Определение титра вируса методом бляшек

Обновлено: 19.04.2024

Перед развитием в культуре клеток многие вирусы культивируются в куриных яйцах с развивающимся эмбрионом. На сегодняшний день этот метод в большинстве случаев используется для выращивания вируса гриппа. Превосходный урожай вируса из куриных яиц привел к их широко распространенному использованию в исследовательских лабораториях и при производстве вакцин. В действительности подавляющее большинство противогриппозных вакцин, как инактивированных, так и инфекционных, производится в куриных яйцах. Как вирус гриппа размножается в яйцах?

Рис. 41 демонстрирует срез куриного яйца с развивающимся эмбрионом. Показаны различные пути инокуляции в яйцо, так же как и различные отделения, где размножаются вирусы.

Рисунок 41.

Для размножения вируса гриппа используются свободные от патогена яйца 11 – 12-го дня после оплодотворения. Яйцо располагают перед источником света для определения области аллантоисной полости без прожилок, расположенной под воздушным мешком. Она помечается карандашом. После того, как все яйца просвечены таким образом, делается небольшая зарубка в скорлупе в этой позиции с использованием ювелирного резца. Затем просверливается отверстие сверху яйца при помощи моторизированного инструмента Дремеля (Dremel). Если этого не сделать, то после введения вируса давление в воздушном мешке просто вытеснит посевной материал.

После того как на всех яйцах поставлена зарубка и они просверлены, в них вводится вирус при помощи шприца для инъекций туберкулина – шприц на 1 мл, заполненный на ½ дюйма, стрелка указателя в позиции 27. Игла проходит через отверстие в скорлупе, сквозь хориоаллантоисную мембрану, и вирус помещается в аллантоисной полости, заполненной аллантоисной жидкостью. Два отверстия в скорлупе запечатываются расплавленным парафином, и яйца помещают на 48 часов в термостат, установленный на 37°С.

В течение инкубационного периода вирус размножается в клетках, составляющих хориоаллантоисную мембрану. Так как новые вирусные частицы образуются почкованием (см. 4.1.), они выходят в аллантоисную жидкость. Чтобы собрать вирус, удаляют верхушку яичной скорлупы – часть, покрывающую воздушный мешок. Для этого когда-то мы пользовались специальным инструментом, который располагался над яйцом. Было легко удалить эту часть скорлупы пинцетом. Скорлуповая оболочка и хориоаллантоисная мембрана протыкались пипеткой, которая использовалась для удаления аллантоисной жидкости – примерно 10 мл в каждой яйце. Достаточное количество вируса для производства 15 мкг дозы вакцины могло быть собрано из одного или двух яиц (в зависимости от штамма вируса).

Когда-то мы выращивали так много вируса гриппа, что большая термальная комната с отдельным входом использовалась как инкубатор для яиц. Когда вы открывали дверь инкубатора и слышали писк, это значило, что кто-то оставил неиспользованные яйца на слишком долгое время и они вывелись. В этом случае вам предстояло поймать неуловимых цыплят.

Взрослые обладают перекрестно-реагирующими антителами к A/California/04/2009 (H1N1)

[Главы нет в содержании, но есть ссылка на нее из глав 7.2. и 7.3.]

Дает ли предыдущее знакомство с вирусами гриппа H1N1, обусловленное заражением или вакцинацией, какую-либо защиту против заражения новыми штаммами H1N1? Ответ на этот вопрос может прояснить, почему свыше 60% подтвержденных случаев гриппа были вызваны вирусами, подобными вирусам свиного гриппа H1N1, в США у людей от 5 до 24 лет, как сообщалось на пресс-конференции CDC.

Для ответа на этот вопрос CDC проанализировал образцы сыворотки, собранные в течение предыдущих исследований вакцины. Эти сыворотки собрали от детей и взрослых до и поле того, как их привили вакциной против гриппа, в сезоны гриппа 2005 – 2006, 2006 – 2007, 2007 – 2008 и 2008 – 2009 гг. Применялись методы нейтрализации вируса и торможения гемагглютинации для определения того, содержат ли эти сыворотки антитела, перекрестно-реагирующие с новым штаммом H1N1. В качестве образца новых изолятов вируса H1N1 использовался A/California/04/2009.

Результаты показали, что предварительная вакцинация детей (в возрасте от 6 месяцев до 9 лет, всего 79 образцов) или сезонной тривалентной инактивированной вакциной, или инфекционной аттенуированной противогриппозной вакциной в предыдущие 4 года не вызвала перекрестно-реагирующих антител для ответа на A/California/04/2009 у взрослых. Среди людей возраста от 18 до 64 лет был двукратный рост перекрестной реактивности антител к вирусу в сравнении с 12 – 19-кратным ростом в титрах антител против сезонных штаммов. У людей старше 60 лет не было роста кросс-реактивности антител. Эти данные показывают, что иммунизация сезонной противогриппозной вакциной, содержащей прежние штаммы H1N1 (2005 – 2009 гг.), похоже, не дает защиты против инфицирования новыми штаммами H1N1.

Важным является вопрос, содержат ли сыворотки, полученные до введения вакцины, перекрестно-реагирующие титры антител против A/California/04/2009. Такой анализ показал бы, дает ли естественное заражение штаммами H1N1 некоторую защиту против новых изолятов. У 79 детей в возрасте от 6 месяцев до 9 лет до вакцинирования не было обнаружено перекрестно-реагирующих антител в сыворотке к A/California/04/2009. Однако 6% взрослых в возрасте от 18 до 40 лет, 9% – от 18 до 64 лет и 33% старше 60 лет имели перед вакцинацией нейтрализующие титры антител к A/California/04/2009 выше 160 или равные этому значению. Эти антитела, скорее всего, были приобретены с инфицированием вирусом H1N1, по антигенным свойствам более близким к A/California/04/2009, чем к другим штаммам сезонного H1N1. Неизвестно, могут ли эти антитела дать защиту против заражения, но они могут уменьшить тяжесть симптомов болезни.

Я подозреваю, что не все знакомы с методами микронейтрализации и торможения гемагглютинации, используемыми в этом исследовании. Впоследствии я объясню механизм действия этих методов и важность их результатов.

Рекомендуемая литература.

J Katz, PhD, K Hancock, PhD, V Veguilla, MPH, W Zhong, PhD, XH Lu, MD, H Sun, MD, E Butler, MPH, L Dong, MD, PhD, F Liu, MD, PhD, ZN Li, MD, PhD, J DeVos, MPH, P Gargiullo, PhD, N Cox, PhD (2009). Serum Cross-Reactive Antibody Response to a Novel Influenza A (H1N1) Virus After Vaccination with Seasonal Influenza Vaccine Morbid.Mortal. Weekly Rep., 58 (19), 521-524.

7.2. Метод торможения гемагглютинации гриппа

Центры по контролю и профилактике заболеваний определили, что некоторые взрослые имеют сывороточные перекрестно-реагирующие антитела к новому вирусу гриппа H1N1. Чтобы сделать такой вывод, использовали одну из методик, называемую методом торможения гемагглютинации. Как он действует?

7.3. Анализ микронейтрализации гриппа

Анализ микронейтрализации – другой метод, с помощью которого Центры по контролю и профилактике заболеваний определили, что некоторые взрослые имеют перекрестно-реагирующие антитела к новому вирусу гриппа H1N1. Рассмотрим, как действует этот метод.

Репликация вируса часто исследуется в лаборатории путем инфицирования клеток, выращиваемых в пластмассовых планшетах или колбах, которые обычно называются клеточными культурами. На рис. 43 – пример клеток HeLa, убиваемых полиовирусом.

Рисунок 43.

Верхний левый квадрат показывает неинфицированные клетки, а другие части показывают клетки в течение определенного времени после заражения. По мере размножения вируса зараженные клетки округляются и отделяются от планшета с культурой клеток. Эти видимые изменения называются цитопатическим эффектом.

Есть и другой путь сделать видимым уничтожение клеток вирусом без использования микроскопа – окрашивание клеток красителем. На рис. 44 клетки были расположены в маленьких лунках 96-луночного планшета. В одну лунку добавили вирус, а в другие – нет. После периода инкубации клетки окрасились в кристаллический фиолетовый, который окрашивает только живые клетки. Видно, какие клетки были поражены вирусом, а какие нет.

7.4. Определение вирусов: анализ бляшкообразования

Одним из наиболее важных процессов в вирусологии при измерении титра вируса является концентрация вирусов в образце. Широко используемый подход для определения количества инфекционного вируса – это анализ бляшкообразования. Данная методика впервые была разработана для подсчета титров линии бактериофагов. Р. Дульбекко (Renato Dulbecco) модифицировал этот процесс в 1952 г. для использования в вирусологии животных, и с тех пор он используется для надежного определения титров многих различных вирусов.

Рисунок 46.

Для проведения анализа бляшкообразования приготавливают 10-кратные разведения линии вирусов и вводят 0,1 мл аликвоты в чувствительные клеточные монослои. После инкубационного периода, во время которого вирус прикрепляется к клеткам, монослои покрываются питательной средой, содержащей вещество (обычно агар), способствующее образованию геля. Когда планшеты инкубируют, в изначально зараженных клетках выводится вирусное потомство. Распространение новых вирусов ограничено гелем до соседних клеток. Следовательно, каждая инфекционная частица производит круговую зону зараженных клеток, называемую бляшкой. В итоге бляшка становится достаточно большой, чтобы стать видимой невооруженным глазом. Краситель, помечающий живые клетки, часто используется для усиления контраста между живыми клетками и бляшками. Этим способом пригоден для анализа только тех вирусов, которые причиняют видимый ущерб клеткам. Пример бляшек, образованных полиовирусом на монослое клеток HeLa, показан на рис. 46. Клетки окрашены кристаллическим фиолетовым, а бляшки без труда видны там, где клетки разрушены вирусной инфекцией.

Титр линии вируса может быть подсчитан в бляшкообразующих единицах (PFU) на миллиметр. Для определения титра вируса подсчитываются бляшки. В целях снижения погрешности подсчитываются только планшеты, содержащие от 10 до 100 бляшек, в зависимости от размера используемого планшета с культурой клеток. Согласно правилам статистики, при подсчете 100 бляшек титр образца будет варьироваться в пределах ± 10%. Каждое разведение проводится дважды для повышения точности. На рис. 47 показано 17 бляшек на планшете, сделанном из разведения 10 -6 . Поэтому титр вируса составит 1,7 × 10 8 PFU/мл.

Рисунок 47.

Впоследствии мы обсудим, как анализ бляшкообразования может использоваться для приготовления клональных линий вирусов – очень важной стадии в исследовании вирусной генетики.

Рекомендуемая литература.

Dulbecco, R., & Vogt, M. (1953). Some problems of animal virology as studied by the plaque technique. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 18, 273-279.

7.5. Сколько вирусов требуется для образования бляшки?

Анализ бляшкообразования – главный инструмент для определения титров вируса. Идея проста: вирусная инфекция ограничивается до соседних клеток полутвердым верхним слоем. Подсчитывая количество бляшек, можно вычислить титр вируса в PFU на мл. Основной вопрос: сколько нужно вирусов для формирования одной бляшки?

Для большинства вирусов животных одной инфекционной частицы бывает достаточно для начала инфекции. К этому выводу можно прийти, изучая отношения между количеством вирусных частиц и подсчетом бляшек. Линейная зависимость означает, что бляшку может образовать одна инфекционная частица. Считается, что в этом случае вирус заразил клетку с динамикой в один удар. Эта концепция продемонстрирована на рис. 48. Количество бляшек, образованных с динамикой одного или двух ударов показано на графике в сравнении с относительной концентрацией вируса.

Рисунок 48.

Есть некоторые примеры вирусов с динамикой в два удара, другими словами, два различные типа вирусных частиц должны заразить клетку для запуска инфекционного цикла. Примеры включают геномы некоторых РНК вирусов растений с (+) нитью, состоящие из двух молекул РНК, упакованных в различные частицы. Кривая зависимости от дозы подобных вирусов, скорее, параболическая, чем линейная.

Когда единичная вирусная частица способна образовать бляшку, вирусное потомство внутри бляшки представляет собой клоны. Вирусная линия, приготовленная из единичной бляшки, называется очищенной линией вирусов из бляшки. Чтобы приготовить такую линию вирусов, наконечник маленькой пипетки вставляют в верхний слой агара над бляшкой. Пробка агара удаляется и помещается в буферный раствор. Вирусы в пробке агара перемещаются в буферный раствор, который затем можно использовать для заражения клеточных культур. Для обеспечения чистоты этот процесс обычно повторяют как минимум еще раз. В значительной степени очищение бляшки используется в вирусологии для основания клональных линий вирусов. Способность подготовки клональных линий вирусов было важным шагом, позволившим проводить генетический анализ вирусов.

7.6. Измерение вирусов методом конечного разведения

Анализ бляшкообразования – замечательный метод определения титров вируса, но он не применим для всех вирусов. К счастью, доступно несколько альтернативных методов, включая метод конечного разведения.

Метод конечного разведения использовался для измерения титра вируса до развития метода бляшкообразования и все еще применяется для вирусов, не образующих бляшек. Подготавливаются последовательные разведения линии вируса, которые вносятся в копируемые культуры клеток, часто в многолуночных форматах (например, в 96-луночный пластмассовый планшет). Количество заражаемых культур клеток определяется впоследствии для каждого разведения вируса, обычно путем поиска цитопатического эффекта.

В данном примере метода конечного разведения каждый из 10 монослоев клеточных культур был инфицирован разведением вируса. После инкубационного периода планшеты, показавшие цитопатические эффекты, были помечены +. При высоких разведениях ни одна из клеточных культур не была заражена, так как не было частиц. При низких разведениях каждая культура клеток была инфицирована. Половина клеточных культур показала цитопатические эффекты при разведении 10 -5 . Это и есть конечная точка: разведение вируса, при котором 50% клеточных культур оказалось заражено. Это количество может быть высчитано на основании данных и выражено как 50% инфекционной дозы (ИД₅₀) на миллилитр. Линия вирусов в приведенном примере содержит 10 5 ИД₅₀ на мл.

Рисунок 49.

В реальной жизни конечная точка со значением 50% обычно не встречается, как мы показали на примере разведения. Поэтому привлекаются статистические методы подсчета конечной точки титрования.

Методы конечного разведения также могут использоваться при определении вирулентности вируса у животных. Применяется тот же подход: производятся последовательные разведения вирусов и вводятся в ряд подопытных животных. Заражение животного можно определить по его смерти или клиническим симптомам, таким как повышенная температура, потеря веса или паралич. Результаты выражаются в виде 50% летальной дозы (LD₅₀) на мл или 50% паралитической дозы (PD₅₀) на мл, когда смертность или паралич используются как конечные точки.

Следующий пример поясняет использование конечного разведения при подсчете смертности от полиовируса у мышей. Восьми мышам ввели разведение вируса, а конечной точкой была смерть. Статистический метод Рида – Мюнха использовался для определения конечной точки со значением 50%. В этом методе объединены результаты, и смертность подсчитана для каждого разведения. Конечная точка в 50%, которая находится между пятым и шестым разведениями, подсчитана как 10 -6,5 . Поэтому образец вируса содержит 10 6,5 LD₅₀ единиц.

Рисунок 41.

Взрослые обладают перекрестно-реагирующими антителами к A/California/04/2009 (H1N1)

[Главы нет в содержании, но есть ссылка на нее из глав 7.2. и 7.3.]

Рекомендуемая литература.

J Katz, PhD, K Hancock, PhD, V Veguilla, MPH, W Zhong, PhD, XH Lu, MD, H Sun, MD, E Butler, MPH, L Dong, MD, PhD, F Liu, MD, PhD, ZN Li, MD, PhD, J DeVos, MPH, P Gargiullo, PhD, N Cox, PhD (2009). Serum Cross-Reactive Antibody Response to a Novel Influenza A (H1N1) Virus After Vaccination with Seasonal Influenza Vaccine Morbid.Mortal. Weekly Rep., 58 (19), 521-524.

7.2. Метод торможения гемагглютинации гриппа

7.3. Анализ микронейтрализации гриппа

Рисунок 43.

7.4. Определение вирусов: анализ бляшкообразования

Рисунок 46.

Рисунок 47.

Рекомендуемая литература.

Dulbecco, R., & Vogt, M. (1953). Some problems of animal virology as studied by the plaque technique. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 18, 273-279.

7.5. Сколько вирусов требуется для образования бляшки?

Рисунок 48.

7.6. Измерение вирусов методом конечного разведения

Рисунок 49.

В данной работе мы сравнили нейроинвазивность вариантов вируса клещевого энцефалита (ВКЭ), полученных при адаптации к иксодовым клещам: к одному из основных переносчиков ВКЭ Ixodes ricinus и к второстепенному переносчику Dermacentor reticulatus. Согласно полученным данным, репродукция ВКЭ в клещах – основных переносчиках может приводить к повышению нейроинвазивности вируса, что указывает на схожее первоначальное селективное воздействие клеток клещей и клеток ЦНС млекопитающих, несмотря на различные максимальные титры вируса в данных системах. Адаптация ВКЭ к клещам путем пассирования приводит к появлению в популяции вариантов, обладающих мелкобляшечным фенотипом в культуре клеток СПЭВ, и к снижению нейроинвазивности вируса. Данные изменения характерны для вирусной популяции, адаптированной как к основным, так и к второстепенным переносчикам ВКЭ.

1. Дживанян, Т.И. Изменение зависимых от хозяина характеристик вируса клещевого энцефалита при его адаптации к клещам и переадаптации к белым мышам / Т.И. Дживанян, М.Б. Королев, Г.Г. Карганова [и др.] // Вопр. вирусол. – 1988. - №5. – С. 589-595.

2. Методы определения эффективности инсектицидов, акарицидов, регуляторов развития и репеллентов, используемых в медицинской дезинсекции // МУК 3.5.2 1759-03. – М.: Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России. – 2004. – 87с.

4. Погодина, В.В. Явление антигенной дефектности у циркулирующих в природе штаммов вируса клещевого энцефалита и его возможная связь с серонегативными формами заболевания / В.В. Погодина, Н.Г. Бочкова, Т.И. Дживанян [и др.] // Вопр. вирусол. – 1992. - №2. – С.103-107.

5. Belova, O.A., Burenkova, L.A., Karganova, G.G. Different tick-borne encephalitis virus (TBEV) prevalences in unfed versus partially engorged ixodid ticks – Evidence of virus replication and changes in tick behavior // Ticks and Tick-borne Diseases – 2012, No 3. – P. 240– 246.

6. Chausov, E.V., Ternovoi, V.A., Protopopova, E.V., et al. Variability of the tick-borne encephalitis virus genome in the 5' noncoding region derived from ticks Ixodes persulcatus and Ixodes pavlovskyi in Western Siberia // Vector Borne Zoonotic Dis. – 2010. – Vol. 10, No 4. – P. 365-375.

7. Khasnatinov, M.A., Ustanikova, K., Frolova, T.V., et al. Non-hemagglutinating flaviviruses: molecular mechanisms for the emergence of new strains via adaptation to European ticks. // PLoS One. – 2009. – Vol.4, No 10. - e7295.

8. Kozlovskaya, L.I., Osolodkin, D.I., Shevtsova, A.S., et al. GAG-binding variants of tick-borne encephalitis virus // Virology. – 2010. – Vol. 398, No 2. – P. 262-272.

9. Labuda, M., Jiang, W.R., Kaluzova, M., et al. Change in phenotype of tick-borne encephalitis virus following passage in Ixodes ricinus ticks and associated amino acid substitution in envelope protein. // Virus Res. – 1994. – Vol. 31 – P. 305-315.

10. Lorenz, R.J., Bogel, K. Methods of calculation. / In: Kaplan, M.M., Koprowski, H. (Eds.), Laboratory techniques in rabies, 3rd ed. World Health Organization, Geneva. – 1973. – P. 321–335.

11. Mandl, C.W., Kroschewski, H., Allison, S.L. et al. Adaptation of tick-borne encephalitis virus to BHK-21 cells results in the formation of multiple heparan sulfate binding sites in the envelope protein and attenuation in vivo. // J. Virol. – 2001. – Vol. 75. – P. 5627-5637.

12. Romanova, L.Iu., Gmyl, A.P., Dzhivanian, T.I. et al. Microevolution of Tick-Borne Encephalitis virus in course of host alternation. // Virology. – 2007. – Vol. 362, No 1. – P. 75-84.

Клещевой энцефалит (КЭ) - природноочаговая трансмиссивная вирусная инфекция, возбудителем которой является нейротропный вирус клещевого энцефалита (ВКЭ) рода Flavivirus (сем. Flaviviridae). В большинстве случаев ВКЭ попадает в организм позвоночного животного при укусе зараженного вирусом иксодового клеща (Acari: Ixodidae), в первую очередь клещей Ixodes persulcatus и I. ricinus. В естественных позвоночных хозяевах инфекция, обычно, протекает бессимптомно. Для некоторых животных и для человека ВКЭ является патогенным и может вызывать поражение клеток ЦНС.

Одними из наиболее эпидемиологически значимых характеристик вируса являются его нейроинвазивность и нейровирулентность. Нейроинвазивность вируса отражает его способность проникать в ЦНС. Данное свойство вируса тесно связано с его способностью реплицироваться и распространяться в периферических тканях и достигать высокого уровня виремии. Многочисленные исследования нейровирулентности и нейроинвазивности различных штаммов ВКЭ, выделенных от больных людей и клещей, показали, что штаммы значительно различаются по этим характеристикам. Поскольку ВКЭ является арбовирусом, естественно было бы предположить, что определенные характеристики биоценоза, в первую очередь, вид и физиологическое состояние клеща определяют свойства вирусной популяции.

Разными учеными было показано, что адаптация ВКЭ к различным системам (клещи, культуры клеток) путем последовательных пассажей приводит к изменению его свойств, в частности, нейроинвазивности и фенотипа бляшек, образуемых в культуре клеток почек эмбрионов свиньи под агаровым покрытием [1; 9; 11; 12]. Ранее при адаптации штамма ЭК-328 ВКЭ (сибирский генотип), первоначально выделенного из клещей Ixodes persulcatus из Эстонии, к клещам Hyalomma marginatum marginatum (17 перкоксальных пассажей), которые не являются естественными переносчиками вируса, был получен вариант М [12]. Он отличался от родительского штамма более низким уровнем репродукции и мелкобляшечным фенотипом в культуре клеток СПЭВ и сниженной нейроинвазивностью для белых мышей [1; 12]. При этом при заражении клещей Hyalomma turanicum вариант М достигал более высоких титров в клещах, чем родительский штамм ЭК-328. Иными словами, было показано, что адаптация ВКЭ к не характерному для вируса виду клещей привела к снижению нейроинвазивности. Пониженной нейроинвазивностью также обладал вариант, полученный при адаптации штамма 4387 европейского генотипа ВКЭ, выделенного из органов рыжей полёвки, к клещам I. ricinus - одному из основных переносчиков вируса [9]. В связи с вышесказанным цель настоящей работы - оценить нейроинвазивность вариантов ВКЭ, полученных при адаптации вирусной популяции к клещам I. ricinus (один из основных переносчиков ВКЭ) и Dermacentor reticulatus (второстепенный переносчик вируса).

Материал и методы исследования

Культура клеток млекопитающих

В работе использовали штамм ЭК-328 ВКЭ (GenBank: DQ486861.1, [12]) сибирского генотипа, первоначально выделенный из пула клещей I. persulcatus в 1972 г. в Эстонии.

Содержание и кормление клещей на лабораторных животных

В работе использовали лабораторные культуры клещей I. ricinus и D. reticulatus, исходные самки которых были собраны в Калужской области. В лабораторных условиях клещей содержали в пробирках дифференцированной влажности [3]. Кормление клещей проводили по стандартной методике [2]. Для питания самок I. ricinus и их потомства, а также неполовозрелых фаз клещей D. reticulatus для поддержания лабораторной культуры использовали белых б/п мышей, на которых надевали картонные воротнички для предотвращения счесывания клещей. На одну мышь сажали не более 1 оплодотворенной самки или 20 нимф или 200 личинок клещей. Перед посадкой неполовозрелых фаз клещей мышь сажали в стеклянную банку и ставили в кювет с водой для предотвращения расползания клещей. Клещей на мышь подсаживали кисточкой, после чего банку с мышью сверху закрывали мельничным газом. По прошествии нескольких часов мышь пересаживали в индивидуальную клетку с решетчатым дном и поддоном с водой снизу. Напитавшихся и отпавших через решетчатое дно клетки в поддон с водой клещей изымали, просушивали на фильтровальной бумаге и помещали в пробирки дифференцированной влажности. Напитавшихся клещей содержали при комнатной температуре до завершения линьки, после чего убирали в холодильник (+4°С).

Перед посадкой половозрелых клещей I. ricinus на спине у мыши в области лопаток выстригали шерсть по периметру квадрата 1,5х1,5 см, куда затем приклеивали квадрат такого же размера из нескольких слоев марли. После того как клей высыхал (1-2 часа) под марлевую наклейку помещали 1 оплодотворенную самку. После завершения питания самку вынимали из-под наклейки и помещали в пробирку дифференцированной влажности при комнатной температуре для откладки яиц.

Для питания половозрелых клещей рода Dermacentor использовали кроликов. На одного кролика сажали не более 30 особей (20 самок и 10 самцов). Перед посадкой клещей кролику надевали пластмассовый ошейник для предотвращения счесывания клещей и на спине в области лопаток выстригали шерсть по периметру квадрата 5х5 см, куда затем приклеивали заранее сшитый колпачок из ткани такого же размера. После того как клей высыхал (1-2 часа) в колпачок помещали клещей. Каждый день колпачок развязывали, наблюдали за процессом питания клещей и, при необходимости, снимали их с кролика.

Титрование вируса методом бляшек

Титры вируса определяли методом бляшек под агаровым покрытием в культуре клеток СПЭВ на пластиковых 6-луночных планшетах согласно описанной методике [5]. Титр вируса выражали в виде десятичного логарифма количества бляшкообразующих единиц (lgБОЕ) в 1%-ной клещевой суспензии - при анализе клещей, или в 1 мл вируссодержащего материала - при исследовании культуральной жидкости (КЖ) или мозговой суспензии.

Проведение пассажей ВКЭ в клещах разных видов

Вирус пассировали на каждом виде клещей в 2 параллельных линиях по 10-15 особей в каждой. Заражение клещей проводили перкоксальным методом [5], с использованием штамма ЭК-328 ВКЭ. Доза вируса для клеща при первом заражении составляла в среднем 3 lgБОЕ. После заражения клещей содержали в пробирках дифференцированной влажности 2 недели и регистрировали их смертность. Затем живых клещей замораживали при -70°С до следующего пассажа. Для проведения пассажа из пула клещей готовили клещевую суспензию в среде 199 (см. ниже) и полученным материалом заражали следующую партию клещей. После каждого пассажа некоторый объем клещевых суспензий замораживался для дальнейшего проведения титрования вируса методом бляшек.

Для получения рабочих клещевых суспензий каждого клеща промывали сначала в 70% этиловом спирте, а затем дважды - в физиологическом растворе со смесью антибиотиков (100 ед/мл пенициллин и 0,0001 г/мл стрептомицин). После этого клещей одного вида и из одной линии гомогенизировали вместе пестиком в отдельной ступке, добавляли среду 199 на растворе Эрла с антибиотиками (см. выше) и переносили в пробирки типа эппендорф. Количество вносимой среды 199 бралось из расчета по 50 мкл на особь для клещей I. ricinus и по 100 мкл на особь для клещей D. reticulatus. От всех полученных суспензий отбиралось по 30 мкл для проведения следующего пассажа.

Титрование ВКЭ на мышах

Результаты исследования и их обсуждение

В данной работе для некоторых вариантов, адаптированных к иксодидам разных видов, мы оценили нейроинвазивность для лабораторных мышей при i/p введении вируса, для чего мы использовали такой показатель как количество БОЕ, вызывающих гибель 50% животных, т.е. LD₅₀, выраженную через БОЕ.

Для исходного штамма ЭК-328 были проведены специальные исследования, посвященные определению его нейроинвазивности в зависимости от системы, в которой он размножался. Согласно результатам 4 независимых экспериментов для вируса, полученного при репродукции штамма ЭК-328 в мозге белых мышей, 1 LD₅₀ соответствовала в среднем 5 БОЕ (0,7±0,6 lgБОЕ). Для вируса, полученного при размножении штамма ЭК-328 в перевиваемой культуре клеток СПЭВ, указанное соотношение по результатам 5 экспериментов составило 50 БОЕ (1,7±0,3 lgБОЕ; Таблица 1). Таким образом, вирулентность ВКЭ, прошедшего размножение в клетках ЦНС мыши, достоверно выше по критерию Стьюдента (р<0,05), чем у вируса после репродукции в культуре клеток СПЭВ. Это означает, что вирулентность вируса определяется системой, в которой он был получен.

Для пассажей в клещах был использован штамм ЭК-328 в виде КЖ инфицированных клеток СПЭВ. Результаты оценки вирулентности адаптированных к разным видам клещей вариантов штамма ЭК-328 приведены в Таблице 1. Согласно нашим данным, при адаптации ВКЭ к клещам I. ricinus на уровне 4 пассажей вирулентность вирусной популяции не снижается, а наоборот повышается до показателей, характерных для наиболее пермиссивной системы для репродукции - клеток ЦНС. Однако после 6-ти пассажей штамма ЭК-328 в клещах I. ricinus нейроинвазивность полученного варианта оказалась достоверно ниже (1 LD₅₀~500 БОЕ), чем верхний предел, определенный из 5 экспериментов при анализе нейроинвазивности исходного штамма, полученного в культуре клеток СПЭВ (1 LD₅₀~50 БОЕ; критерий Стьюдента, р≤0,05) (Таблица 1). Данное изменение сопровождалось появлением вирионов в популяции варианта, образующих мелкие бляшки (диаметр 1,5-2,5 мм; Таблица 1) в культуре клеток СПЭВ под агаровым покрытием.

Вариант тв1098, прошедший 7 пассажей в клещах D. reticulatus, помимо образования мелких бляшек в культуре клеток СПЭВ (Таблица 1) также демонстрировал сниженную нейроинвазивность для белых мышей. Согласно квадратичным отклонениям, полученным в опыте по оценке нейроинвазивности штамма ЭК-328, адаптированного к репродукции в клетках ЦНС мыши и в культуре клеток СПЭВ, данное изменение статистически отличается от нейроинвазивности исходного культурального штамма ЭК-328 (критерий Стьюдента, р<0,05). К сожалению, мы не можем определить с какого пассажа в клещах D. reticulatus происходит изменение свойств вирусной популяции, т.к. анализ более ранних пассажей в данной работе не проводился.

Таким образом, при адаптации ВКЭ как к основным, так и к второстепенным клещам-переносчикам вируса наблюдалось изменение свойств вирусной популяции - появление бляшек малого размера наряду с крупными бляшками в культуре клеток СПЭВ и снижение нейроинвазивности вируса.

Таблица 1

Вирулентность вариантов штамма ЭК-328, адаптированных к клещам разных видов путем перкоксальных пассажей, при интраперитонеальном введении мышам линии BALB/c.

идентификации выделенных вирусов, а также с целью обнаружения и титрования вируснейтрализующ их анти тел в сы воротках больных.

Для получения бляшек клеточный монослой заража ют небольш ой концентрацией вируса и фиксируют адсор бировавш иеся на клетках вирионы с помощ ью агарового покры тия, в которое добавлен витальный краситель — нейтральный красный. В таких условиях ЦПД вирусов имеет очаговый характер, погибш ие клетки дегенериру ют, теряю т способность удерживать нейтральный крас ный и обесцвечиваются. В результате на непрозрачном равномерно розовом фоне клеточного монослоя появля ются бляш ки в виде более прозрачны х неокраш енных округлых пятен.

Одним из первых были получены бляш ки вирусов по лиомиелита в однослойной культуре клеток, выращ ивае

Петри с подачей в термостат стерильного

С 02 (Дюльбекко, 1962).

В настоящее время бляшки получают, выращивая куль

туру клеток в обычном термостате в плоских флаконахматрацах, закрытых резиновыми пробками, иногда в чаш ках Петри, герметизированных лейкопластырем.

П окровная среда. Агаровое покрытие готовят из вы со кокачественного агара в концентрации 1 -1 ,5 % и других компонентов — солевых буферных растворов, дополнитель ных питательных веществ, антибиотиков. Раствор нейт рального красного входит в состав среды или его добавля ют во флакон или чаш ку незадолго до учета опыта. Суще ствуют различные рецепты покровных сред, применяемые с учетом типа клеточной культуры и вируса.

О бщая мбдицинская вирусология

В последнее время хорош о

зарекомендовали себя по

кровные среды, в которых вместо агара используют гель бентионита (5 -6 % ). Это алюмосиликат природного про исхож дения, который биологически инертен и не токси чен для культур клеток. Под бентионитовым питатель ным покрытием бляшки хорош о выявляются.

Обнаруж ение и т ит рование вирусов м ет одом бл я шек. Для получения бляшек вирусов во флаконы или чаш ки наливают взвесь клеток в питательной среде (№ 199 или среда с гидролизатом лактальбумина). Флаконы зак рывают резиновыми пробками, чаш ки заклеивают лей копластырем и помещ ают в термостат на 5 -6 дней для получения монослоя клеток, который должен быть сплош ным, без признаков дегенерации. Перед заражением среду из флаконов или чашек удаляют и однослойную культуру клеток осторож но отмывают раствором Хенкса, которы й затем тщательно отсасывают. Заражение производят путем внесения разведенного исследуемого материала в объеме 0 ,1 -0 ,2 5 мл и равномерного распределения этого матери ала по поверхности клеточного слоя с помощ ью покачи вания. Через 3 0 -6 0 минут зараженную культуру клеток заливают покровной средой. Флаконы или чашки с за стывш ей средой помещ ают в термостат (клеточным слоем кверху) и выдерживают до образования бляшек (2 -5 су ток), после чего производят их подсчет и изучение.

Существует пропорциональная зависимость между раз ведением вируссодержащ его материала и количеством об разовавш ихся бляш ек, позволяющ ая считать, что каж дая бляш ка образуется в результате размножения в клет ках одного вириона.

Способность к образованию бляш ек в настоящее время обнаружена у многих вирусов: полиомиелита, К оксаки, ECHO, энцефалита, гриппа, кори и ряда других.

При изучении морфологии бляшек установлено, что разные вирусы , как правило, образуют бляш ки, отличаю щиеся по величине, форме, характеру краев, по срокам появления и другим свойствам, что может быть использо вано для предварительной идентификации вируса.

Г лава 3 . М ето д ы исследования в вирусологии

Наиболее часто метод бляш ек применяют для титро вания вирусов. Для этой цели приготовляю т серийные разведения вируссодержащ его материала и каждое из разведений вносят во флакон или чаш ку со слоем культуры клеток. Подсчитав образовавшиеся бляш ки (с учетом раз ведения вируса), вычисляют титр вируса — количество вирионов в 1,0 мл исходного материала. Титр вируса, оп ределяемый методом бляш ек, принято выражать числом бляш кообразую щ их единиц (БОЕ) в 1 мл.

Идентификация вирусов и титрование антител.

Метод бляш ек дает возмож ность провести точную иден тификацию вируса с помощ ью диагностических специфи ческих сы вороток. При соответствии между сы вороткой и вирусом происходит нейтрализация вируса и при зара жении монослоя клеток такой см есью бляш ки не образу ются или их количество значительно снижается. Благо даря своей чувствительности и точности метод приобрел большое значение в изучении тонких антигенных разли чий у вирусов.

С пом ощ ью метода бляшек удается также обнаружить антитела в сы воротке больных и определить их титр, что имеет диагностическое значение. За титр сыворотки при нимают ее наибольшее разведение, снижающ ее количе ство бляш ек на 50% .

Цветная проба (или цветная реакция) основана на раз нице в цвете среды с индикаторам фенолрот, в которой растет нормальная, ж изнеспособная культура клеток, и среды, где находится культура, зараженная вирусом.

В процессе развития нормальной культуры клеток про исходит постепенное накопление кислы х продуктов обме на вещ еств, что приводит к сдвигу pH в кислую сторону. Такое изменение реакции среды говорит о наличии роста и размножения клеток. Среда с индикатором фенолрот, первоначально имевшая красный цвет (исходное значение

10 2 О бщ ая медицинская вирусология

pH 7 ,4 -7 ,6 ), вследствие снижения pH до 7 ,0 -6 ,8 приобре тает ж елт ый цвет .

Заражение культуры клеток вирусом приводит к раз витию в ней дегенеративных процессов: происходит по давление процессов метаболизма, значительно пониж ает ся гликолиз, в результате чего кислы х продуктов накап ливается мало, pH среды остается на исходном уровне и среда с индикатором фенолрот остается красного цвета.

Так, по сохранению красного цвета среды или перехо ду его в ж елтый можно судить о наличии или отсутствии вируса в исследуемом материале, внесенном в культуру клеток.

С помощ ью цветной реакции мож но определить соот ветствие вируса и вируснейтрализующ ей сы воротки, если их предварительно смешать и эту смесь после инкубации внести в культуру клеток. Специфическая сыворотка ней трализует вирус и он не оказывает цитопатическое дей ствие на клетки культуры . П оэтом у клетки продолжают нормально ж ить и размножаться, что приводит к перехо ду среды в желтый цвет.

Таким образом, цветную реакцию используют:

1) для выявления вируса и его титрования;

2) с целью идентификации вируса по нейтрализующ е му действию специфической сыворотки;

3) для обнаружения и титрования вируснейтрализую- щ их антител в исследуемых сы воротках.

Цветная проба получила ш ирокое применение в диаг ностике полиомиелита, при инфекциях, вызываемых ви русами К оксаки А и В, ECHO, аденовирусами и некото рыми арбовирусами.

У словия постановки. Ц ветную пробу ставят с различ ными типами клеточных культур. Чаще берут первичную культуру клеток почки обезьяны или перевиваемые куль туры клеток.

Оценка результатов цветной пробы проводится по из менению цвета среды через определенный срок культиви рования клеток.

Г лава 3 . М ето д ы исследования в вирусологии

При постановке цветной реакции

вать, что каждая культура клеток, на которой ставят ре акцию, имеет определенный уровень метаболизма. П оэто му постановке цветной пробы обязательно предшествует определение метаболической активности клеток культу ры, на которой собираются ставить цветную реакцию. У с танавливают так называемую дозу клеток для цветной реакции, то есть то оптимальное количество клеток, к о торое долж но быть взято в каж дую пробирку.

Определение дозы клеток. При работе с культурой по чечных клеток обезьяны готовят взвесь клеток густотой 100 -120 ты с. в 1 мл. Из нее делают ряд возрастающ их двукратных разведений в объеме 0,25 мл и определяют минимальное количество клеток, которое при постановке цветной пробы изменяет цвет питательной среды из крас ного в ж елтый на 5 -6 -й день выдерживания в термостате; это количество и принимается за дозу клеток. Обычно эта доза — 25 ты с. клеток в объеме 0,25 мл.

На воспроизводимость результатов цветной пробы, кро ме типа применяемых клеток и их концентрации, влия ют такж е состав, буферность pH питательной среды.

Титрование вируса методом цветной пробы

Ц ветную пробу ставят в пробирках. (Возможна поста новка реакции в луночках плексигласовых пластин.) П ро бирки иногда закрывают резиновыми пробками, но чаще разобщение от атмосферного воздуха достигается наслаи ванием стерильного вазелинового масла (0 ,6 -0 ,8 мл) или применением алюминиевой фольги. Однотипную опытную смесь наливают не в одну, а в четыре пробирки, что повы шает достоверность реакции.

При оценке результатов реакции учитывают только два тона: желтый и красный (табл. 7).

При титровании вируса по цветной пробе готовят де сятикратны е разведения вируссодерж ащ его материала. Эти разведения вируса, взятые в объеме 0,25 мл, см еш и вают с 1 дозой клеток, содерж ащ ейся в таком же объеме,

1 04 О бщ ая медицинская вирусология

добавляют питательную среду по 0,25 мл и наслаивают вазелиновое масло по 0 ,6 -0 ,8 мл. В реакции ставят контроли клеточной взвеси: берут 1, У 2 и 1/ 4 дозы клеток. Эти контроли подтверж дают правильность выбора дозы клеток. П робирки помещ аю т на 5 -6 дней в термостат при 37 С после чего по изменению цвета учиты ваю т ре акцию .

Титром вируса по цветной пробе называется то наи большее разведение вируса, которое вызывает подавление метаболической активности клеток в 50% случаев. В дан ном примере (табл. 7) титр вируса равен 10 4 (две пробир ки красные, две — желтые). Количество вируса, содерж а щееся в объеме 0,25 мл в разведении, равном титру, на зывается цитопатической дозой (ЦПД50) вируса.

Реакция нейтрализации по цветной пробе

При постановке цветной реакции с определяемым ви русом, предварительно смеш анным с соответствую щ ей вируснейтрализующ ей сы вороткой, вирус инактивирует ся и не подавляет ж изнедеятельности клеточной культу ры, что доказывается переходом цвета среды в желтый. По результатам цветной пробы мож но судить о наступив шей реакции нейтрализации, свидетельствующ ей о соот ветствии вируса и сы воротки, таким образом идентифи цировать исследуемый вирус.

Обычно методом цветной пробы определяют наличие и титр антител в сыворотке больны х; наибольшее значение она имеет для определения антител у больных полиомие литом, а такж е у иммунизированных полиомиелитной вакциной людей (табл. 8).

При титровании антител методом цветной пробы в ка честве антигена берут известный, заранее оттитрованный вирус в рабочей дозе, равной 100 ЦПД50. В нашем приме ре (табл. 8) доза 100 ЦПД50 вируса содержится в 0,25 мл разведения 10~2.

К приготовленным двукратно возрастающим разведе ниям исследуемой сы воротки в объеме 0,25 мл (каж дое

Схема титрования вируса методом цветной пробы

Разведения вируссодержащего материала

Цвет среды в про

К-4 — красного цвета 4 пробирки;

желтого цвета 3 пробирки

Схема титрования антител методом цветной пробы

Разведение иммунной сыворотки

токсичность 1 доза

ротка (рзведенная в

Инкубация смеси при 20-22' в течение 1 -2 часов

Взвесь клеток в

Цвет среды в про

Г лава 3 . М ето д ы исследования в вирусологии

разведение — в 4 пробирках) добавляют по

вируса в равном объеме. Полученные смеси выдерживают при комнатной температуре 1 -2 часа (чтобы могла про изойти реакция нейтрализации), после чего в пробирки добавляют взвесь клеток в количестве одной дозы, также в объеме 0,25 мл. В реакции ставят контроль дозы клеток и контроль сы воротки на токсичность. Иногда сыворотка может оказывать на культуру клеток токсичное действие: клетки гибнут, не накапливая кислых продуктов, и цвет среды остается красным. Учет результатов реакции нейт рализации по цветной пробе производится через 7 -9 дней инкубирования при 37 °С при наличии правильных ре зультатов в контролях.

Тит ром реакции ( т ит ром сы ворот ки) называется максимальное разведение сы воротки, которое еще подав ляет в 50% случаев действие 100 цитопатических доз ви руса. В нашем примере титр равен 1:64 (табл. 8).

3.5. Применение реакции гемагглютинации (рга), реакции торможения гемагглютинации (ртга)

и биологических экспериментальных моделей для индикации и идентификации вирусов

Явление гемагглютинации — склеивания эритроцитов под действием вирусов впервые обнаружил Херст (1941 г.). Было выявлено, что вирус гриппа агглютинирует эритро циты кур, и разработана реакция гемагглютинации. П оз же было установлено, что гемагглютинирующ ими свой ствами обладают и многие другие вирусы (больш инство парамиксовирусов, поксвирусов, рабдвирусов, некоторые энтеровирусы, флавивирусы, аденовирусы и др.).

М еха н и зм , ст адии реакции . Гемагглютинация, вы зываемая вирусами, не является иммунологической ре акцией, так как здесь нет системы антиген — антитело. С пом ощ ью этой реакции легко выявить присутствие гемагглю тинирую щ его вируса, но невозмож но его иденти фицировать.

108 О бщая медицинская вирусология

Вирусы, обладающие гемагглютинирующими свойства

ми, имеют на поверхности гем аггл ю т и н и н ы , с помощ ью которы х и происходит склеивание эритроцитов. По св о ей хим ической природе гемагглютинины являю тся глико- или липопротеидами. У слож ны х вирусов они стр ук турно связаны с ворсинками, у просты х вирусов — с капсидом.

В процессе взаимодействия вирусов с эритроцитами различают стадии адсорбции, агглютинации и элю ции.

А дсорбция вирусов на эритроцитах начинается как не специф ическая, а затем переходи т в спец иф и ческую вследствие сродства гемагглютининов к рецепторам эрит роцитов. На одном эритроците адсорбируется множ ество вирусов, они образуют мостики меж ду эритроцитами, из меняется электростатический заряд эритроцитов и в ре зультате наступает следующ ая стадия взаимодействия — гемагглютинация, на которой процесс мож ет остановить ся. Н екоторы е вирусы способны к элюции — освобож де нию с поверхности эритроцитов. Элюция происходит под действием вирусны х ферментов (например, нейраминидазы) на рецепторы эритроцитов. Элюированные вирусы при этом не повреж даю тся, эритроциты же не способны повторно адсорбировать вирус вследствие разрушения ре цепторов.

При постановке реакции гемагглютинации (РГА) ста раются использовать именно те эритроциты (птиц, ж и вотных, человека), с которыми гемагглютинирующие свой ства данного вируса вы являю тся лучше; чаще всего гемагглютинацию ставят с эритроцитами кур. Обычно РГА ставят при комнатной температуре, реже при 4 °С или 37 °С. Н еобходимо также учитывать значение pH, элект ролитный состав среды.

Задерживающее действие на РГА могут оказать ин ги би т оры , содержащ иеся в тканях, где размножался ви рус, и других биологических субстратах. Для снятия ин гибиторного действия вируссодерж ащ ие материалы про гревают, обрабатывают трипсином, ацетоном и др.

Читайте также: