Оздоровление посадочного материала от вирусов

Обновлено: 09.05.2024

Основное преимущество клонального микроразмножения - получение генетически однородного, безвирусного посадочного материала. Предположение о возможности отсутствия вирусов в меристематических тканях больных растений впервые было высказано в 1936 г. Чунгом, а позднее, в 1943 г., и Уайтом. В 1949 г. этот факт был подтвержден экспериментально. В 1952 г. Морелю и Мартену из Национального агрономического института (Франция) удалось получить безвирусные георгины из зараженных растений.

Структурной основой используемого на практике явления служит специфика строения точки роста растений: дистальная ее часть, представленная апикальной меристемой, у разных растений имеет средний диаметр 200 мкм и высоту от 20 до 150 мкм. В нижних слоях дифференцирующиеся клетки меристемы образуют прокамбий, дающий начало пучкам проводящей системы.

Известно, что успех клонального микроразмножения зависит от меристематического экспланта. При этом отмечается закономерность: чем больше листовых зачатков и тканей, тем легче идут процессы морфогенеза, заканчивающиеся образованием целого растения. Вместе с тем, при таком развитии конуса нарастания увеличивается риск быстрой транспортировки вируса по проводящей системе. Кроме того, даже небольшой меристематический эксплант может содержать вирусы, проникшие в клетки в результате медленного распространения через плазмодесмы.

В целом, эффективность применения апикальной меристемы в качестве метода оздоровления зараженных вирусами растений может оказаться довольно низкой. Снизить риск попадания вирусов в здоровые ткани можно путем применения предварительной термо- или химиотерапии исходных растений.

Метод термотерапии применяется как в условиях in vivo, так и in vitro и предусматривает использование горячего сухого воздуха. Для объяснения механизма освобождения растений от вирусов в процессе термотерапии существуют различные гипотезы. Согласно одной их них при высоких температурах разрушаются белковая оболочка и нуклеиновая кислота вируса. Вторая гипотеза предполагает действие высоких температур на вирусы через метаболизм растений. При такой температуре начинает преобладать деградация вирусных частиц, а синтез их, наоборот, уменьшается. Растения, подвергающиеся термотерапии, помещают в термокамеры, где температура в течение первой недели повышается с 25 до 37оС путем ежедневного увеличения температуры на 2 градуса. Все остальные режимы обязательно поддерживаются в оптимальном состоянии: освещенность, высокая относительная влажность воздуха, определенный фотопериод. Продолжительность термостатирования зависит от состава вирусов и их термостойкости. Если для гвоздики достаточно 10 - 12 недельного воздействия теплом, то для хризантемы этот период превышает 12 недель.

Помимо положительного действия высоких температур на освобождение от вирусов, выявлено аналогичное влияние их на точку роста и процессы морфогенеза некоторых цветочных культур (гвоздики, фрезии) в условиях in vitro. Высокие температуры увеличивают коэффициент размножения на 50 - 60%, повышаю адаптацию пробирочных растений к почвенным условиям и позволяют получить больше безвирусных маточных растений.

Другой способ оздоровления - химиотерапия. В питательную среду, на которой культивируют апикальные меристемы, добавляют препарат вирозола в концентрации 20 - 50 мг/л. Это противовирусный препарат широкого спектра действия. Применение его позволяет увеличить число безвирусных растений с 40% до 80 - 100%.

Одно из преимуществ клонального микроразмножения - получение генетически однородного, безвирусного посадочного материала растений. Это можно достичь, используя меристемные ткани апексов и пазушных почек органов стеблевого происхождения. Как правило, меристема состоит из конуса нарастания, а также одного или двух листовых зачатков (примордий) и является свободной от инфекции (рис. 4.6).

Предположение о возможности отсутствия вирусов в меристематических тканях растений впервые было высказано Чуигом в 1938 г. и Уайтом в 1943 г. Начиная с 50-х гг. предприняты первые успешные опыты по получению свободных от вирусов растений георгина из точки роста. Авторы этого метода Морель и Мартин полагали, что в больном растении вирус распространяется с отставанием от быстрорастущих молодых органов, особенно в молодых недифференцированных тканях, где концентрация вируса может снижаться, вплоть до полного отсутствия.

Теоретические концепции, положенные в основу этого метода, стали проясняться в последнее время. Строение точки роста растений имеет свою специфику: средний диаметр дистальной ее части, представленной апикальной меристемой, у разных растений составляет до 200 мкм, высота - от 20 до 150 мкм (рис. 4.6). В более нижних слоях дифференцирующиеся клетки меристемы образуют прокамбий, дающий начало пучкам проводящей системы. Известно, что успех клонального микроразмножения зависит от размера меристематического экспланта: чем больше листовых зачатков и тканей стебля, тем легче идет процесс морфогенеза, заканчивающийся получением целого нормального пробирочного растения.

Рис. 4.6. Схема мест формирования растительных меристем на побеге: 1 - верхушечные; 2 - боковые; 3 - промежуточные

Вместе с тем зона, свободная от вирусных частиц, очень различна для вирусов. Это зависит также от вида и сорта растения. В колеоптиле злаков, например, размеры участка верхушки, не содержащей сосуды, могут достигать до 250 мкм. Такая особенность строения апикальной меристемы исключает проникновение в нее вируса путем быстрого транспортирования по проводящей системе, не допускает возможность медленного распространения через плазмодесмы, соединяющие меристематические клетки.

В принципе, возможно получение безвирусной апикальной меристемы от больного растения, но при этом риск попадания вирусов в здоровые ткани должен быть снижен до нуля (рис. 4.7, рис. 4.8). Это может быть достигнуто путем применения предварительной термотерапии исходных растений или хемотерапии. Тепловая обработка вызывает инактивацию вирусов, химические вещества ингибируют их развитие.

Рис. 4.7. Этапы развития апикальной меристемы картофеля на питательной среде, содержащей активированный уголь: а - меристема после ведения в культуру; б - начало развития адвентивных почек; в - формирование адвентивных побегов (фото Н.В. Зобовой)

Рис 4.8. Последовательность получения растений, свободных от вирусов через культуру апикальных меристем: 1 - инфицированное вирусом растение, 2 - сегменты стебля; 3 - вычленение апикальной меристемы из пазушной почки; 4 -культивирование апикальной меристемы; 5 - растение, развившееся из апикальной меристемы; 6 - тестирование растений на присутствие вирусов; 7 - размножение в культуральных условиях растения, свободного от вирусов; 8 - размножение свободных от вирусов растений в грунте

Метод термотерапии применяется как в условиях in vivo, так и in vitro и предусматривает использование сухого горячего воздуха. Для объяснения механизма освобождения растений от вирусов в процессе термотерапии существуют различные гипотезы. Согласно одной из них высокие температуры воздействуют непосредственно на вирусные частицы, через их - на нуклеиновую кислоту и белковую оболочку, вызывая физическое разрушение и лишая вирусные частицы инфекционности.

Вторая гипотеза состоит в том, что высокая температуре действует на вирусы через метаболизм растений. Под действием высоких температур нарушается равновесие между синтезом и деградацией вирусных частиц. Если преобладает синтез, то концентрация вируса в зараженных тканях растет и наоборот.

Растения, подвергающиеся термотерапии, помещают в специальные термокамеры, где в течение первой недели повышают температуру от 25 до 37 °С путем ежедневного увеличения параметров температур на 2 °С. Не менее важно при термотерапии создавать и поддерживать на протяжении всего процесса оптимальные режимы: температуру - 37 °С, освещенность лампами дневного света - 5 тыс. лк, фотопериод - 14-16 ч/сут при относительной влажности воздуха в термокамере 90 %.

Продолжительность термотерапии всецело зависит от состава вирусов и их термостойкости. Если, например, для гвоздики достаточно 10-12-недельного воздействия теплом, то для освобождения хризантемы от Б-вируса этот период длится 12 недель и более. Однако существуют растения, например, луковичные культуры, цимбидиум, розы и другие, рост которых угнетается в результате длительной термотерапии in vitro. Для таких растений целесообразно проводить термотерапию растений-регенерантов in vitro.

Помимо положительного действия термотерапии на освобождение растений от вирусов, выявлен положительный эффект от воздействия высоких температур на точку роста и процессы морфогенеза некоторых цветочных культур (гвоздика, хризантема, фрезия) в условиях in vitro. Применение термотерапии позволяет увеличивать коэффициент размножения на 50-60 %, повысить адаптацию пробирочных растений-регенерантов к почвенным условиям, а также получить более высокий процент безвирусных маточных растений.

Использование термотерапии в сочетании с меристемной культурой дает возможность оздоровить более 70 % растений-регенерантов хмеля от вирусного хлороза, 90 % земляники, 25 % растений черной и красной смородины, 50 % малины, более 80 % картофеля. Растения на наличие вирусов, как правило, проверяют с помощью иммуноферментного анализа, электронной микроскопии и травянистых растений-индикаторов.

Другой способ, применяемый для освобождения растений от вирусов, - хемотерапия. Он заключается в добавлении в питательную среду, на которой культивируют апикальные меристемы, аналога гуанозина Д-рибофуранозил-1,2,4-триазол-карбоксимида (коммерческое название - вирозол) концентрацией 20-50 мг/л. Это противовирусный препарат широкого спектра действия.

При использовании вирозола в культуральной среде процент безвирусных ме-ристемных растений увеличивался до 80 % по сравнению с 40 % на контроле. Положительные результаты получены для сливы, черешни, малины, некоторых цветочных и других растений.

Оздоровление посадочного материала от вирусной, бактериальной и грибной инфекции выполняется на основе одного из трех методов ( метод апикальных меристем, метод термотерапии, метод химиотерапии) или их сочетания. Получение свободных от вирусов растений (virus-free plants) является этапом и одной из целей клонального микроразмножения картофеля, плодовых, ягодных, декоративных, лесных растений.

Метод апикальных меристем

Меристема - конус активно делящихся клеток, расположенных на кончике побегов или корней. Для оздоровления используют меристему побегов шириной 0.1 мм и длиной 0.25-0.3 мм. Метод основан на том, что распределение вируса в растении неравномерно и наименьшая концентрация наблюдается в зоне апикальной меристемы. Вычленение апикальной меристемы и высадка ее на питательную среду приводит к снижению концентрации или полной элиминации вируса в дочернем растении после его регенерации из апикальной меристемы.

Существуют несколько теорий, объясняющих отсутствие вирусов в меристеме : медленное распределение вирусов в активно делящихся клетках, подавление размножения вирусов высокой концентрацией ауксинов, влияние компонентов питательной среды.

Авторами метода считаются Ж. Морель и С.Мартин (1952), впервые получившие свободное от вирусов растение георгинов от инфицированного донорного растения. В настоящее время метод получил широкое распространение и используется для оздоровления посадочного материала картофеля, плодовых, ягодных, декоративных растений. Использование метода апикальных меристем само по себе не гарантирует обязательного оздоровления. Вирус может присутствовать в апикальной меристеме в скрытом состоянии. В связи с этим необходимо сочетать метод апикальных меристем с другими методами оздоровления (термо- и химиотерапия) и применять для контроля вирусной инфекции в растении-регенеранте методы электронной микроскопии и/или иммуноферментного анализа. Отмечены случаи, когда свободные от вирусов регенеранты были получены от несущих вирусы апикальных меристем . Вероятно, потеря вирусов в этом случае связана с комбинацией факторов, возникающих при культивировании меристем ( состав питательной среды, наличие гормонов и др.)

Какие факторы способствуют элиминации вирусов в культуре меристем? Одним из главных факторов является размер меристемы. Известно, что эффективность оздоровления обратно пропорциональна размеру меристемы, а эффективность регенерации растений из меристемы прямо пропорциональна. Поэтому для каждого растения подбирается оптимальный размер меристемы, обеспечивающий высокий уровень элиминации вирусов и приемлемый выход растений-регенерантов.

Верхушечные почки обеспечивают более высокую эффективность регенерации в сравнении с боковыми ( эффект апикального доминирования). Влияние сезона и физиологического состояния растения на эффективность регенерации рассматривалось нами ранее. К примеру, для картофеля оптимален период после выхода клубня из состояния покоя. Эксплант (кончик побега), используемый для вычленения меристемы, стерилизуется в 75-95 % этаноле и /или 0.1 -.0.5 % гипохлорите натрия с последующим многократным промыванием в стерильной воде. Вычленение меристемы производится в ламинар-боксе в стерильных условиях под бинокулярным микроскопом. Размер вычленяемой меристемы 0.5 -+ 0.2 мм.

Для культивирования апикальных меристем используют обычно модификацию среды Мурасиге и Скуга, подбирая гормональный состав, оптимальный для культуры. Применяется невысокая концентрация регуляторов роста (0.1-0.5 мг/л); ауксины могут быть необходимы для образования корней, ауксины и цитокинины - для стимуляции клеточного деления, гибберелловая кислота иногда добавляется для удлинения побегов. Нормальной для культивирования меристем является температура 21-25 0 С, для луковичных растений требуется более низкая температура. Оптимальная длина дня - 14-16 часов.

Термотерапия

Тепловая обработка растений в культуре in vivo или in vitro обычно предшествует вычленению апикальных меристем. Термотерапия ( лечение зараженных вирусными болезнями растений длительным воздействием на них повышенных температур) способствует элиминации вирусов в инфицированных растениях. Механизм этого процесса до конца не изучен. Предполагаются следующие возможные причины элиминации вирусов в результате тепловой обработки растений: инактивация имеющихся вирусов, увеличение темпа синтеза вирусных частиц с последующей деградацией, блокирование синтеза РНК вируса, уменьшение движения вируса к быстрорастущей апикальной меристеме. Различные вирусы по разному относятся к термотерапии. Так, например, вирусы картофеля располагаются в порядке увеличения трудности элиминации под действием термотерапии в следующем порядке: вирусы L, А, Y, F, М, Х, S, вироид веретеновидности клубней.

Термотерапия выполняется обычно при температуре, не угнетающей развитие растений и подавляющей развитие вирусов. Наиболее часто используется температура 36-38 0 С. Для выполнения термотерапии растения, черенки или клубни помещают в термокамеры, где в течение первой недели температуру увеличивают от 250 до 37 0 С путем ежедневного увеличения на 2 0 С. Освещенность 3,5-5тыс. люкс, фотопериод 14-16 часов в сутки, влажность 75-90 %. Термотерапию клубней картофеля выполняют в темноте в условиях термобокса, в результате получают этиолированные ростки.

Продолжительность термотерапии зависит от культуры, сорта и состава вирусов инфицированного растения. Если для картофеля оптимальная продолжительность составляет около 4 недель, то для хризантем - более 12 недель.

Для некоторых культур, угнетаемых под действием высокой температуры in vivo ( розы, луковичные и др.) целесообразна термотерапия в культуре in vitro.

Эффективность термотерапии различна и зависит от особенностей культуры. Термотерапия особенно полезна для плодовых деревьев, где культура меристем затруднена. Для культуры картофеля метод недостаточно эффективен в связи с риском распространения вироида веретеновидности клубней . клональный микроразмножение клубневый репродукция

Химиотерапия

Метод предполагает использование химических соединений - ингибиторов вирусов, которые добавляются в состав питательной среды. Наиболее часто для этих целей применяют 1 в- Д- рибофуранозил -1,2,4 - триазол - 3 карбоксимид ( коммерческое название виразол). Виразол стерилизуется путем фильтрации и добавляется в охлажденную среду. Концентрации препарата зависят от вида растений ( 1- 100 мг/л), длительность обработки подбирается эмпирически. По мере возрастания концентрации усиливается процесс элиминации вирусов, однако при концентрации выше 20-50 мг/ л уменьшается темп роста и может наблюдаться фитотоксический эффект. Виразол показал высокую эффективность при оздоровлении картофеля, черешни, сливы, малины, декоративных растений.

В Белорусском НИИ картофелеводства успешно испытан метод оздоровления посадочного материала картофеля на основе применения 2-5- олигоаденилатов - соединений, относящихся к классу олигонуклеотидов и являющихся посредниками противовирусного действия интерферона. Для 2-5- олигоаденилатов обнаружен большой спектр биологической активности, включая противовирусную, фитостимулирующую, цитокининоподобную и др.

Общие условия выбора системы дренажа: Система дренажа выбирается в зависимости от характера защищаемого.

Основное преимущество клонального микроразмножения – это получение генетически однородного, безвирусного посадочного материала. Этого возможно достичь, используя меристемные ткани апексов и пазушных почек органов стеблевого происхождения. Как правило, меристема состоит из конуса нарастания, а также одного или двух листовых зачатков (примордиев) и является свободной от инфекции [23].

Предположение о возможности отсутствия вирусов в меристематических тканях больных растений впервые высказано Чунгом (1938) и П.Р. Уайтом (1943) [8]. Начиная с 50-х годов XX в. были предприняты первые успешные опыты по получению свободных от вирусов растений георгина из точки роста. Авторы этого метода Ж. Морель и С. Мартин [9] полагали, что в больном растении вирус распространяется с отставанием от растущих молодых органов, особенно в молодых недифференцированных тканях, где концентрация вируса может снижаться, вплоть до полного отсутствия. Теоретические концепции, положенные в основу этого метода, стали проясняться в последнее время.

Структурной основой используемого на практике явления служит специфика строения точки роста растений; дистальная ее часть, представленная апикальной меристемой, у разных растений имеет средний диаметр до 200 мкм и высоту от 20 до 150 мкм. В более нижних слоях дифференцирующиеся клетки меристемы образуют прокамбий, дающий начало пучкам проводящей системы. Известно, что успех клонального микроразмножения зависит от размера меристематического экспланта, чем больше листовых зачатков и тканей стебля, тем легче идет процесс морфогенеза, заканчивающийся получением целого, нормального пробирочного растения. Вместе с тем зона, свободная от вирусных частиц, очень различна для разных вирусов. Это зависит также от вида и сорта растения. В колеоптиле злаков, например, размеры участка верхушки, не содержащей сосуды, могут достигать до 250 мкм. Такая особенность строения апикальной меристемы исключает проникновение в нее вируса путем быстрого транспортирования по проводящей системе, но допускает возможность медленного распространения через плазмодесмы, соединяющие меристематические клетки. При культивировании апикальной меристемы картофеля величиной 200 мкм на питательной среде и дальнейшее получение из нее растений-регенерантов показали, что среди полученных растений только 10% были свободны от Х-вируса, но 70% – от Y-вируса [24].

Применение электронной микроскопии часто обнаруживает наличие вирусов в меристеме пораженных ими растений, это, впрочем, подтверждает общеизвестный факт, что число лишенных вируса растений после подобной операции чрезвычайно мало, и многие меристемы пораженных растений инфекционны [15].

Таким образом, эффективность применения апикальной меристемы в качестве метода оздоровления зараженных вирусами растений оказывается низкой. Это было доказано результатами, полученными рядом меристемных лабораторий Российской Федерации, показывающими, что из апикальных меристем растений гвоздики, цимбидиума, пораженных вирусами CarM V и CarVMV, в условиях in vitro получают инфицированные мериклоны [15].

В принципе возможно получение безвирусной апикальной меристемы от больного растения, но при этом риск попадания вирусов в здоровые ткани должен быть снижен до нуля. Это может быть достигнуто путем применения предварительной термотерапии исходных растений или хемотерапии [25].

Метод термотерапии применяется как в условиях in vivo, так и in vitro и предусматривает использование сухого горячего воздуха. Для объяснения механизма освобождения растений от вирусов в процессе термотерапии существуют различные гипотезы. Согласно одной из них, высокие температуры воздействуют непосредственно на вирусные частицы через их рибонуклеиновую кислоту и белковую оболочку, вызывая физическое разрушение и лишая вирусные частицы инфекционности. Вторая гипотеза состоит в том, что высокая температура действует на вирусы через метаболизм растений. Под влиянием высоких температур нарушается равновесие между синтезом и деградацией вирусных частиц. Если преобладает синтез, то концентрация вируса в зараженных тканях растет, и наоборот [25].

Растения, подвергающиеся термотерапии, помещают в специальные термокамеры, где в течение первой недели повышают температуру от 25°С до 37°С путем ежедневного увеличения параметров температур на 2°С. Не менее важно при термотерапии создавать и поддерживать на протяжении всего процесса оптимальные режимы: температуру 37°С, освещенность лампами дневного света 5 тыс. лк, фотопериод в зависимости от культуры 14–16 ч в сутки при относительной влажности воздуха в термокамере 90 %.

Продолжительность термотерапии всецело зависит от состава вирусов и их термостойкости. Если, например, для гвоздики достаточно 10–12-недельного воздействия теплом, то для освобождения хризантемы от Б-вируса этот период длится 12 и более недель. Однако существуют растения, например луковичные культуры, цимбидиум, розы и другие, рост которых угнетается в результате длительной термотерапии in vivo. Для таких растений целесообразно проводить термотерапию растений-регенерантов in vitro[23].

Помимо положительного действия термотерапии на освобождение растений от вирусов, выявлен положительный эффект высоких температур наточку роста и процессы морфогенеза некоторых цветочных культур (гвоздики, хризантемы, фрезии) в условиях in vitro. Применение термотерапии позволяет увеличить коэффициент размножения на 50–30 %, повысить адаптацию пробирочных растений-регенерантов к почвенным условиям, а также получить более высокий процент безвирусных маточных растений [23].

Применение термотерапии в сочетании с меристемной культура позволяет оздоровить более 70 % растений-регенерантов хмеля от вирусного хлороза, 90% растений земляники, 25% – черной и красной смородины, 50% – малины, более 80 – картофеля. Проверку растений на наличие вирусов, как правило, проводят при помощи иммуноферментного анализа, электронной микроскопии и травянистых растений-индикаторов [25].

Другой способ, применяемый для освобождения растений от вирусов, – хемотерапия. Он заключается в добавлении в питательную среду, на которой культивируют апикальные меристемы, аналога гуанозина-1β-Д-рибофуранозил-1,2,4-триазол-З-карбоскимид (коммерческое название вирозол) в концентрации 20–50 мг/л. Это противовирусный препарат широкого спектра действия. При использовании вирозола в культуральной среде процент безвирусных меристемных растений для ряда обычных для этих растений вирусов увеличивался до 80–100 % при 0–41 % в контроле. Положительные результаты хемотерапии были получены для сливы, черешни, малины, некоторых цветочных и других растений. Термо- и хемотерапевтические методы оздоровления посадочного материала от вирусов экономически малоэффективны. Поэтому в настоящее время с помощью методов трансгеноза создаются формы растений с генетической устойчивостью к вирусам [26].

Таким образом, микроклональное размножение является новым методом вегетативного размножения и имеет ряд преимуществ. Этот метод используется для быстрого клонального размножения in vitro лучших экземпляров декоративных травянистых и древесных растений. Кроме того этот метод применим и для сохранения редких и исчезающих видов, но пока не доконца разработан этап технологий, связанный с возвращением этих растений в соответствующую среду обитания. Тем самым мы получаем генетически однородный, безвирусный посадочный материал.

1.2 Микроклональное размножение Orchidaceae и Saintpaulia

Технологии клонального микроразмножения представляют исключительную ценность для поддержания биоразнообразия коллекций и сохранения генофонда цветочно - декоративных растений, особенно в тех случаях, когда вид или сорт представлен ограниченным количеством экземпляров или находится под угрозой исчезновения . Кроме того, эти методы позволяют быстро и в достаточном количестве размножить новые сорта и гибриды цветочно-декоративных растений [20].

Современные сорта орхидей, полученные с использованием видов, происходящих из тропиков и субтропиков, занимают ведущее место в мировой цветочной индустрии. Под растения орхидных, выращиваемые на срез или как горшечная культура, заняты значительные площади как в хозяйствах Азии, так и в Европе [27]. Высокой декоративностью обладают сортовые растения, происходящие из родов Cymbidium Sw., Phalaenopsis Blum., Paphiopedilum Pfitz., Dendrobium Sw., Oncidium Sw., Miltonia Lindl., Odontoglossum Н.B.K., Cattleya Lindl., Laelia Lindl. Кроме того, постоянно ведутся поисковые и селекционные работы, направленные на выявление новых, перспективных для внутреннего озеленения видов и создания на их основе устойчивых во внутреннем озеленении сортов орхидей [28].

В настоящее время интродукция тропических и субтропических растений в ботанических садах умеренной зоны является одним из действенных способов их сохранения. Следующий этап их изучения - это выявление их биологических особенностей, разработка эффективных методов размножения и адаптация полученных растений к условиям in situ. По сути, ботанические сады являются музеями живых растений, собранных со всех континентов. Известен целый ряд примеров, когда вследствие нерациональной деятельности человека представители того или иного вида флоры сохранялись лишь в коллекциях ботанических учреждений. Очевидно, что возможности по сохранению ex situ видов мировой форы ограничены, поэтому необходимо искать новые подходы к решению данной проблемы [29].

Для осуществления этих задач в 1974 году в отделе была создана лаборатория микроклонального размножения, целью которой была разработка методов массового размножения растений в асептической культуре. В работе использовали как семена, полученные по делектусам, так и семена репродукции ботанического сада. Проведенные исследования подтвердили гипотезу о том, что семена орхидных вызревают значительно раньше, чем их плоды. В связи с этим, метод высева семян из незрелых коробочек (green capsule culture), более чем на 1/3 сокращает сроки получения сеянцев [30].

В лаборатории проводятся комплексные исследования, направленные на выяснение действия различных компонентов питательных сред на процессы роста и развития сеянцев разных видов орхидных, изучаются их особенности онтогенеза in vitro. Полученные результаты привели к разработке состава универсальной питательной среды для проращивания семян тропикогенных видов орхидных, которая значительно ускоряет темпы развития сеянцев [30].

Постсеменное развитие зародыша орхидных протекает необычно, с формированием специфической структуры – протокорма. Разные виды орхидных отличаются формой и размером протокорма. У эпифитов протокормы сферические, а у наземных видов они имеют вытянутую форму. Установлено, что развитие сеянцев в асептической культуре может проходить двумя основными путями. В первом случае из зародыша формируется первичный протокорм, а из последнего, в дальнейшем, один сеянец. Во втором случае, на теле первичного протокорма формируются конгломераты вторичных протокормов [31].

Таким образом спорофит орхидных, уже на самых ранних этапах онтогенеза, способен к эффективному вегетативному размножению, что является отличительной особенностью представителей этого семейства. Направляя течение онтогенеза по второму пути можно существенно повысить коэффициент вегетативного размножения орхидных in vitro. На сегодня разработаны приёмы семенного размножения более чем 160 видов тропикогенных орхидных, относящихся к 52 родам [30].

Важной составляющей успеха в деле поддержания таксономического состава коллекции орхидных является разработка приёмов микроклонального размножения. Это становится особенно актуально, когда речь идёт о размножении уникальных сортов или видов, от представителей которых не удаётся получить полноценный семенной материал. Поэтому в лаборатории постоянно проводятся работы по разработке методов клонального микроразмножения, усовершенствованию питательных сред, изучению особенностей адаптации к условиям оранжерей сеянцев и растений-регенерантов [32].

Метод клонального микроразмножения орхидных включает в себя несколько этапов: выбор экспланта, стерилизация растительного материала, получение протокормов и ювенильных растений, высадка полученного растительного материала в субстрат. Эксплантами у орхидей могут служить различные части растений: пазушные почки (Calanthe, Cymbidium, Dendrobium, Aranda, Paphiopedilum, Thunia, Vanda), верхушки листьев (Суmbidium, Dendrobium, Epidendrum, Laeliocattleya, Phalaenopsis), верхушки побегов (Cattleya, Cymbidium, Rhynchostylis), листья сеянцев (Саttleya, Laelia, Phalaenopsis) почки цветоносов (Ascofinetia, Neostyllis, Phalaenopsis, Vanda), кончики корней (Сymbidium, Phalaenopsis) [33].

Большое значение имеет время года, в которое вычленяется эксплант, так как в основе сезонных различий регенерационной способности растений лежат изменения их физиолого-биохимичекого состояния. Исследования показали, что лучший рост протокормов и образование растений происходит весной. На выживаемость экспланта влияет и его размер. В целях массового размножения растений используют экспланты размером 0,5-1 см. Для освобождения от вирусной инфекции вычленяют эксплантаты от 0,1 до 0,5 мм и проводят ранее тестирование как протокормов, так и растений-регенерантов [31].

Основная трудность при микроразмножении орхидей состоит в получении асептического материала. Интактные растения находятся в симбиотических отношениях с различными микроорганизмами, поэтому процент контаминации бывает очень высок. Разработаны методы стерилизации эксплантов различных видов орхидных, обеспечивающие получение стерильного материала. Чаще всего в качестве источника эксплантов используют молодые отрастающие побеги и туберидии. При изучении морфогенетического потенциала сортов Cymbidium были отобраны 17 генотипов, обладающих высоким морфогенным потенциалом, высокой продуктивностью цветения и потому пригодных для использования в промышленном цветоводстве [34].

Рост эксплантов орхидей на питательных средах зависит от положения вычленяемых частей на интактном растении. Экспланты, вычлененные из нижней части побега или туберидия, быстрее формируют растения [35].

Как было отмечено выше, первым этапом микроразмножения орхидных является получение протокормов, которые служат основной структурной единицей при микроразмножении. Экспланты орхидных, в зависимости от этапа микроразмножения, культивируют как на твердых, так и на жидких питательных средах. Формирование протокормов начинается через 1-2 месяца после того как эксплант помещён на питательную среду. Полученные протокормы разделяют и переносят на свежие питательные среды. В дальнейшем размножение протокормов происходит в геометрической прогрессии. Установлено, что закладка меристематических центров, образующих в дальнейшем вторичные протокормы происходит в эпидермальных и субэпидермальных слоях тела протокорма. Если конгломераты протокормов не разделять и не субкультивировать, то со временем они начинают формировать растения [31].

Перенос полученных in vitro ювенильных растений в септические условия весьма болезненный процесс для представителей многих видов. Большинство тропикогенных орхидных хорошо переносят период адаптации при высадке в сфагновый мох с последующей пересадкой в легкие питательные землесмеси. В то же время некоторые виды, представители которых являются ярко выраженными эпифитами, необходимо сразу высаживать на блоки [36].

Таким образом, высокий экономический эффект семенного и клонального микроразмножения заключается не только в получении массового посадочного материала в течение кратчайших сроков вне зависимости от времени года, но и в оздоровлении растений от патогенов. Растения, полученные при размножении in vitro, сохраняют все отличительные особенности характерные виду, морфологически выровнены и имеют высокий коэффициент размножения при культивировании их в условиях оранжерей [32].

Что же касается сенполий, то размножение их in vitro требует очень высокой технологии производства. Зарубежные фирмы хорошо освоили этот метод. В России успешное микроклональное размножение сенполии было проведено в лабораторных условиях (1991). И только с 1997 года в научно-производственном центре "Фитогенетика" г.Тула, освоено промышленное производство сенполии. Сейчас она одна из самых популярных комнатных растений. В настоящее время коллекция центра насчитывает не менее 100 сортов [37].

Клональное микроразмножение сенполии основано на их способности размножаться листовыми черенками. Причём в условиях in vitro возможна посадка на питательную среду не только целого листа (без черешка), но и отдельных его фрагментов, хотя чем больше фрагмент листа, тем быстрее идёт образование каллусной ткани. Именно она даёт начало новым растениям: под действием гормонов на каллусной ткани образуются ростовые почки. Затем почки отделяют и пересаживают на свежую среду, где образуются целые пучки молодых растений. Хорошо развитые растеньица укореняют на другой питательной среде [38].

Основные этапы микроклонального размножения сенполий in vitro:

Этап 1: Инициация

Инициация культуры сенполии in vitro: стерильные экспланты (кусочки листа, цветоноса, обработанные стерелизующим раствором) помещают на искусственную питательную среду для размножения.

Этап 2: Формирование и рост микропобегов сенполии

Этап 3: Укоренение

На этом этапе отдельные растения пересаживают на новую питательную среду для укоренения.

Этап 4: Высадка в почву, адаптация.

Микророзетки высаживают в грунт или торфо-перегнойные таблетки и помещают в парник, где поддерживают высокую влажность воздуха в течение 2-3 недель. По мере адаптации растений к естественным условиям, с началом активного роста, влажность воздуха постепенно снижают [39].

Весь процесс от начала введения в культуру до получения укоренённого растения занимает 7-8 месяцев. Зато потом, в условиях in vitro растения множатся как грибы да и характер роста похожий. Такой высокий коэффициент размножения не даёт ни один другой способ. Однако размноженные таким способом фиалки имеют некоторые особенности. Во-первых, они быстро развиваются и образуют V-образную мощную розетку листьев. Во вторых, клональное микроразмножение приводит к их омолаживанию, поэтому клонированные сенполии способны дольше и больше цвести [40].

1.3 Влияние экзогенных и эндогенных факторов на процесс клонального микроразмноженя Orchidaceae и Saintpaulia

На эффективность микроклонального размножения декоративных видов влияет масса факторов различной природы.

Читайте также:


Коронавирус садхгуру дает совет

Особенности эпидемиологии вирусных инфекций

Может ли быть температура на прививку пневмококковой инфекции отзывы

Астено-вегетативный синдром при гепатитах

Сколько вирус полиомиелита живет на предметах