Одноцепочечные рнк содержащие вирусы
Обновлено: 17.04.2024
В ходе эволюции вирусов сложилось несколько стратегий, обеспечивающих: а) организацию вирусных генов и их кодирующую функцию, б) экспрессию вирусных генов, в) репликацию вирусных геномов и г) сборку и созревание вирусного потомства.
Прежде чем мы рассмотрим каждое из этих положений в деталях, стоит напомнить, что ключевым моментом в репликации вирусов является использование для синтеза вирусных белков хозяйских структур, синтезирующих белки клетки. Независимо от размеров, состава и организации своего генома вирус должен предоставить белоксинтезирующему аппарату эукариоти-ческой клетки информационную РНК, которую клетка должна распознать и транслировать. В этом отношении клетка навязывает вирусу два ограничения.
Во-первых, клетка синтезирует в ядре свою собственную мРНК путем транскрипции своей ДНК и последующего постранскрипционного процессинга транскрипта. Поэтому в клетке: а) ни в ядре, ни в цитоплазме нет фер* ментов, необходимых для транскрипции мРНК с вирусного РНК-генома, и б) в цитоплазме нет ферментов, способных транскрибировать вирусную ДНК. В связи с этим клеточную транскриптазу для синтеза вирусных мРНК могут использовать только вирусы, содержащие ДНК и способные проникать в ядро. Все другие вирусы вынуждены создавать собственные ферменты для синтеза мРНК.
Для удобства сначала лучше обсудить РНК-содержащие вирусы, фокусируя внимание прежде всего на функции геномной РНК.
Вирусы с одноцепочечной РНК можно подразделить на три группы. В первую группу входят пикорнавирусы и тогавирусы. Их геномы выполняют две функции (рис. 5.2 и 5.3). Во-первых, они функционируют как мРНК. Вирусы, геном которых может служить в качестве мРНК, принято называть вирусами с позитивным геномом. РНК пикорнавирусов после проникновения в клетку связывается с рибосомами и полностью транслируется. Затем продукт этой трансляции — полипротеин — расщепляется. Во-вторых, геномные РНК выполняют функцию матрицы для синтеза на ней комплементарных минус-цепей при участии полимеразы, появившейся в результате расщепления полипротеина. Образуется двуспиральная репликативная форма. На ее минус-цепях синтезируются новые плюс-цепи, которые могут использоваться в качестве а) мРНК, б) матриц для синтеза новых минус-цепей и в) составной части вирусных частиц потомства.
Тогавирусы и ряд других вирусов с позитивным геномом отличаются от пикорнавирусов в одном отношении: для трансляции в первом цикле синтеза белков доступна только часть их геномной РНК. Вероятной функцией образующихся при этом белков является способность транскрибировать геномную РНК. Они осуществляют синтез минус-цепи, которая в свою очередь служит матрицей для синтеза двух различных по размеру классов молекул плюс-РНК. В клетках, зараженных тогавирусами, РНК первого класса представлены небольшими молекулами мРНК, фланкирующими участок геномной РНК, который не транслировался в первом цикле. Образующиеся на них полипротеины расщепляются на белки, которые играют структурную роль в вирионах. Плюс-РНК второго класса состоит из полноразмерных цепей, которые упаковываются в вирионы.
РНК-содержащие вирусы с негативным геномом: ортомиксовирусы, парамиксовирусы, буньявирусы, аренавирусы и рабдовирусы.
Их геномная РНК выполняет две матричные функции: во-первых, для транскрипции и, во-вторых, для репликации. В связи с тем что для синтеза мРНК должен транскрибироваться вирусный геном, а в клетках соответствующие ферменты отсутствуют, все вирусы с негативным геномом содержат в вирионе кроме вирусного генома транскриптазу. Транскрипция вирусного генома — первое событие после проникновения вируса в клетку, в результате которого накапливаются функционально активные моноцистронные мРНК [позитивные, или плюс-цепи], кодирующие один белок. Репликацию начинают новосинтезированные вирусные белки, катализирующие образование полной плюс-цепи, которая служит матрицей для синтеза геномной минус-РНК (рис. 5.4).
Размножение ортомиксовирусов и парамиксовирусов.
– РНК зависимая РНК полимераза (синтез +нитей,
– две разновидности РНК полимераз
РНК транскриптаза (синтез +нитей в начале инфекции,
РНК репликаза ( – нитей в конце инфекции)
Ретровирусы входят в третью группу РНК-содержащих вируссов.
Характерно, что геномы ретровирусов монолитны, но имеют диплоидную структуру, и обе цепи либо частично соединены водородными связями друг с другом, либо спарены неизвестным до настоящего времени образом. Единственная известная функция геномной РНК — матричная функция для синтеза вирусной ДНК. Поскольку эукариотические клетки не имеют для этого соответствующих ферментов, вирион кроме генома содержит еще и РНК-зависимую ДНК-полимеразу (обратную транскриптазу 1), а также смесь тРНК хозяина, одна из которых служит в качестве затравки. В цикле репродукции можно выделить следующие ключевые ступени: а) связывание комплекса тРНК —обратная транскриптаза с геномной РНК; б) синтез ДНК-копии, комплементарной по отношению к РНК, с переходом полимеразы с одной молекулы РНК-матрицы на другую, что приводит к образованию кольцевой одноцепочечной молекулы ДНК, связанной водородными связями с линейной геномной РНК; в) расщепление геномной РНК нуклеазой, атакующей только РНК в ДНК—РНК-гибридах (рибонуклеазои Н, также содержащейся в вирионе), и г) синтез комплементарной копии вирусной ДНК. Затем кольцевая двухцепочечная ДНК перемещается в ядро, где интегрирует с геномом хозяина, но последующая экспрессия вирусных генов не обязательна. Если экспрессия происходит, то интегрированная.вирусная ДНК транскрибируется транскриптазой клетки-хозяина. Продуктами транскрипции являются молекулы РНК, как равные по длине молекуле генома, так и более короткие мРНК-транскрипты нескольких соседних генов, которые транслируются с образованием полипротеинов. Полипротеины затем расщепляются на отдельные вирусные белки. В состав вирионов включаются только транскрипты, содержащие весь геном.
Одни вирусы способны интегрироваться в геном клетки-мишени и таким образом оставаться во всех дочерних клетках, которые будут в будущем получены после ее деления. К таким вирусам относятся гаммаретровирусы и лентивирусы. Другие делать этого не умеют (например, адено- и аденоассоциированные вирусы). Но для производства белков и репликации (размножения) все они используют клетку и ее синтетический аппарат.
Как это работает?
Для того чтобы вирус мог проникнуть в клетку, белки его оболочки должны связаться с мембранными белками клетки-мишени. Важно отметить, что проникает вирус только в те клетки, которые могут в дальнейшем помочь его репликации. Вирус ВИЧ живет в клетках иммунной системы, вирус гепатита С — в клетках печени. Есть особые вирусы, которые поражают только растения или даже только бактерии.
Строение вируса гриппа. Под оболочкой вириома - генетический материал вируса, необходимый для его воспроизводства в клетке.
Содержащие неактивный вирус и оставшиеся в живых клетки иногда сохраняют возможность нормального функционирования. В этом случае клетки могут быть заражены, но вирус проявит себя спустя длительный период времени. Так устроен герпес.
В зависимости от того, каким типом нуклеиновой кислоты представлен генетический материал, выделяют ДНК-содержащие вирусы и РНК-содержащие вирусы. И тут стоит остановиться на классификации.
Типы вирусов. Коротко о главном
Современная типология вирусов содержит 7 классов и была предложена Дэвидом Балтимором еще в 1971 году. С тех пор, впрочем, она была уточнена и расширена, в том числе советскими учеными. И выглядит в настоящее время таким образом:
Вирусы, содержащие двухцепочечную ДНК
Описание
Для репликации вирусу необходимо попасть в ядро клетки-мишени и воспользоваться ее ДНК-полимеразой. Иногда вирус вызывает незапланированное деление самое клетки, то есть становится онкогенным. Эти вирусы хорошо изучены.
Пример: Вирус герпеса, адено- и папилломавирусы
Вирусы, содержащие одноцепочечную ДНК
Описание
Попадая в ядро клетки, вирусы образуют двухцепочечную ДНК, после чего реплицируются так же, как вирусы класса I.
Пример: Парво- и цирковирусы
Вирусы, в которых РНК способна к репликации (редупликации)
Описание
Вирусы этого класса могут размножаться в цитоплазме клетки, им не нужна молекула ДНК. Каждый ген, находящийся в РНК вируса, кодирует только один вирусный белок.
Пример: Бирна- и реовирусы
Вирусы, содержащие одноцепочечную (+) РНК
Описание
Из геномной (+) РНК на рибосомах хозяина создаются вирусные белки. В одном фрагменте РНК могут быть закодированы разные белки, что увеличивает сложность вируса без удлинения генов.
Пример: Пикорнавирусы (полиомиелит, гепатит А) и коронавирусы
Вирусы, содержащие одноцепочечную (–) РНК
Описание
(–) РНК этих вирусов предварительно должна быть транскрибирована в (+) РНК вирусными РНК-полимеразами, после чего может начаться синтез вирусных белков. Вирусы этого класса делятся еще на две группы, в зависимости от их генома и места его репликации (цитоплазма или ядро).
Пример: Филовирусы, аренавирусы (геморрагическая лихорадка Ласса), ортомиксовирусы (вирусы гриппа) и так далее.
Вирусы, содержащие одноцепочечную (+) РНК, реплицирующиеся через стадию ДНК
Описание
Такие вирусы используют фермент обратную транскриптазу для превращения (+) РНК в ДНК, которая встраивается в геном хозяина ферментом интегразой. Дальнейшая репликация происходит при помощи полимераз клетки хозяина.
Пример: Ретровирусы (в том числе ВИЧ)
Вирусы, содержащие двухцепочечную ДНК, реплицирующиеся через стадию одноцепочечной РНК
Описание
Молекула ДНК замкнута в кольцо и является матрицей для синтеза мРНК и дополнительных молекул РНК, которые используются при репликации вирусного генома обратными транскриптазами.
Пример: Колимовирусы (вызывают инфекции растений) и гепаднавирусы (например, гепатит В)
Вакцинация и лечение
Как правило, организмы умеют бороться с паразитирующими на них вирусами. На примере млекопитающих и человека мы обычно говорим о главном инструменте — врожденном иммунитете.
Впрочем, наиболее эффективен этот вид защиты в отношении бактериальных инфекций и не может обеспечить продолжительную и надежную защиту, особенно от инфекций вирусных.
Именно поэтому огромное значение имеет приобретенный иммунитет, в результате которого клетки иммунной системы обучаются вырабатывать специфические к вирусу антитела, способные уничтожать как саму вирусную частицу, так и зараженные ею клетки.
Еще одна врожденная система борьбы с вирусными инфекциями — внутриклеточная. Как правило, клетка способна распознать чужеродную РНК в своей цитоплазме, куда ее сперва и доставляют многие вирусы, и имеет специальные комплексы для ее деградации. Но часть вирусов научились обходить и эту ловушку. К примеру, ротавирусы, которые даже внутри клетки сохраняют капсид с геномной РНК.
Миссия: уничтожить
Основная сложность в лечении вирусных заболеваний заключается в том, что они используют естественные функции клеток-мишеней для своего размножения, поэтому ученым зачастую оказывается не так-то просто придумать препарат, который будет токсичен для вируса и безопасен для самой клетки. Если такой безопасности достичь не удастся, лекарство будет иметь слишком много побочных эффектов, повреждающих сам организм, что окажется нецелесообразно для использования.
Сравнение жизненных циклов ВИЧ и вируса гриппа. Если первый использует обратную транскрипцию и живет в клетках иммунной стистемы, вирион второго, проникая в эпительные клетки дыхательных путей целиком - а именно там он и обитает - распадается уже внутри клетки, а репликация вирусной РНК происходит в ядре с помощью вирусных полимераз PA, PB1 и PB2 путем комплементарного копирования.
По принципу действия противовирусные препараты подразделяются на две группы: стимулирующие иммунную систему атаковать вирусы (например, за счет индукции синтеза белков-интерферонов) и атакующие вирусы напрямую. Препараты второй группы различаются по этапу жизненного цикла вируса, на котором они активны: это препараты, препятствующие проникновению вируса в клетку, препятствующие размножению вируса внутри клетки и препятствующие выходу копий вируса из клетки.
Еще один класс противовирусных препаратов блокирует ферменты, необходимые для создания и модификаций белков вируса. Такие лекарства называют протеазными ингибиторами.
Вместо заключения: а могут ли вирусы приносить пользу?
Безусловно, да. Несмотря на то, что вирусы ассоциируются у большинства людей с однозначным вредом, они могут приносить и пользу — если речь идет о так называемых вирусных векторах и терапевтических подходах на их основе.
Исследователи давно научились помещать в белковую оболочку вируса интересующие их нуклеиновые кислоты, чтобы доставлять нужный ген в клетки, а также убирать те гены, которые делают вирус опасным для организма.
Это позволило сделать возможной генную терапию, помогающую бороться с заболеваниями, вызванными известными генетическими мутациями. Создание вирусных векторов — достаточно непростая задача, к тому же ограниченная свойствами самих вирусных частиц: количеством помещающейся генетической информации, местом ее вставки, стабильностью. Кроме того, вирусный вектор, используемый в медицине, не должен вызывать иммунного ответа или критично влиять на жизнедеятельность клетки. Тем не менее эти сложности решаются, поэтому уже одобрен ряд вполне успешных и безопасных генных терапий. А в качестве основы для вирусных векторов чаще всего используются ретро-, ленти-, адено- и аденоассоциированные вирусы.
И это неудивительно хотя бы потому, что вирусы — штука довольно непонятная. Неясно даже, считать их живыми или нет. С одной стороны, это просто хрупкий набор молекул, который не может существовать автономно, без живой клетки. Он не производит и не накапливает энергии, а также не поддерживает постоянства внутренней среды — ее попросту нет. Но когда вирус попадает в клетку, он проходит жизненный цикл, копирует себя и эволюционирует. Невидимое глазу нечто существует в огромном количестве, постоянно меняется, переходит от одних хозяев к другим и причиняет страдания разной степени тяжести всему человечеству.
Как устроены вирусы?
РНК-содержащие вирусы можно разделить на собственно РНК-вирусы и ретровирусы. Первые — это вирусы гриппа, бешенства, гепатита С, а также коронавирусы и вирус Эбола. Они содержат РНК и используют для размножения РНК-зависимую РНК-полимеразу, с ее помощью на исходной молекуле РНК сразу синтезируется новая. А к ретровирусам относится, например, ВИЧ. Он содержит РНК, но в ходе жизненного цикла она превращается в ДНК и встраивается в геном клетки-хозяина. После чего новая РНК синтезируется уже на основе молекулы ДНК — то есть так же, как у нас.
Жизненный цикл вируса, на примере вируса иммунодефицита
Как с ними бороться?
Еще одна стратегия — активная и пассивная иммунопрофилактика. Активная — это простая и всем знакомая вакцинация. Человеку вводят неактивную форму вируса или его кусочек, в организме срабатывает иммунный ответ и синтезируются антитела, которые защитят человека в будущем, если он когда-нибудь встретится с настоящим живым вирусом. Но вакцину не всегда можно создать, да и уже существующие порой не работают на все сто. Так, вакцина от гриппа защищает только от нескольких — самых распространенных в текущем сезоне — штаммов (видов) вируса. Пассивная иммунопрофилактика — это введение готовых антител тем, кто уже встретился с вирусом или с большой вероятностью сделает это. Такие лекарства существуют для респираторно-синцитиального вируса (рекомендованы недоношенным младенцам) и ветряной оспы (для людей с подавленным иммунитетом).
И, наконец, последняя стратегия на случай, если ничто не помогло и человек заболел, — антивирусные препараты. Их развитие подстегивали научный прогресс и насущные проблемы. Чтобы придумать противовирусный препарат, нужно сначала изучить вирус и его жизненный цикл и выбрать возможные мишени для атаки. Причем такие, чтобы они как можно сильнее отличались от человеческих аналогов. Иначе лекарство будет бороться и с вирусами, и с невинными человеческими клетками, вызывая сильные побочные эффекты.
В 80-е произошло другое громкое открытие — вирус иммунодефицита человека. Это породило шквал научных работ, посвященных разработке новых противовирусных лекарств. К тому времени связанный с ним СПИД уже распространился по миру, а в США началась эпидемия.
Какие бывают антивирусные препараты?
Их можно разделить на 13 групп, причем к шести относятся различные лекарства против ВИЧ. Это ингибиторы входа вируса в клетку, вирусных ферментов интегразы и протеазы, а также три вида ингибиторов вирусного фермента обратной транскриптазы, или ревертазы. Все они действуют на разные этапы жизненного цикла вируса:
1. Проникновение в клетку
Это первое, что должен сделать вирус, попав в организм. То, какую клетку он поразит, определяется рецептором на ее поверхности. У ВИЧ это рецептор CD4, который есть у Т-хелперов, макрофагов, а также некоторых других видов клеток. Кроме него в связывании вируса и его проникновении участвуют: рецепторы CXCR4 и CCR5 со стороны клетки и поверхностные гликопротеины gp120 и gp41 — со стороны вируса.
Сейчас FDA (американское Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов) одобряет четыре лекарства, работающие на этой стадии. Каждый связывается с каким-то из участников процесса и мешает его работе. Например, к этой группе принадлежит самый новый препарат против ВИЧ — фостемсавир, его одобрили в США в июле 2020 года. В организме он превращается в активную форму темсавир, соединяется с вирусным гликопротеином gp120 и мешает ему связаться с клеточным рецептором CD4. Другой препарат — ибализумаб — связывается с самим CD4, причем так, что рецептор не может участвовать в проникновении вируса, но выполняет свою нормальную иммунную функцию — связывает и узнает антигены на поверхности антигенпрезентирующих клеток.
Подобные препараты также используются для лечения респираторно-синцитиального вируса, вирусов ветряной оспы и простого герпеса. Они тоже действуют на вирусные гликопротеины и их связывание с клеточными рецепторами. К этой же группе можно отнести препараты для пассивной иммунопрофилактики антителами.
2. Подготовка к размножению, часть 1
Когда вирус попал в клетку, он должен в ней размножиться, то есть создать копии себя, используя ресурсы самой клетки. Так как ВИЧ — ретровирус, его генетический материал — РНК, которая должна достроиться до двухцепочечной ДНК и встроиться в ДНК клетки. Процесс достраивания называется обратной транскрипцией, и для него необходим вирусный фермент обратная транскриптаза, ее еще называют ревертазой. Это самая популярная мишень препаратов против ВИЧ, которые делятся на две группы: нуклеозидные и ненуклеозидные.
Механизм дейсвтия ингибиторов обратной транскриптазы
3. Подготовка к размножению, часть 2
Чтобы наконец размножиться, ВИЧ, уже в виде молекулы ДНК, необходимо встроиться в геном клетки-хозяина. В этом участвует другой вирусный фермент — интеграза. Ее ингибируют несколько одобренных лекарств, причем они часто используются вместе с другим препаратом — кобицистатом. Он никак не действует на вирус, но ингибирует некоторые ферменты печени и увеличивает биодоступность самих антивирусных препаратов.
4. Созревание
Другие препараты
Есть три группы антивирусных препаратов, которые мы еще не упоминали. Во-первых, это ингибиторы белков NS5A и NS5B вируса гепатита С, которые играют важную роль в репликации РНК вируса. Во-вторых, лекарства против вируса гриппа: три ингибитора вирусного белка нейраминидазы и один ингибитор РНК-полимеразы вируса. И, наконец, сборная солянка препаратов, которые не действуют прицельно на вирусные компоненты. Это интерфероны, а также иммуностимуляторы и ингибиторы митоза клеток.
Первые заслуживают особого внимания из-за обилия отечественных лекарств против гриппа и простуды на их основе. FDA одобряет инъекции (!) интерферонов только для лечения гепатита B и С, причем на практике они используются очень осторожно из-за серьезных побочных эффектов. Отечественные противовирусные препараты с интерферонами, которые выпускаются в форме мазей, спреев и суппозиториев, вряд ли работают. И слава богу. Иммуностимуляторы и ингибиторы митоза клеток выпускаются в виде мазей и используются для лечения генитальных бородавок, то есть папилломавируса человека.
Наука не стоит на месте, и разработка противовирусных препаратов продолжается, подстегиваемая новыми вирусами, эпидемиями, а также развитием резистентности к существующим лекарствам. Но по-прежнему самыми изученными и многочисленными препаратами остаются ингибиторы вирусных обратной транскриптазы или ДНК-полимеразы и протеазы. Для разработки других стратегий борьбы ученым еще предстоит изучить детали работы вирусов — как давно известных, так и совершенно новых.
Да, вирусы остаются источником зловещих идей в популярной культуре. Но существующих препаратов и методов уже достаточно, чтобы мы могли избежать заражения, быстро вылечиться или свести негативные последствия болезни к нулю.
Обзор
Автор
Редакторы
Обратите внимание!
Спонсоры конкурса: Лаборатория биотехнологических исследований 3D Bioprinting Solutions и Студия научной графики, анимации и моделирования Visual Science.
Эволюция и происхождение вирусов
В 2007 году сотрудники биологического факультета МГУ Л. Нефедова и А. Ким описали, как мог появиться один из видов вирусов — ретровирусы. Они провели сравнительный анализ геномов дрозофилы D. melanogaster и ее эндосимбионта (микроорганизма, живущего внутри дрозофилы) — бактерии Wolbachia pipientis. Полученные данные показали, что эндогенные ретровирусы группы gypsy могли произойти от мобильных элементов генома — ретротранспозонов. Причиной этому стало появление у ретротранспозонов одного нового гена — env, — который и превратил их в вирусы. Этот ген позволяет вирусам передаваться горизонтально, от клетки к клетке и от носителя к носителю, чего ретротранспозоны делать не могли. Именно так, как показал анализ, ретровирус gypsy передался из генома дрозофилы ее симбионту — вольбахии [7]. Это открытие упомянуто здесь не случайно. Оно нам понадобится для того, чтобы понять, чем вызваны трудности борьбы с вирусами.
Из давних письменных источников, оставленных историком Фукидидом и знахарем Галеном, нам известно о первых вирусных эпидемиях, возникших в Древней Греции в 430 году до н.э. и в Риме в 166 году. Часть вирусологов предполагает, что в Риме могла произойти первая зафиксированная в источниках эпидемия оспы. Тогда от неизвестного смертоносного вируса по всей Римской империи погибло несколько миллионов человек [8]. И с того времени европейский континент уже регулярно подвергался опустошающим нашествиям всевозможных эпидемий — в первую очередь, чумы, холеры и натуральной оспы. Эпидемии внезапно приходили одна за другой вместе с перемещавшимися на дальние расстояния людьми и опустошали целые города. И так же внезапно прекращались, ничем не проявляя себя сотни лет.
Вирус натуральной оспы стал первым инфекционным носителем, который представлял действительную угрозу для человечества и от которого погибало большое количество людей. Свирепствовавшая в средние века оспа буквально выкашивала целые города, оставляя после себя огромные кладбища погибших. В 2007 году в журнале Национальной академии наук США (PNAS) вышла работа группы американских ученых — И. Дэймона и его коллег, — которым на основе геномного анализа удалось установить предположительное время возникновения вируса натуральной оспы: более 16 тысяч лет назад. Интересно, что в этой же статье ученые недоумевают по поводу своего открытия: как так случилось, что, несмотря на древний возраст вируса, эпидемии оспы не упоминаются в Библии, а также в книгах древних римлян и греков [9]?
Строение вирусов и иммунный ответ организма
Рисунок 1. Первооткрыватель вирусов Д.И. Ивановский (1864–1920) (слева) и английский врач Эдвард Дженнер (справа).
Почти все известные науке вирусы имеют свою специфическую мишень в живом организме — определенный рецептор на поверхности клетки, к которому и прикрепляется вирус. Этот вирусный механизм и предопределяет, какие именно клетки пострадают от инфекции. К примеру, вирус полиомиелита может прикрепляться лишь к нейронам и потому поражает именно их, в то время как вирусы гепатита поражают только клетки печени. Некоторые вирусы — например, вирус гриппа А-типа и риновирус — прикрепляются к рецепторам гликофорин А и ICAM-1, которые характерны для нескольких видов клеток. Вирус иммунодефицита избирает в качестве мишеней целый ряд клеток: в первую очередь, клетки иммунной системы (Т-хелперы, макрофаги), а также эозинофилы, тимоциты, дендритные клетки, астроциты и другие, несущие на своей мембране специфический рецептор СD-4 и CXCR4-корецептор [13–15].
Одновременно с этим в организме реализуется еще один, молекулярный, защитный механизм: пораженные вирусом клетки начинают производить специальные белки — интерфероны, — о которых многие слышали в связи с гриппозной инфекцией. Существует три основных вида интерферонов. Синтез интерферона-альфа (ИФ-α) стимулируют лейкоциты. Он участвует в борьбе с вирусами и обладает противоопухолевым действием. Интерферон-бета (ИФ-β) производят клетки соединительной ткани, фибробласты. Он обладает таким же действием, как и ИФ-α, только с уклоном в противоопухолевый эффект. Интерферон-гамма (ИФ-γ) синтезируют Т-клетки (Т-хелперы и (СD8+) Т-лимфоциты), что придает ему свойства иммуномодулятора, усиливающего или ослабляющего иммунитет. Как именно интерфероны борются с вирусами? Они могут, в частности, блокировать работу чужеродных нуклеиновых кислот, не давая вирусу возможности реплицироваться (размножаться).
Причины поражений в борьбе с ВИЧ
Тем не менее нельзя сказать, что ничего не делается в борьбе с ВИЧ и нет никаких подвижек в этом вопросе. Сегодня уже определены перспективные направления в исследованиях, главные из которых: использование антисмысловых молекул (антисмысловых РНК), РНК-интерференция, аптамерная и химерная технологии [12]. Но пока эти антивирусные методы — дело научных институтов, а не широкой клинической практики*. И потому более миллиона человек, по официальным данным ВОЗ, погибают ежегодно от причин, связанных с ВИЧ и СПИДом.
Подобный вирусный механизм характерен не только для ВИЧ. Он описан и при инфицировании некоторыми другими опасными вирусами: такими, как вирусы Денге и Эбола. Но при ВИЧ антителозависимое усиление инфекции сопровождается еще несколькими факторами, делая его опасным и почти неуязвимым. Так, в 1991 году американские клеточные биологи из Мэриленда (Дж. Гудсмит с коллегами), изучая иммунный ответ на ВИЧ-вакцину, обнаружили так называемый феномен антигенного импринтинга [23]. Он был описан еще в далеком 1953 году при изучении вируса гриппа. Оказалось, что иммунная система запоминает самый первый вариант вируса ВИЧ и вырабатывает к нему специфические антитела. Когда вирус видоизменяется в результате точечных мутаций, а это происходит часто и быстро, иммунная система почему-то не реагирует на эти изменения, продолжая производить антитела к самому первому варианту вируса. Именно этот феномен, как считает ряд ученых, стоит препятствием перед созданием эффективной вакцины против ВИЧ.
Открытие биологов из МГУ — Нефёдовой и Кима, — о котором упоминалось в самом начале, также говорит в пользу этой, эволюционной, версии.
Сегодня не только ВИЧ представляет опасность для человечества, хотя он, конечно, самый главный наш вирусный враг. Так сложилось, что СМИ уделяют внимание, в основном, молниеносным инфекциям, вроде атипичной пневмонии или МЕRS, которыми быстро заражается сравнительно большое количество людей (и немало гибнет). Из-за этого в тени остаются медленно текущие инфекции, которые сегодня гораздо опаснее и коварнее коронавирусов* и даже вируса Эбола. К примеру, мало кто знает о мировой эпидемии гепатита С, вирус которого был открыт в 1989 году**. А ведь по всему миру сейчас насчитывается 150 млн человек — носителей вируса гепатита С! И, по данным ВОЗ, каждый год от этой инфекции умирает 350-500 тысяч человек [33]. Для сравнения — от лихорадки Эбола в 2014-2015 гг. (на состояние по июнь 2015 г.) погибли 11 184 человека [34].
* — Коронавирусы — РНК-содержащие вирусы, поверхность которых покрыта булавовидными отростками, придающими им форму короны. Коронавирусы поражают альвеолярный эпителий (выстилку легочных альвеол), повышая проницаемость клеток, что приводит к нарушению водно-электролитного баланса и развитию пневмонии.
Рисунок 8. Электронная микрофотография воссозданного вируса H1N1, вызвавшего эпидемию в 1918 г. Рисунок с сайта phil.cdc.gov.
Почему же вдруг сложилась такая ситуация, что буквально каждый год появляются новые, всё более опасные формы вирусов? По мнению ученых, главные причины — это сомкнутость популяции, когда происходит тесный контакт людей при их большом количестве, и снижение иммунитета вследствие загрязнения среды обитания и стрессов. Научный и технический прогресс создал такие возможности и средства передвижения, что носитель опасной инфекции уже через несколько суток может добраться с одного континента на другой, преодолев тысячи километров.
Обзор
здесь и далее рисунки Андрея Занкевича
Автор
Редактор
Генеральный партнер конкурса — ежегодная биотехнологическая конференция BiotechClub, организованная международной инновационной биотехнологической компанией BIOCAD.
Спонсор конкурса — компания SkyGen: передовой дистрибьютор продукции для life science на российском рынке.
Напомним, что РНК (рибонуклеиновая кислота) — это такая молекула, представляющая собой одну цепочку нуклеотидов. В составе каждого нуклеотида присутствует остаток моносахарида рибозы. На сегодняшний день известно множество разных типов РНК, которые выполняют совершенно разные функции: от кодирования клеточных белков (мРНК) до противовирусной защиты (некоторые микроРНК) [1–5]. РНК, входящие в состав многих вирусов, могут иметь ряд оригинальных функций, таких как регуляция времени экспрессии различных вирусных генов путем изменения пространственной организации цепи РНК или привлечение клеточных белковых комплексов.
Но бывает ли такое, что в пределах одной молекулы РНК одна ее часть, кодирующая некоторый белковый продукт, имеет положительную полярность, в то время как другая часть цепи представлена участком отрицательной полярности, кодирующим другой белок? Могла ли такая молекула возникнуть в процессе эволюции живых форм?
Ответ — да! И для того, чтобы разобраться, как функционируют такие молекулы, нам предстоит погрузиться в таинственный мир вирусов.
Давным-давно, в далекой-далекой галактике.
Как известно, все формы жизни обладают определенной наследственностью, которая определяет степень генетической идентичности живых объектов. В качестве молекул, ответственных за поддержание такой наследственной идентичности, выступают нуклеиновые кислоты (ДНК и РНК). Клеточные формы жизни для хранения и передачи информации используют только один тип нуклеиновых кислот — дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК), в то время как вирусы в качестве основной молекулы наследственности могут использовать либо ДНК, либо РНК.
В случае ДНК-содержащих вирусов реализуется, как правило, Центральная догма молекулярной биологии в классическом виде: попав в клетку, ДНК удваивается в процессе репликации вирусного генома, на матрице ДНК в ходе транскрипции синтезируются мРНК, которые затем прочитываются рибосомой, синтезирующей по ним вирусные белки, то есть осуществляется трансляция. Далее вирусные белки ассоциируются с ДНК-геномом вируса в вирусную частицу (вирион), которая способна заражать новые клетки.
Очевидно, что РНК-содержащие вирусы используют иные стратегии размножения и, следовательно, реализации своего генома. Непривычные для большинства биологов молекулярные механизмы, которые используются такими вирусами, вероятно, унаследованы от далеких предков из того самого РНК-мира.
Размножение РНК-вирусов подразумевает использование разных типов РНК:
- геномная РНК находится внутри вириона, в зависимости от конкретного вируса, она может быть представлена (+)РНК, (–)РНК, (±)РНК, либо двухцепочечной РНК;
- комплементарная геномной РНК антигеномная РНК образуется в процессе репликации вирусов с одноцепочечным РНК-геномом и обладает полярностью, противоположной геномной РНК;
- субгеномная РНК (вирусная мРНК) имеет (+)полярность и является продуктом транскрипции геномной или антигеномной РНК. Как и подобает мРНК, субгеномная РНК участвует в процессе трансляционного синтеза белка.
Немного истории
Первым найденным РНК-вирусом стал бактериофаг f2, инфицирующий бактерию кишечную палочку (Escherichia coli) [7]. Выделенная геномная РНК фага f2 имела свойства мРНК, то есть она распознавалась рибосомой и могла транслироваться. На родственном РНК-бактериофаге Qβ была изучена РНК-зависимая РНК-полимераза (RdRp), которая, как оказалось, может синтезировать цепь РНК на матрице другой цепи РНК, то есть осуществлять репликацию вирусного РНК-генома! В ходе работы с РНК-бактериофагами f2 и его родственником Qβ были получены общие представления о биологии таких РНК-вирусов [8].
После РНК-бактериофагов были найдены (+)РНК-вирусы животных, такие, как вирус полиомиелита [9], [10], представитель группы пикорнавирусов. Подобные вирусы не содержат репликативных белков в составе вирусной частицы (вириона).
Встречаются вирусы, геном которых представлен двухцепочечной РНК. Как и в случае (–)РНК-вирусов, у дцРНК-вирусов во время репликации в клетке первым делом происходит синтез (+)цепи. Вирусные частицы этой группы также включают в свой состав RdRp.
Вирусы с двусмысленным РНК-геномом из семейства Bunyaviridae
Рисунок 1. Схематичное изображение структуры вириона флебовирусов
В семействе Bunyaviridae роды Phlebovirus, Tospovirus и Tenuivirus являются вирусами с двусмысленным РНК-геномом и, в отличие от остальных представителей семейства, имеют чуть более длинный S-сегмент генома (РНК S) (±)полярности. Род Tospovirus имеет вдобавок (+)участок на РНК M, который делает и эту РНК амбисенсной.
Флебовирусы
Вирусы рода Phlebovirus выделяют практически по всему миру и относят к нетаксономической группе арбовирусов, распространяющихся в членистоногих переносчиках и в позвоночных, на которых питаются переносчики. Члены этого рода переносятся кровососущими членистоногими. Инфекции не обходят стороной человека: вирусы сицилийской и неаполитанской москитных лихорадок широко распространены по территории Средиземноморья [15]. Среди симптомов таких инфекций — продолжительная сильная лихорадка, тошнота, рвота, диарея и головные боли. Вирус Тосканы, также переносимый москитами, обладает способностью проникать в нервную ткань и, вдобавок к вышеперечисленным симптомам, вызывает асептический менингит и менингоэнцефалит. Флебовирусы, переносимые клещами, например, вирус Бханджа, вирус тяжелой лихорадки с синдромом тромбоцитопении, или вирус Хартленд, вызывают серьезные вспышки инфекций среди людей [16].
Эти вирусы получили свое имя от латинского названия москитов (Phlebotominae), которые являются их основными переносчиками. Вирионы флебовирусов имеют диаметр 100-125 нанометров. Внутри вириона находятся три вирусных рибонуклеопротеина (вРНП), содержащих геномные сегменты, однако для вируса лихорадки долины Рифт (RVFV) было показано [17], что вирионы также могут содержать ещё три дополнительных вРНП, образованных цепочками антигеномных РНК, комплементарных геномным вирусным РНК. Рецептор-распознающий аппарат вирусов представлен гетеродимерами гликопротеинов Gn и Gc, которые организованным способом распределены по мембране вириона.
Структура генома флебовирусов
Геном флебовирусов как и других представителей семейства Bunyaviridae, включает три молекулы РНК: PHК L, РНК M, РНК S, имеющие на 5′- и 3′- концах уникальные для каждого геномного сегмента комплементарные последовательности. РНК L (–)полярности кодирует белок репликазы L. (–)РНК M кодирует предшественник гликопротеинов G1 и G2. (±)РНК S кодирует белок нуклеокапсида N на (–)полярном участке (ближе к 3′) и неструктурный белок NSs на (+)полярном участке (ближе к 5′) (рис. 2).
Рисунок 2. Схема структуры генома флебовирусов. Отмечены участки РНК, обладающие (–)- и (+)полярностью. Пунктирной линией обозначен сайт протеолиза белкового продукта.
NSs выполняет ряд функций, среди которых подавление индукции интерферона, усиление репликации и транскрипции вирусной РНК и определение круга хозяев [18]. NSs через цепочку белковых факторов способен приводить к инактивации противовирусной протеинкиназы R организма-хозяина [19].
Механизмы транскрипции и репликации РНК флебовирусов
Остановка транскрипции (–)участка РНК S определяется межгенным сигналом терминации. Похожие сигналы терминации находятся в 5′-концевой области РНК M и РНК L. В результате синтезируются кэпированные, но неполиаденилированные (и, следовательно, не такие стабильные, как клеточные мРНК) субгеномные РНК [18]. Также было показано [17], что в инфицированных клетках наблюдается ранняя экспрессия белка NSs, к тому же при детальном анализе состава вирионов обнаружили, что в вирусную частицу может упаковываться как три геномных цепи, так и еще три антигеномных цепи. Считается, что антигеномная РНК S присутствует в вирионе для осуществления ранней транскрипции мРНК, кодирующей NSs, поскольку этот неструктурный белок способен регулировать клеточные процессы, и чем раньше он начнёт работать в зараженной клетке, тем интенсивнее будет протекать вирусная инфекция.
Жизненный цикл флебовирусов
Жизненный цикл состоит из следующих стадий (рис. 3):
Рисунок 3. Схема, демонстрирующая основные этапы цикла флебовируса
Тосповирусы и тенуивирусы
Название рода Tospovirus происходит от сокращения названия вируса пятнистого увядания томатов (tomato spotted wilt virus, ТоSWV), впервые выделенного в 1930 году из зараженных растений томата. Этот вирус имеет очень широкий спектр хозяев и важное хозяйственное значение, борьба с ним ведется, в основном, за счет контроля численности трипсов.
Структура генома тосповирусов и тенуивирусов
Представители родов Тospovirus и Tenuivirus (тенуивирусы близки к тосповирусам, но не имеют липидной оболочки) являются единственными известными РНКвирусами растений с двусмысленным геномом [23]. Геном тосповирусов представлен тремя РНК-сегментами: большим, средним и малым (L, M, S). РНК L кодирует репликазу L. РНК S, подобно таковой у флебовирусов, кодирует белок нуклеокапсида N в (–)области и неструктурный белок NSs в (+)области. Эти области не пересекаются, они разделены межгенным некодирующим участком, содержащим сигналы терминации транскрипции. М-сегмент генома имеет принципиально отличную от РНК М флебовирусов структуру, являясь амбисенсной РНК. РНК М тосповирусов имеет область (–)полярности, в которой находится последовательность, кодирующая мРНК GnGc — предшественника поверхностных гликопротеинов, а также участок (+)полярности в 5′-области, кодирующий белок межклеточного транспорта NSm. Эти последовательности также разделены межгенным участком (рис. 4). Механизмы транскрипции и репликации РНК этих вирусов сходны с таковыми у флебовирусов [18].
Рисунок 4. Схема структуры генома тосповирусов. Отмечены участки РНК, обладающие (–)- и (+)полярностью. Пунктирной линией обозначен сайт протеолиза белкового продукта.
Отдельного внимания заслуживает неструктурный белок, закодированный в S-сегменте генома тосповирусов — NSs. Основной его функцией является супрессия противовирусного сайленсинга РНК, системы малых интерферирующих РНК [5], [24], распознающих вирусные РНК, что приводит к деградации последних [25]. Логично предположить, что синтез такого белка должен происходить как можно раньше, поэтому, возможно, по аналогии с белком NSs флебовирусов, ранняя транскрипция такой последовательности происходит в результате наличия в вирионе, помимо геномной цепи РНК S, еще и соответствующей ей антигеномной.
Вирусы с двусмысленным РНК-геномом из семейства Arenaviridae
Помимо семейства Bunyaviridae, амбисенсные РНК имеют представители семейства Arenaviridae. Аренавирусы являются таксономической группой вирусов позвоночных с сегментированным двусмысленным РНК-геномом. Вирусы, инфицирующие млекопитающих, определены в род Mammarenavirus, а заражающие рептилий — в роды Reptarenavirus и Hartmanivirus [26].
Вирионы аренавирусов, как и рассмотренных выше буньявирусов, плеоморфны, а их диаметр может варьировать от 40 до 200 нанометров в зависимости от вида, однако и частицы одного вида могут заметно различаться по размерам [27]. Границы вириона представлены липопротеидной оболочкой — производной клеточной мембраны, модифицированной равномерно распределёнными гликопротеиновыми комплексами (гетеродимерный гликопротеин GP1/GP2). Гликопротеины синтезируются в виде предшественника, который разрезается примерно пополам клеточной протеиназой на рецептор-распознающую субъединицу GP1 и трансмембранную субъединицу GP2. Последняя ответственна за слияние мембран при проникновении в цитоплазму [28]. В вирионе гликопротеины ассоциированны с лежащими на внутренней стороне мембраны молекулами матриксного белка Z, выстилающего внутреннюю поверхность мембраны, и белка нуклеокапсида N. Белок N способен связываться с РНК, распознавать кэп и ингибировать интерфероновый ответ. Структурный белок Z в клетке выполняет ряд функций (в том числе ингибирование трансляции клеточных мРНК и подавление апоптоза), являясь фактором созревания вирусных частиц (отвечает за инициацию сборки вирионов и за их отпочковывание).
Во время сборки вирусных частиц при формировании внешней оболочки иногда происходит захват субъединиц клеточных рибосом, по всей видимости, не играющих роли в вирусной инфекции (рис. 5).
Рисунок 5. Схематичное изображение структуры вириона аренавирусов
Значительная часть представителей семейства вызывает хронические и, как правило, бессимптомные инфекции у грызунов. При контакте человека с такими вирусами может развиваться острая и тяжелая инфекция, часто — геморрагическая лихорадка (например, в случае инфекции вирусом лихорадки Ласса, LasV). Вирус лимфоцитарного хориоменингита (LCMV), первый выделенный аренавирус, является нейроинвазивным. Попав в организм человека (например, через выделения грызунов), вирионы с током крови преодолевают гематоэнцефалический барьер центральной нервной системы и вызывают воспаления мозговых оболочек [29].
Структура генома аренавирусов
Рисунок 6. Схема структуры генома аренавирусов. Отмечены участки РНК, обладающие (–)- и (+)полярностью. Пунктирными линиями обозначены сайты протеолиза белковых продуктов.
РНК L на (–)участке несет последовательность, комплементарную гену репликазы L, и рамку матриксного и регуляторного белка Z на (+)участке в 5′-концевой части геномной РНК.
РНК S кодирует белок нуклеокапсида N в области (–)полярности и содержит рамку считывания GP1GP2 — предшественника поверхностных гликопротеинов GP1/GP2 (также в 5′-концевой части геномного сегмента).
Транскрипция и репликация генома аренавирусов
Переключение на репликацию связано с наличием белка N: когда его накапливается такое количество, что он начинает покрывать строящиеся цепи РНК, это, вероятно, влияет на конформацию репликазы и приводит к проскоку сигналов терминации транскрипции в виде межгенных шпилек. РНК S при репликации накапливается в больших количествах, так как нужно много копий белка нуклеокапсида, а также гликопротеинов (для экспрессии последних необходим предварительный синтез антигеномной РНК).
Заключение
Такая необычная организация двусмысленных геномных сегментов является интересным способом представления двух кодирующих последовательностей в одном геномном сегменте. На примере вирусов с двусмысленными РНК-геномами заметно, насколько изобретательной может быть эволюция вирусных РНК. Поскольку вирусы с двусмысленными РНК-геномами до сих пор удерживают определенную нишу, можно утверждать, что такой способ кодирования обладает некоторыми преимуществами по сравнению с более привычным для родственных вирусов способом, использующим только (–)РНК-сегменты.
Как возникли амбисенсные РНК и почему поддержались отбором, до сих пор остается одной из загадок современной вирусологии.
Благодарности от автора
Я благодарю доктора биологических наук, профессора кафедры вирусологии биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова Аграновского Алексея Анатольевича за интересные и содержательные лекции по молекулярным процессам РНК-вирусов и вдохновение на написание данной статьи. Также выражаю благодарность художнику Андрею Занкевичу, чьи наглядные и яркие иллюстрации украшают данную статью.
Читайте также: