Методы обнаружения и идентификации вируса
Обновлено: 25.04.2024
Для выявления (индикации) вирусов применяются следующие методы.
Индикация вирусов в культуре клеток осуществляется, прежде всего, по цитопатическому действию (ЦПД) вирусов, сроки и характер которого зависят от свойств вируса, проявляясь дегенеративными изменениями клеток с последующей их гибелью и отслаиванием от стекла (рис. 29).
Полная дегенерация клеток сопровождается значительными изменениями в виде пикноза ядра и цитоплазмы, отслаиванием клеточного монослоя от стекла. Частичная дегенерация культур клеток может протекать по следующим типам:
гроздеобразования (округление, увеличение и слияние клеток с образованием гроздевидных скоплений, типично для аденовирусов),
очаговой деструкции (очаги пораженных клеток на фоне в целом сохранившегося монослоя), характерной для вирусов гриппа;
симпластообразования (слияние клеток с образованием гигантских многоядерных клеток в виде симпластов или синцитиев, характерных для вирусов кори, паротита, парагриппа, респираторно-синцитиального, герпеса, иммунодефицита человека).
Пролиферативный тип ЦПД с трансформацией клеток в злокачественные, обладающие неограниченными потенциями к росту, способны вызывать онкогенные вирусы.
Сроки, в течение которых наступает ЦПД, вариабельны (например, 1-2 дня у полиовирусов, 7-14 суток у аденовирусов).
Рис. 29. Культура клеток почек обезьян (а – незараженная, б – цитопатическое действие вируса) х200
Индикация вирусов с помощью реакции гемадсорбции (РГад). Сущность этой реакции заключается в способности эритроцитов человека или животных адсорбироваться на поверхности клеток, инфицированных рядом вирусов (например, орто и парамиксовирусов и др.) в ранние сроки их репродукции (до развития ЦПД) в результате действия гемагглютининов – гликопротеидов, входящих в состав суперкапсида вируса. Для постановки РГад в культуру клеток добавляют 0,2 мл 0,5%-й взвеси эритроцитов, выдерживают 15-20 мин при температуре 4 0 , 20 0 или 37 0 С в зависимости от свойств вируса, после чего взвесь эритроцитов удаляют и производят учет реакции под малым увеличением микроскопа по скоплению эритроцитов на отдельных клетках или на всем монослое.
Индикация вирусов по цветной пробе. Принцип метода основан на определении кислых продуктов метаболизма, накаливающихся в клетке в процессе ее жизнедеятельности с помощью индикатора фенолового красного, меняющего свой цвет с красного в щелочной среде на оранжево-желтый в кислой среде. При заражении культуры клеток вирусами, вызывающими ЦПД (например, аденовирусы, энтеровирусы и др.), метаболизм клеток подавляется, рН среды не меняется и она остается окрашенной в красный цвет.
Индикация вирусов по внутриклеточным включениям. Репродукция некоторых вирусов (оспы, герпеса, бешенства) приводит к образованию внутриклеточных включений, локализующихся в цитоплазме или в ядре клеток и представляющих собой скопления вируса (или его антигенов). Включения выявляют путем световой микроскопии культур клеток, окрашенных по Романовскому- Гимзе или другими методами, а также с помощью прямого флюорохромирования (например акридиновым оранжевым) с последующей микроскопией препаратов в люминесцентном микроскопе.
Индикация вирусов с помощью прямой РИФ – выявление вирусных антигенов, находящихся в инфицированной клетке культуры ткани, с помощью антител диагностической иммунной сыворотки, специфических иммуноглобулинов или моноклональных антител, меченых флюорохромом, обычно флюоресцеином (рис. 30).
Индикация вирусов с помощью электронно-микроскопического метода (ЭММ) применяется, в основном, в научных исследованиях. Материал для ЭММ концентрируют различными методами (ультрацентрифугирование, хроматография на колонках, адсорбцией с помощью специальных сорбентов или антител – для метода иммунной электронной микроскопии). ЭММ позволяет обнаружить в ядре или цитоплазме клеток отдельные вирионы, а также их скопления. В практических целях ЭММ может быть полезен для индикации и идентификации вирусов с типичной морфологией (оспенные вирусы, ротавирусы, коронавирусы, ВИЧ и т.д.).
Рис. 30. Реакция иммунофлюоресценции (РИФ) – выявление вирус-специфических антигенов. х900
Индикация вирусов по образованию бляшек - очагов разрушенных вирусом монослоя культуры клеток под агаровым покрытием. Количество бляшек отражает инфекционную активность вируса.
Для постановки этой пробы вирусную суспензию в разных разведениях вносят в культуры ткани, находящиеся в плоских сосудах, после чего монослой клеток заливают гелем (слой агара или бентонита с индикатором нейтральным красным). Время бляшкообразования для большинства вирусов, обладающих ЦПД, варьирует от 36 до 48 ч. Бляшки выглядят в виде неокрашенных светлых пятен на розово-красном фоне окрашенного монослоя. В бентонитовом методе монослой клеток молочного цвета, бляшки прозрачные.
Индикация вирусов в куриных эмбрионах. Зараженные РКЭ инкубируют в термостате при 35- 37 0 С в течение 48 -72 ч., после чего производят их вскрытие, амниотическую и аллантоисную жидкость отсасывают шприцем, а оболочки и эмбрион извлекают и помещают в стерильные чашки Петри.
При репродукции некоторых вирусов (натуральной оспы, осповакцины, простого герпеса) на ХАО куриных эмбрионах появляются характерные бляшки - беловатые пятна диаметром 1-2 мм, количество которых соответствует числу инфекционных частиц.
В аллантоисной и амниотической жидкости зараженных эмбрионов ряд вирусов (например, ортомиксовирусы, парамиксовирусы, аденовирусы и т.д.) может быть выявлен с помощью реакция гемагглютинации (РГА). Принцип реакции состоит в способности гемагглютининов -поверхностных вирусных структур гликопротеидной природы этих вирусов склеивать (агглютинировать) эритроциты определенных видов животных, птиц или человека. РГА не относится к иммунологическим реакциям, поскольку в ее основе отсутствует взаимодействие АГ и AT.
Определение титра вирусов можно проводить также на хорионаллантоисной оболочке. Для этого в лунки стерильных полистироловых пластин помещают кусочки скорлупы 11-12-дневного куриного эмбриона с неповрежденной ХАО, добавляют вирусосодержащую жидкость в десятикратных разведениях на буфере, накрывают пластины фольгой и инкубируют при 35-37 0 С в течение 24-72 часов. После этого скорлупу удаляют, добавляют 0,5% взвесь куриных эритроцитов и производят учет реакции по эффекту гемагглютинации, который свидетельствует о репродукции вируса.
Рис. 31. Реакция гемагглютинации для выявления вируса гриппа в хорион-аллантоисной жидкости куриного эмбриона.
Индикация вирусов в организме лабораторных животных находится в зависимости от вируса и вида чувствительного лабораторного животного, будет описана в лабораторной диагностике конкретных вирусных инфекций.
Для индикации вирусов в инфекционном материале могут быть использованы следующие методы и критерии:
Микроскопический: обнаружение вирусных включений в препаратах, окрашенных но Муромцеву, Морозову, Романовскому, Пигаревскому, Павловскому, обработанные флюорохромами.
Вирусологическое выделение вирусов в культурах клеток, в развивающихся куриных эмбрионах, на лабораторных животных (состояние, симптомы).
В культуре тканей: реакция гемаглютинации (РГА), реакция гемадсорбции (РГадс), цитопатогенное действие (ЦПД), цветная проба, метод бляшек.
Идентификация вирусов осуществляется с помощью серологических (иммунологических) методов:
реакция торможения гемагглютинации (РТГА),
реакция торможения гемадсорбции (РТГадс),
реакция связывания комплемента (РСК),
реакция нейтрализации цитопатогенного действия (РН),
реакция иммунофлюоресценции прямая и непрямая (РИФ, РНИФ),
реакция преципитации в геле (РП),
реакция нейтрализации цветной пробы.
Приложение 4
Культивирование вирусов в развивающихся куриных эмбрионах
Берут 7-11 дневные куриные эмбрионы, проверяют их жизнеспособность на овоскопе, на нем же у эмбриона простым карандашом обводят воздушную камеру - главный ориентир для последующих манипуляций.Стерильным тампоном с йодом протирают верхнюю (тупую) часть яйца, затем 60° спиртом.
Заражение невскрытого эмбриона
А) В хорион аллантоисную полость: Делают по границе воздушной камеры яйца под углом 45° к его поверхности на глубине 0,3-0,5 см. После введения вирусного материала отверстие заливают расплавленным парафином, и эмбрион в специальных лотках помещают в термостат-инкубатор приt° +40; +42С° и влажности в 60 %.
Б) В амнион и куриный зародыш:Инфицируют толстой тупой иглой для спинномозговыхпункций. Манипуляцию выполняют в темной комнате под контролем глаза, осторожно упираясь в эмбрион.
После заражения отверстие парафинируют, а инкубацию эмбриона продолжают.
Заражение вскрытого эмбриона:
Выполняют после снятия изогнутыми ножницами крышки яйца над его воздушной камерой, которую снимают очень осторожно.
А) Заражение в амниотический мешок выполняют после его подтягивания стерильным пинцетом.
Б) Заражение в желточный мешок проводят также.
В) обоих случаях дефект в скорлупе яйца закрывают: либо возвращением снятого тупого конца скорлупы, либо крышечкой от стеклянного бюкса. Их края для приданиягерметичности заливают парафином. Помещают в термостат-инкубатор.
Контрольные наблюдения ведут по критериям:
подвижность эмбриона, как показатель жизнеспособности;
появление на оболочках эмбриона бляшек с просяное зерно из внутриклеточных вирусных включений;
общепринятая индикация и идентификация вируса (Приложение 3).
Приложение 5
РЕПРОДУКЦИЯ ВИРУСОВ С РАЗНЫМ ГЕНОМОМ
ДНК- геномные цитоплазматические (вирус натуральной оспы)
Адсорбция на клетке- виропексис
Депротеинизация, освобождение генома
Стратегия вирусного генома (СВГ)
Все этапы в цитоплазме клетки
Репродукция ДНК (с участием эндорепликазы)
Трансляция на рибосомы
Выход из клетки
Синтез вирусного белка
Эндогенная (вирусная) транскриптаза
Транскрипция
Синтез вирусного белка на рибосомах клетки-хозяина
ДНК -геномные ядерные (вирус герпеса)
Адсорбция на клетки -виропексис
Депротеинизация. Освобождение генома
СВГ
Редупликация ДНК в ядре клетки хозяина
Разобщенный (дизъюнктивный) синтез
Репродукция ДНК в ядре клетки с участием экзорепликаз
Сборка вириона в цитоплазме
Синтез вирусного белка на рибосомах клетки
Экзогенная транскрипция (клеточная)
И-РНК транскрипция
Трансляция на рибосомы
Итак, синтез идёт по схеме: ДНК РНК белок
РНК-геномные минуснитевые (вирус гриппа)
Адсорбция на клетке- виропексис
Депротеинизация. Освобождение генома
СВГ
Редупликация ДНК
И-РНК
Экзогенная транскриптаза
М-РНК
М-РНК + репликативная форма
Синтез вирусного белка на рибосоме
+РНК
Сборка вириона
+РНК выполняет функции И- РНК
Трансляция на рибосомы
Синтез вирусного белка
Итак, синтез идет по схеме РНК РНК белок
РНК геномные + нитевые
Адсорбция
Депротеинизация
СВГ
Функции И-РНК выполняет +РНК нить
+РНК
Трансляция на рибосомы
Синтез вирусной репликазы (эндорепликазы)
Матрица для образования +нитей ДНК
Синтез вирусного белка
Итак, синтез идет по схеме: РНК белок
ДНК онкогенные вирусы
Адсорбция
депротеинизация
Интеграция в геном ДНК клетки хозяина
Редупликация ДНК
И-РНК
Белок вирусный
Итак, синтез идет по схеме: ДНК РНК белок
РНК онкогенные вирусы (обратная транскрипция)
Адсорбция- виропексис
Депротенизация
РНК (одна нить)
В вирионе формируется РНК зависимая ДНК полимераза
Синтез двунитчатой ДНК (провирус)
СВГ
Редупликация ДНК
Сборка вириона созревание на мембранах клетки
Трансляция ДНК (провируса при участии РНК- полимеразы клетки)
Учет вирусиндуцированных патологических изменений в чувствительных живых системах.
Изучение антигенных свойств вирусов в серологических реакциях с противовирусными сыворотками является основным методом идентификации вирусов. Для этого используют ряд иммунологических реакций.
Реакция нейтрализации основана на способности антител нейтрализовать инфекционную активность вирусов в культурах ткани, РКЭ, чувствительных лабораторных животных. Из вирус-содержащего материала готовят десятикратные разведения и добавляют к ним специфическую сыворотку в разведении в соответствии с титром, указанным на этикетке ампулы. Смеси вирус-сыворотка инкубируют 30 — 60 мин при 37 °С для обеспечения связывания антигенов с антителами, после чего смесью заражают культуру ткани, куриные эмбрионы или лабораторных животных. Контролем является чувствительная биосистема, зараженная вирусом без сыворотки.
Реакция считается положительной в случае нейтрализации ЦПД в культуре клеток, а также при отсутствии патологических изменений в куриных эмбрионах или в организме животных. По результатам РН высчитывается индекс нейтрализации (ИН - отношение титра вируса в контроле к титру вируса в опыте). При ИН менее 10 реакция расценивается как отрицательная, от 11 до 49 — сомнительная, от 50 и выше — положительная.
РН может быть поставлена в наиболее чувствительном варианте - подавления вирусного бляшкообразования под действием вирусспецифической антисыворотки. Для этого к вирус-содержащему материалу добавляют соответствующую искомому вирусу антисыворотку и после инкубации в термостате при 37 0 С течение 30-60 мин смесь вносят в культуру чувствительных клеток. Бляшкообразование выявляют в слое агара или бентонита. Идентичность вируса антителам сыворотки проявляется подавлением бляшкообразования.
Другим вариантом РН является цветная проба. Положительный результат пробы в случае соответствия вируса противовирусным антителам проявляется блокадой репродукции вируса, клетка при этом остается жизнеспособной, вырабатывая кислые продукты метаболизма, под влиянием которых цвет индикатора (фенолового красного) меняется с красного на желтый. Для постановки пробы в пробирки вносят по 0,25 мл рабочего разведения вируса и соответствующую антисыворотку. Смесь выдерживают при комнатной температуре 30-60 мин, добавляют в каждую пробирку по 0,25 мл клеточной суспензии и закрывают их резиновыми пробками. Пробирки инкубируют в термостате при 37 0 С 6-8 дней, результаты реакции учитывают по изменению цвета индикатора (красный цвет индикатора соответствует щелочному характеру рН - 7,4 указывая на репродукцию вируса и подавление метаболизма клеток; желтый цвет свидетельствует о кислом рН - ниже 7,2 в результате нейтрализации вируса антителами и активном метаболизме клеток с выработкой кислых продуктов обмена).
Реакция торможения гемадсорбции (РТГадс) основана на нейтрализации эффекта адсорбции эритроцитов на поверхности клеток, инфицированных вирусами, способными вызывать гемадсорбцию. Для постановки реакции по 0,2 мл специфической сыворотки, разведенной 1:5, вносят в пробирки, инкубируют 30-60 мин в термостате при оптимальной для данного вируса температуре, затем добавляют по 0,2 мл 0,5% взвеси эритроцитов. Контрольные пробы содержат неиммунную сыворотку и эритроциты. Пробирки снова инкубируют 20-30 мин, после чего производят учет реакции. Идентификация вируса основывается на признаке отсутствия адсорбции эритроцитов на клетках в присутствии иммунной сыворотки при наличии гемадсорбции в контрольных пробирках.
Для антигенной идентификации вирусов в клетках культур тканей используются также РПГ, РСК, РИФ, РОПГА ИФА, РИА со специфическими иммунными противовирусными сыворотками или моноклональными AT.
выявление вирусной НК методами генодиагностики с помощью метода молекулярной гибридизации и ПЦР;
Лабораторные методы при диагностике вирусных инфекций включают:
• выделение и идентификацию возбудителя;
• обнаружение и определение титров противовирусных AT;
• обнаружение Аг вирусов в образцах исследуемого материала;
• микроскопическое исследование препаратов исследуемого материала.
Забор материала для выявления вирусов
При заборе материала для исследований необходимо выполнять следующие условия:
• образцы следует отбирать как можно раньше либо с учётом ритма циркуляции возбудителя;
• материал следует отбирать в объёме, достаточном для всего комплекса исследований;
• образцы следует доставлять в лабораторию незамедлительно (!), при относительно кратковременной транспортировке (не более 5 сут) образцы сохраняют на льду, при более длительной — при температуре -50 С.
Выделение и культивирование вирусов
Выделение и идентификация возбудителя — золотой стандарт в диагностике вирусных инфекций.
Культуры клеток для выявления вирусов
Вирусы размножаются только в живых клетках, и выделение возбудителя в заражённой культуре клеток — один из основных методов диагностики вирусных инфекций. Поскольку большинство патогенных вирусов отличает тканевая и типовая специфичность, то почти к каждому вирусу можно подобрать соответствующие клеточные или тканевые чультуры, а также создать стандартные условия культивирования (наличие клеток одного типа). Размножение вируса обеспечивают чувствительные (пермиссивные) клетки. Поэтому при выделении неизвестного возбудителя проводят одномоментное заражение 3~4 культур клеток, предполагая, что одна из них может оказаться пермиссивной. Культуры клеток получают диспергированием соответствующих органов и тканей, но чаще используют эмбриональные ткани (человека и животных) либо трансформированные опухолевые клетки. При помещении на соответствующую плоскую поверхность клеточные культуры обычно растут в виде монослоя. Первично-трипсинизированные культуры. Суспензии клеток получают гомогенизированием соответствующих тканей, предварительно обработанных трипсином. Культуры часто представлены клетками смешанного типа и не подлежат повторному культивированию. Жизнеспособность таких культур составляет 2-3 нед.
Полуперевиваемые линии клеток представлены диплоидными клетками человека и животных. Культуры ограниченно пригодны к повторному диспергированию и росту (как правило, не более 20-30 пересевов), сохраняя при этом жизнеспособность и не подвергаясь спонтанной трансформации.
Перевиваемые линии клеток (гетероплоидные культуры) представлены клетками, подвергнутыми длительному культивированию и спонтанным трансформациям. Культуры способны к многократному диспергированию и перевиванию. Работа с ними менее трудоёмка по сравнению с приготовлениями первичных культур; перевиваемые клетки относительно одинаковы по своей морфологии и стабильны по свойствам.
Информация на сайте подлежит консультации лечащим врачом и не заменяет очной консультации с ним.
См. подробнее в пользовательском соглашении.
Животные модели для обнаружения вирусов. Идентификация вирусов. Качественное определение вирусов. Цитопатические эффекты вирусов. Бляшкообразование вируса. Тельца включений вирусов.
При невозможности выделить и идентифицировать вирус стандартными методами in vitro инфекционный материал вводят чувствительным к возбудителю животным, и после развития типичного инфекционного процесса проводят повторное заражение чувствительных клеточных культур. Наиболее часто используют мышей, кроликов и обезьян; для выделения некоторых вирусов (например, вирусов Коксаки) заражают мышат-сосунков. Вследствие дороговизны и сложности содержания лабораторных животных, практически повсеместно их вытеснили клеточные культуры. Тем не менее животные модели активно используют для изучения особенностей патогенеза и формирования иммунных реакций при вирусных инфекциях. j
Идентификация вирусов
Цитопатические эффекты вирусов оценивают при микроскопии клеточных культур. По степени поражения клеток выделяют вирусы с высокой или умеренной цитопатогенностью. Размножение вирусов в культурах клеток сопровождается нарушениями морфологии клеток монослоя. Некоторые вирусы вызывают характерные цитопатические изменения, что (с учётом клинической картины заболевания) позволяет быстро поставить предварительный диагноз. Например, размножение парамиксовирусов (вирусы кори, паротита, PC-вирус) сопровождается появлением характерных гигантских многоядерных клеток; аденовирусы вызывают образование скоплений больших круглых клеток, а при репродукции герпесвирусов клетки округлой формы диффузно располагаются по всему монослою.
Бляшкообразование вирусов
Информация на сайте подлежит консультации лечащим врачом и не заменяет очной консультации с ним.
См. подробнее в пользовательском соглашении.
Читайте также: