Набор для твердофазной иммуноферментной диагностики африканской чумы свиней
Обновлено: 16.04.2024
Набор предназначен для определения антигенов вируса африканской чумы свиней (АЧС ) в сыворотке крови, цельной крови, селезенке, печени и лимфатических узлах от инфицированных, больных и павших животных, а также в инфицированных культурах клеток.
Набор состоит из следующих компонентов:
1. Планшет для иммуноферментного анализа с адсорбированными в лунках моноклональными антителами к белку VP 73 вируса АЧС — 1 штука.
2. Положительный контроль (К +) – рекомбинантный белок VP 73 вируса АЧС, жидкость от розового до красного цвета, 1,0 см 3 -1 флакон.
3. Отрицательный контроль (К -) — буферный раствор, не содержащий антиген вируса АЧС, жидкость от голубого до синего цвета, 1,0 см 3 — 1 флакон.
4. 20-кратный концентрат фосфатно-солевого буфера с Твином 20 для промывания планшетов (ФСБТ ), прозрачная жидкость, бесцветная или с желтоватым оттенком, 25,0 с м³ — 2 флакона.
5. Буфер для разведения образцов и конъюгата (БР ), жидкость розового цвета, 25,0 см 3 – 1 флакон.
6. Конъюгат — моноклональные антитела к белку VP 73 вируса АЧС, меченные пероксидазой хрена, 50-кратный концентрат, прозрачная жидкость зеленого цвета, 0,3 с м³ — 1 флакон;
7. Субстратный раствор с перекисью водорода для разведения хромогена (СР ), бесцветная прозрачная жидкость, 5,1 см 3 -1 флакон.
8. Хромоген, тетраметилбензидин (ТМБ ), бесцветная прозрачная жидкость, 5,1 см 3 — 1 флакон.
9.1 М серная кислота (Стоп -раствор), бесцветная прозрачная жидкость, 5,1 см 3 — 1 флакон.
Набор рассчитан на проведение одновременного анализа 46 исследуемых проб биоматериала (в 2 повторах) и контрольных проб (в 2 повторах). Компоновка набора допускает возможность дробного использования компонентов для проведения нескольких серий анализов по мере поступления биоматериала.
Время проведения анализа:
3–3,5 часа (не учитывая время подготовки материалов для исследования).
Принцип действия:
Специфические моноклональные антитела к белку VP 73 вируса АЧС, адсорбированные в лунках иммунологического планшета, образуют комплекс с антигеном вируса АЧС, содержащимся в пробе. Образующийся комплекс взаимодействует с конъюгатом (меченые пероксидазой хрена моноклональные антитела к белку VP 73 вируса АЧС). Связанная пероксидаза вызывает разложение находящейся в хромоген-субстратном растворе перекиси водорода и окисление хромогена. В лунках развивается окраска, интенсивность которой прямо пропорциональна количеству антигена в определяемой пробе.
Хранение:
Набор хранить в защищенном от света месте при температуре от 20 до 8°С. Не допускается замораживание компонентов набора.
- Диагностические наборы ИФА
- Тест-системы ПЦР
- ИХМ
- Диагностические наборы РТГА
- Вакцины
- Противопаразитарные средства
Набор для выявления вируса африканской чумы свиней (АЧС) иммуноферментным методом
92 определения (46 в 2-х повторах)
Описание:
Набор предназначен для определения антигенов вируса африканской чумы свиней (АЧС ) в сыворотке крови, цельной крови, селезенке, печени и лимфатических узлах от инфицированных, больных и павших животных, а также в инфицированных культурах клеток.
Набор состоит из следующих компонентов:
1. Планшет для иммуноферментного анализа с адсорбированными в лунках моноклональными антителами к белку VP 73 вируса АЧС — 1 штука.
2. Положительный контроль (К +) – рекомбинантный белок VP 73 вируса АЧС, жидкость от розового до красного цвета, 1,0 см 3 -1 флакон.
3. Отрицательный контроль (К -) — буферный раствор, не содержащий антиген вируса АЧС, жидкость от голубого до синего цвета, 1,0 см 3 — 1 флакон.
4. 20-кратный концентрат фосфатно-солевого буфера с Твином 20 для промывания планшетов (ФСБТ ), прозрачная жидкость, бесцветная или с желтоватым оттенком, 25,0 с м³ — 2 флакона.
5. Буфер для разведения образцов и конъюгата (БР ), жидкость розового цвета, 25,0 см 3 – 1 флакон.
6. Конъюгат — моноклональные антитела к белку VP 73 вируса АЧС, меченные пероксидазой хрена, 50-кратный концентрат, прозрачная жидкость зеленого цвета, 0,3 с м³ — 1 флакон;
7. Субстратный раствор с перекисью водорода для разведения хромогена (СР ), бесцветная прозрачная жидкость, 5,1 см 3 -1 флакон.
8. Хромоген, тетраметилбензидин (ТМБ ), бесцветная прозрачная жидкость, 5,1 см 3 — 1 флакон.
9.1 М серная кислота (Стоп -раствор), бесцветная прозрачная жидкость, 5,1 см 3 — 1 флакон.
Набор рассчитан на проведение одновременного анализа 46 исследуемых проб биоматериала (в 2 повторах) и контрольных проб (в 2 повторах). Компоновка набора допускает возможность дробного использования компонентов для проведения нескольких серий анализов по мере поступления биоматериала.
Время проведения анализа:
3–3,5 часа (не учитывая время подготовки материалов для исследования).
Принцип действия:
Специфические моноклональные антитела к белку VP 73 вируса АЧС, адсорбированные в лунках иммунологического планшета, образуют комплекс с антигеном вируса АЧС, содержащимся в пробе. Образующийся комплекс взаимодействует с конъюгатом (меченые пероксидазой хрена моноклональные антитела к белку VP 73 вируса АЧС). Связанная пероксидаза вызывает разложение находящейся в хромоген-субстратном растворе перекиси водорода и окисление хромогена. В лунках развивается окраска, интенсивность которой прямо пропорциональна количеству антигена в определяемой пробе.
Хранение:
Набор хранить в защищенном от света месте при температуре от 20 до 8°С. Не допускается замораживание компонентов набора.
Набор для выявления антител к вирусу африканской чумы свиней иммуноферментным методом
92 определения (46 в 2 повторах)
Набор рассчитан на проведение одновременного анализа 92 исследуемых проб сыворотки (в 1 повторе) или 46 проб (в 2 повторах).
Компоновка набора допускает возможность дробного использования компонентов для проведения нескольких серий анализов по мере поступления биоматериала.
В состав набора входят:
-планшет для иммуноферментного анализа с адсорбированным в лунках рекомбинантным антигеном р30 вируса АЧС;
— положительный и отрицательный контроли;
— моноклональные антитела к белку р30 вируса АЧС, меченные пероксидазой хрена (Конъюгат – 50-х концентрат);
— неспецифические химические компоненты
Время проведения анализа:
Принцип метода:
Метод основан на конкурентном взаимодействии конъюгированных с пероксидазой хрена моноклональных антител к белку р30 вируса АЧС (конъюгат ) и сывороточных вирусспецифических антител с иммобилизованным в лунках планшета рекомбинантным белком р30.
При отсутствии в исследуемой сыворотке вирусспецифических антител, моноклональный конъюгат свободно взаимодействует с иммобилизованным в лунке белком р30 вируса АЧС и, после добавления ТМБ, в лунке развивается окраска.
Если исследуемая сыворотка содержит вирусспецифические антитела, происходит их взаимодействие с иммобилизованным р30, его частичная или полная блокировка. В результате чего связывание антител конъюгата с антигеном не происходит или происходит частично и, соответственно, окрашивание отсутствует или интенсивность окраски снижается.
Таким образом, интенсивность окраски обратно пропорциональна количеству антител в исследуемой сыворотке.
Хранение:
Набор хранят в защищенном от света месте при температуре от 2 до 8 0 С. Замораживание реагентов набора не допускается.
Отбор проб для вирусологических исследований. Для обнаружения вируса африканской чумы свиней, антигена или генома от павших или убитых с диагностической целью свиней отбирают массой 5-10 г - селезёнку (1/3 часть), портальные, желудочные и подчелюстные (или мезентериальные) лимфоузлы (целиком), лёгкое (5х5 см) и почку (1/3 часть), 3-5 мл крови (или сгусток). Кроме того, рекомендуется в случае аутолизиса трупа отбирать грудинную или трубчатую кость.
Отбор проб для серологических исследований. Минимальное количество проб, которые должны быть отобраны для серологических исследований, рассчитывают с учётом 10%-ой серопревалентности заболевших с 95%ой достоверностью для обследования каждого помещения.
Пробы крови отбирают их полой вены не менее 10 мл от каждой свиньи [3].
Для лабораторных исследований применяют следующие методы: реакцию гемадсорбции (РГАд) в культурах клеток, реакцию прямой иммунофлюоресценции (РПИФ), полимеразную цепную реакцию (ПЦР) в формате электофорезной детекции, ПЦР в формате реального времени, применяют твёрдофазный иммуноферментный анализ (ТФ – ИФА) (сэндвич-вариант). В сомнительных случаях окончательный диагноз устанавливают заражением подозрительным материалом (кровь, суспензия селезенки и лимфатических узлов) свиней, вакцинированных против классической чумы. Заражение свиней (биопроба) проводят в специализированной лаборатории с соблюдением особых мер предосторожности. Серологические типы вируса определяют в реакции преципитации (РП), реакции связывания комплемента (РСК), реакции задержки геамадсорбции (РЗГАд) и другими методами. [2]
Реакция прямой иммунофлуоресценции (РПИФ) ставят в вирусологических лабораториях для прямого обнаружения вирусного антигена в клетках органов свиней, подозреваемых в заражении вирусом африканской чумы свиней. Внутриклеточный антиген обнаруживают люминесцентной микроскопией препаратов мазков-отпечатков, окрашенных ФИТЦ-иммуноглобулинами (специфические антитела к вирусу африканской чумы свиней, меченные флуоресцеинизотиацианатом). Лучшими органами для РПИФ являются селезёнка и лимфоузлы. Исследование может быть выполнено в течение 2-4 час [2].
Оценку результатов микроскопии проводят по условной четырех крестовой шкале при окуляре 10х20-объективе 10. В положительных случаях наблюдают сверкающую, желто-зеленого цвета флуоресценцию клеток с включениями или очаговыми флуоресцирующими комплексами диффузного и гранулярного антигена, в одном из 10-50 полей зрения.
При визуальном учёте реакцию считают положительной при окрашивании хромогенного субстратного раствора в лунках, в которых предварительно инкубировали исследуемые и специфический антиген в сине-зеленый цвет и отсутствии окрашивания субстрата в лунках, в которых предварительно инкубировали нормальный антиген.
Анализ по выявлению вируса АЧС включает выделение ДНК и амплификации специфического фрагмента в полимеразной цепной реакции и электрофорез в агарозном геле [3].
Реакция считается положительной, если полоса в соответствующем треке располагается в геле точно на таком же расстоянии от старта, что и полоса положительного контроля амплификации. Размер апликонов после проведения ПЦР- 485 п.н.
Реакция считается отрицательной, если в соответствующих треках полос не обнаружено или полосы не соответствуют по размеру фрагменту в контрольной пробе (т. е. располагаются на другом расстоянии от старта) [4].
Учёт результатов проводят по анализу кривых накопления флуоресцентного сигнала по каналу FAM с помощью программного обеспечения используемого прибора.
Положительными считают результаты реакции при значениях Ct, не превышающих 35.
Образцы, для которых не определено значение Ct (кривая флуоресценции не пересекает пороговую линию) – результаты считают отрицательными [4].
Белоусова Л.В., Троценко Н.И., Преображенская Э.А. Практикум по ветеринарной вирусологии. М.: КолосС, 2006. — 248 с [Текст] с.131-140.
Госманов Р.Г., Колычев Н.М. Ветеринарная вирусология М.: KoлoсC, 2006. — З04 c. [Текст] с.151-153.
Инфекционные болезни животных / Б.Ф. Бессарабов, А.А., Е.С. Воронин и др.; Под ред. А.А. Сидорчука. - М.: Колосс, 2007.-671с [Текст] с.206-275.
Шевченко А.А., Шевченко Л.В., Черных О.Ю., Шевкопляс В.Н. Лабораторная диагностика инфекционных болезней животных. Учебное пособие. Краснодар. – 2009. – 575 С. [Текст] с.340-402
МОРФОЛОГИЯ И ХИМИЧЕСКИЙ СОСТАВ АФРИКАНСКОЙ ЧУМЫ СВИНЕЙ
Текст работы размещён без изображений и формул.
Полная версия работы доступна во вкладке "Файлы работы" в формате PDF
Африканская чума свиней (Pestis africana suum (лат.); African swine fever (англ.); болезнь Монтгомери(АЧС)) - высококонтагиозная вирусная болезнь, характеризующаяся лихорадкой, геморрагическим диатезом, воспалительными, дистрофическими и некротическими изменениями в различных органах. Болезнь характеризуется разнообразием форм (острая, подострая, хроническая, бессимптомная). До настоящего времени стоит в ряду важнейших проблем ветеринарной вирусологии, как с теоретической, так и с практической стороны [1].
Вирионы представляют собой округлые частицы диаметром 175-215 нм, состоящие из плотного нуклеоида, двухслойного икосаэдрического капсида и наружной оболочки. Нуклеоид содержит ДНК и белок и окружен электронно-прозрачным слоем. Двухслойный капсид состоит из 1892-2172 капсомеров. Наружная липопротеидная оболочка вирионов имеет типичное строение и не необходима для проявления инфекционных свойств вируса. Между наружной оболочкой и капсидом имеется электронно-прозрачный слой. Плавучая плотность в CsCl составляет 1,19-1,24 г/см 3 , коэффициент седиментации 1800-8000S. Инфекционность вируса сохраняется при 5°С в течение 5-7 лет, при комнатной температуре - 18 месяцев, при 37 С -10-30 дней. Вирус стабилен при рН 3-10, чувствителен к жирорастворителям и инактивируется при 56°С в течение 30 мин [3].
Концы ДНК ковалентно связаны и содержат инвертированные повторы, сходными с таковыми в ДНК поксвирусов. ДНК не обладает инфекционностью. В вирионах вируса АЧС обнаружено 54 полипептида. С вирионами ассоциировано несколько ферментов, необходимых для синтеза ранних иРНК.
Вирус АЧС размножается в цитоплазме клеток, однако функция ядра также необходима для его репродукции. В инфицированных клетках обнаружено 106 вирусспецифических белков, из которых 35 синтезируются до начала репликации вирусной ДНК (ранние белки) и 71 после репликации ДНК (поздние белки). Вирионы созревают в цитоплазме и приобретают наружную оболочку при почковании через цитоплазматическую мембрану. Вирус размножается в организме свиней и клещах рода Ornithodoros. В организме свиней вирус реплицируется в моноцитах, макрофагах и ретикулоэндотелиальных клетках. У самок клещей вирус сохраняется более 100 дней, передается трансовариально и трансфазно [4].
Известно, что проникновение вирусов в организм сопровождается образованием вируснейтрализующих антител. Исключение представляет прежде всего вирус АЧС. Инфицирование этим вирусом не индуцирует у животных синтез вируснейтрализующих антител, хотя в сыворотке крови выявляют комплементсвязывающие антитела, преципитирующие антитела и типоспецифические задерживающие гемадсорбцию антитела. Отсутствие вируснейтрализующих антител обусловливает неспособность организма связывать и элиминировать вирус, что, в свою очередь, приводит к исключительно высокой летальности инфицированных животных. С другой стороны, отмеченный парадоксальный феномен сводит на нет попытки создания эффективной вакцины, поскольку аттенуированные штаммы вируса вызывают у свиней хроническое течение болезни и длительное вирусоносительство, что весьма опасно в эпизоотологическом отношении.
Вирус АЧС обладает отдельными характеристиками иридо- и поксвирусов. Является единственным представителем уникального семейства. ДНК кодирует свыше 100 полипептидов, из которых более 30 обнаружено в препаратах очищенного вируса. С вирионами ассоциированы ряд ферментативных активностей, в том числе ДНК-зависимая РНК-полимераза, фосфатогидролазная активность, а также протеинкиназа и кислая фосфотаза. ДНК-зависимая РНК-полимераза расположена на периферии капсида, а АТФ-гидролаза - между капсидом и нуклеоидом. Капсид образуют, в основном, полипептиды с мол. м. 73 и 37 кД. С капсидом ассоциирована и ДНК-зависимая РНК-полимераза, участвующая в начальных стадиях репродукции вируса. ДНК представляет двухнитчатую структуру мол. м. 100-106 Д, состоящую из 170 тыс. п. о. длиной 58 нм с ковалентными концевыми сшивками в виде инвертированных повторов величиной 2,7 тыс. п. о.
Вирус АЧС имеет 20-гранную форму, величина его 175-215 нм, покрыт двухслойной липопротеиновой оболочкой, имеющей антигенное родство с тканями хозяина. Далее располагается трехслойный капсид из периодически размещенных капсомеров, внутри находится нуклеопротеид из плотных фибрилл, содержащих ДНК. Поверхностная оболочка и капсид содержат большое количество липидов. ДНК вируса АЧС шт. BA71V имеет длину 170101 п. о. и 151 открытую рамку считывания. Секвенирование ДНК показало, что вирус АЧС занимает промежуточное положение между поксвирусами и иридовирусами и принадлежат к независимому семейству вирусов. Под действием рестриктазы ЕСо-R-l выявлено 28 фрагментов ДНК (величина 0,3-21,9 кД), что составляет 96 % всей молекулы, а другими рестриктазами -11-50 фрагментов (0,3-76,6 кД). Получена экспрессия 16 фрагментов ДНК в E. coli, методом молекулярной гибридизации определено местонахождение 80 сайтов и составлена карта расположения фрагментов. Выявлены различия между отдельными изолята-ми и вариантами вируса, а также механизм и последовательность синтеза вирусспеци-фических белков, их роль в патогенезе болезни. [5]
А. Д. Середа и В. В. Макаров идентифицировали изолятспецифический гликопептид вируса АЧС. В составе оболочек очищенных вирионов вируса АЧС обнаружены три гликозилированных полипептида с мол. м. 51, 56, 89 кД и три радиомаркированных монохромных оболочечных компонента с мол. м. 9, 95, 230 кД, биохимическая природа которых не выяснена. Пять вирусиндуцированных гликозилированных полипептидов с мол. м. 13, 33, 34, 38, 220 кД идентифицировано в инфицированных вирусом АЧС клетках Vera. Полипептид (110-140 кД), по-видимому, имеет прямое отношение к ГАд АГ, о существовании которого ранее судили лишь по феномену ГАд. Авторы показали, что олигосахаридные белки составляют около 50 % массы гликози-лированного полипептида (110-140 кД). Липидный состав вируса АЧС зависит от клеточной системы культивирования.
Рестрикционным анализом и перекрестной гибридизацией фрагментов рестрикции показано, что геном изолята САМ/82 вируса АЧС не изменяется при пассировании на свиньях (в течение 20 пассажей) и в культуре клеток костного мозга свиньи (в течение 17 пассажей). Геном вируса АЧС достаточно стабилен при передаче вируса в естественных и экспериментальных условиях. Сопоставление данных физического картирования и биологических свойств штаммов вируса АЧС позволило предположить, что в левом концевом регионе локализуются участки ДНК, имеющие непосредственное отношение к таким проявлениям фенотипа вируса как вирулентность и иммуногенность. Такое предположение основывается на том, что у авирулентных штаммов наблюдается утрата большого участка ДНК именно в этом регионе, в то время как у природных изолятов протяженность левой концевой области гораздо значительнее. На основании полученных результатов построены физические карты геномов референс-штаммов ВАЧС всех 4 серотипов и проведена паспортизация вакцинных штаммов, что позволяет в дальнейшем контролировать возможные изменения генома. С использованием праймеров, комплементарных нуклеотидным последовательностям структурного гена белка VP2 ВАЧС разработана тест-система для идентификации ВАЧС методом ПЦР. Открытая рамка считывания B438L, расположенная на фрагменте EcoRI-L генома вируса африканской лихорадки свиней (ВАЛС), кодирует белок длиной 438 остатков с мол. м. 49,3 кД, имеющий мотив RGD прикрепления к клеткам и не гомологичный белкам из баз данных. Ген B438L транскрибируется только на поздней стадии заражения ВАЛС. Белок экспрессировали в Escherichia coli, очистили и использовали для получения кроличьей антисыворотки, которая узнает белок с мол. м. 49 кД в зараженных ВАЛС клетках. Этот белок синтезируется на поздней стадии заражения всеми изученными штаммами ВАЛС, расположен в цитоплазматических вирусных фабриках и является структурным компонентом очищенных вирионов ВАЧС. [6].
Геномы изолятов вируса африканской чумы свиней, выделенные в Камеруне в 1982-1985 гг., неразличимы поданным рестрикционного анализа. ИзолятСАМ/87 незначительно отличается от изолятов 1982-1985 гг. Однако, в ДНК изолята САМ/86 с помощью 4-рестриктаз в 2- фрагментах (внутри правого концевого региона и в центральном районе) обнаружены значительные отличия [7].
Библиографический список
Макаров В.В., Сухарев О.И., Боев Б.В., Коломыцев А.А., Литвинов О.Б. Дикий европейский кабан. Природная очаговость африканской чумы свиней // Ветеринария. - 2010. - № 9. - С. 24-28.
Волянский Ю.Л., Колотова Т.Ю., Васильев Н.В. // Успехи соврем. биол., 1994, т. 114, № 5, С. 679-692.
Вишняков И.Ф., Митин Н.И., Курносов А.Н. и др. Диагностика вируса африканской чумы свиней. I. Реакция гемадсорбции и задержки гемадсорбции при АЧС// Вопросы ветеринарной вирусологии, микробиологии и эпизоотологии. Покров, 1992, Ч. 1.
Читайте также: