Особенности биотехнологии культивирования вирусов

Обновлено: 28.03.2024

Хемостатная, или непрерывная, культура представляет собой проч­ную культуру тех или иных микроорганизмов. В таком случае воз­можность продления жизни микробной популяции поддерживается с помощью непрерывной подачи свежей среды и постоянного отбора микробной биомассы или образовавшихся продуктов метаболизма, т.е. можно культуру микроорганизма как бы зафиксировать в одной, например стационарной, фазе роста и получать нужные продукты об­мена или биомассу во времени столько, сколько требуется. Таким об­разом, максимальная производительность в хемостатной культуре все­гда выше, чем максимальная производительность в периодической культуре.

Нужно сказать, что до 50-х годов для культивирования микроорга­низмов с целью их всестороннего изучения служила простая периоди­ческая культура. Только с переходом к методу хемостатного культи­вирования обнаружился недостаток периодической культуры, которая не даёт полного представления обо всех изменениях, происходящих в клетке, и о влиянии внешних факторов на протекающие в ней процес­сы.

Развитие хемостатного культивирования открыло возможность управлять процессом, контролируя рост и поведение микроорганиз­мов, а при необходимости вмешиваться в этот процесс, изменяя ско­рость роста до задаваемых пределов путём воздействия на такую куль­туру внешними факторами. В настоящее время интерес к непрерывно­му культивированию растёт как в нашей стране, так и за рубежом. Од­нако, несмотря на преимущества хемостатных культур, в биологиче­ской промышленности при производстве вакцин они не получили ещё достаточного применения по следующим причинам:

1. Технические трудности, в первую очередь связанные с создани­ем асептических условий.

2. Не во всех случаях непрерывный процесс предпочтительнее пе­риодического, поскольку при низкой удельной скорости роста биомас­сы периодический процесс по эффективности не уступает непрерыв­ному и более выгоден, т. к. его проще осуществить.

3. Интенсивный биосинтез многих продуктов метаболизма проис­ходит при медленном росте биомассы, поэтому в периодических про­цессах концентрация целевого продукта в культуральной жидкости обычно выше, чем в непрерывных, что существенно повышает эффек­тивность стадий выделения и очистки продукта. Всё это свидетельствует о том, что периодические процессы в бу­дущем будут применяться.

2. Особенности биотехнологии культивирования вирусов

Вирусы являются облигатными внутриклеточными микроорганиз­мами, поэтому на искусственных питательных средах они не растут. Для культивирования вирусов используют 3 живые системы:

1. Восприимчивые животные.

2. Куриные эмбрионы.

3. Культуры клеток.

При лабораторном культивировании вирусов используют культу­ры клеток, растущие на поверхности стенок тех или других емкостей (матрасах).

В крупномасштабном производстве используют метод выращива­ния суспензионных клеточных культур. Этот метод впервые описал в 1953 г. Оуенс. Он показал способность клеток размножаться в жидкой среде в свободном суспендированном состоянии. Клетки перевивае­мых линий могут длительно культивироваться во взвешенном состоя­нии. В таких условиях клетки размножаются, не прикрепляясь к стен­кам культурального сосуда, благодаря постоянному перемешиванию среды. Перемешивание суспензионных культур проводят лопастными и магнитными мешалками, а также круговыми качалками.

Суспензионные культуры готовят из однослойных клеточных культур. Клетки снимают со стекла с помощью растворов Версена и трипсина. Осадок клеток после центрифугирования ресуспендируют в свежей ростовой питательной среде. Приготовленную суспензию по­мещают в культуральные сосуды, реакторы, ферментеры и выращива­ют при постоянном и интенсивном перемешивании. Это делается для того, чтобы поддерживать клетки во взвешенном состоянии, препятст­вовать их осаждению и прикреплению к стенкам сосуда и в то же вре­мя не вызывать их механического повреждения. Способ суспензионного выращивания клеток в биологической про­мышленности стал применяться сравнительно недавно.

Даже за короткий срок получены впечатляющие результаты. Боль­шие успехи достигнуты при получении суспензионных постоянных культур клеток ВНК-21 для выращивания вируса ящура, вируса бе­шенства клеток почки поросят JBRS-2 для размножения вируса ящура, вируса везикулярной болезни свиней и др.

Выращивание клеточных культур осуществляют в специальных ре­акторах емкостью 1000 и более литров при температуре 36-37° С, рН 7,4 и непрерывном перемешивании суспензии клеток при 300-350 об/мин.

Несмотря на достижения по выращиванию суспензионных клеточ­ных культур, на многих предприятиях биологической промышленно­сти чаще используются методы получения клеточных линий в состоя­нии покоя или роллерным (динамичным) способом.

Культивирование вирусов. Биотехнологии в вирусологии.

Массовое выращивание клеток в культуре является центральным звеном любого технологического процесса, основанного на использовании клеток животных, и, в первую очередь, производства вирусных препаратов. Эта стадия определяет массу и качество клеток и, тем самым, в целом технологию получения вирусного сырья. Выбор способа культивирования вируса в значительной мере определяется способностью клеток размножаться на поверхности плотного субстрата или в суспензионной культуре. Трудно определить верхние и нижние границы крупномасштабного или промышленного выращивания вирусов в клеточных культурах. Все зависит от масштабов производства вирусных препаратов. В одних случаях речь идет о получении сотен литров, в других — десятков и даже сотен тысяч литров культурального вируса в год. Это зависит от вида вакцин и масштабов их применения. Изготовление живых вакцин при прочих равных условиях всегда требует меньших объемов вирусного сырья, нежели приготовление инактивированных, в особенности концентрированных вакцин.

Отсутствие эффективных вакцин для профилактики некоторых заболеваний объясняется, прежде всего, отсутствием экономичного способа получения иммуногенного материала в достаточном количестве.

В отличие от инактивированных вакцин против ящура и полиомиелита, выпускаемых в больших количествах, при многих заболеваниях человека и животных применяют живые вакцины, для изготовления которых не требуется большого количества вирусного сырья. Это, прежде всего, относится к тем вакцинам, которые перед применением разводят. Ежегодно производство таких вакцин, связанное с получением сотен литров культурального вируса, удовлетворяется использованием статических или вращающихся культуральных сосудов. Однако такие методы культивирования вирусов не могут удовлетворить крупномасштабное производство ряда вирусных вакцин. Например, при изготовлении противоящурной вакцины перевиваемые клетки выращивают в суспензии в реакторах с рабочим объемом более 1000 л. Крупные научно-производственные центры Южной Америки ежегодно вырабатывали до 600 млн. доз моновалентной инактивированной противоящурной вакцины. Для этой цели необходимо еженедельно получать около 20 000 л суспензионной культуры клеток ВНК-21.

классификация вирусов

До недавнего времени производство большинства вирусных препаратов основывалось на использовании первичных культур клеток из нормальных тканей различных видов домашних и лабораторных животных. Кроме того, в качестве клеточных субстратов для производства вакцин, применяемых в медицине, использовали немногие линии диплоидных клеток с ограниченной жизненной потенцией. Широкое применение таких препаратов в медицине и ветеринарной практике дало возможность достичь больших успехов в борьбе со многими опасными вирусными болезнями человека и животных. Однако первичные культуры клеток во многих отношениях не являются перспективными клеточными субстратами. Их приготовление связано с периодическим убоем животных и необходимостью выделения клеток из тканей.

Первичные культуры отличаются нестандартностью, таят в себе опасность в отношении эндогенной контаминации различными вирусами и микроорганизмами. Наконец, их сложно выращивать в условиях крупносерийного производства. Отмеченные трудности значительно возрастают в связи с тенденцией постоянного увеличения масштабов изготовления противовирусных препаратов. Кроме того, в последнее время все более широкое развитие получает разработка концентрированных и субъединичных вакцин, при изготовлении которых требуется большое количество вирусного материала. Естественно, что стоящая задача может быть решена лишь путем использования постоянных (перевиваемых) линий клеток, отличающихся способностью к бесконечной пересеваемости вне организма, высокой стандартностью, низкой стоимостью, относительной простотой трансфекции рекомбинантной ДНК и последующего клонирования высокоэффективных продуцентов, высокой вероятностью правильного посттрансляционного процессинга вновь синтезируемых белков, кодируемых трансфецирующей ДНК.

Ветеринарная наука в течение последней четверти века накопила большой опыт в изготовлении вирусных вакцин с использованием в качестве субстрата для размножения вирусов культур постоянных линий клеток животных. Особый успех достигнут в изготовлении инактивированной противоящурной вакцины. Производство вакцин против ящура имеет наиболее цитируемую технологию. Она основана на использовании линии трансформированных клеток новорожденного хомяка, выращиваемых в суспензии. Эта технология достаточно экономична, ее выполняют в биореакторах большой емкости. Накоплены определенные доказательства безопасности некоторых постоянных клеточных линий, используемых в качестве субстрата в производстве ряда биологических препаратов. Например, инактивированную противоящурную вакцину готовят из вируса, выращенного в культуре постоянной линии клеток почки новорожденного хомяка (линия ВНК-21). Более чем за 20-летний период этой вакциной привито свыше 100 млн. голов крупного рогатого скота и не обнаружено каких-либо нарушений у привитых животных, по крайней мере, в течение 2—4 лет после введения вакцины. Имеется много других примеров безопасности применения инактивированных и даже живых вакцин против ряда болезней животных, приготовленных из вирусов, размноженных в культурах различных постоянных линий клеток. Применение биологических препаратов, полученных на основе перевиваемых клеточных линий, в медицине началось намного позже, чем в ветеринарной практике.

Несмотря на очевидные преимущества постоянных линий клеток, медицинская практика до недавнего времени воздерживалась от их применения в производстве вирусных вакцин. Причина заключалась в том, что, согласно существовавшему мнению, для изготовления медицинских вирусных вакцин можно было использовать клетки из тканей только клинически здоровых животных. Производство таких вакцин ограничивалось использованием первичных и диплоидных культур клеток. В диплоидных линиях клеток человека никогда не были обнаружены латентные вирусы или спонтанная трансформация клеток. Основное возражение против использования постоянных клеточных линий для репликации вирусов и векторных рекомбинатов в производстве вирусных вакцин медицинского назначения заключалось в их возможной онкогенности из-за контаминации вакцин клеточной ДНК или генными продуктами (регуляторными белками). Интеграция гетерогенной ДНК может привести к предзлокачественным изменениям в результате активации протоонкогенов, запуску онкогенов и инактивации генов опухолевой супрессии. В процессе репродукции вакцинных штаммов для живых вакцин с использованием клеточных линий, латентно контаминированных другими вирусами, могут появляться вирусные гибриды с неожиданными свойствами.

Этот вопрос рассматривался неоднократно на различных научных форумах в Европе и Северной Америке. Ценность постоянных клеточных линий в качестве субстратов стала особенно очевидной благодаря успехам, достигнутым в последнее время в области фундаментальных биологических исследований, а также в связи с перспективой их использования в рекомбинантной ДНК-технологии и получении генно-инженерных биопрепаратов. Общая тенденция к применению постоянных клеточных линий в производстве медицинских иммунобиологических препаратов наметилась на рубеже 70—80-х годов. Так, в 1978 г. в Лейк-Плесиде (США) было предложено использовать лимфобластоидные клетки человека для крупномасштабного производства альфа-интерферона. В 1981 г. Комитет экспертов ВОЗ по стандартизации биологических препаратов одобрил применение неопухолевых и неконтаминированных вирусами постоянных клеточных линий для производства инактивированной полиомиелитной вакцины, а затем также для инактивированной вакцины против бешенства. Такое решение дало возможность в короткий срок разработать методы крупномасштабного выращивания вирусов с использованием микроносителей и создать высокоэффективные вирусные вакцины.

В истории создания биологических препаратов ключевая роль всегда принадлежала выбору приемлемо безопасных вариантов. Решение о применении людям биопрепаратов, полученных с использованием постоянных клеточных линий, основывалось на оценке различными комитетами выгод и риска, связанных с созданием новых препаратов, по сравнению с существующими. Важнейшие потенциальные факторы риска, связанные с биологическими препаратами, производимыми на постоянных клеточных линиях, можно разделить на три категории: примесь гетерогенной ДНК, вирусы и трансформирующие белки.

Одним из основных вопросов, требующих самого пристального внимания, является потенциальная долгосрочная опасность, связанная с присутствием в препаратах примесей гетерогенных ДНК, особенно в тех случаях, когда последние могли содержать потенциально онкогенные кодирующие или регуляторные последовательности.

Информация на сайте подлежит консультации лечащим врачом и не заменяет очной консультации с ним.
См. подробнее в пользовательском соглашении.

Выращивание вирусов. Методика выращивания вирусов.

Развитие специфической профилактики инфекционных заболеваний человека и животных создало необходимость разработки методов массового получения вирусного сырья.

В течение многих лет заражение животных оставалось единственным методом культивирования вирусов, что служило серьезным препятствием для получения высококачественных вирусных вакцин и в достаточном количестве. До сих пор не удалось культивировать in vitro некоторые вирусы (папилломы человека и др.).

Использование куриных эмбрионов — важный шаг на пути разработки вирусных вакцин. В силу высокой производительности и отличного накопления некоторых вирусов этот метод не потерял своей актуальности. Его и сейчас с успехом применяют для изготовления вакцин против ряда заболеваний человека и животных.

выращивание вирусов

Большое накопление некоторых вирусов в организме составляет серьезную конкуренцию методам их размножения в клеточных культурах. Это, прежде всего, относится к вирусу гепатита В, который накапливается в плазме крови человека в высоком титре (1012—1013 частиц/мл) и является прекрасным источником вирусного антигена для приготовления инактивированной вакцины.

Другим примером может служить вирус миелобластоза птиц, который при экспериментальном заражении цыплят накапливается в плазме крови в титре 5х10 12 вирусных частиц/мл и является хорошим источником препаративного получения ре-вертазы.

Значительные успехи в области выращивания вирусов животных вне организма прежде всего связаны с открытием возможности выращивания полиовируса в экстраневральных тканях (Эндерс и сотр., 1949) и усовершенствованием метода тканевых культур (Дульбекко и др., 1952). Этому в огромной степени способствовало также открытие антибиотиков и создание синтетических и полусинтетических питательных сред. Указанные достижения обеспечили возможность обновить методы получения ранее существовавших препаратов и создать новые эффективные вакцины против ряда вирусных болезней.

В производстве вирусных препаратов широкое применение нашли первичные культуры и линии клеток. Для приготовления живых и инактивированных вакцин человека, а также животных, часто используют вирус, выращенный в первичных культурах клеток животных. В последнее время инактивированные вакцины, предназначенные для вакцинации людей, все чаще готовят с использованием клеточных линий. Для некоторых вакцин, применяемых в животноводческой практике, вирус выращивают в культурах постоянных клеточных линий. Перспектива использования постоянных линий клеток особенно заманчива в плане крупномасштабного суспензионного культивирования.

Выбор метода получения вирусного сырья в каждом конкретном случае определяется специфическими требованиями, предъявляемыми к готовому препарату.

Получение большого количества вирусного сырья с выраженной антигенной активностью особенно необходимо для инактивированных вакцин. Изготовление некоторых из них, применяемых в животноводческой практике, достигло огромных масштабов. С точки зрения технологии крупномасштабного производства вирусных препаратов, метод культивирования вируса должен основываться на потреблении доступных, недорогих, максимально стандартизированных клеточных субстратов и питательных сред, обеспечивать достаточное накопление вируса или вирусного антигена и иметь высокую производительность.

В настоящее время разработаны и широко применяются методы производственного выращивания ряда вирусов человека и животных с целью изготовления вирусных препаратов. Однако, учитывая исключительную практическую важность исследований и разработок в этой области, они постоянно направлены на поиски новых принципов и технологических решений.

Информация на сайте подлежит консультации лечащим врачом и не заменяет очной консультации с ним.
См. подробнее в пользовательском соглашении.

Постоянная клеточная линия для выращивания вирусов. Непрерывное культивирование вирусов.

Постоянная (непрерывная) клеточная линия — это клетки, способные субкультивироваться вне организма в течение неограниченного количества пассажей. На уровне знаний о поведении культивируемых клеток невозможно определить точку, когда культура становится стабильной, т. е. приобретает способность расти до бесконечности. Только на основе опыта с фибробластоподобными клетками человека показано, что культура должна субкультивироваться, по крайней мере, 70 раз с интервалом примерно в три дня, прежде чем ее можно будет считать постоянной (непрерывной) линией клеток.

Под трансформацией клеток подразумевают необратимые генетические изменения, характеризующиеся изменением ростовых свойств культивируемых клеток. Трансформация делает клетки бессмертными и менее зависимыми от питательных факторов и геометрических параметров роста. Изменение ростовых свойств связано с изменением транспортировки питательных веществ через клеточную мембрану и является одной из адаптивных особенностей, позволяющих клеткам размножаться в условиях, неблагоприятных для не трансформированных родительских клеток.

Изменение клеточной мембраны сопровождается потерей поверхностного белка (150 кД) и изменением антигенных свойств. Основное достоинство трансформированных клеток - способность к бесконечному размножению и улучшенные ростовые свойства. Трансформированные клетки могут образовывать опухоли у иммунологически толерантных животных. По этой причине трансформацию иногда неправомерно приравнивают к злокачественным изменениям. Первичные культуры клеток, линии диплоидных и трансформированных клеток получили широкое применение в вирусологической практике и явились основой создания крупномасштабных систем культивирования клеток и производства вакцин.
Это, в свою очередь, потребовало усовершенствования методов культивирования, организации коммерческого производства сред и аппаратуры для культур клеток.

культура клеток щитовидной железы и цитомегаловирус

Получение постоянных линий намного расширило исследования в области клеточной биологии и вирусологии. На их основе появилась возможность получения мутантных и гибридных линий клеток, что открыло перспективу создания новых субстратов, пригодных для культивирования вирусов. Нормальные клетки удается субкультивировать вне организма в течение ограниченного количества пассажей, после чего их размножение прекращается и они, как правило, погибают. Это обычно происходит примерно после 50 генераций, если клетки получены из тканей взрослого организма.

Лишь иногда они способны продолжать размножаться в культуре неограниченно долго, превращаясь в так называемые трансформированные постоянные клеточные линии. Трансформация клеток в культуре имеет полиэтиологическую природу. Спонтанная трансформация культур клеток нормальных тканей — относительно редкое событие. Частоту таких трансформаций можно увеличить, обработав клетки мутагенами или некоторыми вирусами.

Все они получены в результате спонтанной или индуцированной трансформации клеток в организме или в культуре. Многие происходят из опухолей животных, хотя не всегда при эксплантации опухолевых клеток in vitro образуются клеточные линии. Линии клеток, полученные непосредственно из опухолевых тканей (т.е. трансформированных в организме), часто сохраняют специализированные функции, например, способность продуцировать некоторые ферменты в течение более продолжительного периода, чем клетки, трансформированные в культуре различными методами (физическими, химическими, вирусными агентами). Частота получения постоянных линий у различных видов млекопитающих неодинакова.

Клетки мышей подвергались спонтанной трансформации значительно чаще, чем клетки человека или других млекопитающих. Указанные различия, по-видимому, связаны с неодинаковой стабильностью кариотипа разных видов животных.

Субкультивирование клеток, а затем и становление постоянной клеточной линии, были более успешными, когда первичную однослойную культуру получали путем посева механически измельченной ткани, чем из суспензии трипсинизированных клеток. Возможно, это связано с уменьшением количества белка в поверхностных структурах клеток в результате обработки трипсином. Для трансформации клеток часто используют вирусы. Клетки почки новорожденного хомяка (ВНК), например, легко трансформируются вирусом полиомы или вирусом SV-40, а клетки эмбриона хомяка - герпесвирусом типа 3 лошадей. В последнем случае клеточные линии экспрессировали вирус-специфические белки, но не продуцировали вирусного потомства.

Трансфекция культуры клеток почки эмбриона человека онкогеном вируса SV-40 увеличивала период размножения in vitro от 15-20 до 70-90 поколений. Из популяции таких клеток удалось выделить две постоянные линии, практически не имеющие признаков трансформации. В результате трансфекции гепатоцитов нормальных крыс ДНК вируса SV-40 получена серия клеточных линий SV-40 гепатоцитов. С помощью рекомбинантного вектора SV-40-аденовируса получены различающиеся по свойствам постоянные линии клеток стромы костного мозга человека, экспрессирующие большой Т-антиген вируса SV-40. Т-штамм вируса ретикулоэндотелиоза кур вызывал трансформацию культур клеток печени, селезенки, костного мозга, а также тимуса куриных эмбрионов и молодых цыплят. Подавляющее большинство трансформированных линий клеток секретировало вирус, вызывающий летальный ретикулоэндотелиоз у 1—2-дневных цыплят.

Предпочтительными сайтами интеграции вирусного генома оказались ломкие участки в геноме млекопитающих, что обусловлено, по-видимому, их структурными и функциональными особенностями. Результатом взаимодействия вирусного и клеточного геномов могут явиться хромосомные аномалии и приобретение клетками способности к неограниченному размножению.

При длительном культивировании клеточные линии могут изменять те или иные свойства, поэтому для поддержания исходных свойств расплодки клеток, их хранят при низкой температуре и периодически берут для размножения и практического использования. Например, в процессе многих циклов выращивания клеток ВНК-21 в однослойной культуре могут значительно изменяться их первоначальные свойства. Нормальный равномерный рост фибробластоподоб-ных клеток может смениться ростом эпителиоподобных клеток, образующих слои и грозди. От свойств сыворотки также зависит скорость роста клеток и чувствительность к разным типам и штаммам вируса ящура.
Большинство таких изменений характерно для трансформированных клеток других линий.

Информация на сайте подлежит консультации лечащим врачом и не заменяет очной консультации с ним.
См. подробнее в пользовательском соглашении.

Культивирование вирусов — выращивание вирусов в искусственных условиях путем заражения животных, культур клеток и тканей. Культивирование вирусов производят в диагностических целях (выделение от больных и носителей), при экспериментальной работе (изучение вирусов), для производства вирусных вакцин и диагностикумов.

Гальтье (V. Galtier) впервые осуществил в 1879 г. культивирование вируса бешенства, заразив кролика мозгом больной собаки. Левенштейн (A. Lowenstein, 1919) первый опубликовал данные об успешной передаче вируса герпеса от человека кролику. Грютер (W. Gruter, 1920) доказал возможность культивирования вируса герпеса на кроликах. Способность вируса вакцины (коровьей оспы) репродуцироваться в тканевой культуре была доказана Паркером и Наем (F. Parker, В. N. Nye) в 1925 г. В 1931 г. Вудрафф (А. М. Woodruff) и Э. Гудпасчер показали возможность К. в. на хорион-аллантоисной оболочке эмбрионов кур (вирус оспы птиц).

Вирусы репродуцируются только в живых клетках, поэтому для их накопления заражают вирусами животных или культуры клеток и тканей. При этом происходит адаптация вируса, полученного из организма больного или носителя, к новым условиям. Чем меньше отличается искусственная система от естественной, тем легче осуществляется адаптация вируса.

Для оптимальной репродукции вируса необходимо использовать наиболее чувствительную систему и проводить заражение сильно разведенным свежим материалом, поскольку инактивированные вирусные частицы могут тормозить размножение инфекционных вирионов. Система, в к-рой вирус проходит полный цикл репродукции, носит название пермиссивной (разрешающей). В непермиссивной (неразрешающей) системе происходит неполный цикл репродукции вируса либо он вообще не репродуцируется. Пермиссивная для данного вируса система может стать для него непермиссивной при изменении условий культивирования, напр, при изменении температуры.

На животных культивируют те вирусы, которые вызывают у них четкую клиническую или патологоанатомическую картину (напр., развитие у мышей параличей при заражении вирусом бешенства или пневмонии при гриппозной инфекции). Многие вирусы лучше растут в мало-дифференцированных тканях эмбрионов птиц и новорожденных млекопитающих, чем в организме взрослых особей.

Для Культивирования вирусов используют мышей, крыс, морских свинок, кроликов, сирийских хомячков, африканских хорьков, обезьян, кур и др. На взрослых мышах культивируют вирусы гриппа, бешенства, многие тогавирусы; мыши-сосунки незаменимы при выращивании ряда вирусов Коксаки и тогавирусов ряда ареновирусов — возбудителей вирусных геморрагических лихорадок.

Сосунков белых крыс и сирийских хомячков часто используют для культивирования онкогенных вирусов. Морские свинки служат для выращивания вирусов ящура, марбургской болезни и др. Из обезьян наиболее часто используют зеленых африканских мартышек и разные виды макаки. Так, изучение вирусов полиомиелита и желтой лихорадки стало возможным после их адаптации к организму макак. Культивирование возбудителей некоторых медленных инфекций (куру, болезни Крейтцфельдта—Якоба), а также вирусов гепатитов А и В впервые удалось при заражении шимпанзе. Чувствительными к вирусу гепатита А также оказались южноамериканские обезьяны мармозеты.

Для получения стандартных результатов животные, используемые для работы с вирусами, должны быть генетически однородными. Этой цели служит инбредное скрещивание лаб. животных — братьев и сестер или родителей и детей, чем достигается возрастающая степень гомозиготности.

Для успешного К. в., помимо вида и возраста животных, имеет значение путь введения материала, что обусловлено тропностью вируса. Поэтому в большинстве случаев для размножения вируса в организме животного необходима его инокуляция в чувствительную ткань. Лишь некоторые вирусы патогенны для животных при любых способах инокуляции (напр., вирус венесуэльского энцефалита лошадей для мышей).

Большинство нейротропных вирусов культивируют путем введения их в полушария головного мозга животных. Этим путем заражают мышей различными тогавирусами, буньявирусами и другими арбовирусами. Вирус бешенства вводят таким же образом мышам, кроликам, овцам и собакам, вирус лимфоцитарного хориоменингита — мышам и морским свинкам. При культивировании вируса полиомиелита на обезьянках его инокулируют в спинной мозг или таламус головного мозга. Часто при культивировании нейротропных вирусов их вводят животным в брюшную полость, однако этот путь инокуляции уступает по чувствительности внутримозговому. Респираторные вирусы культивируют обычно путем интраназального заражения — их закапывают в нос наркотизированным животным или вводят в виде аэрозоля в специальной камере.

Аденовирусы инокулируют сирийским хомячкам подкожно или в слизистую оболочку защечных мешков, вирус герпеса обезьян — кроликам внутрикожно, а оспенные вирусы — на скарифицированную кожу (кроликам, телятам, курам). Вирусы оспы и герпеса можно культивировать на скарифицированной роговице кролика. Введение вирусов в мышцу, внутривенно, через рот и per rectum применяют редко. Внутривенное заражение морских свинок, хомячков и хорьков технически сложно, вместо этого материал чаще вводят в полость сердца.

Культивирование вирусов на животных очень затрудняется наличием в их организме различных бактерий, микоплазм и вирусов, которые могут загрязнить культивируемый вирус. Иногда вирус, находящийся в организме животного, создает иммунитет к культивируемому вирусу, напр, возбудитель эктромелии у мышей к вирусу вакцины.

Для уменьшения риска загрязнения культивируемых вирусов посторонними возбудителями все чаще используют животных, выращенных в условиях изоляции. С этой целью получают животных, свободных от специфических для данного вида патогенных агентов,— SPF (specific pathogen free). У их матерей не должно быть инфекций, передающихся через плаценту. Детенышей извлекают при помощи кесарева сечения, вводят им в кишечник апатогенные бактерии, напр, молочнокислые, после чего они вскармливаются SPF самками. В дальнейшем эти животные размножаются обычным путем. Содержат их в закрытых помещениях, куда подается стерильный воздух, пища, вода и пр.

Животных, свободных от всяких возбудителей, содержат в специальных боксах в условиях еще более строгой изоляции (см. Стерильные животные).

Эмбрионы птиц с их малодифференцированными тканями пригодны для культивирования очень многих вирусов. Для получения оптимальных результатов имеет значение вид и возраст эмбрионов, путь заражения, введенная доза и температура инкубации. Чаще всего используют эмбрионы кур. Они наиболее чувствительны до 13-го дня инкубации. Инокулируют вирусы обычно на хорион-аллантоисную оболочку, в желточный мешок, аллантоисную и амниотическую полость; в мозг эмбрионов и внутривенно (в сосуды оболочек) вирусы вводят редко. В желточном мешке культивируют многие тогавирусы; вирусы гриппа и инфекционного паротита хорошо культивируются в амниотической полости 10 —11-дневных эмбрионов, при этом вирус гриппа размножается не только в клетках амниона, но также в трахее и легких эмбриона. Вирусы оспенной группы и др. культивируют на хорион-аллантоисной оболочке, заражая 10—13-дневные эмбрионы через естественный воздушный мешок или через отверстие на боковой поверхности яйца после создания искусственного воздушного мешка. При заражении любым путем эмбрионы могут быть травмированы, поэтому их гибель в первые 24 часа расценивается как неспецифическая. Оптимальное количество вируса при заражении — 1000 — 10 000 инфекционных доз. К. в. в эмбрионах обычно происходит при t° 36—37°. Некоторые вирусы, напр, вирус вакцины, могут размножаться при температуре выше 40°, в то время как возбудитель натуральной оспы необходимо культивировать при температуре не выше 38,5°. Температурно-чувствительные мутанты вирусов, обладающие, как правило, сниженной патогенностью, культивируют при t° 25—28°.

При размножении в эмбрионах вирусы могут вызвать их гибель (многие арбовирусы, вирус энцефаломиокардита и др.), появление изменений на хорион-аллантоисной оболочке (оспенные вирусы) или в теле эмбриона, накопление в эмбриональных жидкостях гемагглютининов (вирусы гриппа, паротита) и комплементсвязывающего вирусного антигена.

Большинство известных вирусов можно выращивать в культурах клеток и тканей (см.). Чаще всего используют однослойные первичные или перевиваемые клеточные культуры на стекле, реже применяют суспензионные культуры. К первичным культурам клеток вирусы адаптируются легче, чем к перевиваемым. Вирусы человека лучше всего размножаются в культурах человеческих клеток и почечных клеток обезьян.

Оптимальная доза вируса при заражении — 0,1—0,001 50% тканевой цитопатической дозы вируса на клетку. Объем инокулята должен быть небольшим. Адсорбцию вируса проводят в течение 1—2 час. при t° 37°, после чего инокулят удаляют, если он токсичен для клеток. Питательная среда должна иметь pH 6,9 — 7,2. Если к ней прибавлена сыворотка, последняя не должна содержать антител или неспецифических ингибиторов по отношению к культивируемому вирусу. Наиболее интенсивная репродукция большинства вирусов происходит при t 36 — 37°; при более низкой температуре (33°) культивируют риновирусы.

При К. в. с целью их выделения из инфицированных органов весьма эффективно культивирование клеток самой исследуемой ткани после ее трипсинизации (напр., ткани миндалин для выделения аденовирусов).

Размножение большинства вирусов сопровождается цитопатическими изменениями. Максимальное количество вируса в культуре обычно наблюдается при дегенерации 75% клеток. Размножение вирусов, не обладающих цитопатической активностью, можно установить с помощью реакции гемадсорбции (многие миксо- и тогавирусы), методом иммунофлюоресценции, путем исследования культуральной жидкости на наличие гемагглютининов (напр., миксовирусы) или комплементсвязывающего вирусного антигена, а также в опытах на животных (вирус бешенства). Некоторые вирусы можно выявить по их способности подавлять размножение цитопатогенного вируса, т. е. по феномену интерференции (напр., в культурах клеток эмбрионов кур, инфицированных вирусами лейкоза птиц, не размножается вирус саркомы Рауса). Некоторые вирусы образуют в клетках включения.

Большинство вирусов после размножения в клетках выходит в культуральную среду, ряд других остается связанным с клетками (вирусы оспы, аденовирусы), некоторые герпетические вирусы необходимо пересевать вместе с неповрежденными клетками, поскольку при разрушении клеток они инактивируются. Иногда при взаимодействии вируса и клетки развивается хроническая инфекция. Напр., инфицированные вирусом лимфоцитарного хориоменингита перевиваемые человеческие клетки могут продуцировать инф. вирус в продолжение многих поколений.

Для выращивания коронавирусов человека и некоторых других используют тканевые культуры, т. е. культивируемые вне организма тканевые фрагменты. Чаще всего используют ткань трахеи кролика. О размножении вируса в этом случае судят по прекращению движения ресничек культуры ткани.

Следует учитывать возможность присутствия в культурах клеток и тканей различных вирусов и микоплазм. Они могут быть внесены вместе с клетками, если последние взяты из инфицированного организма, попасть из трипсина или используемой в качестве ингредиента питательной среды сыворотки.

Адаптация вируса к искусственным условиям размножения требует проведения нескольких пассажей, быстро следующих друг за другом при заражении небольшой дозой вируса. Обычно интенсивность репродукции вируса при этом значительно возрастает. Иногда вирус после адаптации к одной системе приобретает способность размножаться также в других системах. Свежевыделенные вирусы более пластичны, чем долго культивировавшиеся в каких-либо одних условиях. К. в. в искусственных условиях нередко приводит к снижению их патогенности для естественных хозяев, чем пользуются для получения вакцинных штаммов. В неблагоприятных условиях культивирования (малочувствительных системах или при заражении слишком большой дозой) могут формироваться дефектные вирусные частицы, содержащие лишь часть генома или не имеющие нуклеиновой к-ты. Некоторые вирусы вообще не удается культивировать в искусственных условиях или их репродукция прекращается после нескольких пассажей.

Сохранять вирусы в течение нескольких дней можно при t° 4° в среде с pH ок. 7,0. Устойчивость их возрастает при удалении клеточных фрагментов и прибавлении сыворотки (10%), глицерина (50%) или обезжиренного молока (50%). Все вирусы хорошо сохраняются при t° —70° и ниже в герметически закрытых сосудах; многие остаются жизнеспособными месяцы и даже годы. Оспенные вирусы и энтеровирусы хорошо сохраняются при t° —20°. Замораживание вируса должно происходить быстро. Для повышения устойчивости вируса прибавляют к среде сывороточный белок, куриный желток, пептон, сахарозу или глюкозу. Влияние стабилизаторов на разные вирусы неодинаково. Вирусы могут оставаться жизнеспособными длительное время и после лиофилизации. В качестве стабилизаторов при этом используют пептон (10%), молоко (50%), сахарозу с желатиной или куриным желтком (по 10 %). Лиофилизированный вирус должен сохраняться в вакууме или нейтральном газе (напр., азоте) при t° 4° или —15°.


Библиография: Лабораторная диагностика вирусных и риккетсиозных заболеваний, под ред. Э. Леннета и Н. Шмидт, пер. с англ., М., 1974; Соколов М. И., Синицкий А. А. и Ремезов П. И. Вирусологические и серологические исследования при вирусных инфекциях, Л., 1972; Штарке Г. и др. Практическая вирусология, пер. с нем., М., 1970, библиогр.; Comparative diagnosis of viral diseases, ed. by E. Kurstak a. C. Kurstak, v. 1—2, N. Y. a. o., 1977.

Читайте также: