Методы определения вида и типа вирусов

Обновлено: 17.04.2024

Определение вида и типа вирусов в вируссодержащем материале производится путём нейтрализации вирусов специфическими сыворотками. Результат нейтрализации может быть установлен на основании следующих признаков:

1) нейтрализация ЦПД;

2) нейтрализация гемадсорбции;

3) задержка (торможение) гемагглютинации;

4) цветная проба;

5) свечение клеток, содержащих вирус, под влиянием специфических флюоресцирующих сывороток;

6) нейтрализация в опыте на животных (у опытных животных инфекция не развивается).

Возбудителями ОРВИ являются следующие вирусы:

1. Ортомиксовирусы (вирусы гриппа А, В, С).

2. Парамиксовирусы (парагриппозные вирусы, вирус эпидемического паротита, вирус Ньюкастла, вирус кори, респираторно-синцитиальный вирус).

3. Пикорнавирусы (более 110 серотипов риновирусов, некоторые серотипы вирусов Коксаки (А и В) и ЕСНО).

4. Реовирусы (3-й серотип).

6. Аденовирусы (из 41 серотипа 8 являются возбудителями ОРВИ).

Для диагностики ОРВИ применяются следующие методы:

1. Вирусологические – заражение культур клеток и куриных эмбрионов.

2. Иммунофлюоресцентный (метод ускоренной диагностики).

3. Серологические реакции – РТГА, РСК, ИФА.

4. Использование РНК-зондов.

Контрольные вопросы

Положение вирусов среди живых организмов, к какому царству они относятся? Основные особенности вирусов, присущие только им. Размеры вирусов (мелкие, средние, крупные), способы определения размеров вирусов. Как называется зрелая вирусная частица? Строение простых и сложных вирусов: типы симметрии, составные части вирусной частицы, внешняя оболочка; примеры простых и сложных вирусов. Принципы классификации вирусов. Назовите основные семейства, роды и виды РНК- и ДНК-содержащих патогенных вирусов. Методы культивирования вирусов. Виды культур тканей, их характеристика и способы получения. Питательные среды для выращивания культур тканей. Куриные эмбрионы: строение, методы и условия заражения куриных эмбрионов. Основные этапы репродукции вирусов в клетке. Методы обнаружения вирусов в культуре ткани. Что такое внутриклеточные включения? Что такое цитопатическое действие вирусов? Методы определения вида и типа вирусов. Как определить ЦПД вируса? Способы обнаружения вирусов в заражённом курином эмбрионе.

Перечислите основных возбудителей острых респираторных вирусных инфекций (ОРВИ). Вирус гриппа: к какому семейству вирусов относится; форма, тип симметрии, схема строения, особенности генома, антигены и серологическая реакция. По каким антигенам определяют тип и подтип вирусов гриппа? Антигенная изменчивость вируса гриппа. Методы диагностики, применяемые в первые дни заболевания и для ретроспективной диагностики. Реакция гемагглютинации, способ постановки. Реакция торможения гемагглютинации, что можно определить с помощью этой реакции (два варианта)? Какие диагностические препараты нужны для этого? Составьте схему реакции торможения гемагглютинации для определения типа и подтипа вируса гриппа. Специфическая профилактика и лечение гриппа, препараты и их характеристика. Вирусы парагриппа: классификация, характеристика, вызываемые заболевания. Лабораторная диагностика и лечение. Вирус эпидемического паротита: классификация, характеристика, диагностика заболевания, специфическая профилактика. Вирус кори, его характеристика. Иммунитет. Вирусологическая диагностика кори. Профилактические препараты. Респираторно-синцитиальный вирус: классификация, характеристика, вызываемые заболевания. Лабораторная диагностика и лечение. Коронавирусы: характеристика, вызываемые заболевания и их диагностика. Аденовирусы: характеристика, вызываемые заболевания. Диагностика аденовирусных инфекций. Лечение и профилактика. Вирус краснухи, его характеристика. Иммунитет. Диагностика заболевания. Препараты для специфической профилактики. Вирусы герпеса: классификация, характеристика, вызываемые заболевания. Вирусологическая диагностика герпетических заболеваний. Профилактика и лечение.

Вирус - неклеточная форма жизни, обладающая геномом (РНК или ДНК), но лишенная собственного синтезирующего аппарата и, поэтому, способная к воспроизведению лишь в клетках более высокоорганизованных существ.

Вирус является облигатным внутриклеточным паразитом и для размножения ему требуется живая клетка. Различают три типа взаимодействия вируса с клеткой:

продуктивный, или цитоцидный тип, при котором в зараженных клетках образуется новое поколение вирионов;

абортивный тип, характеризующийся прерыванием инфекционного процесса в клетке, поэтому новые вирионы не образуются;

интегративный тип, или вирогения, заключающийся в интеграции, т.е. встраивании вирусной ДНК в виде провируса в хромосому клетки и их совместном сосуществовании.

Продуктивный тип взаимодействия вируса с клеткой осуществляется в результате размножения, т.е. репродукции вируса (от англ. reproduce - воспроизводить). Репродукция вируса происходит в несколько стадий, различающихся у разных вирусов:

адсорбция вирионов на клетке;

проникновение вирусов в клетку;

депротеинизация или `раздевание' вирусов и высвобождение вирусного генома;

биосинтез компонентов вируса;

формирование вирусной частицы;

выход вирионов из клетки.

Методы культивирования и индикации вирусов

Культивирование вирусов в организме лабораторных животных.

Выбор экспериментальных животных определяется целью работы и видовой чувствительностью к изучаемому вирусу. Для заражения используют обезьян, кроликов, морских свинок, хомячков, белых крыс и мышей.

Применение живых систем.

- Для обнаружения вируса - биопроба.

- Для выделения вируса и получения вирус содержащего материала от положительной биопробы.

- Для поддержания вируса в лаборатории, т.е. для сохранения его в активной форме в течении многих лет. Это достигается путем чередований пассажей и хранений в консервирующих условиях. Пассаж - заражение живого объекта с последующим получением новой популяции вируса.

- Для накопления вирусной массы с целью исследования вируса и получения вакцин.

- Для титрования вирусов.

- Как тест-объект в реакции нейтрализации.

Лабораторных животных заражают различными способами в зависимости от тропизма вируса к определенным тканям. Так, например, для культивирования нейротропных вирусов заражение производят преимущественно в мозг (вирусы бешенства, клещевого энцефалита и др.), культивирование респираторных вирусов осуществляется при интраназальном инфицировании животных (вирусы гриппа), дерматотропных (вирус оспы) - путем накожного и внутрикожного заражения. Наиболее часто используются накожное, внутрикожное, внутримышечное, внутрибрюшинное и внутримозговое заражение.

При первичном заражении животные могут не заболеть, поэтому через 5-7 дней внешне здоровых животных убивают, а из их органов готовят суспензии, которыми заражают следующие партии животных. Эти последовательные заражения называются `пассажами'.

Индикацию, т.е. обнаружение факта размножения вируса, устанавливают на основании развития типичных признаков заболевания, патоморфологических изменений органов и тканей животных или положительной реакции гемагглютинации (РГА). РГА основана на способности некоторых вирусов вызывать агглютинацию (склеивание) эритроцитов различных видов животных, птиц и человека за счет поверхностного вирусного белка - гемагглютинина.В настоящее время использование животных для культивирования вирусов ограничено.

Индикация вирусов при помощи лабораторных животных.

1. Гибель в характерные для данного вируса сроки.

2. Характерные клинические признаки.

3. Характерные патологоанатомические изменения.

- обнаружить характерные для данной вирусной патологии изменения во внутренних органах.

- взять материал для последующих пассажей (материал берется в зависимости от тропизма вируса).

Заражение лабораторных животных.

1. подкожно - спина.

2. Внутрикожно - пятка

3. Внутримышечно -бедро

Культивирование вирусов в куриных эмбрионах .

Большинство известных вирусов обладают способностью размножаться в курином эмбрионе (рис.4). Используют эмбрионы в возрасте от 8 до 14 дней в зависимости от вида вируса, способа заражения и задач исследования. Вирусы гриппа культивируются в 9-10, осповакцины - в 12, паротита - в 7-дневных куриных эмбрионах. Размножение вируса в куриных эмбрионах происходит в разных частях зародыша, что связано с особенностями тропизма вируса. Методику выращивания вируса в курином эмбрионе широко используют при промышленном культивировании.

Строение куриного эмбриона и способы его заражения: 1 - в амнион; 2 - в аллантоисную полость; 3 - в желточный мешок. (Микробиология и иммунология. Под редакцией Воробьева А.А. - М. - 1999).

Самая наружная внезародышевая оболочка, примыкающая к скорлупе или материнским тканям и поэтому служащая местом обмена между зародышем и окружающей его средой, называется Хорионом. У видов, откладывающих яйца, основная функция хориона — осуществление дыхательного газообмена. У млекопитающих хорион участвует в дыхании и питании, выделении, фильтрации и синтезе веществ. У примитивных организмов хорион – вторичная оболочка, а у продвинутых – оболочка плода. Полость между хорионом и амнионом – хорионамниотическая.

Амнио́н (греч. Amnion), Амниотический мешок или Водная оболочка — одна из зародышевых оболочек у эмбрионов пресмыкающихся, птиц, млекопитающих.

Алланто́ис (от греч. allantoeidēs — колбасовидный) — эмбриональный орган дыхания высших позвоночных животных; зародышевая оболочка, развивающаяся из задней кишки эмбриона. Кроме того, аллантоис участвует в газообмене зародыша с окружающей средой и выделении жидких отходов. Аллантоис, вкупе с другими эмбриональными оболочками — амнионом и хорионом, является определящим признаком высших позвоночных животных — млекопитающих, птиц и рептилий.

У яйцекладущих птиц и рептилий аллантоис развивается вокруг эмбриона вдоль стенок скорлупы. В своём внешнем слое, называемым мезодермой, он создаёт разветвлённую сеть кровеносных сосудов, с помощью которых происходит взаимодействие с внешней средой. У млекопитающих аллантоис входит в состав пуповины.

Существует несколько способов заражения развивающегося куриного эмбриона: на хорионаллантоисную оболочку, в аллантоисную и амниотическую полости, желточный мешок, тело эмбриона.

Заражение на хорионаллантоисную оболочку применяется для выделения и культивирования вирусов, образующих на оболочках бляшки (вирусы вакцины, натуральной оспы, простого герпеса). Перед заражением яйца просвечивают с помощью овоскопа, карандашом очерчивают границу воздушного пространства и хорионаллантоисной оболочки. Поверхность яйца над воздушным пространством и в месте заражения протирают спиртом, прожигают, обрабатывают йодом и делают отверстие в полости воздушного мешка. На месте заражения скорлупу удаляют так, чтобы не повредить подскорлупную оболочку, которую затем прокалывают короткой стерильной иглой, чтобы не повредить хорионаллантоисную оболочку. Воздух из полости воздушного мешка отсасывают. Вирусный материал (0,05 - 0,2 мл) наносят на хорионаллантоисную оболочку туберкулиновым шприцем с короткой иглой или пастеровской пипеткой. Отверстие в скорлупе закрывают стерильным покровным стеклом или тем же выпиленным кусочком скорлупы и по краям заливают расплавленным парафином. Зараженные эмбрионы располагают на подставке горизонтально и инкубируют в термостате. Вскрытие эмбрионов производится не раньше 48 часов инкубации. На зараженной оболочке обнаруживаются беловатые непрозрачные пятна разной формы (бляшки).

Заражение в аллантоисную полость. Вирус, введенный в аллантоис, размножается в эндодермальных клетках, переходя затем в аллантоисную жидкость. Заражение осуществляют следующим способом: в скорлупе над воздушной камерой острием скальпеля или ножниц производят прокол, после чего через отверстие в вертикальном направлении вводят иглу со шприцем, которая проходит через хорионаллантоисную оболочку и попадает в аллантоисную полость, материал вводится в объеме 0,1 мл и отверстие заливают парафином.

Заражение в желточный мешок. С этой целью используют эмбрионы 5 - 10-дневного возраста. Наиболее употребительны два метода заражения. По первому материал вводится через воздушное пространство. В центре яйца делают отверстие, помещают его на подставку тупым концом вправо и через отверстие в вертикальном направлении вводят иглу, надетую на шприц, игла проходит через хорионаллантоисную оболочку, аллантоисную полость в желток. В желточный мешок можно ввести от 0,1 до 0,5 мл вируссодержащего материала. После заражения отверстие в скорлупе заливают парафином, и эмбрион помещают в термостат. По второму методу на границе воздушного пространства с той стороны, где лежит желток (стороны, противоположной от эмбриона), делают прокол скорлупы, через который вводят инфекционный материал. Направление иглы должно быть к центру яйца.

Куриный эмбрион, инфицированный вирусным материалом, ставят в инкубатор на 2—3 дня, в зависимости от характера внесенного вируса. Для развития вирусов из проб, взятых у больного (например, смывов из носоглотки, использующихся при диагностировании гриппа), куриный эмбрион представляет хорошую среду. По типу изменений, скажем в тканях хорионаллантоисной оболочки, можно непосредственно определить, с каким вирусом мы имеем дело. Очень характерные изменения дают вирусы оспы и герпеса. Некоторые вирусы очень интенсивно размножаются в различных тканях куриного эмбриона и дают исходный материал для приготовления вирусных антигенов, необходимых при лабораторной диагностике вирусных заболеваний. Вирусы, размноженные в курином эмбрионе, были использованы как исходный материал для получения восемнадцати видов прививочных вакцин.

Несмотря на положительные стороны культур клеток, получивших столь широкое распространение в современных вирусологических лабораториях, куриный эмбрион во многих случаях сохранил свое первенствующее значение и по-прежнему служит классическим материалом для работы.

1) нейтрализация ЦПД;

2) нейтрализация гемадсорбции;

3) задержка (торможение) гемагглютинации;

4) цветная проба;

5) свечение клеток, содержащих вирус, под влиянием специфических флюоресцирующих сывороток;

6) нейтрализация в опыте на животных (у опытных животных инфекция не развивается).

Возбудителями ОРВИ являются следующие вирусы:

1. Ортомиксовирусы (вирусы гриппа А, В, С).

3. Пикорнавирусы (более 110 серотипов риновирусов, некоторые серотипы вирусов Коксаки (А и В) и ЕСНО).

4. Реовирусы (3-й серотип).

6. Аденовирусы (из 41 серотипа 8 являются возбудителями ОРВИ).

Для диагностики ОРВИ применяются следующие методы:

1. Вирусологические – заражение культур клеток и куриных эмбрионов.

2. Иммунофлюоресцентный (метод ускоренной диагностики).

3. Серологические реакции – РТГА, РСК, ИФА.

4. Использование РНК–зондов.

Контрольные вопросы

Положение вирусов среди живых организмов, к какому царству они относятся? Основные особенности вирусов, присущие только им. Размеры вирусов (мелкие, средние, крупные), способы определения размеров вирусов. Как называется зрелая вирусная частица? Строение простых и сложных вирусов: типы симметрии, составные части вирусной частицы, внешняя оболочка; примеры простых и сложных вирусов. Принципы классификации вирусов. Назовите основные семейства, роды и виды РНК- и ДНК–содержащих патогенных вирусов. Методы культивирования вирусов. Виды культур тканей, их характеристика и способы получения. Питательные среды для выращивания культур тканей. Куриные эмбрионы: строение, методы и условия заражения куриных эмбрионов. Основные этапы репродукции вирусов в клетке. Методы обнаружения вирусов в культуре ткани. Что такое внутриклеточные включения? Что такое цитопатическое действие вирусов? Методы определения вида и типа вирусов. Как определить ЦПД вируса? Способы обнаружения вирусов в заражённом курином эмбрионе.

Строение вирусов. Классификация вирусов

Вирусы классифицируют по типу генетического материала, способам репликации, строению и расположению структурных белков (капсидов), а также наличию или отсутствию оболочки.

Генетическая структура и способы репликации ДНК-вирусы. Могут быть только двунитевыми и одноните-выми. К. первым относят вирус оспы, герпес-вирусы, аденовирусы, паповавирусы и полиомавирусы. Последние два вируса вызывают развитие доброкачественных (бородавки) и злокачественных (рак шейки матки) опухолей. Вирус гепатита В частично дву- и однонитевой. К однонитевым вирусам относят парвовирусы, вызывающие инфекционную эритему.

Репликация ДНК-вирусов обычно происходит в ядре клеток хозяина и сопровождается продукцией полимераз, воспроизводящих вирусную ДНК. При этом последняя не всегда встраивается в хромосомную ДНК хозяина.

РНК-вирусы. Эти вирусы содержат однонитевую РНК, но различаются по стратегии репродукции, (вирусы, содержащие плюс-однонитевую РНК и минус-однонитевую РНК). У плюс-однонитевых вирусов РНК транслируется в структурные белки и служит матрицей (мРНК) для РНК-зависимой РНК-полимеразы.

В состав минус-однонитевых вирусов входит собственная РНК-зависимая РНК-полимераза, продуцируемая на базе генома вируса мРНК. Последняя в свою очередь может быть матрицей для продукции вирусной (минус-однонитевой) РНК.

Строение капсидов вирусов. Вирусная нуклеиновая кислота покрыта белковой оболочкой, состоящей из повторяющихся единиц (капсида) с икосаэдрическим (кубическим) или спиральным типами симметрии. Капсиды вирусов с икосаэдрическим типом симметрии имеют практически сферическую форму. Спиральный тип симметрии свойствен РНК-вирусам, капсиды которых окружают нуклеиновую кислоту, располагающуюся в виде спирали.

Капсид состоит из повторяющихся компонентов (капсомеров), количество генов, кодирующих его, снижено, тем самым облегчён процесс сборки вируса.

Оболочка вирусов. В некоторых случаях нуклеиновая кислота и капсидные белки вируса (нуклеокапсид) окружены липидной оболочкой, состоящей из компонентов клетки хозяина или ядерных мембран. Мембрана клетки хозяина изменяется под действием белков, кодируемых вирусом, или гликопротеинов, выступающих в роли рецепторов для других клеток хозяина. Покрытые оболочкой вирусы чувствительны к действию веществ, растворяющих липидную мембрану (например, эфиров).

Редактор: Искандер Милевски. Дата обновления публикации: 18.3.2021

Лабораторные методы при диагностике вирусных инфекций включают:
• выделение и идентификацию возбудителя;
• обнаружение и определение титров противовирусных AT;
• обнаружение Аг вирусов в образцах исследуемого материала;
• микроскопическое исследование препаратов исследуемого материала.

Забор материала для выявления вирусов

При заборе материала для исследований необходимо выполнять следующие условия:
• образцы следует отбирать как можно раньше либо с учётом ритма циркуляции возбудителя;
• материал следует отбирать в объёме, достаточном для всего комплекса исследований;
• образцы следует доставлять в лабораторию незамедлительно (!), при относительно кратковременной транспортировке (не более 5 сут) образцы сохраняют на льду, при более длительной — при температуре -50 С.

Выделение и культивирование вирусов

Выделение и идентификация возбудителя — золотой стандарт в диагностике вирусных инфекций.

Культуры клеток для выявления вирусов

Вирусы размножаются только в живых клетках, и выделение возбудителя в заражённой культуре клеток — один из основных методов диагностики вирусных инфекций. Поскольку большинство патогенных вирусов отличает тканевая и типовая специфичность, то почти к каждому вирусу можно подобрать соответствующие клеточные или тканевые чультуры, а также создать стандартные условия культивирования (наличие клеток одного типа). Размножение вируса обеспечивают чувствительные (пермиссивные) клетки. Поэтому при выделении неизвестного возбудителя проводят одномоментное заражение 3~4 культур клеток, предполагая, что одна из них может оказаться пермиссивной. Культуры клеток получают диспергированием соответствующих органов и тканей, но чаще используют эмбриональные ткани (человека и животных) либо трансформированные опухолевые клетки. При помещении на соответствующую плоскую поверхность клеточные культуры обычно растут в виде монослоя. Первично-трипсинизированные культуры. Суспензии клеток получают гомогенизированием соответствующих тканей, предварительно обработанных трипсином. Культуры часто представлены клетками смешанного типа и не подлежат повторному культивированию. Жизнеспособность таких культур составляет 2-3 нед.

Полуперевиваемые линии клеток представлены диплоидными клетками человека и животных. Культуры ограниченно пригодны к повторному диспергированию и росту (как правило, не более 20-30 пересевов), сохраняя при этом жизнеспособность и не подвергаясь спонтанной трансформации.

Перевиваемые линии клеток (гетероплоидные культуры) представлены клетками, подвергнутыми длительному культивированию и спонтанным трансформациям. Культуры способны к многократному диспергированию и перевиванию. Работа с ними менее трудоёмка по сравнению с приготовлениями первичных культур; перевиваемые клетки относительно одинаковы по своей морфологии и стабильны по свойствам.

Информация на сайте подлежит консультации лечащим врачом и не заменяет очной консультации с ним.
См. подробнее в пользовательском соглашении.

Читайте также: