки с резиновой пробкой или во флакончики из под антибиотиков. Для исследования вполне достаточно 5—10 г материала;
на пробирках должна быть не смываемая этикетка; материал направляют с нарочным и сопроводительным письмом, в котором указывают хозяйство, вид больных животных, предварительный диагноз, вид и количество патологического материала, на что следует провести исследование, дату и фамилию врача.
В зависимости от симптомов болезни, а значит, и локализации возбудителя от больного животного может быть взят следующий материал:
смывы со слизистой оболочки носа, глаз, с задней стенки глотки, прямой кишки и клоаки у птиц. Берут их стерильными ватными тампонами, которые погружают в пробирки или флаконы, содержащие 3—5 мл соответствующей жидкости (раствор Хенкса, среды Игла, 199 и др.) с антибиотиками;
содержимое везикул, пустул, стенки везикул, корочки на коже; ^ фекальные массы непосредственно из прямой кишки;
кровь для выделения вируса и кровь для получения парных сывороток крови для обнаружения и определения титра антител. Для этой цели кровь берут дважды у одного и того же животного — в начале болезни и через 2—3 нед, т. е. в начале и в конце болезни.
От трупов патологический материал должен быть взят не позднее 1—2 ч после клинической смерти или убоя животного. В качестве патологического материала берут кусочки органов, которые:
имеют видимые отклонения от нормы;
могут быть поражены и содержать вирус на основании клинической картины болезни;
наиболее часто содержат вирус: селезенка, печень, легкие, почки, головной мозг, лимфатические узлы.
В лаборатории часть материала берут для исследования, оставшуюся часть хранят в холодильнике на случай дополнительных исследований. Затем составляют план исследования присланного материала, который включает следующие задачи: обнаружение (индикация) вируса в материале; выделение (изоляция) вируса из материала; идентификация выделенного вируса;
при необходимости требуется доказать этиологическую роль выделенного вируса;
Лабораторная диагностика – это система мер по обнаружению, индикации вируса. В нее входят: получение посланного патологического материла, исследование патологического материала методом быстрой диагностики, исследование длительными методами (ретроспективная диагностика, исследование парных сывороток в серореакциях).
Лабораторные исследования. I.Индикация вируса в патологическом материале. 1.Обнаружение – световая микроскопия крупных вирусов (Poxviridae), электронная микроскопия. 2.Обнаружение телец-включений. (тельца Бабеша-Шенегри при бешенстве) 3.Обнаружение вирусных антигенов: серологические реакции. 4.Обнаружение вирусных НК (ДНК-зонды и ПЦР – полимеразно-цепная реакция). 5.Обнаружение активной формы вируса путем биопробы (лабораторные животные, куриные эмбрионы, культура клеток). 6.Обнаружение гемаглютининов у гемаглютинирующих вирусов (в настоящее время практически не используется по причине наличия более точных методов). II.Изоляция (выделение) вируса из патологического материала. Проводится не менее трех слепых пассажей, делается биопроба. А)Лабораторные животные (клиника, гибель, пат. изменения) Б)Куриные эмбрионы (гибель, пат. изменения, РГА) В)Культура клеток (ЦПД, РГАд, метод бляшек) III.Идентификация выделенного вируса – серологические реакции. IV.Доказательство этиологической роли. Иногда требуется доказать этиологическую роль выделенного вируса. Для этого используют парные сыворотки крови в серологических реакциях. В качестве АГ используют выделенный вирус, а в качестве АТ – парные сыворотки. Повышение титра антител во второй сыворотке в 4 и более раз свидетельствует о этиологической роли выделенного вируса.
Клинико-эпизоотологическая или до-лабораторная диагностика – проводится в хозяйствах и позволяет поставить лишь предварительный диагноз, проводится распознавание на основе сбора, сопоставления анализа о больных животных (клинические симптомы болезни, Патологоанатомические изменения в органах). Сбор эпизоотологических данных очень важен, позволяет получить данные о том, как протекает заболевание, сведения о хозяйствах. Если хозяйства неблагополучны, то это лишний раз подтверждает диагноз. Клинический осмотр ориентирует ветеринара только на несколько видов болезней. Основное значение все же у лабораторной диагностики.
I.Индикация вируса в патологическом материале. 1.Обнаружение – световая микроскопия крупных вирусов (Poxviridae), электронная микроскопия. 2.Обнаружение телец-включений (тельца Бабеша-Шенегри при бешенстве) 3.Обнаружение вирусных антигенов: серологические реакции. 4.Обнаружение вирусных НК (ДНК-зонды и ПЦР – полимеразно-цепная реакция). 5.Обнаружение активной формы вируса путем биопробы (лабораторные животные, куриные эмбрионы, культура клеток). 6.Обнаружение гемаглютининов у гемаглютинирующих вирусов (в настоящее время практически не используется по причине наличия более точных методов). Для идентификация выделенного вируса – серологические реакции. 1.РИФ – реакция иммунофлюорисценции. АГ + АТ меченные флюорохромом. Дают контакт 30 минут при 37 С, затем производят тщательный отмыв в ИХН. Метод обнаружения – флюоресцентное свечение под микроскопом. 2.ИФА – иммуно-ферментный анализ. АГ + АТ с ферментом. Контакт, отмыв, затем добавляют субстрат, который при контакте с АТ-ферментным комплексом дает цветную реакцию. 3.РСК – реакция связывания комплемента. АГ + АТ + комплемент. Контакт. Затем добавляют гем-систему (гемолизин + эритроциты барана). Контакт. Если гемолиза не происходит, значит АГ и АТ связали комплемент. Задержка гемолиза – реакция положительная. Если произошел гемолиз, значит комплемент связан гем-системой – реакция отрицательная. 4.РДП - реакция диффузной преципитиции. АГ + АТ (диффузия в агаровом геле). Метод обнаружения – образование контура преципитации. 5.РНГА – реакция непрямой гемаглютинации. Эритроциты нагружают АГ и при образовании комплекса АГ-АТ происходит агглютинация эритроцитов. 6.РТГА – реакция торможения гамаглютинации 7.РТГАд – реакция торможения гемадсорбции 8.РН – реакция нейтрализации. Вирус + АТ. Контакт. Ввод в чувствительную к вирусу систему. Метод обнаружения – нейтрализация инфекционной активности вируса.
Ретроспективная диагностика – преследует цель обнаружить динамику прироста АТ, основана на исследовании парных сывороток, которые берут дважды, в начале болезни и в конце. Их проверяют в одной из серореакций. Если прирост АТ в 4-5 раз больше – 100% постановка диагноза.
+ роль – метод позволяет достоверно поставить диагноз в большинстве случаев.
- роль – длительность ретроспективной диагностики.
Болезнь Ауески (псевдобешенство, зудящая чума, бешеная чесотка, инфекционный бульбарный паралич) – остро протекающая болезнь всех видов сельскохозяйственных животных, пушных зверей и грызунов. Характеризуется признаками поражения головного и спинного мозга, сильным зудом и расчесами.
Особый ущерб БА приносит в свиноводстве и пушном звероводстве. У пушных зверей это острая кормовая инфекция. Причиной является пища, которой нередко служат боенские отходы и субпродукты, полученные от больных животных или животных вирусоносителей.
Клиника. Инкубационный период – 1,5 суток – 10-12 дней в зависимости от метода заражения, вирулентности вируса и устойчивости животного. Вирус пантропен.
У свиней клиника протекает без признаков зуда. Тяжело болеют сосуны и отъемыши. Болезнь носит септический характер. Поросята обычно погибают через 4-12 часов. У поросят от 10 дней до 3-х месяцев первые признаки болезни – лихорадка (40-42), угнетение, слизистые истечения из носа. Позднее появляются признаки поражения ЦНС: беспокойство, манежные движения, потеря ориентации, судороги, прогиб спины, параличи глотки, гортани, конечностей, отек легких, слюнотечение. Болезнь длится от нескольких часов до 3-х дней. Летальность: 70-100%
У свиноматок проявляется в виде гриппоподобного синдрома с выздоровлением через 3-4 дня.
У КРС повышается температура до 42 С, прекращается жвачка, сильный зуд в областе ноздрей, губ, щек, отказ от корма, вялость, беспокойство, страх, учащенное дыхание, потливость, судороги жевательных и шейных мышц. Смерть наступает при нарастающей вялости через 1-2 суток. Выздоровления крайне редки.
У плотоядных животных наблюдается отказ от корма, пугливость, беспокойство, сильный зуд. Иногда у собак и кошек проявляются признаки бешенства. Потом наступает паралич глотки. Смерть через 2-3 суток. Животные не являются источником вируса и не выделяют его, являясь экологическим тупиком.
Заподозрить болезнь Ауески можно по характерным клиническим симптомам и патологоанатомическим изменениям (клинико-эпизоотологическая и патологоанатомическая диагностика).
Материал для исследования: смывы из носовой полости и кровь (лучше парные сыворотки), от трупов - кусочки головного мозга, легких, печени, селезенки.
Экспресс-метод - обнаружение вирусного антигена в РИФ. Вирусологический метод: а) выделение вируса на культуре клеток почек поросят: б) биопроба на кроликах (характерны зуд и расчесы в месте заражения).
Идентификация: РИФ, РН.
Ретроспективная диагностика: по приросту титра антител в парных выворотках.
Следует дифференцировать болезнь Ауески от бешенства, чумы свиней, гриппа, рожи, отравления поваренной солью.
Применятся живая вирусвакцина ВГНКИ, инактивированная культурная вакцина – иммунитет на 6-10 месяцев.За рубежом используются субъединичные и рекомбинантные вакцины.
Смотри вопрос №7
В целях определения вида данного вируса при изучении защитных процессов в организме больного человека или зараженного животного применяются серологические методы. Серология (от лат. Serum - сыворотка, жидкая составная часть крови) - это раздел иммунологии, изучающий реакции антигена специфическими защитными веществами, антителами, которые находятся в сыворотке крови. Антитела нейтрализуют действие вируса. Они связываются с определенными антигенными веществами, находящимися на поверхности вирусных частиц. В результате связывания молекул антител с поверхностной структурой вируса последний теряет свои патогенные свойства. Для установления уровня (количества) антител в сыворотке или определения типа данного вируса проводится реакция нейтрализации вируса. Ее можно проводить как на животных, так и на культуре клеток.
Минимальную концентрацию сыворотки, содержащей антитела, достаточную для того, чтобы нейтрализовать вирус, не дать ему проявить ЦПД, называют титром сыворотки, нейтрализующей вирус. Эта концентрация может быть выявлена и с помощью метода бляшек.
С помощью серологической реакции можно: определять титр АТ к гемагглютинирующему вирусу в сыворотке; идентифицировать неизвестный гемагглютинирующий вирус по известным сывороткам; установить степень АГ родства 2 вирусов, определять титр вируснейтрализующих АТ в сыворотке, или индекс нейтрализации, идентифицировать неизвестный вирус путем испытания его с различными заведомо известными сыворотками.
1. РИФ – реакция иммунофлюорисценции.
АГ + АТ меченные флюорохромом. Дают контакт 30 минут при 37 С, затем производят тщательный отмыв в физрастворе. Метод обнаружения – флюоресцентное свечение под микроскопом.
2. ИФА – иммуно-ферментный анализ.
АГ + АТ с ферментом. Контакт, отмыв, затем добавляют субстрат, который при контакте с АТ-ферментным комплексом дает цветную реакцию.
3. РСК – реакция связывания комплемента.
АГ + АТ + комплемент. Контакт. Затем добавляют гем-систему (гемолизин + эритроциты барана). Контакт. Если гемолиза не происходит, значит АГ и АТ связали комплемент. Задержка гемолиза – реакция положительная. Если произошел гемолиз, значит комплемент связан гем-системой – реакция отрицательная.
4. РДП - реакция диффузной преципитиции.
АГ + АТ (диффузия в агаровом геле). Метод обнаружения – образование контура преципитации.
5. РНГА – реакция непрямой гемаглютинации.
Эритроциты нагружают АГ и при образовании комплекса АГ-АТ происходит агглютинация эритроцитов.
6. РТГА – реакция торможения гамаглютинации
7. РТГАд – реакция торможения гемадсорбции
8. РН – реакция нейтрализации.
Вирус + АТ. Контакт. Ввод в чувствительную к вирусу систему. Метод обнаружения – нейтрализация инфекционной активности вируса.
Все методы лабораторной диагностики вирусных инфекций можно разделить на три группы:
1. Экспресс-методы, основанные на обнаружении в патматериале следов пребывания вирусов, позволяют относительно быстро установить наличие вируса. Для обнаружения вирусных антигенов и их следов пребывания в организме птиц используют:
– серологические реакции с заведомо известными специфическими сыворотками (РИФ, РСК, РРП в агаровом геле, ИФА (ELISA), РГА, РТГА);
- генетические методы – ПЦР, ДНК-зондов;
- обнаружение специфических вирусных телец-включений;
- микроскопию – электронная (хотя и не имеет практического значения) и вирусоскопия при оспе птиц (оспенный вирус – единственный, который обнаруживается в световом микроскопе). Положительная вирускопия в сочетании с биопробой достаточна для постановки диагноза на оспу.
- биопробу - её тоже можно отнести к экспресс-методам, особенно, если можно надеяться на получение характерной клинической картины или характерных патологоанатомических изменений.
После проведения экспресс-исследований диагноз ставят предварительно в течении 1-2 суток и в этом их главное достоинство. Но высокой достоверностью они не отличаются, поэтому нуждаются в подтверждении другими методами.
2. Вирусологический метод – основан на обнаружении и изоляции активных форм вирусов из патматериала и их идентификации в серологических реакциях. Метод отличается длительными и трудоемкими исследованиями, но дает точный и уверенный ответ о возбудителе болезни.
Индикацию и изоляцию обычно осуществляют путем биопробы на чувствительных лабораторных объектах. Поэтому при исследовании патматериала от больных птиц для заражения используют цыплят или куринные эмбрионы (КЭ), или культуру клеток (КК). Главным показателем размножения вируса служит:
- в КЭ – гибель его и характерные патологоанатомические признаки (кровоизлияния на ХАО, оспины, мумифмцирование плода, скручивание шеи и т.д.);
- в КК – ЦПЭ (ЦПД) – бляшки, тельца включения, дегенерация монослоя.
Для идентификации выделенного вируса используют серологические реакции с диагностическими специфическими сыворотками. Выбор реакции определяется в основном свойствами самого вируса – это может быть РТГА, если вирус проявил гемагглютирующую активность, РТГАд – если вирус проявил гемадсорбирующие свойства.
Применяют для идентификации вируса также РН, РДП в агаровом геле, ИФА, в том числе метод ELISA, основанный на использовании ферментов в качестве метки антигенов и антител. Этот метод применяют также и для ранней диагностики инфекционных, опухолевых болезней птиц, и для контроля эпизоотической ситуации в птицеводстве, и для контроля уровня поствакциннальных антител.
После идентификации вируса необходимо доказать его этиологическую роль в заболевании. Так, выделение от погибших кур вируса Ньюкаслской болезни не всегда свидетельствует о его этиологической роли – это может быть непатогенный, к примеру, вакциный штамм. Этиологическая роль выделенного вируса может считаться доказанной, если будет установлено нарастание титра антител к вирусу в парных сыворотках от птиц, послуживших источником получения патматериала.
3. Серологический метод (иммунологический) – основан на установлении динамики титра антител в парных сыворотках от группы птиц, которые исследуют с интервалом в 2-3 недели.
Основанием для предположения, к каким вирусам искать антитела, служит предварительный диагноз, поставленный по данным эпизоотологических и эпизоотологических наблюдений, клинических и патологоанатомических симптомов.
Наличие в сыворотках антител и их титры определяют в серологических реакциях с использованием антигенов предполагаемых вирусов.
Наиболее достоверные результаты практически к любым вирусам дает РН. Результат нейтрализации эталонного вируса антителами исследуемой сыворотки устанавливают на цыплятах, в культуре ткани и эмбрионах по феномену утраты ими биологической активности.
Важным методом диагностики большого количества вирусных болезней является постановка РДП в агаровом геле. Но условие ее методики - довольно высокий титр антител (в противном случае полосы преципитации получаются не яркие).
Наиболее проста по технике исполнения и быстроте реакция торможения гемагглютинации (РТГА); её применяют в случаях, если вирус обладает гемагглютицирующими свойствами.
Используют и другую методику – ИФА (в т.ч. ELISA).
После установления титра антител в парных сыворотках результаты интерпретируют, исходя из динамики титра. Считается, что нарастание титра антител во второй сыворотке в 4 и более раз по сравнению с первой уверенно свидетельствует об активном инфекционном процессе у птицы в период взятия у них крови. При этом болезнь была вызвана тем возбудителем, к которому было найдено повышение титра антител в парных сыворотках. Поставленный серологическим методом диагноз дает уверенное представление о болезни и важное значение для мероприятий ликвидации вспышки эпизоотий. Недостатком его является – ретроспективность, т.к. к моменту установки диагноза птицы, от которой получены сыворотки, уже или выздоровела, или пала.
Читайте также: