Моноклональные антитела к вирусу эбола

Обновлено: 28.03.2024

В обзоре обобщены литературные данные по исследованию вирусных антигенов и антител, специфичных к вирусу Эбола, пригодных для разработки тест-систем для иммунодиагностики вызываемого им заболевания. Представлены результаты работ авторов по получению гибридомных моноклональных антител (МКА), специфичных к структурным вирусным белкам NP, VP40 и VP35, рекомбинантных белков NP, VP40 и VP35 в прокариотической системе E. coli, а также возможность использования панелей МКА для выявления вирусных и рекомбинантных белков ВЭ в иммуноферментном анализе.

Ключевые слова

Об авторах

Список литературы

1. Борисевич В.Н., Михайлов В.В., Краснянский Б.П., Градобоев В.Н., Лебединская Е.В., Потрываева Н.В., Тиманькова Г.Д. Разработка и изучение свойств иммуноглобулинов против лихорадки Эбола. Вопр. вирусол. 1996; 6:270-3.

2. Иванова А.В., Казачинская Е.И., Качко А.А., Субботина Е.Л., Сорокин А.В., Разумов И.А., Нетесов С.В., Локтев В.Б. Получение и иммунологическая характеристика рекомбинантных белков VP40 и NP филовирусов. Пробл. особо опасных инф. 2010; 106:32-3.

3. Казачинская Е.И., Терновой В.А., Рудзевич Т.Н., Нетесов С.В., Чепурнов А.А., Разумов И.А. Исследование антигенной структуры белка VP35 вируса Эбола. Вопр. вирусол. 2001; 5:25-31.

4. Казачинская Е.И., Перебоев А.В., Чепурнов А.А., Беланов Е.Ф., Разумов И.А. Моноклональные антитела к вирусу Эбола: получение, характеризация и изучение перекрестной реактивности с вирусом Марбург. Вопр. вирусол. 2000; 3:40-4.

5. Казачинская Е.И., Иванова А.В., Сорокин А.В., Качко А.А., Субботина Е.Л., Разумов И.А., Локтев В.Б. Моноклональные антитела и рекомбинантные белки филовирусов. Иммунохимические свойства и оценка возможности их использования для иммунодиагностики. Мед. иммунол. 2010; 3(12):177-90.

6. Мерзликин Н.В., Чепурнов А.А., Истомина Н.Н., Офицеров В.И., Воробьева М.С. Разработка и применение иммуноферментных тест-систем для диагностики лихорадки Эбола. Вопр. вирусол. 1995; 40(1):31-5.

8. Aman M., Bosio C.M., Panchal R.G., Burnett J.C., Schmaljohn A., Bavari S. Molecular mechanisms of filovirus cellular trafficking. Microbes Infect. 2003; 5(7):639-49.

9. Bente D., Gren J., Strong J.E., Feldmann H. Disease modeling for Ebola and Marburg viruses. Dis. Model. Mech. 2009; 2(1-2):12-7.

10. Binning J.M., Wang T., Luthra P., Shabman R.S., Borek D.M., Liu G., Xu W., Leung D.W., Basler C.F., Amarasinghe G.K. Development of RNA aptamers targeting Ebola virus VP35. Biochemistry. 2013; 52(47):8406-19.

11. Bukreyev A.А., Volchkov V.E., Blinov V.M., Netesov S.V. The VP35 and VP40 proteins of filoviruses. Homology between Marburg and Ebola viruses. FEBS Lett. 1993; 322(1):1-6.

13. Bukreyev A., Rollin P.E., Tate M.K., Yang L., Zaki S.R., Shieh W.J., Murphy B.R., Collins P.L., Sanchez A. Successful topical respiratory tract immunization of primates against Ebola virus. J. Virol. 2007; 81(12):6379-88.

14. Carroll M.W., Matthews D.A., Hiscox J.A., Elmore M.J., Pollakis G., Rambaut A., Hewson R., García-Dorival I., Bore J.A., Koundouno R., Abdellati S., Afrough B., Aiyepada J., Akhilomen P., Asogun D., Atkinson B., Badusche M., Bah A., Bate S., Baumann J., Becker D., Becker-Ziaja B., Bocquin A., Borremans B., Bosworth A., Boettcher J.P., Cannas A., Carletti F., Castilletti C., Clark S., Colavita F., Diederich S., Donatus A., Duraffour S., Ehichioya D., Ellerbrok H., Fenandez-Garcia M.D., Fizet A., Fleischmann E., Gryseels S., Hermelink A., Hinzmann J., Hopf-Guevara U., Ighodalo Y., Jameson L., Kelterbaum A., Kis Z., Kloth S., Kohl C., Korva M., Kraus A., Kuisma E., Kurth A., Liedigk B., Logue C.H., Lüdtke A., Maes P., McCowen J., Mély S., Mertens M., Meschi S., Meyer B., Michel J., Molkenthin P., Muñoz-Fontela C., Muth D., Newman E.N., Ngabo D., Oestereich L., Okosun J., Olokor T., Omiunu R., Omomoh E., Pallasch E., Pályi B., Portmann J., Pottage T., Pratt C., Priesnitz S., Quartu S., Rappe J., Repits J., Richter M., Rudolf M., Sachse A., Schmidt K.M., Schudt G., Strecker T., Thom R., Thomas S., Tobin E., Tolley H., Trautner J., Vermoesen T., Vitoriano I., Wagner M., Wolff S., Yue C., Capobianchi M.R., Kretschmer B., Hall Y., Kenny J.G., Rickett N.Y., Dudas G., Coltart C.E., Kerber R., Steer D., Wright C., Senyah F., Keita S., Drury P., Diallo B., de Clerck H., Van Herp M., Sprecher A., Traore A., Diakite M., Konde M.K., Koivogui L., Magassouba N., Avšič-Županc T., Nitsche A., Strasser M., Ippolito G., Becker S., Stoecker K., Gabriel M., Raoul H., Di Caro A., Wölfel R., Formenty P., Günther S. Temporal and spatial analysis of the 2014-2015 Ebola virus outbreak in West Africa. Nature. 2015 Jun 17; doi: 10.1038/nature14594.

16. Dhama K., Malik Y.S., Malik S.V., Singh R.K. Ebola from emergence to epidemic: the virus and the disease, global preparedness and perspectives. J. Infect. Dev. Ctries. 2015; 9(5):41-55.

17. Dolnik O., Volchkova V., Garten W., Carbonnelle C., Becker S., Kahnt J., Ströher U., Klenk H.D., Volchkov V. Ectodomain shedding of the glycoprotein GP of Ebola virus. EMBO J. 2004; 23:2175-84.

18. Groen J., van den Hoogen B.G., Burghoorn-Maas C.P., Fooks A.R., Burton J., Clegg C.J., Zeller H., Osterhaus A.D. Serological reactivity of baculovirus-expressed Ebola virus VP35 and nucleoproteins. Microbes Infect. 2003; 5(5):379-85.

19. Hartlieb B., Muziol T., Weissenhorn W., Becker S. Crystal structure of the C-terminal domain of Ebola virus VP30 reveals a role in transcription and nucleocapsid association. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2007; 104(2):624-9.

20. Huang Y., Wei H., Wang Y., Shi Z., Raoul H., Yuan Z. Rapid detection of filoviruses by real-time TaqMan polymerase chain reaction assays. Virol. Sin. 2012; 27(5):273-7.

21. Huang Y., Zhu Y., Yang M., Zhang Z., Song D., Yuan Z. Nucleoprotein-based indirect enzyme-linked immunosorbent assay (indirect ELISA) for detecting antibodies specific to Ebola virus and Marbug virus. Virol. Sin. 2014; 29(6):372-80.

22. Ikegami T., Niikura M., Saijo M., Miranda M.E., Calaor A.B., Hernandez M., Acosta L.P., Manalo D.L., Kurane I., Yoshikawa Y., Morikawa S. Antigen capture enzyme-linked immunosorbent assay for specific detection of Reston Ebola virus nucleoprotein. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2003; 10(4):552-7.

23. Kalstrom G., Warfield K.L., Swenson D.L., Mort S., Panchal R.G., Ruthel G., Bavari S., Aman J. Analysis of Ebola virus and VLP release using an immunocapture assay. J. Virol. Meth. 2005; 127(1):1-9.

24. Ksiazek T.G., Rollin P.E., Jahrling P.B., Johnson E., Dalgard D.W., Peters C.J. Enzyme immunosorbent assay for Ebola virus antugens in tissues of infected primates. J. Clin. Microbiol. 1992; 30(4): 947-50.

26. Luch A., Grunov R., Moller P., Feldman H., Becker S. Development, characterization and use of monoclonal VP40-antibodies for the detection of Ebola virus. J. Virol. Meth. 2003; 111:21-8.

27. Luch A., Grunov R., Otterbein C., Moller P., Feldman H., Becker S. Production of monoclonal antibodies and development of an antigen capture ELISA directed against envelope glycoprotein GP of Ebola virus. Med. Microbiol. Immunol. 2004; 193:81-7.

28. Lucht A., Formenty P., Feldmann H., Gotz M., Leroy E., Bataboukila P., Grolla A., Feldmann F., Wittmann T., Campbell P., Atsangandoko C., Boumandoki P., Finke E.J., Miethe P., Becker S., Grunov R. Development of an immunofiltration-based antigen-detection assay for rapid diagnosis of Ebola virus infection. J. Infect. Dis. 2007; 196(2):184-92.

29. Maruyama T., Rodriguez L.L., Jahrling P.B., Sanchez A., Khan A.S., Nichol S.T., Peters C.J., Parren P.W., Burton D.R. Ebola virus can be effectively neutralized by antibody produced in natural human infection. J. Virol. 1999; 73(7):6024-30.

30. Muhlberger E., Lotfering B., Klenk H.-D. Becker S. Three of the four nucleocapsid proteins of Marburg virus., NP., VP35., and L., are sufficient to mediate replication and transcription of Marburg virus-specific monocistronic minigenomes. J. Virol. 1998; 72(11):8756-84.

31. Nakayama E., Yokoyama A., Miyamoto H., Igarashi M., Kishida N., Matsuno K., Marzi A., Feldmann H., Ito K., Saijo M., Takada A. Enzyme-linked immunosorbent assay for detection of filovirus species-specific antibodies. Clin. Vaccine Immunol. 2010; 17(11):1723-8.

32. Ndayimirije N., Kindhauser M.K. Marburg hemorrhagic fever in Angola-fighting fear and a lethal pathogen. N. Engl. J. Med. 2005; 352(21):2155-7.

33. Niikura M., Ikegami T., Saijo M., Kurane I., Miranda M.E., Morikawa S. Detection of Ebola viral antigen by enzyme-linked immunosorbent assay using a novel monoclonal antibody to nucleoprotein. J. Clin. Microbiol. 2001; 39(9):3267-71.

34. Noda T., Watanabe S., Sagara H., Kawaoka Y. Mapping of the VP40-binding regions of the nucleoprotein of Ebola virus. J. Virol. 2007; 81(7):3554-62.

35. Onyango C.O., Opoka M.L., Ksiazek T.G., Formenty P., Ahmed A., Tukei P.M., Sang R.C., Ofula V.O., Konongoi S.L., Coldren R.L., Grein T., Legros D., Bell M., De Cock K.M., Bellini W.J., Towner J.S., Nichol S.T., Rollin P.E. Laboratory diagnosis of Ebola hemorrhagic fever during an outbreak in Yambio, Suda, 2004. J. Infect. Dis. 2007; 196(2):193-8.

36. Prehaud C., Hellebrand E., Coudrier D., Volchkov V.E., Volchkova V.A., Feldmann H., Le Guenno B., Bouloy M. Recombinant Ebola virus nucleoprotein and glycoprotein (Gabon 94 strain) provide new tools for the detection of human infections. J. Gen. Virol. 1998; 79(11): 2565-72.

37. Prins K.C., Delpeut S., Leung D.W., Reynard O., Volchkova V.A., Reid S.P., Ramanan P., Cárdenas W.B., Amarasinghe G.K., Volchkov V.E., Basler C.F. Mutations abrogating VP35 interaction with double-stranded RNA render Ebola virus avirulent in guinea pigs. J. Virol. 2010; 84(6):3004-15.

39. Saijo M., Niikura M., Morikawa S., Ksiazek T.G., Meyer R.F., Peters C.J., Kurane I. Enzyme-linked immunosorbent asseys for detection of antibodies to Ebola and Marburg viruses using recombinant nucleoproteins. J. Clin. Microbiol. 2001; 39(1):1-7.

40. Shahhosseini S., Das D., Qiu X., Feldmann H., Jones S.M., Suresh M.R. Production and characterization of monoclonal antibodies against different epitopes of Ebola virus antigens. J. Virol. Methods. 2007; 143(1):29-37.

41. Takada A., Watanabe S., Okazaki K., Kida H., Kawaoka Y. Infectivity-Enhancing Antibodies to Ebola virus glycoprotein. J. Virol. 2001; 75(5):2324-30.

42. Takada A., Feldmann H., Stroeher U., Bray M., Watanabe S., Ito H., McGregor M., Kawaoka Y. Identification of protective epitopes on ebola virus glycoprotein at the single amino acid level by using recombinant vesicular stomatitis viruses. J. Virol. 2003; 77(2):1069-74.

43. Takada A., Feldmann H., Stroeher U., Bray M., Watanabe S., Ito H., McGregor M., Kawaoka Y. Identification of protective epitopes on ebola virus glycoprotein at the single amino acid level by using recombinant vesicular stomatitis viruses. J. Virol. 2003; 77(2):1069-74.

44. Towner J.S., Sealy T.K., Khristova M.L., Albariño C.G., Conlan S., Reeder S.A., Quan P.L., Lipkin W.I., Downing R., Tappero J.W., Okware S., Lutwama J., Bakamutumaho B., Kayiwa J., Comer J.A., Rollin P.E., Ksiazek T.G., Nichol S.T. Newly Discovered Ebola Virus Associated with Hemorrhagic Fever Outbreak in Uganda. PLoS Pathog. 2008; 4(11):e1000212.

45. Volchkov V.E., Volchkova V.A., Slenczka W., Klenk H.D., Feldmann H. Release of viral glycoproteins during Ebola virus infection. Virology. 1998; 245(1):110-9.

46. Volchkova V.A., Klenk H.D., Volchkov V.E. Delta-peptide is the carboxy-terminal cleavage fragment of the nonstructural small glycoprotein sGP of Ebola virus. Virology. 1999; 265(1):64-71.

47. Wilson J.A., Bray M., Bakken R., Hart M.K. Vaccine potential of Ebola virus VP24., VP30., VP35 and VP40 proteins. Virology. 2001; 286(2):384-90.

48. Wolf K., Beimforde N., Falzarano D., Feldmann H., Schnittler H.J. The Ebola virus soluble glycoprotein (sGP) does not affect lymphocyte apoptosis and adhesion to activated endothelium. J. Infect. Dis. 2011; 204(3):947-52.

49. Yu J.S., Liao H.X., Gerdon A.E., Huffman B., Scearce R.M., McAdams M., Alam S.M., Popernack P.M., Sullivan N.J., Wright D., Cliffel D.E., Nabel G.J., Haynes B.F. Detection of Ebola virus envelope using monoclonal and polyclonal antibodies in ELISA, surface plasmon resonance and a quartz crystal microbalance immunosensor. J. Virol. Methods. 2006; 137(2):219-28.

50. Zinzula L., Esposito F., Mühlberger E., Trunschke M., Conrad D., Piano D., Tramontano E. Purification and functional characterization of the full length recombinant Ebola virus VP35 protein expressed in E. coli. Protein Expr. Purif. 2009; 66(1):113-9.


Обзор

Фотография жизнерадостного молотоголового крылана, потенциального переносчика вируса Эбола.

Автор
Редакторы


Партнер номинации — компания SkyGen: передовой дистрибьютор продукции для life science на российском рынке.

Генеральный партнер конкурса — международная инновационная биотехнологическая компания BIOCAD.

Рисунок 1. Информационный плакат о вирусе Эбола.

Геморрагическая лихорадка Эбола — острая вирусная болезнь с высокой заразностью, которая характеризуется развитием тромбогеморрагического синдрома. Он выражается в снижении числа лейкоцитов (белых кровяных тел, частично отвечающих за иммунитет) у больного и, как следствие, — в уменьшении сопротивляемости организма инфекции; а затем и в снижении количества тромбоцитов, что приводит к нарушению свертываемости крови и, нередко, нарушению целостности сосудистой стенки и кровоизлияниям.

Вирус Эболы (рис. 1, 2) вызывает тяжелое заболевание с острым течением, которое обладает близкой к абсолютной летальностью в отсутствие лечения и средней — порядка 60% от всех заболевших — для пациентов, получающих симптоматическое лечение [1]. Распространяясь через физиологические жидкости больных или умерших людей и животных, а также через загрязненные биологическим материалом предметы, болезнь быстро поражает членов одной семьи или деревни после проявления симптомов инфекции. Низкая плотность населения в Африке — один из немногих естественных барьеров для передачи болезни, но представьте только потенциальную активность этого потрясающего патогена в городских условиях развитых стран! Вирус также разносится естественными носителями, обитателями влажных тропических лесов — крыланами (рис. 3), очаровательными летучими мышами, употребляемыми местными жителями в пищу.

Рисунок 2. Схема структуры вируса Эбола с изображением вирусной РНК и относительным расположением участков, кодирующих его элементы.

Рисунок 3. Крылан молотоголовый, естественный носитель вируса Эболы.

На первом этапе, наступающем через 6–10 дней после контакта с зараженным материалом [2], заболевшие (рис. 4) испытывают симптомы, схожие с другими распространенными в тропических странах заболеваниями, такими как малярия, тифоидная лихорадка (брюшной тиф) и менингит. А именно, у больного наблюдаются повышенная утомляемость, слабость, лихорадка с повышением температуры свыше 38 о С и боли в теле. Спустя еще некоторое время проявляются симптомы обыкновенных кишечных инфекций — тошнота, боли в животе, рвота и диарея.

Рисунок 4. Две медсестры около кровати с больным лихорадкой Эбола. Позднее пациент скончался.

Настоящий ад для заболевших начинается примерно через неделю после проявления первых характерных симптомов. До этого момента, без возможности сделать ПЦР-тест, геморрагическую лихорадку Эбола невозможно обнаружить.

Q-ПЦР (или количественная полимеразная цепная реакция ) — метод молекулярной биологии, позволяющий создать копии определенного фрагмента ДНК из исходного образца, повысив его содержание в пробе на несколько порядков. Он применяется с целью увеличения количества РНК вирусных частиц в пробе и их последующего детектирования посредством взаимодействия с флуоресцентным красителем и регистрации излучения оптическими системами.

Через неделю после проявления первых симптомов лихорадки у больных начинается стадия обильных кровотечений. Вирус Эбола вызывает некоторое снижение свертываемости крови, что в условиях жизни африканских народов в естественном ареале распространения инфекции может провоцировать сильные кровотечения в желудочно-кишечном тракте из-за особенностей слизистых оболочек тонкого и толстого кишечника в десяти процентах случаев, а обильное кровотечение из прочих слизистых — практически в каждом втором. Это приводит к наличию крови в рвоте, кашле и стуле, что многократно повышает заразность заболевания [4].

Как же трактовать частоту появления кровоизлияний? С точки зрения чистой статистики, одна десятая численности — небольшое количество, однако это потенциальные три сотни человек при многотысячной вспышке, подобной той, что была последней в ДРК на текущий момент, которые могут истекать кровью на улице, загрязнять предметы зараженной кровью и разносить инфекцию по округе. Слоняясь в умирающих деревнях, они могут неумышленно распространить вирус на людей, остановившихся с целью помочь и облегчить страдания кажущегося раненным измученного африканца. Инкубационный период болезни вполне может позволить таким туристам покинуть очаг эпидемии.

Именно этот обзор привлек внимание и вызвал оправданное беспокойство нескольких групп эпидемиологов, в том числе американских, к опасности заболевания, возбудитель которого был быстро отнесен к первой группе патогенности.

Рисунок 5. Карта распространения вируса Эбола во время вспышки в 2013–2016 годах.

Текущая обстановка в регионах распространения заболевания остается напряженной: вспышка 2018–2019 годов окончилась при поддержке экспериментальных вакцин как на основе модифицированной ДНК, содержащей гены нуклеопротеинов и гликопротеинов вируса Эболы, так и посредством наиболее свежих на тот момент разработок — векторных вакцин на основе рекомбинантных вирусов .

Параллельно с этим больным оказывалась симптоматическая медицинская помощь в полевых госпиталях и предоставление гуманитарной помощи для находящихся на карантине пострадавших стран. К несчастью, испытания и лечение больных сопровождались вооруженными нападениями на госпитали из-за продолжающейся гражданской войны в ДРК, что неоднократно подрывало миссию медиков и поиск эффективного лечения заболевания и тестирования противовирусных препаратов [8].

Что же такое Инмазеб?

Данный трехкомпонентный препарат состоит из натуральных человеческих специфических антител, которые взаимодействует с гликопротеинами вируса Эбола и блокируют его внедрение в клетки человека, что способствует снижению скорости репликации вирусных частиц и уменьшает тяжесть течения заболевания [10]. В сочетании с имеющимися протоколами лечения болезни, вызываемой вирусом Эбола, это значительно увеличивает эффективность терапии.

Антитела — это крупные глобулярные белки плазмы крови, выделяемые плазматическими клетками иммунной системы и предназначенные для нейтрализации клеток патогенов (бактерий, грибов, многоклеточных паразитов) и вирусов, а также белковых ядов и некоторых других чужеродных веществ. Каждое антитело распознает уникальный элемент патогена, отсутствующий в самом организме, — антиген, а в пределах данного антигена — определенный его участок. Связываясь с антигенами на поверхности патогенов, антитела могут либо непосредственно нейтрализовать их, либо привлекать другие компоненты иммунной системы, чтобы уничтожить чужеродные клетки или вирусные частицы.

Для нейтрализации перечисленных выше патогенов организмом вырабатывается смесь антител, направленных на специфическое связывание с инородными веществами, однако в ряде случаев, а именно — при создании медицинских препаратов узкого спектра действия требуется выделить один компонент из настоящего сонма различных белков, продуцируемых клетками иммунной системы с весьма ограниченным сроком жизни.

Рисунок 6. Строение и типы антител с указанием структурно значимых участков.

О потенциально успешном применении моноклональных антител сообщалось во время ранних клинических препарата ZMapp для лечения лихорадки Эбола [16], и хотя его эффективность не была полностью подтверждена, именно усилия создателей данного лекарственного средства и несколько спасенных жизней показали один из возможных путей борьбы с данной инфекцией. Так начались поиски эффективного типа антител для подавления или ослабления вируса с целью облегчения течения болезни и ее лечения.

Впервые препарат REGN-EB3 был применен в качестве экспериментального лечения во время вспышки заирского эболавируса в 2018 году как на взрослых пациентах, так и на детях параллельно с проведением третьей части клинических испытаний препарата [17]. Согласно данным предварительных исследований, рекомендуемая дозировка для каждого компонента препарата составила 50 мг/кг, однако по завершении вспышки и сбора данных рекомендуемая дозировка была поднята до 100 мг/кг. Препарат разводят перед применением и однократно вводят пациенту внутривенно [18].

Научная сторона исследований

Препарат REGN-EB3, состоящий из антител атолтивимаб (REGN3470), мафтивимаб (REGN3479) и одесивимаб (REGN3471), показал высокое сродство к гликопротеинам вируса Эболы как in silico — при моделировании его активности путем молекулярного докинга, — так и in vivo — при испытании на животных и на людях. Данные электронной микроскопии показали, что при одновременном применении трех типов антител, их связывание с гликопротеином происходит на различных участках, что полностью изменяет свойства белка [18].

Антитела группы атолтивимабов и мафтивимабов успешно нейтрализовали псевдовирусные частицы (клетки, снабженные гликопротеинами вируса Эболы) при сравнительно небольших концентрациях в крови, однако применение одного одесивимаба имело несколько меньший эффект, несмотря на его наибольшее сродство к белковой структуре антигена. Одновременное применение препарата, содержащего все три группы антител, показало полную защиту подопытных животных от летального исхода на пятый, восьмой и одиннадцатый день течения болезни в сравнении с контрольной группой, которой препарат не вводили [18], [19]. Последовательное изучение влияния дозировок препарата на эффективность лечения показало, что минимальная эффективная доза в 100 мг/кг является наименьшей для лучшего контроля за симптомами инфекции [19].

В ходе клинических испытаний препарата, проведенных во время вспышки 2018–2019 годов в ДРК, было обнаружено снижение средней летальности с 50 до 27% и уменьшение общей вирулентности патогена в ходе мутаций в естественной среде обитания, что, несомненно, показывает эффективность препарата в лечении заболевания, однако все еще предполагает комбинированную терапию для достижения наилучшего результата с минимальным количеством летальных исходов.

Обнаруженные во время клинических испытаний побочные эффекты от применения препарата REGN-EB3 включали в себя лихорадку, озноб, тахикардию, учащенное дыхание и другие симптомы (рис. 6), характерные для геморрагической лихорадки Эбола средней тяжести. Полное описание свойств и особенностей представлено на странице 177 опубликованного отчета [9].

Дальнейшие планы

Согласно данным Национальной библиотеки медицины США, протокол клинических испытаний NCT03576690 был одобрен к проведению 14 октября 2020 года, и по настоящее время проводится проверка препарата для лечения болезни, вызываемой заирским эболавирусом, в рамках расширенных клинических испытаний. К исследованиям допускаются люди всех возрастов и полов, которые имеют положительный результат ПЦР-теста и не обладают противопоказаниями к применению представленного протокола лечения геморрагической лихорадки Эбола. Также стоит отметить разрешение от Управления по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США на включение в перечень допущенных до тестирования субъектов беременных женщин, инфицированных вирусом Эбола.

Несмотря на наличие вакцины от болезни, вызываемой вирусом Эбола у многих стран мира, считается, что ей необходимы дополнительные клинические испытания на людях. Параллельно с этим проводятся расширенные клинические исследования препарата моноклональных антител для терапии больных людей. Всё вместе это отражает стремление ученых к созданию не только средств для предотвращения поражения людей этим смертельно опасным вирусом, но и способов лечения для лиц в зоне риска, а именно — жителей Западной Африки, находящихся далеко от пунктов медицинской помощи. Создание единого комплекса мер по противодействию лихорадке Эбола может стать одним из ключей, необходимых жителям африканских республик для дальнейшего развития в неблагоприятных условиях жизни.


Обзор

Моноклональные антитела, которые можно выработать против практически любого природного антигена, широко используются как в молекулярной биологии и биохимии, так и в медицине.

Авторы
Редакторы

Эта статья посвящена замечательному достижению современной иммунологии — методу гибридóм. Соматический гибрид нормальной антителообразующей и опухолевой клеток (гибридóма) дает потомство, обладающее бессмертием опухолевой клетки и способностью к синтезу антител, унаследованному от клетки нормальной. Гибридомы продуцируют огромное количество моноклональных антител, обладающих уникальной специфичностью.

При введении в организм животных и человека чужеродных макромолекулярных веществ — белков или полисахаридов (антигенов) в крови появляются защитные белки — антитела, для которых характерна необыкновенная, уникальная специфичность. Каждое антитело узнает только свой антиген, точнее, одну его детерминантную группу. Детерминантная группа состоит из нескольких остатков аминокислот или сахаров (обычно из 6–8), образующих пространственную структуру, характерную для данного белка. В одном белке, состоящем из нескольких сот аминокислот, имеется несколько (5–15) разных детерминант, поэтому к одному белку образуется целое семейство различных по своей специфичности антител. Даже к одной детерминанте образуется целый спектр антител, отличающихся по структуре, степени специфичности и прочности связывания с ней. То же относится и к полисахаридным антигенам, детерминантные группы которых образуются 3–6 остатками моносахаридов.

Таким образом, при введении антигена возникает большое семейство антител, направленных к разным его детерминантам и различающихся также внутри группы антител, направленных к одной и той же детерминанте. В крови иммунизированных животных появляется богатый и уникальный по составу спектр антител, который и обеспечивает их абсолютную специфичность в распознавании данного антигена.

Антитела давно и широко используются для нейтрализации бактериальных токсинов (дифтерийного, столбнячного), змеиных ядов (кобры, гадюки), вирусов, попавших в кровь (особенно эффективно для вируса кори), и для идентификации индивидуальных белков (и других антигенов), находящихся в клетке или сложнейших тканевых экстрактах. Однако иногда требуются не многокомпонентные смеси антител, возникающие в крови в ответ на введение антигена, а отдельные, элементарные составляющие этой смеси, направленные лишь к одной детерминанте антигена и имеющие одни и те же характеристики. Такие антитела бывают нужны как для изучения их собственной природы, так и для практического использования, например для доставки в опухоли токсических веществ.

Как получить такие антитела?

Очевидно, что путем иммунизации, то есть введением животному индивидуального антигена или только одной его детерминантной группы, это сделать, как правило, невозможно. Почему? Дело в том, что в организме в процессе созревания антителообразующих клеток (АОК) образуется большое количество (миллионы) генетически однородных семейств клеток — клонов, каждый из которых специализируется на синтезе только одного варианта антител, и в этом причина большого разнообразия антител, индуцируемых даже одним антигеном. Таких клонов много больше, чем требуется антител для распознавания любого, случайно взятого антигена. Антиген, попадая в организм, стимулирует размножение тех клонов, которые продуцируют антитела к его детерминантам.

Казалось бы, выход прост: надо вырастить отдельные клоны антителообразующих клеток in vitro — в культуре тканей — и они будут продуцировать моноклональные антитела, то есть антитела одной строго определенной специфичности, продукт одного клона. Но и это оказалось невозможным: нормальные клетки смертны, вскоре после высаживания в культуру они погибают. Дело не доходит до образования клонов АОК. Добавление в культуру факторов роста несколько продлевает их жизнь, но тоже не решает проблемы.

Дорогу указывают опухоли

Слишком редки были совпадения. Тогда попробовали индуцировать опухоли антителообразующих клеток опухолеродными вирусами. Результаты были лучше, однако создать простой и универсальный метод получения моноклональных антител на этом пути также не оказалось возможным.

Как это было сделано?

Успех пришел, как всегда, неожиданно, как побочный продукт исследования, имевшего иные цели. В начале 70-х годов молодой немецкий иммунолог Жорж Кёлер, получивший стипендию для работы в знаменитом Базельском институте иммунологии, заинтересовался вопросом о генетической изменчивости антител. В то время можно было ожидать, что антитела мутируют (генетически изменяются) с бóльшей частотой, чем другие белки. Для исследования надо было изолировать клон АОК, продуцирующий антитела определенной специфичности, получить из него стабильную клеточную линию, поддерживаемую в пробирке (в культуре), и проследить, с какой частотой появятся там генетически измененные варианты. Для реализации проекта Кёлер поехал в Англию, в лабораторию Сезара Мильштейна, изучавшего клоны плазмоцитом, и они вместе разработали оригинальный подход к этой проблеме: решили получить гибрид нормальной АОК и опухолевой клетки. В случае успеха такой гибрид унаследовал бы от нормальной клетки способность к синтезу антител, а от опухолевой — бессмертие и способность к неограниченному и бесконтрольному росту. Это им удалось осуществить.

Гибридóмы

Методы гибридизации соматических (то есть не половых) клеток к тому времени были хорошо известны и широко применялись для разных целей. Для этого использовали вирус, способствующий слиянию клеток. Разнородные клетки, у которых слились оболочки, образовывали двуядерные гибриды, которые сохраняли способность к клеточным делениям. В процессе клеточного деления хромосомы обоих ядер перемешивались и образовывали общее ядро. Таким образом, возникал истинный гибрид, потомок двух соматических клеток, или гибридóма. Гибридому можно получить и между нормальной АОК и опухолевой, плазмоцитомной клеткой. Плазмоцитома была взята потому, что она больше всего соответствовала АОК по типу дифференцировки: весь ее синтетический аппарат был настроен на синтез иммуноглобулинов. Проблема заключалась в том, как отделить заданную гибридому от присутствующих в системе отдельных неслившихся клеток и от гибридов иного состава или иной специфичности, чем требуемые.

Для достижения этой цели авторы разработали специальную схему, использующую отбор клеток в селектирующей среде. Прежде всего был получен особый мутант мышиной плазмоцитомы, рост которого можно было контролировать составом питательной среды. Для получения мутанта использовали особенности синтеза нуклеиновых кислот (ДНК и РНК), имеющихся во всех клетках и необходимых для их существования. Известно, что имеются два пути синтеза предшественников нуклеиновых кислот: основной и резервный. Основной — это путь новообразования нуклеотидов (звеньев, входящих в состав нуклеиновых кислот). Этот путь включает несколько этапов и блокируется противоопухолевым препаратом аминоптерином (А). Однако клетки не гибнут от этого препарата, поскольку обладают резервным путем — способностью синтезировать нуклеотиды и нуклеиновые кислоты, реутилизируя продукты распада ранее синтезированных нуклеиновых кислот: гипоксантина (Г) и тимидина (Т). Добавление Г и Т в питательную среду, содержащую А, снимает токсический эффект последнего.

Для селекции гибридом надо было получить мутант плазмоцитомы, не способный пользоваться резервным путем и, следовательно, погибающий в среде, содержащей Г, A и T (ГАТ-среда). Такой мутант получили путем добавления в среду токсических аналогов Г и Т. Все клетки, способные усваивать Г и Т, включали их токсичные аналоги и погибали. Выживали лишь те редкие мутанты, которые были неспособны усваивать Г и Т, то есть были лишены резервного пути. Из потомства этих клеток дополнительно отбирали еще и такие мутанты, которые утратили способность к синтезу собственных иммуноглобулинов. Теперь все было готово для получения гибридом, то есть гибридов нормальных АОК и плазмоцитомных клеток (рис. 1).


Рисунок 1. Схема получения гибридом. Условные обозначения: А, В, С — многокомпонентная смесь антигенов, использованная для иммунизации; АОК — антителообразующие клетки селезенки; Пл — клетки плазмоцитомы, не растущие в селективной ГАТ-среде; ПЭГ — полиэтиленгликоль; ГАТ — среда, содержащая гипоксантин, аминоптерин, тимидин; анти-А, анти-В, анти-С — моноклональные антитела соответственно к А-, В-, С-антигенам.

Мышей интенсивно иммунизировали определенным материалом — белком, бактериальной клеткой или клеткой животного происхождения. Когда в их крови появлялись антитела, у них брали селезенку и лимфатические узлы (места скопления АОК), и из них готовили взвесь клеток. К ней добавляли в избытке клетки мутантной плазмоцитомы и полиэтиленгликоль (ПЭГ). После короткой инкубации, требующейся для слияния клеток, их отмывали от ПЭГа и помещали в среду, содержащую Г, Т и А (ГАТ-среда). Теперь в системе находились гибриды АОК и АОК, АОК и плазмоцитомы, а также оставшиеся свободными АОК и клетки плазмоцитомы. Из них нужно было отобрать только гибриды АОК и плазмоцитомы. После недолгого (несколько дней) культивирования одиночные АОК, а также гибриды АОК и АОК погибали, так как нормальные клетки смертны и быстро погибают в культуре.

Плазмоцитомные клетки и их гибриды также погибали, так как А блокировал основной путь синтеза предшественников нуклеиновых кислот, а Г и Т их не спасали. Выживали, следовательно, только гибриды АОК и плазматических клеток, так как бессмертие они унаследовали от плазмоцитомы, а резервный путь — от нормальной клетки. Такие гибриды — гибридомы — сохраняли способность синтезировать и секретировать антитела.

Моноклональные антитела


Рисунок 2. Иммунофлуоресцентное окрашивание клетки соединительной ткани (фибробласта) моноклональным антителом к тубулину — белку микротрубочек, образующих скелет клетки.

Применение


Рисунок 3. Последовательные срезы через желудок (жел) и пищевод (пищ) мыши, окрашенные двумя моноклональными антителами: 1 — первое моноклональное антитело реагирует с эпителием пищевода и слабее с эпителием желудка; 2 — второе моноклональное антитело реагирует только с эпителием желудка.

Обычные поликлональные антитела давно и широко применяются для определения биологически активных веществ — белков крови и других биологических жидкостей, гормонов, ростовых факторов, клеточных рецепторов, медиаторов воспаления и иммунитета, бактериальных и вирусных антигенов, различных ядов и т.п. Моноклональные антитела из-за высочайшей специфичности, стандартности и технологичности получения успешно вытесняют и заменяют иммунные сыворотки.

Первоначально статья была опубликована в Соросовском образовательном журнале [1], позже — на сайте автора.

Синтетические моноклональные антитела

Автор дополнительной главы — Жанна Олиферова.

Описанный выше метод гибридом позволил получать неограниченное количество моноклональных антител, специфичных к одной детерминантной группе. Их широкое применение в медицине и иммунологии поставило новые задачи:

  1. Мышиные антитела плохо подходят для использования в клинической практике — они вызывают иммунный ответ в организме человека точно так же, как введённый антиген приводит к выработке антител у мышей, из-за чего они быстро удаляются из организма. Стремление создать полностью человеческие антитела для клинической практики стало стимулом для разработки новых технологий.
  2. Иммунизация — необходимое условие для получения гибридомы, но не все молекулы могут легко активировать АОК. Например, они могут быть слишком токсичны для введения мышам. Каждая гибридома производит антитело только к одной детерминанте, но не всегда можно выбрать антитела с необходимой специфичностью к нужному белку даже из большого количества гибридом. Например, у исследователя могут быть такие требования к антителам: специфически связываться только с одним из двух похожих белков или узнавать только одну конформацию белка. Получить такие антитела при помощи метода гибридом очень трудно, потому что при иммунизации антитела могут вырабатываться к антигенным детерминантам, которые одинаковы у двух белков, так как они расположены на поверхности и более доступны для связывания антител. Требовался новый метод, который бы позволил получать антитела нужной аффинности и специфичности, не прибегая к иммунизации мышей.

Появление такого метода стало возможном благодаря развитию нескольких научных направлений. Прежде всего этому способствовал прогресс в понимании структуры и функции антител. Какой механизм обусловливает высокую аффинность и специфичность антител, которые производит гибридома? Во время дифференцирования B-лимфоцитов (в процессе соматической генетической рекомбинации) нуклеотидная последовательность гена, кодирующего вариабельный домен B-клеточного рецептора, собирается из нескольких сегментов (рис. 4). Эта последовательность уникальна у каждой B-клетки, как и рецепторы на её поверхности. Когда B-клетка узнаёт свой антиген, она активируется и становится АОК, часть из которых сразу начинает производить антитела низкой аффинности. Рецепторы других АОК проходят процесс аффинного созревания, в результате которого аффинность и специфичность рецептора АОК, а, следовательно, и антител, повышается.

Строение антител

Аффинное созревание основано на соматической гипермутации, в процессе которой в последовательности вариабельных доменов рецепторов специальные белки вносят 1–5 мутаций на каждое деление клетки. Большинство мутаций приводит к тому, что B-клетка перестает узнавать антиген и погибает. Редкие мутации повышают аффинность рецептора к антигену (такие мутации накапливаются в CDR-участках), и B-клетки, несущие такие рецепторы, выживают, размножаются и производят антитела с высокой аффинностью и специфичностью [7], [8]. К сожалению, этот процесс ещё недостаточно хорошо изучен, чтобы его можно было контролировать в пробирке и таким образом получать антитела с нужной специфичностью.

Развитие методов генной инженерии привело к появлению новых возможностей: вариабельные и константные участки генов, кодирующих антитела, можно комбинировать в пробирке, вносить в них мутации, отбирать необходимые варианты и экспрессировать в бактериях. Так можно получать антитела с нужными свойствами, не иммунизируя мышей. Для того чтобы это стало реальностью, сначала надо было создать библиотеки вариабельных доменов антител. Начало этому было положено в 1989 году, когда соответствующие гены были выделены из пяти гибридом и из активированных клеток селезёнки иммунизированных мышей. Эти гены были клонированы, и были определены их нуклеотидные последовательности. В настоящее время для создания библиотек используют вариабельные домены наивных (неактивированных) лимфоцитов мышей или человека и даже комбинируют фрагменты природных вариабельных доменов с синтезированными человеком [9].

В 1988 году Fab-фрагмент антитела впервые был экспрессирован в бактерии. Чтобы создавать антитела без использования гибридом, оставалось решить последнюю задачу: физически связать между собой антитело и кодирующий его ген, тогда выбрав из библиотеки антитело, специфичное к данной молекуле, можно клонировать его ген для экспрессии в бактерии и получать нужное количество антител. В 1990 году Г. Винтер и соавторы встроили в геном бактериофага нуклеотидную последовательность Fab-фрагмента антитела, объединив его с частью гена поверхностного белка III этого фага [10]. Это позволило экспрессировать на поверхности каждой вирусной частицы несколько копий этого гибридного белка, сохраняющего специфичность к своему антигену, — а значит, можно было проводить селекцию нужного антитела из фаг-дисплейной библиотеки (рис. 5). Один раунд селекции может увеличить частоту фага, специфичного к данному антигену, в 1000 раз. За несколько раундов можно из большой популяции выделить редкие фаги, специфичные к данному антигену, извлечь из них ДНК, определить нуклеотидную последовательность и клонировать для получения антител в бактерии.


Рисунок 5. Фаг-дисплейные библиотеки. Бактериофаги, несущие миллионы различных фрагментов антител, наносят на колонку, содержащую нужный антиген (1). После отмывания ненужных фагов (2), те, которые связывают данный антиген (3), снимают с колонки и размножают в бактериях (4). Нуклеотидная последовательность отобранных фагов может быть модифицирована (5), после чего мутированные фаги размножают в бактериях (6) и повторяют процесс селекции (7).

Кристаллографические структуры комплексов антиген—антитело позволили понять принципы организации, стоящие за кажущимся бесконечным разнообразием природных антител [11], [12]. Например, за исключением CDR-участков, структура антител довольно консервативна: известно всего несколько десятков различных структур, некоторые из которых более стабильны и встречаются в природных антителах чаще. При создании современных фаг-дисплейных библиотек выбирается одна наиболее стабильная структура вариабельных доменов тяжёлой и легкой цепи, разнообразие аминокислотных остатков CDR-участков создаётся искусственно [12]. Анализ природных антиген-связывающих сайтов антител выявил, что наиболее часто непосредственно взаимодействуют с поверхностью антигена аминокислотные остатки тирозин (Tyr) и серин (Ser), поэтому первые библиотеки синтетических антител получали, варьируя именно эти остатки в ключевых позициях CDR. В последующих поколениях библиотек начали варьировать также остатки, которые не взаимодействуют с поверхностью антигена непосредственно, но влияют на конформацию CDR-участков. Современные библиотеки содержат более 10 миллиардов фрагментов антител с уникальной специфичностью [12].


Приведённый пример показывает, что развитие современных методов производства моноклональных антител превратило их в чрезвычайно точный научный инструмент, с помощью которого будет сделано ещё немало интересных открытий.


Новость

Животные тоже страдают от лихорадки Эбола и являются ее переносчиками. ZMapp — новое лекарство против вируса — защищает макак рузусов со 100% эффективностью и уже спасает жизни людям.

Автор
Редакторы


Вирус Эбола вызывает смертоносную лихорадку

В 2014 году вновь произошла вспышка вируса Эбола. В Гвинее, где раньше такая болезнь не встречалась, появился и быстро распространился новый вариант вируса, несмотря на помощь международных медицинских организаций [4]. Вспышку вируса удалось приостановить только спустя 5 месяцев. К 31 августа 2014 года насчитывалось 3685 случаев заражения; из них 1841 — с летальным исходом [5]. Вирус широко распространился по таким странам, как Гвинея, Нигерия, Либерия и т.д. Полагают, что вспышка будет продолжаться еще, по крайней мере, несколько месяцев.

Вакцины, которая прошла бы клинические испытания, или другого лекарства против вируса Эбола на данный момент нет. Поэтому заразившихся людей лечат с помощью простого ухода за ними, а также их изолируют, чтобы предотвратить распространение болезни. Но все-таки без вакцины для больных можно сделать лишь немногое.

Попытки разработать вакцину ведутся уже давно. Были испробованы различные методы лечения. Однако большинство лекарств оказывались неэффективными, если их применяли не сразу, а спустя хотя бы сутки после заражения. Очень важным было найти средство, которое помогало бы после явного проявления симптомов и установления диагноза. Хорошее лекарство должно побеждать вирус даже спустя несколько дней его пребывания в организме. Недавно ученым удалось разработать средство, которое исцеляет макак резусов со 100% эффективностью, если его вводить животным в течение пяти дней после заражения [6]. Этим средством против вируса Эбола оказалась смесь различных моноклональных антител.

Принцип действия моноклональных антител

Что же это за лекарство? Моноклональные антитела [7] — это белковые молекулы, одна часть которых связывает вирус, а вторая привлекает к нему факторы иммунной системы (рис. 1). Самостоятельно организм вырабатывает антитела против вируса слишком долго. Во-первых, филовирусы, к которым относится вирус Эбола, обладают защитным гликопротеиновым слоем (рис. 2), а во-вторых, они кодируют белок, который, предположительно, подавляет иммунитет [2]. А если вводить уже готовые антитела против вируса Эбола, то иммунитет срабатывает практически мгновенно. В борьбу с болезнью вступают клетки крови — так называемые естественные киллеры. Также активируется система комплемента [8]. Вместе с антителами больному вводят еще одно вещество — адъювант. В состав адъюванта входят инактивированные частицы другого вируса. Он еще больше возбуждает иммунную систему, заставляя ее работать активней.

Моноклональные антитела направляют клетки иммунной системы на свою мишень

Рисунок 1. Моноклональные антитела направляют клетки иммунной системы на свою мишень

Вирус Эбола

Рисунок 2. Вирус Эбола и близкий ему вирус Марбург являются представителями семейства филовирусов (Filoviridae), возбудителей острой геморрагической лихорадки у человека — заболевания, приводящего к смерти пациентов с частотой до 90%, в зависимости от конкретного штамма вируса. Эбола заражает преимущественно клетки эндотелия сосудов, а также некоторые клетки иммунной системы и печени. Среди симптомов заболевания — жар, головная боль, кровоточение слизистых, боль в мышцах, кашель, обезвоживание.

Коктейль антител против вируса Эбола назвали ZMapp. Он прошел доклинические испытания, результаты которых оказались оптимистичны. Зараженные приматы выздоравливали. Важно, что когда животным вводили антитела, симптомы у них проявлялись уже ярко: лекарство оказывало действие при приеме спустя 72 часа после заражения. Значит, применение ZMapp оставляет достаточно времени для диагностики.

Скажем спасибо обезьянам

Доклинические испытания проводили на макаках. И это вселяет надежду, что и для человека испытанное лекарство также подойдет. Макаки резусы эволюционно довольно близки к людям, как и приматы в целом, по сравнению с другими млекопитающими. Это подтверждается и по сходству многих белков: например, α-цепи гемоглобина у нас и у макак резусов отличаются всего тремя аминокислотами, в то время как у нас и у мыши — уже четырнадцатью [9]. Макаки резусы широко распространены, хорошо адаптируются к людям, городам и вивариям, что делает их удобным объектом изучения. На них проводят медицинские и нейробиологические исследования (в частности, изучают влияние марихуаны на иммунную систему), и даже их геном расшифровали первым [10]. Словом, исследований проведено множество, и уже не новость, что реакцию макак резусов на лекарство принимают, как близкую к человеческой.

Так, с помощью обезьян было получено лекарство, которое увеличивает вероятность выздоровления приматов при заражении вирусом Эбола до 100%. Однако стоит отметить, что в ходе тестирования препарата выявили, что у одного из животных на третий день после инфицирования вирусов в крови было в 100 раз больше, чем у других. Для этой особи обычной дозы антител оказалось недостаточно для выздоровления. Такой случай говорит о том, что течение и развитие болезни зависит от индивидуальных свойств каждого организма.

Дальнейшие перспективы использования моноклональных антител

Тем не менее, моноклональные антитела несут в себе большой потенциал для медицины. Их даже рассматривают как возможное средство защиты от биологического оружия. А успешное применение антител против вируса Эбола у приматов позволяет надеяться, что вскоре удастся спасти и жизни множества людей. С помощью ZMapp уже излечились от лихорадки Нэнси Райтбол и Кент Брэнтли (рис. 3).

Нэнси Райтбол и Кент Брэнтли

Рисунок 3. Американцы Нэнси Райтбол и Кент Брэнтли испытали на себе действие ZMapp — нового лекарства против вируса Эбола


Новость

Животные тоже страдают от лихорадки Эбола и являются ее переносчиками. ZMapp — новое лекарство против вируса — защищает макак рузусов со 100% эффективностью и уже спасает жизни людям.

Автор
Редакторы


Вирус Эбола вызывает смертоносную лихорадку

В 2014 году вновь произошла вспышка вируса Эбола. В Гвинее, где раньше такая болезнь не встречалась, появился и быстро распространился новый вариант вируса, несмотря на помощь международных медицинских организаций [4]. Вспышку вируса удалось приостановить только спустя 5 месяцев. К 31 августа 2014 года насчитывалось 3685 случаев заражения; из них 1841 — с летальным исходом [5]. Вирус широко распространился по таким странам, как Гвинея, Нигерия, Либерия и т.д. Полагают, что вспышка будет продолжаться еще, по крайней мере, несколько месяцев.

Вакцины, которая прошла бы клинические испытания, или другого лекарства против вируса Эбола на данный момент нет. Поэтому заразившихся людей лечат с помощью простого ухода за ними, а также их изолируют, чтобы предотвратить распространение болезни. Но все-таки без вакцины для больных можно сделать лишь немногое.

Попытки разработать вакцину ведутся уже давно. Были испробованы различные методы лечения. Однако большинство лекарств оказывались неэффективными, если их применяли не сразу, а спустя хотя бы сутки после заражения. Очень важным было найти средство, которое помогало бы после явного проявления симптомов и установления диагноза. Хорошее лекарство должно побеждать вирус даже спустя несколько дней его пребывания в организме. Недавно ученым удалось разработать средство, которое исцеляет макак резусов со 100% эффективностью, если его вводить животным в течение пяти дней после заражения [6]. Этим средством против вируса Эбола оказалась смесь различных моноклональных антител.

Принцип действия моноклональных антител

Что же это за лекарство? Моноклональные антитела [7] — это белковые молекулы, одна часть которых связывает вирус, а вторая привлекает к нему факторы иммунной системы (рис. 1). Самостоятельно организм вырабатывает антитела против вируса слишком долго. Во-первых, филовирусы, к которым относится вирус Эбола, обладают защитным гликопротеиновым слоем (рис. 2), а во-вторых, они кодируют белок, который, предположительно, подавляет иммунитет [2]. А если вводить уже готовые антитела против вируса Эбола, то иммунитет срабатывает практически мгновенно. В борьбу с болезнью вступают клетки крови — так называемые естественные киллеры. Также активируется система комплемента [8]. Вместе с антителами больному вводят еще одно вещество — адъювант. В состав адъюванта входят инактивированные частицы другого вируса. Он еще больше возбуждает иммунную систему, заставляя ее работать активней.

Моноклональные антитела направляют клетки иммунной системы на свою мишень

Рисунок 1. Моноклональные антитела направляют клетки иммунной системы на свою мишень

Вирус Эбола

Рисунок 2. Вирус Эбола и близкий ему вирус Марбург являются представителями семейства филовирусов (Filoviridae), возбудителей острой геморрагической лихорадки у человека — заболевания, приводящего к смерти пациентов с частотой до 90%, в зависимости от конкретного штамма вируса. Эбола заражает преимущественно клетки эндотелия сосудов, а также некоторые клетки иммунной системы и печени. Среди симптомов заболевания — жар, головная боль, кровоточение слизистых, боль в мышцах, кашель, обезвоживание.

Коктейль антител против вируса Эбола назвали ZMapp. Он прошел доклинические испытания, результаты которых оказались оптимистичны. Зараженные приматы выздоравливали. Важно, что когда животным вводили антитела, симптомы у них проявлялись уже ярко: лекарство оказывало действие при приеме спустя 72 часа после заражения. Значит, применение ZMapp оставляет достаточно времени для диагностики.

Скажем спасибо обезьянам

Доклинические испытания проводили на макаках. И это вселяет надежду, что и для человека испытанное лекарство также подойдет. Макаки резусы эволюционно довольно близки к людям, как и приматы в целом, по сравнению с другими млекопитающими. Это подтверждается и по сходству многих белков: например, α-цепи гемоглобина у нас и у макак резусов отличаются всего тремя аминокислотами, в то время как у нас и у мыши — уже четырнадцатью [9]. Макаки резусы широко распространены, хорошо адаптируются к людям, городам и вивариям, что делает их удобным объектом изучения. На них проводят медицинские и нейробиологические исследования (в частности, изучают влияние марихуаны на иммунную систему), и даже их геном расшифровали первым [10]. Словом, исследований проведено множество, и уже не новость, что реакцию макак резусов на лекарство принимают, как близкую к человеческой.

Так, с помощью обезьян было получено лекарство, которое увеличивает вероятность выздоровления приматов при заражении вирусом Эбола до 100%. Однако стоит отметить, что в ходе тестирования препарата выявили, что у одного из животных на третий день после инфицирования вирусов в крови было в 100 раз больше, чем у других. Для этой особи обычной дозы антител оказалось недостаточно для выздоровления. Такой случай говорит о том, что течение и развитие болезни зависит от индивидуальных свойств каждого организма.

Дальнейшие перспективы использования моноклональных антител

Тем не менее, моноклональные антитела несут в себе большой потенциал для медицины. Их даже рассматривают как возможное средство защиты от биологического оружия. А успешное применение антител против вируса Эбола у приматов позволяет надеяться, что вскоре удастся спасти и жизни множества людей. С помощью ZMapp уже излечились от лихорадки Нэнси Райтбол и Кент Брэнтли (рис. 3).

Нэнси Райтбол и Кент Брэнтли

Рисунок 3. Американцы Нэнси Райтбол и Кент Брэнтли испытали на себе действие ZMapp — нового лекарства против вируса Эбола

Читайте также: